CN100565187C - 一种用于除草剂高通量的96孔板筛选方法 - Google Patents
一种用于除草剂高通量的96孔板筛选方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于除草剂高通量的96孔板筛选方法，所述方法如下：采用适用于小球藻的培养基，将指数生长期的小球藻接种于96孔板中，初始接种小球藻个数范围为7～8×105个/mL，接种后往各孔加入具有浓度梯度的除草剂，每个浓度设置2～5个平行样，同时设置空白样对照；培养条件：温度25±0.2℃，光照2000Lx，持续光照，用保鲜膜封口，不加营养液，每天对藻液充气4～5次，共培养72～144h，每天测试样品在630nm处的吸光度，根据吸光度和除草剂浓度间的关系，推算除草剂对小球藻的EC50。本发明相比三角瓶法的有益效果主要体现在：大为缩小了筛选过程中的除草剂使用量，且操作简便、快速，灵敏度高。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种用于除草剂高通量的96孔板筛选方法。
(二)背景技术
农药在我国乃至全世界的农林业生产以及卫生害虫控制方面起着重要作用，但随着环境和消费安全的呼声日益提高，以及有害生物抗药性的产生使农药使用寿命缩短，使得新农药的创制与开发越来越迫切，也越来越困难。据统计，一个高效、低毒、环境友好型新农药的成功开发，目前需要合成筛选80000个化合物，耗资上亿美元。这对药物开发中化合物的合成与筛选都提出了新的挑战。以常规的温室生测方法在短时间内筛选大量的化合物是非常困难的，微型筛选法不仅仅测试规模大大缩小，而且农药用量少、筛选速度也非常快。用代表性植物测试，如藻类、浮萍等。将一定剂量的化合物及藻类或浮萍分别加入三角瓶中，混匀。在控制条件下振荡培养。测定培养前后混合液的光密度值，如果光密度值不变甚至减少，表明藻类不生长，化合物有除草活性。也可通过生长抑制率求出EC50，以判断化合物活性大小。还可以培养藻类细胞，通过化合物对藻类细胞的抑制作用判断其活性大小。随着科学技术的进一步发展，对药物开发中化合物的合成与筛选则提出了更高的要求，为了进一步降低成本，在最初的合成中得到用于筛选的化合物通常都在微克的数量级，因此需要一种更为微型的筛选方法，以替代现有的三角瓶法。
目前已有96孔板法应用于除草剂活性筛选的报道，采用固体培养基，植入杂草种子，通过测定杂草鲜重和株高，来对除草剂活性进行分析。而对于藻类细胞，由于其微生物特性，受外界因素影响而发生性状改变的几率较大，因此还未见有运用96孔板法、采用液体培养基对藻类细胞进行培养分析的相关报道。
(三)发明内容
本发明则是为了提供一种用于除草剂高通量的96孔板筛选方法，以替代传统的三角瓶法。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是：
一种用于除草剂高通量的96孔板筛选方法，所述方法如下：采用适用于小球藻的培养基，将指数生长期的小球藻接种于96孔板中，初始接种小球藻个数范围为7～8×105个/mL，接种后往各孔加入具有浓度梯度的除草剂，每个浓度设置2～5个平行样，同时设置空白样对照；培养条件：温度25±0.2℃，光照2000Lx，持续光照，用保鲜膜封口，不加营养液，每天对藻液充气4～5次，共培养72～144h，每天测试样品在630nm处的吸光度，根据吸光度和除草剂浓度间的关系，推算除草剂对小球藻的EC50。实验中发现，若培养过程中不对藻液进行充气，则藻细胞易沉淀在孔壁上，影响吸光度测量的准确性；而通过每天对藻液充气4～5次的处理，则可明显改善这一问题，藻细胞生长状态良好，分布均匀，且不易沉淀。
数据处理、分析方法：在上述条件下振荡培养，以培养液为参比，用血球计数板在显微镜下直接计数并在最大吸收波长630nm测定吸光值，试验设3个重复，建立藻细胞浓度和吸光度的线性回归关系。抑制率直接采用(对照样品吸光度-处理样品吸光度)/对照样品吸光度计算，并建立抑制率(P)和浓度的自然对数(lnC)的线性回归关系，并求解抑制率为50％的浓度值(EC50)。
所述小球藻优选为普通小球藻(Chlorella vulgaris)。
所述适用于小球藻的培养基为常见可用于小球藻培养的培养基，如水生四号培养基、HA-SK培养基等，优选为水生四号培养基。所述水生四号培养基可使用市购产品，也可按如下组成配制：(NH4)2SO4，0.20g；Ca3(PO4)2，0.03g；MgSO4·7H2O，0.08g；NaHCO3，0.10g；KCl，0.025g；1％(质量浓度)FeCl3，0.15mL；土壤浸出液，0.50mL；水补足至1000mL。
具体的，所述方法如下：采用水生四号培养基，将处于指数生长期的普通小球藻接种于96孔板中，普通小球藻初始浓度为7～8×105个/m，接种后加入精吡氟禾草灵，浓度梯度为0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、5mg/L，每个浓度设置4个平行样，培养条件：温度25±0.2℃，光照2000Lx，持续光照，用保鲜膜封口，不加营养液，每天用排枪对96孔板中的藻液充气4～5次，共培养72h，每天用Bio-Rad 680型酶标仪测试其在630nm处吸光度，根据吸光度和藻生物量间的关系，推算除草剂对藻的EC50，结果取其平均值。
本发明的有益效果主要体现在：大为缩小了筛选过程中的除草剂使用量，且操作简便、快速，灵敏度高。
(四)附图说明
图1为96孔板法抑制率与Ln(C)拟合曲线(精吡氟禾草灵)；当P＝50％时，C＝1.35mg/L(P为抑制率，C为除草剂浓度，下同)；
图2为三角瓶法抑制率与Ln(C)拟合曲线(精吡氟禾草灵)；当P＝50％时，C＝1.58mg/L；
图3为96孔板法抑制率与Ln(C)拟合曲线(氯氟吡氧乙酸)；当P＝50％时，C＝0.60mg/L；
图4为三角瓶法抑制率与Ln(C)拟合曲线(氯氟吡氧乙酸)；当P＝50％时，C＝0.66mg/L；
图5为96孔板法抑制率与Ln(C)拟合曲线(乙草胺)；当P＝50％时，C＝0.33mg/L；
图6为三角瓶法抑制率与Ln(C)拟合曲线(乙草胺)；当P＝50％时，C＝0.45mg/L；
图7为96孔板法抑制率与Ln(C)拟合曲线(精喹禾灵)；当P＝50％时，C＝2.10mg/L；
图8为三角瓶法抑制率与Ln(C)拟合曲线(精喹禾灵)；当P＝50％时，C＝1.91mg/L。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
采用水生四号培养基，在普通小球藻(Chlorella vulgaris，购自中国科学院水生生物研究所，下同)的指数生长期试验，小球藻接种于250μL96孔板中，总体积为200μL，初始接种小球藻个数范围为7～8×105个/mL。接种后对其进行一定浓度梯度的除草剂精吡氟禾草灵(购自江苏洽益农化有限公司)处理，浓度梯度为0，0.05，0.1，0.25，0.5，1，5mg/L，每个浓度设置4个平行样。光照培养条件：温度(25±0.2)℃，光照2000Lx，持续光照，用保鲜膜封口，试验期间不加营养液，每天用排枪对96孔板中的藻液充气4-5次，共培养72h，每天用Bio-Rad 680型酶标仪测试其在630nm处吸光度，根据吸光度和藻生物量间的关系，推算除草剂对藻的EC50，结果取其平均值。
同时用ISO推荐的标准的三角瓶法测定除草剂对藻的EC50，三角瓶法测定过程如下：普通小球藻接种于三角瓶中，总体积为75mL，初始接种小球藻个数范围为7～8×105个/mL。接种后对其进行一定浓度梯度的除草剂精吡氟禾草灵处理，浓度梯度为0，0.05，0.1，0.25，0.5，1，5mg/L，每个浓度设置4个平行样，结果取其平均值。光照培养条件：温度(25±0.2)℃，光照2000Lx，持续光照，用纱布封口，试验期间不加营养液，每天手动振荡4-5次，共培养72h，每天用分光光度计测定藻液在690nm处的吸光度，根据吸光度和除草剂浓度间的关系，推算除草剂对藻的EC50。
在上述条件下振荡培养，以培养液为参比，用血球计数板在显微镜下直接计数并在最大吸收波长630nm测定吸光值，试验设3个重复，建立藻细胞浓度和吸光度的线性回归关系(见表1)：
表1：细胞浓度和吸光度的线性回归关系
| 测定方法 | 线性方程 | R<sup>2</sup> | P |
| 三角瓶法 | Y＝109.56X+5.66 | 0.9872 | 0.0017 |
| 96孔板法 | Y＝78.38X+7.78 | 0.9627 | 0.0039 |
抑制率(P)与除草剂浓度的自然对数(Ln(C))的拟合曲线见图1、图2。
测定结果：用96孔板法计算出的精吡氟禾草灵对小球藻的EC50为1.35mg/L，用三角瓶法计算出的精吡氟禾草灵对小球藻的EC50为1.58mg/L。
实施例2：
采用水生四号培养基，在普通小球藻(Chlorella vulgaris，购自中国科学院水生生物研究所)的指数生长期试验，小球藻接种于250μL96孔板中，总体积为200μL，初始接种小球藻个数范围为7～8×105个/mL。接种后对其进行一定浓度梯度的除草剂氯氟吡氧乙酸(购自浙江捷马化工有限公司)处理，浓度梯度为0，0.05，0.1，0.25，0.5，1，5mg/L，每个浓度设置4个平行样。光照培养条件：温度(25±0.2)℃，光照2000Lx，持续光照，用保鲜膜封口，试验期间不加营养液，每天用排枪对96孔板中的藻液充气4-5次，共培养72h，每天用Bio-Rad 680型酶标仪测试其在630nm处吸光度，根据吸光度和藻生物量间的关系，推算除草剂对藻的EC50。
三角瓶法步骤同实施例1。抑制率(P)与除草剂浓度的自然对数(Ln(C))的拟合曲线见图3、图4。
测定结果：用96孔板法计算出的氯氟吡氧乙酸对小球藻的EC50为0.60mg/L，用三角瓶法计算出的氯氟吡氧乙酸对小球藻的EC50为0.66mg/L。
实施例3：
采用水生四号培养基，在普通小球藻(Chlorella vulgaris，购自中国科学院水生生物研究所)的指数生长期试验，小球藻接种于250μL96孔板中，总体积为200μL，初始接种小球藻个数范围为7～8×105个/mL。接种后对其进行一定浓度梯度的除草剂乙草胺(购自杭州庆丰农化有限公司)处理，浓度梯度为0，0.05，0.1，0.25，0.5，1mg/L，每个浓度设置4个平行样，同时设置空白样对照。光照培养条件：温度(25±0.2)℃，光照2000Lx，持续光照，用保鲜膜封口，试验期间不加营养液，每天用排枪对96孔板中的藻液充气4-5次，共培养72h，每天用Bio-Rad 680型酶标仪测试其在630nm处吸光度，根据吸光度和藻生物量间的关系，推算除草剂对藻的EC50。
同时用ISO推荐的标准的三角瓶法测定除草剂对藻的EC50，三角瓶法测定过程如下小球藻接种于三角瓶中，总体积为75mL，初始接种小球藻个数范围为7～8×105个/mL。接种后对其进行一定浓度梯度的除草剂乙草胺处理，浓度梯度为0，0.05，0.1，0.25，0.5，1，5mg/L，每个浓度设置4个平行样，结果取其平均值。光照培养条件：温度(25±0.2)℃，光照2000Lx，持续光照，用纱布封口，试验期间不加营养液，每天手动振荡4-5次，共培养72h，每天用分光光度计测定藻液在690nm处的吸光度，根据吸光度和除草剂浓度间的关系，推算除草剂对藻的EC50。
抑制率(P)与除草剂浓度的自然对数(Ln(C))的拟合曲线见图5、图6。
测定结果：用96孔板法计算出的乙草胺对小球藻的EC50为0.33mg/L，用三角瓶法计算出的氯氟吡氧乙酸对小球藻的EC50为0.45mg/L。
实施例4：
采用水生四号培养基，在普通小球藻(Chlorella vulgaris，购自中国科学院水生生物研究所)的指数生长期试验，小球藻接种于250μL96孔板中，总体积为200μL，初始接种小球藻个数范围为7～8×105个/mL。接种后对其进行一定浓度梯度的除草剂精喹禾灵(购自江苏丰山集团有限公司)处理，浓度梯度为0，0.1，0.25，0.5，1，5mg/L，每个浓度设置4个平行样，同时设置空白样对照。光照培养条件：温度(25±0.2)℃，光照2000Lx，持续光照，用保鲜膜封口，试验期间不加营养液，每天用排枪对96孔板中的藻液充气4-5次，共培养72h，每天用Bio-Rad 680型酶标仪测试其在630nm处吸光度，根据吸光度和藻生物量间的关系，推算除草剂对藻的EC50。
同时用ISO推荐的标准的三角瓶法测定除草剂对藻的EC50，三角瓶法测定过程如下小球藻接种于三角瓶中，总体积为75mL，初始接种小球藻个数范围为7～8×105个/mL。接种后对其进行一定浓度梯度的除草剂精喹禾灵处理，浓度梯度为0，0.05，0.1，0.25，0.5，1，5mg/L，每个浓度设置4个平行样，结果取其平均值。光照培养条件：温度(25±0.2)℃，光照2000Lx，持续光照，用纱布封口，试验期间不加营养液，每天手动振荡4-5次，共培养72h，每天用分光光度计测定藻液在690nm处的吸光度，根据吸光度和除草剂浓度间的关系，推算除草剂对藻的EC50。
抑制率(P)与除草剂浓度的自然对数(Ln(C))的拟合曲线见图7、图8。
测定结果：用96孔板法计算出的精喹禾灵对小球藻的EC50为2.10mg/L，用三角瓶法计算出的精喹禾灵对小球藻的EC50为1.91mg/L。
Claims (4)
1.一种用于除草剂高通量的96孔板筛选方法，所述方法如下：采用适用于小球藻的培养基，将指数生长期的小球藻接种于96孔板中，初始接种小球藻个数范围为7～8×105个/mL，接种后往各孔加入具有浓度梯度的除草剂，每个浓度设置2～5个平行样，同时设置空白样对照；培养条件：温度25±0.2℃，光照2000Lx，持续光照，用保鲜膜封口，不加营养液，每天对藻液充气4～5次，共培养72～144h，每天测试样品在630nm处的吸光度，根据吸光度和除草剂浓度间的关系，推算除草剂对小球藻的EC50。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述小球藻为普通小球藻(Chlorella vulgaris)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述适用于小球藻的培养基为水生四号培养基，所述水生四号培养基按如下组成配制：(NH4)2SO4，0.20g；Ca3(PO4)2，0.03g；MgSO4·7H2O，0.08g；NaHCO3，0.10g；KCl，0.025g；质量浓度为1％的FeCl3，0.15mL；土壤浸出液，0.50mL；水补足至1000mL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：采用水生四号培养基，将处于指数生长期的普通小球藻接种于96孔板中，普通小球藻初始浓度为7～8×105个/m，接种后加入精吡氟禾草灵，浓度梯度为0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、5mg/L，每个浓度设置4个平行样，培养条件：温度25±0.2℃，光照2000Lx，持续光照，用保鲜膜封口，不加营养液，每天用排枪对96孔板中的藻液充气4～5次，共培养72h，每天用Bio-Rad 680型酶标仪测试其在630nm处吸光度，根据吸光度和除草剂浓度间的关系，推算除草剂对藻的EC50，结果取其平均值，所述水生四号培养基按如下组成配制：(NH4)2SO4，0.20g；Ca3(PO4)2，0.03g；MgSO4·7H2O，0.08g；NaHCO3，0.10g；KCl，0.025g；质量浓度为1％的FeCl3，0.15mL；土壤浸出液，0.50mL；水补足至1000mL。
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