CN100554966C - 筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一组筛选方法用于发展药物对抗含有双组分系统DevR-DevS和/或DevR-Rv2027c及其同源物的致病微生物，所述方法组成步骤有超量表达DevR、DevS和Rv2027c及它们的单结构域衍生物和突变变体蛋白，自磷酸化DevS和Rv2027c蛋白及此后在待测化合物存在的情况下以SDS-PAGE或高通量的形式磷酸转移至DevR及其衍生物，及确定待测化合物的药物潜力，其中药物潜力反比于(i)DevS和Rv2027c的自磷酸化程度，(ii)DevR和/其单结构域衍生物基于磷酸转移的去磷酸化程度，及(iii)磷酸化的DevS和Rv2027c及/它们的单结构域衍生物的去磷酸化程度，以及一种治疗方法和治疗方法中的一种组合物。

Description

筛选方法
技术领域
本发明涉及一组用于设计药物以对抗含有DevR-DevS和/或DevR-Rv2027及其同源体的双组分系统的致病微生物的筛选方法，所述方法包括步骤：过量表达DevR、DevS和Rv2027c及其单结构域衍生物和突变变体蛋白；自磷酸化DevS和Rv2027c蛋白及随后在待测化合物存在的情况下以SDS-PAGE或以高通量形式磷酸转移到DevR及其衍生物；和检测待测化合物的药物潜力，其中该药物潜力反比于(i)DevS和Rv2027c的自磷酸化程度，(ii)DevR及其单结构域衍生物基于磷酸转移的去磷酸化程度，和(iii)磷酸化的DevS和Rv2027c及其单结构域衍生物的去磷酸化程度。发明还涉及治疗方法以及其组合物。
背景技术
本发明涉及运用DevR-DevS(Rv3133c-Rv3132c)和Rv2027c-DevR信号转导通路作为治疗靶点以对抗由分枝杆菌生物体引起的疾病，该分枝杆菌生物体包括所有形式的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和其他具有双组分系统的分枝杆菌。本发明进一步涵盖了将这些蛋白及它们的催化活性用作筛选以这些信号转导通路中的所有或任何步骤为靶点的抗细菌、抗分枝杆菌、杀菌和/或细菌抑制药物和/或化合物的方式。
双组分信号转导系统是感觉系统的最基本形式，该系统包括对环境信号的直接反应，如对压力[氧压，pH]，营养缺乏[化学化合物，生物类似物，离子]，暴露于化学药品、毒素和渗透压摩尔浓度的改变等的直接反应。双组分系统包含基本的感觉系统，该感觉系统含有跨膜传感器组氨酸激酶，该激酶感受环境刺激并以ATP依赖的方式在其保守的组氨酸残基发生自磷酸化(图1)。磷酸化的组氨酸传感器激酶将其磷酸基团转移至反应调节因子蛋白的保守天冬氨酸残基上，该蛋白为双组分系统中的另一半，据推断该蛋白具有依赖于其内部存在的保守的螺旋-转角-螺旋基序的DNA结合能力。反应调节因子蛋白的磷酸化状态能够改变其DNA结合潜力/能力以及进而开启和关闭在其调节控制下的基因的表达(Parkinson和Kofoid，1992；Stock等，2000)。
结核分枝杆菌中能引起肺结核的致病菌株H37Rv的基因组全序列表明存在11个完整双组分系统及7个孤儿传感器激酶和反应调节因子蛋白的潜在编码基因(Cole等，1998)。在这些系统中只有4个系统在生化水平上得到表征，包括DevR-DevS(本专利申请)，DevR-Rv2027c(本专利申请)，SenX3-RegX3(Himpens等，2000)和TrcS-TrcR(Haydel等，1999)。已经表明，DevR-DevS(Rv3133c-Rv3132c)双组分系统依赖于其基因表达的组织缺氧应答模式在氧气局限时起到调节作用(Tyagi，JS，DST report，October 2001；Boon等，2001；Sherman等，2001)。组织缺氧据推断是启动肉芽瘤内的分枝杆菌的休眠的引发物。因此DevR-DevS系统是调节结核杆菌休眠的可能的候选系统。根据积累的关于该双组分系统在结核分枝杆菌毒性中所起作用的试验证据，该系统是抗生素作用靶点的合适选择，抗生素抑制该系统的公知功能，从而根除/杀死结核杆菌或阻止该杆菌进入休眠期，并使该系统可以用来能够改进常规治疗/对休眠杆菌无效的抗生素。为了筛选该双组分系统的抑制剂，在生化水平上构建了DevR-DevS和DevR-Rv2027c(与DevS有极高同源性的孤儿传感器激酶)的磷酸化通路。
Rv2027c蛋白与DevS蛋白有62.5％的一致性，含有组氨酸激酶典型的H、N、D/G1和G2框。因此作为孤儿传感器激酶的Rv2027c被推断可以发生自磷酸化并随后参与DevR蛋白的磷酸转移过程。该假说经过检验并证实可在体外发生(本专利申请)。
因此提议将这些磷酸化分析或反应用手筛选阻断磷酸化反应的先导分子并将它们用作杀菌/抗微生物化合物，这些化合物可干扰这些信号转导通路并因此而抑制在其控制下的下游靶基因的表达，阻断它们的生理表现如休眠或潜伏(见图1)。
本发明所参考的现有技术
肺结核在全球每年造成超过300万人死亡，在所有由单一感染源引发的死亡中居首位。1998年，印度的结核病病例估计数目为2,078,076例，其中有9,351,34例很可能具有传染性(WHO报告，1998)，上一个治疗肺结核的新化合物的引入距今已过了近40年的时间。
肺结核感染的后果明显是病原体和宿主免疫抵抗之间连续的相互作用的结果。在大多数情况下，被感染的个体产生有效的免疫反应，其在感染位点周围形成肉芽瘤及中止疾病升级的过程中达到顶峰。临床研究表明肉芽瘤内的杆菌并没有被杀死而是保持休眠状态(Grange，1992；Stead，1967；Stead等，1968)，这称为潜伏感染。未接受治疗的自然的TB感染可以导致潜伏感染，潜伏感染可以持续一生，大约10％的潜伏感染会重新活化，而在初始感染后的数月到数年内引起活动期疾病(Stead等，1968)。大量的潜伏感染个体表明在降低肺结核发生率和结核分枝杆菌传播率方面存在着主要的障碍。结核分枝杆菌在传染和发病过程中出现适应，包括在肉芽瘤中的存活时间延长，这可能是通过精确的遗传通路实现的，该通路由宿主组织内特定的生理和环境状况调节。为了设计出新颖且更加直接的预防，控制和治疗肺结核的手段，了解这些通路成为当务之急。
原核生物代谢途径中独特的限速步骤如细胞壁的生物合成和DNA的复制是抗感染药物的传统位点。这些药物在对抗处于缓慢生长和非复制期的细菌时的低活性被认为是采用目前手段要花费很长时间才能根除感染(Parrish等，1998)以及很多时候完全不能根除感染的一个重要原因。我们在对结核分枝杆菌基因组及其代谢通路的认识上的迅速拓展提供了一个针对新的代谢靶点设计药物的空前的机遇。
对于在持久存活中起到关键作用的细菌基因的发现为识别休眠细菌中可作为新类型药物靶点的分子开辟了道路。细菌双组分系统属于这类新靶点(Barrett和Hoch，1998)。抑制这些双组分系统的药物预期将专门针对细菌而对人类没有作用，因为没有报道称后者具有双组分系统。DevR-DevS双组分系统特别是反应调节因子DevR与毒性有关，这使其成为针对结核杆菌的化疗试剂的诱人靶点(Kapur，V.，医学博士毕业论文，2001；Tyagi和Kapur，PCT/IN02/00022)。异柠檬酸裂合酶(McKinney等，2000)，一种甲基转移酶pcaA  (Glickman等，2000)，和双组分系统Rv0981-0982(Zahrt和Deretic，2001)也已证实对结核杆菌的持久存活状态十分关键。这些基因连同其他一些近期发现的靶点如复苏因子(Mukamolova等，1998)，包括8kDa的分泌蛋白及与滕黄微球菌(Micrococcus luteus)复苏因子16kDa蛋白同源的蛋白(Mukamolova等，1998)，为改进肺结核的治疗提供了新途径(Barry等，2000)。
早先报道的涉及休眠/持久存活的一些基因在各种水平得到表征，且确定了一些三维晶体结构。这些基因包括异柠檬酸裂合酶和抗原85B(Armitige等，2000)。根据它们的三维结构晶格，若干个实验室近期正在进行合理性药物设计。但是，对含有一般的双组分系统的和特定的DevR-DevS系统的微生物调节网络级联的功能性分解还没有完成。在此背景下DevR-DevS成为攻击肉芽瘤内的细菌的有力靶点。最近在体外休眠模型中发现氧气局限/组织缺氧能上调双组分系统在结核分枝杆菌，牛分枝杆菌(M.bovis)BCG和耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)中的合成(Tyagi，JS，DST report，2001年10月；Sherman等，2001；Boon等，2001和Mayuri等，2002)。该发现对结核分枝杆菌有着极其重要的意义，因为通常认为组织缺氧的特征是具有环境性质的肉芽瘤，且组织缺氧可能是引起和/或维持休眠应答的引发物。由于DevR在组织缺氧时上调，所以DevR对基因活性的调节很可能是通过其公知的DNA结合能力来实现的，如已知的在其他双组分系统反应调节因子中所发生的一样(Dziejman和Mekalanos，1995)。因此，组织缺氧诱导的且与持久存活有关的一些基因很可能受到DevR-DevS双组分系统的调节。
除了涉及结核分枝杆菌的持久存活和/或休眠应答的候选基因可作为抗肺结核治疗的靶点外，其他一些基因靶点同样表明可作为干扰靶点，因为它们在结核分枝杆菌存活和致病过程中起关键作用(Zhang和Amzel，2002)，其中包括，(i)转录因子如稳定期的σ因子SigB(Doukhan等，1995)、SigF(DeMaio等，1996)、全球表达调节σ因子，SigE和SigH(Manganelli等，2001；Raman等，2001)，(ii)毒性相关因子如RpoV(Collins等，1995)、过氧化氢酶-过氧化物酶，KatG(Wilson等，1995)、复合脂结核菌醇二硬脂酸酯(PDIM)(dimycocerosate)及其转运子mmpL7(Cox等，1999)，(iii)细胞壁合成调节基因如磷脂酰肌醇合成酶(Jackson等，2000)，脂肪酸II型合成酶(Kremer等，1999)和(iv)双组分系统如已证实是结核分枝杆菌存活所必需的MtrA(Zahrt和Deretic，2000)，调节毒性的PhoP/PhoQ和Rv0981/Rv0982(Perez等，2001；Zahrt和Deretic，2001)。除了这些已知的方法外，在结核分枝杆菌中还有很多靶点/基因，根据它们与其他已知的致病微生物基因的同源性，正在对它们进行研究(Zhang和Amzel.，2002)。其他很多抗结核治疗的靶基因主要是那些三维结构已经确定的基因，因此可以将它们有效地用于基于结构的合理性药物设计方法中，例如芳香胺N-乙酰基转移酶-NAT(Upton等，2001)、离子依赖调节因子-IdeR(Pohl等，1999)、抗原85复合体(Ronning等，2000；Anderson等，2001)、离子依赖过氧化物歧化酶-SOD(Zhang等，1991；Cooper等，1995)及其他。尽管抗结核治疗的靶基因数目巨大，但是至今还没有报道任何新的干扰万法。
对现存种类的抗菌试剂进行化学修饰一直是设计新的抗生素的卓有成效的方法，就如发现糖肽能有效对抗抗万古霉素的肠球菌的和活性酮内酯类药物能对抗抗链霉素的肺炎链球菌(S.pneumoniae)一样(Baltch等，1998；Denis等，1999)。使用此法设计出了新的抗结核药物如利福平衍生物，如利福喷丁等。但是，由于对母体药物具有抗性，因此对低效的抗菌药的结构进行不断改变可能只能赋予类似物有限的寿命(Macielag和Goldschmidt，2000)。这进一步使得发展完全新颖的和更新的药物靶点以及发展能有效对抗肺结核的治疗方法成为必需。
理论上十分诱人但还没有进行大量研究的方法是抑制毒性因子和/或调节元件如双组分系统的功能或表达。双组分调节系统作为抗菌药物的新靶点和毒性抑制剂作用的潜在位点逐渐受到越来越多的关注(Barrett和Hoch，1998；Wallis，1999)。
最近双组分系统或传感器激酶或反应调节因子蛋白已用作新药或新化合物的靶点(Macielag和Goldschmidt，2000)。来自各独立实验室包括制药公司的报道提供了各种化合物，已证实这些化合物具有抑制传感器组氨酸激酶磷酸化的潜力，特别是在体外分析中。但迄今为止在发展抗分枝杆菌试剂中还没有尝试使用该方法。
目前描述的绝大多数双组分系统抑制剂能阻断组氨酸传感器激酶组分的自磷酸化。但是，由于缺乏公开的酶动力学数据，对于大多数抑制剂，其准确的作用模式仍然不清楚，因此研究有用的药效团模型很困难。此外，文献中大部分抑制剂是在传感器激酶催化结构域的结构公开之前发现的。
已经证实，通过广谱全体文库(broad-spectrum corporate)的筛选识别的大多数传感器激酶抑制剂是高度疏水的化合物，其中包括异噻唑酮(isothiazolones)(Ulijasz等，1999)、脂肪酸衍生物(Strauch等，1992)、咪唑鎓盐(Roychoudhary等，1993)、酪胺结构部分如环己烯衍生物(Urbanski等，1997)和苯并噁嗪(Frechette等，1997)等。绝大部分被识别的化合物在体外分析中显示出功效，分析中显示出其抑制磷酸化分析的潜力，该分析本身可用于筛选反应/分析。
现有技术的缺陷
识别和发展新的抗结核药物主要基于三个原因：(i)通过缩短整个疗程和/或提供更广范围的间歇性治疗以改进现有治疗，(ii)改进MDR-TB治疗，和(iii)为潜伏的肺结核感染提供更有效的治疗。这些原因总结了现有抗结核治疗中存在的主要缺陷，同时指明了有必要强调的该领域中存在的需要。
肺结核的抗药形式对于在一个群体中成功地实行肺结核控制计划产生了严重威胁。虽然可以使用很多高度有效的药物如异烟肼，利福平，乙胺丁醇和吡嗪酰胺，但是长的治疗周期(标准治疗期为6个月)部分地导致了其可执行性差，进而导致了治疗的失败率高，因此亟需施行DOTS(直接督导下的短程化疗)治疗程序以普遍降低肺结核特别是抗药形式的发生和传播。尽管所有这些含有利福平-异烟肼-吡嗪酰胺的传统给药策略非常有效，但是这三种药的最低抑制浓度(MIC)都非常接近受到毒性限制的血清最高浓度，这导致了每种药的治疗指数不理想。在日常给药过程中这些药的血清浓度可能在MIC上下水平之间波动，这一现象连同病人在非常长的化疗期间较差的执行状况认为与抗药性的出现有直接关系(Mitchison，1998)。因此当前治疗的无效直接导致非常长的疗程和抗药性出现。某些第四代喹诺酮类药物包括加替沙星和levamofloxacin等在体外已经显示出对很多临床的包括结核分枝杆菌在内的分枝杆菌种群有一定程度的有效性，但是这些药同样有其内在缺陷，如在体内环境中的效率有限，严重的副作用，高成本和抗药种群的迅速出现。
因此亟需引入可以有效对抗肺结核的抗药形式和降低化疗疗程和花费的新药。虽然很多以传统药物的靶点为目标的先导化合物正在世界范围内进行测试，但在过去的三十年中市场没有引入任何治疗肺结核的新药。
此外，目前市场上没有任何一种药可用于解决日益严重的潜伏肺结核病的问题。所有用于对抗肺结核的药物均只在疾病活动状态下有效而无法根除潜伏疾病。由于DevR-DevS双组分系统与毒性特别是休眠有关，因此以此为靶点也可以提供解决潜伏肺结核问题的方法。从技术上而言，遗传破坏反应调节因子的基因，DevR-DevS和/或DevR-Rv2027c双组分系统信号转导通路的devR产生减毒株，其可以迅速地从系统中清除且不会引起任何潜伏肺结核病(Kapur，V.，Ph.D.毕业论文，2001；Tyagi和Kapur，PCT/IN02/00022)。因此通过抑制剂破坏DevR-DevS或DevR-Rv2027c信号转导通路会使它们从遗传上遭到破坏，据此进行的常规疗法就会阻止结核杆菌进入休眠期，从而有效地根除结核杆菌。
将双组分系统用于筛选抑制剂已经产生了很多在体外分析系统中显示出抑制传感器激酶自磷酸化反应的潜力的抑制剂分子。但是，所有的已被识别的细菌双组分系统抑制剂和化合物都存在着极端疏水性的缺陷。这些分子的高度疏水性使得准备和释放化合物变得极端困难。此外，化合物显示出很低的生物利用性且与血浆蛋白过量结合，因此，这些化合物在体内感染模型中没有效果。
设计苯并噁嗪(Frechette等，1997)以改进疏水/亲水之间的平衡和提高抑制剂的体内活性。虽然这些化合物显示出好的抗菌活性，但是它们同样存在过量结合蛋白的问题，因而阻碍了对体内功效的验证。由Hoch等(1998)识别的一系列传感器激酶抑制剂包括已确定的抗蠕虫化合物氯氰碘柳胺(Closantel)和RWJ-49815A，体外分析证明这些化合物会导致传感器激酶分子的非特异性聚集，而不会抑制磷酸化反应(Stephenson等，2000)。Parke-Davis Pharma识别的一系列双酚类似物可抑制NRII自磷酸化，在全细胞分析中抑制由双组分系统NRII/NRI等介导的功能性反应(Domagala等，1998)，并且在高浓度下具有杀菌作用。但是，细胞死亡机制显示是细胞膜破碎，其导致高分子合成完全中止。这些化合物同样因为过量的血浆蛋白结合能力而在体内无效。到目前为止，所有已识别的组氨酸传感器激酶自磷酸化的抑制剂均被证明是疏水化合物，因此通常很难在体内保护研究中设计足够量的配方。在所有测试中，这些化合物极可能由于过量的血清蛋白结合而在小鼠感染模型中均不能起到保护作用。
卤化苯基异噻唑酮(Halophenylisothiazolones)可以在重组的VanS/VanR信号转导通路中抑制磷酸根从组氨酸蛋白激酶转移到反应调节因子，该重组通路由膜制备的VanS激酶和纯化的VanR组成(Ulijasz和Weisblum，1999)。力学研究证明该化合物抑制VanR受体活性而不抑制VanS～P供体活性。由于抑制在抑制剂的浓度较高的情况下才能发生(ED50＝0.35mM)，因此这可能造成与已报道的作用机制的差别。但是，已经证实异噻唑类物质衍生物在上述的体内实验中无效。
据报道，在凝胶迁移率变动分析中，咪唑类化合物在～150μM的浓度下可抑制反应调节因子AlgR1与其上游区域/探针algD的结合(Roychoudhary等，1993)。据称化合物是algD启动子转录的专一抑制剂而不是DNA-蛋白质相互作用的非特异性抑制剂，因为其在CatR和catBC框的结合中缺乏抑制活性。然而，如上所述，咪唑衍生物和类似物明显地对组氨酸蛋白激酶自磷酸化具有普遍的作用，而在体内保护分析中完全无效。
一般而言，这类试剂中的大部分存在选择性低，蛋白质结合过量或生物利用性有限的问题。
采用本发明如何克服这些缺陷
如上所述，目前急需识别新的药物靶点以发展能够有效治疗对现有药物治疗具有抗性的肺结核病的新药物。此外，相比于作用于活跃复制的细菌的目前药物，对能够治疗慢性的/潜伏形式的肺结核的有效药物存在巨大的需求。
Jaya S.Tyagi博士实验室的早期报道表明devR基因更可能与慢性感染过程相关而不与人体单核细胞或早期感染事件中的生长本身相关。据观察，在豚鼠中，和野生型菌株H37Rv相比，突变型菌株在实验条件下不会引起严重的进行性疾病和病理(Kapur，V.，Ph.D.毕业论文，2001年2月，Tyagi和Kapur，PCT/IN02/00022)。
由于DevR蛋白属于调节蛋白的反应调节因子类，因此可能该蛋白负责结核杆菌对宿主敌对环境的适应。双组分系统调节网络通过磷酸化通路行使功能，其中DevS组氨酸传感器激酶蛋白感受环境提示/刺激并产生应答而在其保守的His395残基发生自磷酸化。磷酸化的DevS通过磷酸转移事件将磷酸基团转移至DevR蛋白的保守残基Asp54。可能诱导DevR的蛋白结构发生变化的可能磷酸化很可会能改变其DNA结合能力，从而调节在其控制下的基因的表达。已知这种双组分系统能对缺氧作出响应(Boon等，2001；Sherman等，2001；Mayuri等，2002)，关键因子与持久存活有关，且还表明该系统实际上与结核杆菌的毒性有关(Kapur，V.，Ph.D.毕业论文，2001年2月；Tyagi和Kapur，PCT/IN02/00022)。因此该系统提供了全新靶点以生产对抗位于肉芽瘤中的杆菌的药物。可以预见，使诸如DevR-DevS和DevR-Rv2027c的调节系统丧失功能将导致由这些系统调节的细菌通路在对组织缺氧或其他毒性/病理相关信号应答中失活。在此描述的研究提供了方案及生化分析，可用于筛选针对这些通路/系统的抑制剂分子/化合物/药物，从而导致系统的功能性失活(图1)。
鉴于从全体化合物文库中筛出的双组分系统抑制剂存在的缺陷，许多替换手段可用于识别和设计双组分系统的抑制剂。许多小组建议根据传感器激酶的胞质结构域的X-ray或NMR结构采用合理性药物设计和筛选方法并结合计算机应用进行抑制剂的从头设计和筛选(Inouye美国专利申请#6162627)。此外，除了针对最明显的磷酸化反应筛选抑制剂外，抑制剂的筛选可针对双组分系统磷酸化通路中的其他位点进行，比如(i)传感器激酶二聚作用结构域，(ii)传感器激酶的感应结构域，(iii)传感器激酶和反应调节因子的相互作用界面，和(iv)反应调节因子-DNA相互作用界面，该项筛选只有在对各参与蛋白质的催化活性有细节性了解的基础上才可能实现，这正是本申请的核心部分。
除了采用改进的选择或筛选手段，在高通量分析中，天然产物文库或组合肽文库也可以在高通量分析中用作双组分系统新抑制剂的来源。一旦在高通量筛选中确定一个先导“候选”分子，该分子应进一步在同样以高通量形式进行的全细胞分析中进行筛选。
尽管DevR-DevS或Rv2027c-DevR双组分系统提供了独特的调节系统，可作为发展新颖的抗微生物/抗菌/抗结核化合物的靶点，然而通过利用DevR模型结构的合理性药物设计方法或将突变蛋白用于筛选步骤中肽文库的筛选设置，运用新颖重折叠筛选和特定的突变蛋白同样为有效的筛选有力的抑制剂提供了途径。
本发明的目的
本发明的主要目的是设计一组筛选方法以制备对抗含有双组分系统DevR-DevS和/或DevR-Rv2027c及其同源体的致病微生物的药物。
本发明的另一个目的是设计筛选方法以制备具有活性的药物，该活性选自抗生素活性、抗菌活性、抗微生物活性和抗结核活性。
本发明的另一个目的是设计有助于识别抗肺结核药物、抗分枝杆菌药物和对抗由细菌引起的疾病如肺炎、百日咳、李氏杆菌病、肠道细菌疾病、霍乱等的药物的方法。
本发明的另一个目的是设计治疗由含有双组分系统DevR-DevS和/或DevR-2027c或同源体的致病微生物引起的疾病的方法。
本发明的另一个目的是设计用于控制由含有双组分系统DevR-DevS和/或DevR-2027c或同源体的致病微生物引起的疾病病情的组合物，所述组合物含有药物以及药物学上可接受的添加剂，该药物可选自溴化乙锭(EtBr)、溴酚蓝(BPB)、2-巯基苯并咪唑(2-MBI)、2-苯基苯并咪唑及它们的活性衍生物。
本发明的概述
本发明涉及一组筛选方法用以制备药物来对抗含有双组分系统DevR-DevS和/或DevR-Rv2027c及其同源体的致病微生物，以及治疗方法。
本发明的具体描述
相应地，本发明涉及一组基于SDS-PAGE的用以鉴别对抗含有双组分系统DevR-DevS和/或DevR-Rv2027c及其同源体的分枝杆菌的药物的高通量检测方法，所述方法包括步骤：过量表达DevR、DevS和Rv2027c及它们的单结构域衍生物和突变变体蛋白；分别将DevS和Rv2027c蛋白自磷酸化及此后在待测化合物存在的情况下以SDS-PAGE或高通量的形式将磷酸基团转移至DevR并分析反应产物；及测定待测化合物的药物潜力，其中该药物潜力反比于(i)DevS和Rv2027c蛋白的自磷酸化程度，(ii)DevR及其单结构域衍生物基于磷酸转移的去磷酸化程度，和(iii)磷酸化DevS和Rv2027c及其单结构域衍生物的去磷酸化程度。
本发明涉及用于鉴别和制备有效对抗肺结核的治疗形式和药物的方法以及运用信号转导系统DevR-DevS和DevR-Rv2027c作为抗结核治疗的靶点来进行抗肺结核治疗的方法。本发明详细公开了前述双组分系统的特征性磷酸化反应的具体分析和用于大批量筛选对抗所述磷酸化通路/反应的抑制剂/化合物的高通量形式的检测系统。本发明还描述了突变和/或缺陷型蛋白质在筛选这些磷酸化通路的抑制剂中的全新应用。本发明还揭示了能够抑制这些磷酸化通路特别是抑制传感器激酶自磷酸化的抑制剂的特征。
本专利描述的发明第一次在涉及各蛋白磷酸化的生化水平上为DevR-DevS双组分系统以及Rv2027c和DevR之间交叉对话/交叉沟通的真实本质提供了证据。DevR-DevS双组分系统是涉及结核分枝杆菌毒性的双组分系统的第三个例子，另外两个已报道的在结核分枝杆菌的毒性中产生作用的双组分系统是Rv0981-0982(Zahrt和Deretic，2001)和phoP-phoQ(Perez等，2001)。由于组织缺氧认为是DevR-DevS双组分系统的关键信号，因此认为在潜伏感染中该系统是结核杆菌的独特特征就显得十分合理。此外，涉及毒性的其他双组分系统还需要在生化水平上进行描述，因此目前还不能将其用于生化筛选程序筛选先导分子。
可以合理地推断，由组织缺氧诱导的一个/多个基因的表达受到DevR-DevS系统的调节，该系统进而调节分枝杆菌的休眠和毒性。因此，该发明提供了纯化DevR、DevS和Rv2027c的活性蛋白的方法以及筛选新的抗微生物/细菌药物/化合物/分子的方法，它们通过阻碍DevR和DevS/Rv2027c的活性从而能够有效地干扰一个或多个受DevR调控的与细菌/分枝杆菌的存活和休眠相关的基因产物的活性，从而破坏分枝杆菌的休眠(本申请中提供了其特定实施例)。因此，DevR-DevS/Rv2027c-DevR双组分系统为干扰宿主体内分枝杆菌的生命周期提供了非常独特的位点。
本发明中将DevR-DevS(Rv3133c-Rv3132c)和DevR-Rv2027c信号转导通路作为靶点用于治疗由分枝杆菌生物体引起的疾病，分枝杆菌包括所有形式的结核分枝杆菌和其他含有双组分系统的分枝杆菌。本发明进一步包含了将这些蛋白作为模式用以筛选以信号转导通路为靶点的抗菌的、抗分枝杆菌的、杀菌的和/或抑制细菌的药物和/或化合物。同时还提供了一些证明分析实用性的实施例。
双组分信号转导系统是感觉系统的最基本形式，该系统涉及对环境信号的直接反应，如对压力[氧压、pH、渗透压摩尔浓度]，营养缺乏，暴露于化学药品、毒素等的直接反应。双组分系统包含一个基本的感觉系统，该感觉系统由一跨膜传感器组氨酸激酶组成，该激酶感受环境刺激并以ATP依赖的方式在其保守的组氨酸残基发生自磷酸化(图1)。磷酸化的组氨酸传感器激酶将其磷酸基团转移至反应调节因子蛋白的保守的天冬氨酸残基上，该蛋白为双组分系统中的另一半，据推测该蛋白具有依赖于其保守的螺旋-转角-螺旋基序的DNA结合能力。反应调节因子蛋白的磷酸化状态能够改变其DNA结合能力及由此开启和关闭在其调节控制下的基因的表达(Parkinson和Kofoid，1992；Stock等，2000)。
结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组全序列表明存在11个完整的双组分系统的编码基因及7个孤儿传感器激酶和反应调节因子蛋白的潜在编码基因(Cole等，1998)。在这些系统中只有4个系统在生化水平上得到表征，其中包括DevR-DevS(本专利申请)、DevR-Rv2027c(本专利申请)、SenX3-RegX3(Himpens等，2000)和TrcS-TrcR(Haydel等，1999)。已经表明，DevR-DevS(Rv3133c-Rv3132c)双组分系统依赖于其基因表达的组织缺氧反应模式在氧气局限时起到调节作用(Kapur，V.，Ph.D.毕业论文，2001；Tyagi和Kapur，PCT/IN02/00022；Boon等，2001；Sherman等，2001)。由于组织缺氧被假定是启动肉芽瘤内的分枝杆菌的休眠的引发物，因此DevR-DevS系统是调节休眠的可能的候选系统。根据积累的关于该双组分系统在结核分枝杆菌毒性中所起作用的实验证据，该系统是抗生素作用靶点的合适选择，抗生素抑制该系统的公知功能并，从而根除/杀死该结核杆菌。为了筛选该双组分系统的抑制剂，在生化水平上构建了DevR-DevS和DevR-Rv2027c(与DevS有极高同源性的孤儿传感器激酶)的磷酸化通路。
在本发明的具体实施方案中，提供了一组基于SDS-PAGE用于鉴别对抗含有双组分系统DevR-DevS和/或DevR-Rv2027c的分枝杆菌的药物的高通量分析方法，所述方法的包括步骤：过量表达DevR、DevS和Rv2027c及它们的单结构域衍生物和突变变体蛋白；分别将DevS和Rv2027c蛋白自磷酸化及此后在待测化合物存在的情况下以SDS-PAGE或高通量的形式将磷酸基团转移至DevR并分析反应产物；及测定待测化合物的药物潜力，其中该药物潜力反比于(i)DevS和Rv2027c蛋白的自磷酸化程度，(ii)DevR及其单结构域衍生物基于磷酸转移的去磷酸化程度，和(iii)磷酸化DevS和Rv2027c及其单结构域衍生物的去磷酸化程度。
在本发明的另一具体实施方案中，DevS衍生物选自DevS201、DevS578、DevS201-H395Q、DevS201-H397Q、DevS201-H397A和DevS201-N503D。
在本发明的另一具体实施方案中，Rv2027c衍生物选自Rv2027194和Rv2027194-H392Q。
在本发明的另一具体实施方案中，其中的DevR衍生物为DevRN145同时还包括突变蛋白DevR-D8N、DevR-D9N、DevR-D54V、DevR-D54N和DevR-K104E。
在本发明的另一具体实施方案中，其中的蛋白在大肠杆菌(E.coli)中过量表达。
在本发明的另一具体实施方案中，其中的待测化合物显示的活性选自抗生素活性、抗菌活性、抗微生物活性和抗结核活性。
在本发明的另一具体实施方案中，其中所述的方法有助于鉴定抗肺结核药物、抗分枝杆菌药物和对抗由细菌引起的疾病的药物，如肺炎、百日咳、李氏杆菌病、肠道细菌疾病、霍乱等。
本发明的另一具体实施方案，其中涉及溴酚蓝(BPB)或其衍生物用于由含有双组分系统DevR-DevS和/或DevR-2027c的致病微生物引起的疾病的用途，所述用途包括对需要的个体用药学上有效量的作为DevR、DevS和Rv2027c及它们的单个结构域衍生物和突变变体蛋白的磷酸化反应抑制剂的溴酚蓝(BPB)或其衍生物给药，可选择地伴随药学上有效的添加剂。
本发明的另一具体实施方案，其中BPB显示的对DevS/Rv2027c活性50％抑制(IC50)的浓度范围在1.3和2.0mM之间。
本发明的另一具体实施方案，其中的添加剂选自硬脂酸镁、纤维素、碳酸钙、淀粉凝胶贴、云母、载体、赋形剂和稀释液。
本发明的另一具体实施方案，其中的化合物以口服、吸入、或灌输给药。
本发明的另一具体实施方案，其中所述化合物的物理状态选自胶囊、片剂、糖浆、浓缩剂、粉剂、颗粒、气雾剂、和珠状剂。
本发明的另一具体实施方案，其中所述方法使用所述组合物对健康没有任何不良影响。
用于控制由含有双组分系统DevR-DevS和/或DevR-2027c或同源体的致病微生物引起的疾病病情的组合物，所述组合物含有药物以及药学上可接受的添加剂，该药物可选自溴化乙锭(EtBr)、溴酚蓝(BPB)、2-巯基苯并咪唑(2-MBI)、2-苯基苯并咪唑及它们的活性衍生物。
本发明进一步的具体实施方案，其中的添加剂选自硬脂酸镁、纤维素、碳酸钙、淀粉凝胶贴、云母、载体、赋形剂和稀释液。
本发明的另一具体实施方案，其中药物和添加剂的比例范围在1∶10到10∶1之间。
本发明的另一具体实施方案，其中的化合物以口服、吸入、或灌输给药。
本发明的另一具体实施方案，其中所述化合物的物理状态选自胶囊、片剂、糖浆、浓缩剂、粉剂、颗粒、气雾剂、和珠状剂。
本发明表格的简要说明
表1.本研究中所用质粒和用于本研究的单结构域衍生物和DevR、DevS201和2027194蛋白的氨基酸替换突变体的列表。
本发明附图的简要说明
图1.双组分信号转导系统及潜在可阻断位点的示意图。1.组氨酸传感器激酶DevS或Rv2027c发现刺激。2.组氨酸传感器激酶自磷酸化。3.反应调节因子蛋白DevR被磷酸化的传感器激酶磷酸化。4.DevR与其专一的DNA靶点结合。本专利申请包含了对步骤2和3的分析。[DevS和Rv2027c中的跨膜螺旋由www.expasy.org的TMpred分析预测。根据预测，这些蛋白与细胞膜有联结]；
图2.结核分枝杆菌DevR、DevRN145、DevS和Rv2027c蛋白的特征及突变蛋白中的氨基酸替换。超量表达蛋白N末端的白框代表His6-tag，H-T-H代表根据Interpro扫描(www.expasy.org)预测的存在于DevR C末端结构域的螺旋-转角-螺旋基序。TM1、2和3指由TMpred(www.expasy.org)预测的跨膜结构域。阴影框H、N、D/G1和G2标明传感器组氨酸激酶中的保守序列基序。数字8、9等代表各蛋白中的氨基酸编号。DevRN145指DevR反应调节因子中长度为145个氨基酸的有催化活性的N末端区域。DevS201指DevS传感器激酶中长度为201个氨基酸的有催化活性的胞质区域。DevS578指全长为578个氨基酸的DevS传感器激酶。Rv2027194指Rv2027c传感器激酶中长度为194个氨基酸的有催化活性的胞质区域。[下标代表在重组质粒中结核分枝杆菌的氨基酸残基的数目]；
图3.用于本研究的His6tagged融合蛋白的基质辅助纯化及基于氧化还原的重折叠的流程图；
图4.大肠杆菌中超量表达蛋白质的SDS-PAGE分析。泳道1、6、9和12，带有DevR、DevS201、DevS578和Rv2027194重组表达载体的E.coli细胞未诱导的溶解产物；泳道2、7、10和13，诱导的E.coli溶解产物；泳道3、4、8、11和15，纯化的蛋白DevR、DevRN145、DevS201、DevS578和Rv2027194及泳道5和14，蛋白质分子量标记；
图5.传感器激酶蛋白质的时间依赖的自磷酸化。DevS201和Rv2027194带有[γ32P]ATP。将纯化的蛋白(15μM的DevS201或Rv2027194或5μM的DevS578)置于所述的反应缓冲液中，在指定的时间点取样(以小时计)，样品中加入中止缓冲液置于冰上，并用SDS-PAGE分析。将对应于标记蛋白的凝胶片断切下，用液体闪烁计数法对标记蛋白的含量定量。A.DevS201B.DevS578C.Rv2027194自磷酸化反应的特征性描述；
图6.A.DevS201～32P的稳定性。按所述方法制备DevS201～32P，将其置于25℃，将没有结合的[γ32P]ATP通过10kDa的MWCO Nanosep设备从反应混合液中过滤去除后，在指定的不同的时间点分析其稳定性。B.DevS578～32P的稳定性。按所述方法制备DevS578～32P，稳定性分析基本按照DevS201的方法进行。C.Rv2027194～32P的稳定性。反应基本按照DevS201的方法进行(见上)；
图7.自磷酸化反应对离子的需求。A.DevS201(15μM)在含有所述特定二价阳离子的反应缓冲液中通过[γ32P]ATP自磷酸化。泳道1，MgCl2；泳道2，MnCl2；泳道3，CaCl2；泳道4，CoCl2；泳道5，EDTA；泳道6，MgSO4；泳道7，NiSO4；泳道8，CuSO4和泳道9，ZnSO4，均为25mM。B.DevS578(5μM)在含有所述特定二价阳离子的反应缓冲液中通过[γ32P]ATP自磷酸化。泳道1，MnCl2；泳道2，MgCl2；泳道3，CaCl2；泳道4，CoCl2；泳道5，EDTA；泳道6，MgSO4；泳道7，NiSO4；泳道8，CuSO4；泳道9，ZnSO4和泳道10，HgSO4，均为25mM。C.Rv2027194(15μM)在含有所述特定二价阳离子的反应缓冲液中通过[γ32P]ATP自磷酸化。泳道1，MgCl2；泳道2，MnCl2；泳道3，CaCl2；泳道4，CoCl2；泳道5，EDTA，均为25mM；
图8.A.DevS201突变蛋白的磷酸化反应。DevS201蛋白及其突变体如所述发生磷酸化。下方的图显示了以上蛋白的SDS-PAGE的考马斯染色模式。B.Rv2027194突变蛋白的磷酸化反应。Rv2027194蛋白及其突变体如所述发生磷酸化。下方的图显示了以上蛋白的SDS-PAGE的考马斯染色模式。C.DevS201～P、Rv2027194～P和DevR～P的化学稳定性。DevS201～32P、Rv2027194～32P和DevR～32P按所述方法制备。产物用2％SDS稳定，加入测试试剂，将试管在37℃放置30分钟。样品用Tris中和后用SDS-PAGE分析。泳道1，只含有2％SDS的对照；泳道2，加入1N HCl；泳道3，加入0.1N HCl；泳道4，加入1N NaOH和泳道5，加入0.1N NaOH；
图9.A.从DevS201～P至DevR的磷酸转移。DevS201～32P按所述方法制备，在DevS201～32P中以3∶4DevS201∶DevR的摩尔比加入DevR，将试管置于25℃。样品按指定方法收集，与中止缓冲液混合并用SDS-PAGE分析。B.从DevS578～P至DevR的磷酸转移。DevS578～32P按所述方法制备，在DevS578～32P中以1∶4DevS578∶DevR的摩尔比加入DevR，将试管置于25℃。样品按指定方法收集，与中止缓冲液混合并用SDS-PAGE分析。C.从Rv2027194～P至DevR的磷酸转移。Rv2027194～32P按所述方法制备，在Rv2027194～32P中以3∶4Rv2027194∶DevR的摩尔比加入DevR，将试管置于25℃。样品按指定方法收集，与中止缓冲液混合并用SDS-PAGE分析。D.从DevS201～P至DevRN145的磷酸转移。DevS201～32P按所述方法制备，在DevS201～32P中以3∶4DevS201∶DevRN145的摩尔比加入DevRN145，将试管置于25℃。样品按指定方法收集，与中止缓冲液混合并用SDS-PAGE分析。E.从Rv2027194～P至DevRN145的磷酸转移。Rv2027194～32P按所述方法制备，在Rv2027194～32P中以3∶4Rv2027194∶DevRN145的摩尔比加入DevRN145，将试管置于25℃。样品按指定方法收集，与中止缓冲液混合并用SDS-PAGE分析。F.从DevS201～P至DevR的镁离子依赖性磷酸转移。DevS201～32P按所述方法制备，通过10k Nanosep装置过滤及洗涤去除MgCl2和ATP。按照说明加入DevR(20μM)和Mg2+，将试管放置3分钟；
图10.A.DevS201和DevR突变蛋白之间的磷酸转移反应。DevS201～32P按所述方法制备并与不同突变体共同放置3分钟后进行分析。泳道1，单独的DevS201～32P；泳道2，DevR-D54V；泳道3，DevR-K104E；泳道4，DevR-D8N；泳道5，DevR-D9N；泳道6，野生型DevR。下方的图显示了上述蛋白的SDS-PAGE图的考马斯染色模式。B.DevS578和DevR突变蛋白之间的磷酸转移反应。DevS578～32P按所述方法制备并与不同DevR突变蛋白在25℃共同放置3分钟。样品用中止缓冲液中止后用SDS-PAGE分析。泳道1，不含DevR；泳道2，野生型DevR；泳道3，DevR-D54N；泳道4，DevR-D9N；泳道5，DevR-D54V；泳道6，DevR-D8N和泳道7，DevR-K104E；
图11.预测的结核分枝杆菌DevR蛋白3-D结构。DevR的3D结构根据E.coli中的反应调节因子蛋白NarL的结构模板和坐标(Baikalov等，1996)(PDB accession no.1A04)，用公共服务器www.expasy.ch上的“Swiss-Model”软件进行模拟。Asp54，磷酸化残基，Asp8和Asp9，二价阳离子结合位点，Glu11，邻近酸性氨基酸残基(在Asp9突变中参与Mg+2的结合)，保守的Thr82purple和不变的Lys104，用球棒形式呈现。图中标明了组成H-T-H基序的两个α螺旋(α9和α10)；
图12.高通量分析中自磷酸化反应的传感器激酶的优选浓度。A.DevS201和B.Rv2027194。反应基本依据在具体描述中揭示的方法进行。不同量的各蛋白在10μl反应体积中磷酸化，如所述方法过滤和洗涤，残留的Cpm±SD以蛋白浓度的函数形式描点作图。每个实验重复3次；
图13.传感器激酶在高通量分析中自磷酸化反应所需MgCl2的优选浓度。A.DevS201和B.Rv2027194。反应基本依据在具体描述中揭示的方法进行。在反应混合物中加入不同量的MgCl2，混合物中各蛋白的浓度为其优选浓度(30μM的DevS201和21μM的Rv2027194蛋白)；蛋白在10μl反应体积中磷酸化，如所述方法过滤和洗涤，残留的Cpm±SD以MgCl2浓度的函数形式描点作图。每个实验重复3次；
图14.高通量分析中传感器激酶去磷酸化反应的DevR优选浓度。磷酸转移通过A.DevS201和B.Rv2027194。传感器激酶的自磷酸化按上述方法进行。为此，30μM的DevS201和21μM的Rv2027194蛋白在分别含有25mM和1mM MgCl2(优选浓度)的10μl反应体积中进行60分钟的磷酸化反应。随后，将不同量的DevR蛋白(按说明)加入到自磷酸化反应混合物中在25℃放置20分钟。此后反应物如所述方法过滤和洗涤，残留的Cpm±SD以DevR浓度的函数形式描点作图。每个实验重复3次；
图15.在高通量分析中与反应调节因子蛋白DevR磷酸发生转移反应后传感器激酶的去磷酸化。反应基本依据在具体描述中揭示的方法进行。将DevR(16μM)加入到含有磷酸化的30μM DevS201和21μM Rv2027194蛋白的反应混合物中，10ml反应体积中含有25mM MgCl2，反应终产物在室温继续放置20分钟以促进磷酸转移和随后的去磷酸化。之后反应物如所述方法过滤和洗涤，残留的Cpm±SD以磷酸化反应本质(自磷酸化vs磷酸转移)的函数形式描点作图。每个实验重复3次；
图16.不同的候选化合物对传感器激酶DevS201自磷酸化的抑制。自磷酸化反应产物SDS-PAGE的放射自显影图。泳道1，左旋咪唑；泳道2，叶酸；泳道3，甘酰甘酰甘氨酸；泳道4，EGTA；泳道5，溴酚蓝；泳道6，HABA；泳道7，溴化乙锭；泳道8，抗-DevS抗体(1μl)；泳道9，无化合物。简要地，将所述所有化合物(1mM终浓度)加入到含有12μMDevS201而不合ATP的反应缓冲液中在室温放置30分钟，此后加入[γ32P]ATP和冷的ATP起始反应。反应物在25℃放置60分钟后用前述方法在凝胶上分析；
图17.BPB对DevS201和Rv2027194自磷酸化浓度依赖性抑制。本分析基本按前述方法以高通量形式重复三次。残留的Cpm±SD以反应中BPB浓度的函数形式描点作图。A.DevS201的抑制图B.DevS201自磷酸化反应产物的SDS-PAGE放射自显影图。反应中的BPB浓度为泳道1，1mM；泳道2，0.5mM；泳道3，0.1mM；泳道4，0.01mM和泳道5，无抑制剂。下方的图是SDS-PAGE考马斯染色图，其中显示BPB的加入没有引起传感器激酶的聚集。C.Rv2027194的抑制图D.Rv2027194自磷酸化反应产物的SDS-PAGE放射自显影图。反应中的BPB浓度为泳道1，1mM；泳道2，0.5mM；泳道3，0.1mM；泳道4，0.01mM和泳道5，无抑制剂。下方的图是SDS-PAGE考马斯染色图，其中显示BPB的加入没有引起传感器激酶的聚集；
图18.EtBr对DevS201和Rv2027194自磷酸化浓度依赖性抑制。本分析基本按前述方法以高通量形式重复三次。残留的Cpm±SD以反应中EtBr浓度的函数形式描点作图。A.DevS201的抑制图B.DevS201自磷酸化反应产物的SDS-PAGE放射自显影图。反应中的EtBr浓度为泳道1，1mM；泳道2，0.5mM；泳道3，0.1mM；泳道4，0.01mM和泳道5，无抑制剂。下方的图是SDS-PAGE考马斯染色图，其中显示EtBr的加入没有引起传感器激酶的聚集。C.Rv2027194的抑制图D.反应中的EtBr浓度为泳道1，1mM；泳道2，0.5mM；泳道3，0.1mM；泳道4，0.01mM和泳道5，无抑制剂。下方的图是SDS-PAGE考马斯染色图，其中显示EtBr的加入没有引起传感器激酶的聚集；
图19.2-巯基苯并咪唑(2-MBI)对DevS201和Rv2027194自磷酸化浓度依赖性抑制。本分析基本按前述方法以高通量形式重复三次。残留的Cpm±SD以反应中2-MBI浓度的函数形式描点作图。A.DevS201的抑制图B.Rv2027194的抑制图。
被公认的Rv2027c蛋白与DevS蛋白有62.5％的一致性，其中包含组氨酸激酶典型的H、N、D/G1和G2框。因此推断Rv2027c是潜在的孤儿传感器激酶，其可以表达、自磷酸化并随后参与到DevR蛋白的磷酸转移过程中。经测试确认该假说可在体外发生(本专利中请)。
已经表明磷酸化分析可用于筛选先导分子或抑制剂以阻断磷酸化反应及识别杀菌/抗微生物/抗结核化合物以干扰信号转导过程进而抑制其控制下的下游靶基因的表达(见图1)。
发展的当前阶段(包括操作/生产、确认、质量等的范围)。
通过结核分枝杆菌毒性菌株H37Rv和非毒性菌株H37Ra的消减杂交分析鉴别了devR-devS双组分信号转导系统(Kinger和Tyagi，1993)。通过测定组成所有双组分系统网络(本专利)的各蛋白的磷酸化潜力，双组分系统的真实本质在蛋白质水平上得以证实。Rv2027c-DevR通路的生化功能也得到验证。DevR、DevS和Rv2027c蛋白已在大肠杆菌中得到过量表达、体外纯化和重折叠。重折叠的蛋白已用于体外磷酸化分析，即组氨酸传感器激酶DevS和Rv2027c的自磷酸化和将磷酸基团从磷酸化的传感器(DevS/Rv2027c)到DevR的磷酸转移。成功的在生化水平上重新构建这些双组分系统为发展快速的高通量分析从化合物/药物文库中筛选先导分子以干扰信号转导通路提供了途径。除了运用前面提及的分析中用到的全长DevS和DevR蛋白外，传感器激酶C末端单结构域催化活性部分即DevS201和Rv2027194以及反应调节因子蛋白的N末端单结构域催化活性部分——DevRN145亦得到生化检验并证明其和全长母蛋白同样地具有催化活性。这也证明前面提及和陈述的双组分系统中的单结构域蛋白具有用作本专利筛选程序的工具/靶点的潜力。
高通量分析已设计用于筛选双组分信号转导通路即传感器激酶DevS/Rv2027c和反应调节因子DevR中的参与体的磷酸化反应的抑制剂，并提供了快速筛选化合物文库的途径。此外，各特定的磷酸化缺陷蛋白的运用为我们筛除错误先导分子并进而更有效和科学地研究抑制剂的动力学提供了途径。在此还提供了一些实施例以说明这些分析在筛选抑制剂中的效用。
本发明的实用性
肺结核作为单一传染源在全球引起的死亡数超过其他所有传染源的总和。世界人口中的大多数可能没有遭受活动期疾病的伤害但据估计是疾病的携带者。活动期疾病主要是病原体和宿主免疫防御系统之间复杂的相互作用的结果。在大多数病例中，疾病进程会停滞，杆菌在重新活化引发临床疾病之前的很长一段时间在宿主体内处于休眠状态，该状况称作潜伏感染，其中肉芽瘤在感染位点周围形成，疾病进程停滞。临床上的这些肉芽瘤不包含死的生物体，但是储备了休眠的杆菌，它们重新活化后完全能够引发全面性的疾病(Grange，1992；Stead等，1968)。
大约10％的潜伏感染会重新活化，导致在初始干扰后的数月至数年内发生活动期传染病(Stead，1967)。长期以来结核杆菌的适应性休眠被认为与肉芽瘤中的组织缺氧，低pH和/或营养限制相关联。最近有报道证明组织缺氧可诱导双组分系统devR-devS的表达(Kapur，V.，Ph.D.毕业论文，2001；Tyagi和Kapur，PCT/IN02/00022；Sherman等，2001；Boon等，2001)。
功能性敲除devR的结核分枝杆菌H37Rv菌株(由J.S.Tyagi博士的实验室构建)的毒性减轻，在受感染豚鼠的肝和肺中的致病性最小。在注射了突变菌株的豚鼠的脾中，得以恢复的活杆菌的数目降低了将近1000倍，这表明突变体在诸如脾的二级感染位点不能自身建立或被迅速地清除，指明了该系统对建立持久感染的重要性(Kapur，V.，Ph.D.毕业论文，2001；Tyagi和Kapur，PCT/IN02/00022)。结核分枝杆菌的持久存活中还涉及其他的一些基因即katG、acr、icl、pca、sigF等，它们可作为对抗持久/潜伏杆菌的药物的潜在靶点(Chen等，2000；Glickman等，2000；Li等，1998；McKinney等，2000；Weber等，2000；Yuan等，1998)。
由于DevR-DevS双组分系统属于调节蛋白家族，因此可以推测在潜伏/持久存活中的一个或几个基因受到DevR-DevS系统的调节。尽管靶基因还没有得到识别，但是对组织缺氧中活化的调节系统进行抑制为抑制组织缺氧过程中诱导的多重基因的表达提供了方法，这些基因包括可能在肉芽瘤中上调的基因。该双组分系统的功能性重建对确认该系统的功能性本质十分重要。在蛋白质水平对信号转导通路的证实为快速筛选抑制性化合物以在多个步骤(1到4，见图1)干扰信号转导磷酸化通路提供了平台。
结核分枝杆菌基因组序列揭示了基因组中存在的一个孤儿传感器激酶——Rv2027c。DevS和Rv2027c蛋白之间存在看高度的序列同源性(62.5％一致性)(Dasgupta等，2000)。因此Rv2027c可能作为DevR蛋白的传感器激酶。进行交互对话研究，证实其可在体外发生，这表明Rv2027c-DevR与DevR-DevS系统可用作抗感染治疗的靶点。
传统药物以细菌生长和分裂中的通路为靶点如细胞壁生物合成和DNA复制。它们对于慢速生长和非复制期细菌的低活性被认为是目前所用策略需要花费很长时间来根除感染(Parrish等，1998)且常常不能彻底清除细菌的一个重要原因。发现细菌基因在持久存活中(见上)起关键作用为鉴别在休眠细菌中可作为新类药物靶点的分子铺平了道路。DevR与毒性的关系使其成为具吸引力的靶点以制备针对结核杆菌的化疗试剂。
在体外休眠模型中，氧气局限/组织缺氧上调了DevR-DevS双组分系统在牛分枝杆菌BCG、结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌中的合成(Tyagi，J.S.，DST report，October，2001；Boon等，2001；Sherman等，2001和Mayuri等，2002)。该发现对结核分枝杆菌有着关键的意义，因为组织缺氧经常被认为是肉芽瘤特征性的环境性质并且极可能是起始和/或维持休眠反应的引发物。DevR对基因活性的调节可能是通过其公认的DNA结合能力实现的，正如已知的在其他细菌双组分系统中发生的一样(Dziejman和Mekalanos，1995)。鉴别受DevR调控的靶基因以及组织缺氧在DevR活性调节中的作用的实验目前正在进行。
目前急需可以用于对抗病原体的抗药形式和治疗慢性肺结核的新抗肺结核药物。Pathogenesis公司(美国)最近宣布属于双环硝基咪唑并呋喃(nitroimidazofuran)化合物家族的化合物PA-824如果被批准，将成为市场上30年以来第一个新的肺结核专门药物。该化合物已经显示了对正在复制的和静态的结核杆菌以及具有多重抗药性的杆菌的作用(Stover等，2000)。
我们已经在早先的专利中就DevR作为抗结核药物靶点的潜力申请了专利(印度专利申请号1286/DEL/2001和PCT申请号PCT/INO2/00022)。在先前的专利中没有包含DevS、DevR和Rv2027c蛋白的磷酸化活性，并且尽我们现在的知识和了解，运用这些蛋白通过SDS-PAGE电泳分析或高通量形式筛选针对磷酸化活性的潜力抑制剂的发明/程序还没有在其他任何地方提交专利，这些信息也没有以任何形式公开发表。
传感器激酶和/或反应调节因子蛋白——DevR的拮抗剂/抑制剂/拮抗物的基 于蛋白质结构的设计。
蛋白质的三维结构一旦被确定，潜力药物/抑制剂/试剂可以通过计算机辅助建模和对接软件GRAM、DOCK等进行检验。该程序包括将结构分子文库中的化学化合物和基团在计算机中装配和对接到蛋白质结构中(West等，1995)，在此即为传感器激酶DevS或Rv2027c和反应调节因子蛋白DevR，以确定潜力抑制试剂结合和对接效率以及潜力对接分子能否成为相互作用表面的潜力抑制剂，如传感器激酶二聚界面，传感器激酶-反应调节因子相互作用界面，传感器激酶信号感应界面，传感器激酶磷酸化界面，反应调节因子磷酸化界面，反应调节因子-DNA相互作用界面，以及各蛋白其他结构关键性表面。计算机程序还可以用于估计试剂对不同表面区域的吸引、排斥和空间阻碍(如上所述)。此基于结构的合理性药物设计方法需要靶蛋白的精确的3D结构，在此为DevS/Rv2027c和DevR蛋白的结构。此高分辨率/质量的3D数据需要足够量的纯化过的活性蛋白，通过运用本专利申请所述的构建质粒、方法和步骤可以大量地获得蛋白。
为了给基于结构的药物设计方法提供一个框架，靶蛋白的初步结构根据3D结构数据库应用建模软件如Swiss-Model建模，该软件根据靶蛋白与早前已经明确结构的蛋白之间的蛋白序列同源性自动生成一个预测的蛋白质结构。该方法对反应调节因子蛋白DevR富有成效，其3D结构根据其与3D结构已经清楚的大肠杆菌反应调节因子蛋白NarL(Baikalov等，1996)的序列同源性用Swiss-Model服务器预测(图11)。尽管提供的结构不是实际的结构而只是一个模型，但其已经可以很好地作为基于结构的合理性药物设计的起始材料。
计算机建模允许选择有限数量的合理性化学修饰，而不是可能的无限量的基本随机的化学修饰，任何一种修饰都可能产生一种有效的药物。每一种修饰都要求额外的化学步骤，对于有限数量的化合物，合成还是合理的，但如果所有可能的修饰都需要在初始筛选时完成，合成工作则难以实现。因此采用3D结构分析和计算机建模，大量的化合物可以在计算机屏幕上进行快速的筛选而不需要真正合成它们，一些可能的候选化合物可以被识别和筛选而不需要辛苦地合成难以计数的化合物。一旦潜力候选化合物被识别，化合物可以从商业机构如大型化学药品公司即Merek、Glaxo-Smithcline、Monsanto、Eli Lily、DuPont等选购，或从头合成化合物。
如此识别的“抑制剂-化合物”可在体外进行标准的高通量检测(如本专利申请所述)及在体内用全细胞分析系统检测以评估建模方法及抑制剂活性的功效。运用在此所述的方法，采用模拟的DevR结构和一定数量的传感器激酶和反应调节因子的结构，可以对各种已经报道的抑制剂(Macielag和Goldschmidt，2000；Matsushita和Janda，2002)和新识别的化合物进行详细的分析，同时预测它们的作用模式。但在目前阶段，对于DevR-DevS和DevR-Rv2027c双组分系统进行的后续实验和预测均需要对于每一个参与蛋白通过X-ray晶体学或溶液NMR波谱学生成精确的3D结构以确认结构预测的结果并评估所有参与蛋白的真实的结构差异和动力学。
用于药物/抑制剂“肽”筛选的噬菌体文库——突变蛋白的新应用
很多噬菌体文库系统已经在遗传水平得到构建，它们通过感染大肠杆菌，随机生成结构约束的或非约束的7-20残基的肽序列，序列展示在噬菌体颗粒的表面。如此大量的随机肽使得该系统类似于拥有一个巨大的化学药品文库，适于筛选需要的肽。一些关于此类筛选的方法在文献中已经有所报道。我们提出将我们可利用的突变蛋白(传感器激酶和反应调节因子蛋白)全新地用于此筛选及清除——“淘洗(biopanning)”法。
可以提出不同的手段将各种突变蛋白用于筛选步骤以去除非特异性的结合或亲和力低的结合或不影响本研究种各蛋白磷酸化的结合。下述方法中提出了可运用的程序的大纲：
1.筛选可抑制传感器激酶自磷酸化的肽(随机的，噬菌体展示的)，
·将传感器激酶蛋白(包括DevS201或DevS578或Rv2027194传感器激酶蛋白但不仅限于所述蛋白，可含有其它所述组成本专利中的网络的传感器激酶的全长和/或单结构域蛋白或它们的衍生物)固定于固体支持物/基质上，支持物/基质包括但不局限于ELISA盘(聚苯乙烯基质)，磁珠，聚赖氨酸涂敷盘，链霉亲和素(strepavidin)涂敷珠，Ni+2-NTA基质或它们的其它亲和基质。
·根据生产商或已经建立的程序使用特定的固定程序将待分析蛋白即传感器激酶或它们的衍生物固定之后，用洗涤缓冲液(PBS/TBS)彻底地洗涤固定基质结合蛋白。
·一旦完成固定珠/基质的洗涤，按照生产商提及的指定时间或情况将所需的包被/固定蛋白的等量基质(例如100μg，但不仅限于该数量)与指定数量的噬菌体共同放置(例如，对于NEB系统7残基，1011个病毒可以与固定待测蛋白的基质预培养，主要除去基质结合噬菌体)。
·按照生产商手册中指定的方法用TBS-T(Tween-20)严格地洗涤基质/珠。
·在接下来的一步中，将固定于珠/基质上的结合噬菌体的蛋白与等量的磷酸化缺陷型突变传感器激酶蛋白在室温放置10-30分钟，即如果DevS被固定，则用DevSH395Q或DevSN503D蛋白，若为Rv2027194蛋白则使用Rv2027H392Q。该步骤不仅促进了低亲和力的噬菌体/肽从反应池中的去除，还选择性地留下了与磷酸化口袋结合的肽，即使只有很低的亲和力，以及那些与固定的传感器激酶以很高的亲和力结合的肽。
·在洗涤之后，采用非专一性洗脱条件如0.2M甘氨酸pH～2.2或三乙醇胺，pH～10.5或采用专一性的洗脱条件如用咪唑从Ni+2-NTA珠(如果此珠被用作基质的话)上释放出蛋白质-肽-噬菌体复合物，将相互作用的噬菌体从固定蛋白上洗脱。采用专一性的洗脱条件如采用咪唑等较使用非专一性洗脱条件如甘氨酸或三乙醇胺在洗脱专一性蛋白-肽复合物上有极大的优势，非专一性条件可能导致将仅与基质作用的噬菌体/肽也同时洗脱，例如与盘或珠等有结合亲和力的肽在此洗脱条件下也将被洗脱。将这些非专一性的噬菌体或基质结合肽洗脱将干扰后续的筛选步骤并可能最终提供错误的先导分子。
·按照生产商手册扩增洗脱的肽展示噬菌体并将扩增的噬菌体用于下一轮的淘洗(选择-去除循环)。
·在下一步淘洗中用于固定传感器激酶蛋白的基质可以更换(即如果在第一轮淘洗中采用了ELISA盘做包被，则在第二轮淘洗中可用磁珠)。这样可相当有效地去除与基质结合的噬菌体展示肽，同时提高信嗓比以及提高恢复蛋白结合噬菌体的可能性。
·重复上述步骤2-3次即总计淘洗3-4轮并在后续的洗涤中提高Tween-20的浓度，例如在第一轮淘洗中为0.2％，第二轮淘洗中为0.25％，第三和第四轮淘洗中为0.5％，并同时改变固定基质。
·在第三和第四轮淘洗中将固定蛋白-肽/噬菌体复合物用突变蛋白洗涤后用ATP/Mg+2复合物(在此用作配体)洗涤以专一地洗脱与ATP-结合结构域和传感器激酶磷酸化口袋结合的噬菌体。该基于配体的洗脱将产生很好的候选肽用于检验对磷酸化反应的抑制。
·在3或4轮淘洗后，每个克隆将分别用肽测序分析并评估肽在噬菌体-ELISA中的结合能力。
·-旦分析被证实，有抑制作用的肽将被合成并用于体外和体内分析以评价其效用及它们对于磷酸化通路的作用模式。
2.筛选抑制对DevR蛋白的磷酸转移的肽。
与传感器激酶类似，反应调节因子蛋白同样可用于肽的筛选，采用与前述相同/相似的步骤以及以下建议的改变/改进。
·可将DevR或DevRN145蛋白固定于基质/珠上以淘洗具有抑制磷酸化反应潜力的肽，
·磷酸化缺陷型DevR突变蛋白即D54V、K104E、D8N等或单结构域衍生物即DevRN145或DevRC-term可用于洗除以低亲和力结合的肽
·为了洗脱专一的磷酸化口袋结合肽，固定的DevR-肽复合物可以用磷酸化的传感器激酶(在此作为洗脱“配体”)洗涤以诱导DevR/DevRN145反应调节因子蛋白的磷酸化。在此条件下，与传感器激酶-反应调节因子相互作用界面结合的肽以及与DevR/DevRN145蛋白磷酸化口袋结合的肽将和由于反应调节因子蛋白中的磷酸化诱导的结构修饰而被替换的肽一起被释放。
·所有的这些肽之后被用于和对组氨酸激酶蛋白进行的类似的广泛的分析。
有效肽(在此术语“有效肽”指肽或其类似物，能够在筛选中干扰磷酸化反应即能够抑制传感器激酶的自磷酸化和/或通过传感器激酶——DevS或Rv2027c的反应调节因子蛋白DevR的转移磷酸化)可大量合成以用于体内模型和最终用于人体以帮助对抗肺结核。在此需要强调的是合成肽的合成相对地非劳动密集、质量可控、操作简单且可以非常便宜地大量生产。
合成的抗体文库在“潜力”抑制形态中的运用
如上所述，目前急需识别新的药物靶点以发展新药用于有效对抗那些对使用当前的药物进行的治疗具有抗性的肺结核。此外，与当前给药靶作用于活跃复制的杆菌相对比，对于能够作用于肺结核的慢性形式的有效药物有着巨大的需求。
来自Jaya S.Tyagi博士的实验室的早期报道提议devR基因更可能与慢性感染过程相关，与有氧条件下或在感染的早期的生长本身没有太多关联。据观察，和野生型H37Rv菌株相比，在豚鼠中突变菌株在实验条件下不能引起严重的进行性疾病和病理。
DevR蛋白属于调节蛋白的反应调节因子类。由该蛋白负责结核杆菌对宿主的敌对环境的适应似乎是合理的。双组分系统的调节网络通过一个磷酸化通路行使功能，其中DevS组氨酸传感器激酶蛋白(HK)感受环境提示/刺激作为反应在其保守位点His395残基处进行自磷酸化。磷酸化的DevS之后通过磷酸转移将磷酸基团转移至DevR蛋白的保守的Asp54残基处。磷酸化诱导的DevR蛋白可能的结构变化可能改变其DNA结合能力，导致对其控制下的基因表达的调节。已知该双组分系统对涉及持久存活的一个关键因子组织缺氧产生应答(Boon等，2001；Sherman等，2001；Tyagi，J.S.，DST report，2001年10月；Mayuri等，2002)并且该系统被提议事实上涉及引发慢性感染(Kapur，V.，Ph.D.毕业论文，2001；Tyagi和Kapur，PCT/IN02/00022)。该系统因此为发展有效对抗肉芽瘤内的杆菌的药物提供了新的靶点。使调节系统如DevR-DevS和DevR-Rv2027c丧失功能预期将导致由调节系统调节的细菌通路在应答组织缺氧中失活。在此描述的研究建议了用于筛选抑制剂分子/化合物/药物以对抗这些通路/系统及导致系统功能性失活的步骤和生化分析(图1)。此外，还描述了高通量分析的设置和细节用于从全体化合物文库或组合文库中快速筛选针对自磷酸化和磷酸转移反应的潜力抑制剂。除了这些筛选步骤，本发明还揭示了将EtBr和BPB作为抑制形态的新用途以及运用专一性的抗体和肽作为这些双组分系统的抑制剂的潜力。
本发明采用下列的实施例和手段进一步阐述。这些实施例仅作为说明，在任何情况下均不应直接用于限制本发明的范围。
实施例
实施例1.DevR、DevS和Rv2027c及单结构域衍生物和突变变体蛋白的克隆、超量表达和纯化及重折叠
A.DevR、DevR N145 、DevS 201 、DevS 578 和Rv2027 194 的克隆及它们的单结构 域和突变衍生物的生成
如所述进行所有的常规的重组DNA的工作(Sambrook和Russell，2001)。在0.1％Triton X-100存在的情况下，在95℃将细胞煮沸25分钟以制备结核分枝杆菌H37Rv的DNA，离心后的上清液用作PCR中模板DNA的来源。全长devR、N末端截断devS201、全长devS578和N末端截断Rv2027194基因通过PCR从结核分枝杆菌DNA扩增，运用PfuDNA聚合酶和其中引入了特定的限制性酶切位点的引物(图2，表1)。为表达N末端带有His6-tagged的DevR蛋白，devR的PCR产物用NdeI和SalI消化，在用T4DNA聚合酶平端化后，克隆进pPROEx-HTa质粒表达载体的平端EcoRI位点(美国Invitrogen公司)生成pDSR217。为表达DevRN145质粒pDSR217用PpuMI(其限制性位点位于反应调节因子蛋白，DevR的连接区域的基因内并将具有催化活性的磷酸化活性N末端结构域和C末端DNA结合结构域分开)和XhoI(消化载体骨架)消化。此PpuMI-XhoI双酶切释放出含有完整的DNA结合结构域的devR基因C末端片段。用Klenow聚合酶将消化后的表达载体填补，重封闭/重连接步骤生成了载体pDSR145可超量表达145个氨基酸长的N末端DevR蛋白，DevRN145。
为表达末端His6-tagged的DevS201、DevS578和Rv2027194蛋白，其相应的PCR产物用BamHI消化并依次克隆进BamHI消化后的pPROEx-HTb、pPROEx-HTc和pPROEx-HTc表达载体生成质粒pSCS201、pDSS578和pDSH194。
对于各质粒的定点突变，通过QuikChange定点突变试剂盒(美国Stratagene公司)和设计的诱导突变寡核苷酸将点突变引入pDSR217、pSCS201、pDSH194。表1中显示了所用的诱导突变的寡核苷酸。
所有的编码野生型和突变蛋白的表达载体(图2)用377ABI PrismDNA sequencer进行DNA自动测序以确认。
B.蛋白纯化步骤
a.细胞生长
除了将pDSS578转化进大肠杆菌DH5α，将所有的重组质粒(表1)新鲜转化进大肠杆菌BL23(DE3)。转化平板在转化后保存于4℃并不得超过两周，用平板上的一个单个分离的菌落接种5ml含有氨苄青霉素的Luria broth或2xYT培养基作为初级起始培养物，在37℃生长12-16小时。
次日早晨将5ml的初级培养物全部加入到500ml的含有氨苄青霉素(100μg/ml)的2x YT培养基中(1％传代培养物)置于37℃摇晃(200rpm)直至OD600达到0.4-0.6。通过加入1mM的IPTG诱导重组蛋白生成，培养物在37℃再额外放置5-6小时后细胞用离心法收获。
DevS578蛋白的细胞生长和诱导按照下述步骤进行。带有质粒pDSS578的E.coli DH5细胞在含有100μg/ml的氨苄青霉素和1mM的IPTG的500ml 2xYT培养基中传代培养(1％)并置于37℃摇晃(200rpm)7-8小时，诱导细胞用离心法收获。
b.重组蛋白的纯化和柱上重折叠。
诱导细胞沉淀物(总蛋白)用pH7.4的磷酸钠缓冲液重悬并用超声法破碎(用微探头破碎3次，每次1分钟)。蛋白的可溶部分和不可溶部分用离心法分离。(用SDS-PAGE对可溶和不可溶部分进行的分析显示超量表达的融合蛋白主要存在于包涵体中)。
含有重组蛋白的不可溶包涵体用与百分之一的培养物体积等量的变性缓冲液溶解(即500ml的培养物沉淀物用5ml的缓冲液)：20mMTris.Cl，pH8.0、10％甘油、500mM NaCl和20mM咪唑、6M盐酸胍或8M尿素。溶解产物在30-37℃放置2-16小时以促进变性蛋白的完全溶解。对于DevR蛋白，推荐使用6M Gm.HCl溶解。
可选择地，细胞沉淀物可直接用变性缓冲液重悬(不分离溶解和不溶解蛋白)并置于37℃摇晃12-16小时溶解。
溶解后，细胞溶解产物在25℃以20000-28000rpm的速度离心1小时，将细胞碎片和不溶物质从变性溶解的蛋白中分离。溶解的蛋白产物作为柱上重折叠步骤中的起始物质。
图3给出了用于所有蛋白的纯化和重折叠的方案的大纲。将5ml变性缓冲液中的Gm.HCl或尿素变性蛋白加到2ml的已用变性缓冲液预平衡的Ni2+-NTA琼脂糖柱(Qiagen，GmBH，德国)在室温放置2小时。随后将柱子移至16℃，步骤中的其余部分均在该温度下进行，除了对于DevR，其操作只在室温进行。
未结合的蛋白，包括其他污染蛋白和过量的His6-tagged专一性蛋白，作为流过液收集。用3倍柱床体积(6ml)的含有20mM咪唑的变性缓冲液洗涤柱床，之后用含有递减浓度的尿素(8M到1M)或Gm.HCl(6M到0M)的4ml重折叠缓冲液(20mM Tris.Cl，pH8.0、500mM NaCl、10％甘油、500mM NaCl、20mM咪唑、0.5mM氧化型谷胱甘肽[GSSG]和5mM还原型谷胱甘肽[GSH])梯度洗涤。
柱床最终用不含有尿素或Gm.HCl的2柱床体积(4ml)的重折叠缓冲液洗涤去除污染的E.coli蛋白。结合的蛋白用5ml含有200mM-500mM(250mM最优)的重折叠缓冲液以1ml的片断洗脱。在重折叠缓冲液中使用GSSG和GSH提供了柱床很好的氧化还原环境。当GSSG/GSH进入柱床，Ni2+的氧化状态发生改变且基质颜色逐渐从灰白色变至最终的粉白色。在用含有250mM的缓冲液洗脱的过程中，Ni+2树脂因为释放出固定蛋白，Ni离子恢复到氧化态，树脂的颜色回到蓝色，因此树脂的颜色可作为重折叠蛋白洗脱的有用的指示剂。
洗脱的片断/洗脱物用SDS-PAGE或Bradford试剂检测，汇集洗脱峰(通常为片断#3-10)，对透析/储存缓冲液(50mM Tris.Cl，pH8.0、50mM NaCl、50％甘油、0.1mM DTT)进行透析并保存于-20℃。
重折叠和纯化的蛋白用BCA蛋白分析试剂盒(美国PierceBiochemicals)或用以BSA为标准估计蛋白的Bradford法(Bradford，1976)定量。SDS-PAGE分析显示所有的蛋白有高于～90％纯度(图4)。
DevR蛋白和其突变体衍生物主要按上述步骤纯化，除了以下所列出的修改：
a.变性剂(盐酸胍/尿素)的去除在一步中完成。在收集了流过液后，柱床用3-4柱床体积(6-8ml)的含有6M Gm.HCl的变性缓冲液洗涤。之后柱床直接用3-4柱床体积的重折叠缓冲液洗涤以去除变性剂并促进蛋白质的快速重折叠。
b.用含有250mM咪唑的重折叠缓冲液对重折叠后蛋白进行洗脱。洗脱片断在室温以0.5ml的等分收集于1.5ml的微离心管中，管中含有0.5ml冷的1M L-精氨酸。各等分在收集后立即颠倒混匀。一次典型的纯化可收集8-10个这样的等分。L-精氨酸的存在是为了避免蛋白的聚集和提高重折叠蛋白质在更长时间里(在室温中达到1周)的稳定性。
DevRN145蛋白在可溶和不可溶部分分离后也存在于可溶的部分。虽然大量的蛋白仍然存在于不可溶的包涵体中，但在可溶的细胞溶解物中已经有了足够量的可溶蛋白用于以可溶蛋白形式进行的纯化而不需要重折叠。对此基本遵照生产商提供的用来从可溶部分中纯化His6-tagged蛋白的手册(德国Qiagen)，成功运用以下段落中提及的步骤。
除了DevRN145，对于前面所述的其他蛋白在次优条件下缓慢诱导同样可以提供很少量的可溶天然态蛋白，如生长在LB培养基中于25℃缓慢搅动16-20小时用0.2mM IPTG诱导，虽然蛋白不足以用于动力学分析和研究，但仍然可以在筛选步骤作为可溶蛋白的可再生来源。
类似地，在多种表达条件下对蛋白的大培养体积的诱导包括最优表达条件即用1mM IPTG作为诱导物，37℃培养4-6小时同样可以提供很少量的可溶的天然态蛋白以避免重折叠步骤。采用小型或中型的发酵桶可有效地实现如此大体积的诱导从而可以生产出一定数量的可溶的各蛋白用于本专利申请中提到的分析。
但是，尽管存在蛋白可溶的优势，前面所述的可溶性蛋白的有限数量限制了其在需要大量蛋白的高通量筛选分析中的应用。因此重折叠方法在此方面提供了关键的先进优势。
简要地，所有的可溶性蛋白按照下述步骤纯化。
将从上述的超声步骤中获得的可溶蛋白加到用洗涤缓冲液(20mMTris.Cl，pH～8.0；50mM NaCl；10％甘油；20mM咪唑)预平衡的Ni+2-NTA树脂柱。上清液在16℃与树脂平衡15-20分钟。
缓慢收集流过液，用10-15倍柱床体积的洗涤缓冲液迅速洗涤柱床。
固定的蛋白用含有250mM咪唑的洗涤缓冲液洗脱。洗脱片断/洗脱物用SDS-PAGE或Bradford试剂检测，汇集洗脱峰(通常片断#3-7)，对透析/储存缓冲液(50mM Tris.Cl，pH8.0、50mM NaCl、50％甘油；0.1mMDTT)透析并储存在-20℃。将所有蛋白等分成小等分并在进一步使用前储存在-20℃。
实施例2.DevS和Rv2027c蛋白的自磷酸化活性研究。
对DevS201、DevS578和Rv2027194蛋白以及它们的突变体衍生物DevS201-H395Q、DevS201-H397Q、DevS201-H397A、DevS201-N503D和Rv2027194-H392Q用[γ32P]ATP作为磷酸供体分子进行自磷酸化。
将经过纯化和重折叠的蛋白(15μM的DevS201或Rv2027194或它们的突变变体以及2.5μM的DevS578)与5μCi的[γ32P]ATP(5000Ci/mmol，BRIT，CCMB校园，Hyderabad，印度)在10μl的反应缓冲液中(50mMTris.Cl，pH8.0、50mM KCl、10mM MgCl2、50μM ATP)于25℃放置指定的时间。此后加入5μl 3x的样品缓冲液中止反应，其中含有250mMTris.Cl，pH6.8、10％甘油、1％SDS、280mM β-巯基乙醇、0.01％溴酚蓝。
样品立即在冷乙醇浴上冷冻并存于-70℃直到SDS-PAGE分析之前。
在SDS-PAGE分析之前，样品在冰上解冻(如果冷冻的话)后加到12.5％(自磷酸化反应)或15％(磷酸转移反应)的胶上根据已建立的方法(Fritsch和Sambrook，2001)进行电泳直至低的溴酚蓝染料跑出胶。将胶在水中漂洗10分钟后在4℃用塑料包装包裹4-16小时后进行发射自显影。
将放射自显影图谱和湿的胶对准之后用干净的无菌刀片从胶上将对应的条带切下进行放射性的定量。切下的对应于放射标记蛋白的条带在液体闪烁流中(OptiSync HiSafe)用液体闪烁计数器(Wallac，DSA1409)计数。
对于传感器激酶的自磷酸化反应，得到以下观察：
1.DevS201、DevS578和Rv2027194蛋白通过从[γ32P]ATP到保守组氨酸残基的磷酸转移发生自磷酸化。32P的结合不是因为ATP与蛋白质的非专一性结合。这一点通过运用α[32P]ATP在磷酸化反应中替代γ[32P]ATP不会引起蛋白磷酸化得以证实。
2.磷酸化产物的时间过程研究和稳定性分析揭示蛋白中32P的结合在4小时达到峰值，在1小时内对于DevS201和DevS578发生～98％的结合，对于Rv2027194发生～82％的结合(图5A，5B，5C)。在γ[32P]ATP存在和不存在的情况下对磷酸化产物稳定性进行评估；DevS201产物至少在4小时内完全稳定，Rv2027194产物可达20小时(图6)。磷酸化的传感器激酶内在的稳定性将推动其在筛选分析中的应用(图1中的步骤2)。
3.DevS201和DevS578的自磷酸化活性在Mg2+离子存在时达到最优，同时Mn2+可以替代Mg2+降低了～40％效率以及Co2+替代具有～25％的效率(图7A，B)。对于Rv2027194优选的二价阳离子同样是Mg2+且Mn2+替代降低了～40％效率以及Co2+替代具有～25％的效率。虽然DevS不能运用Ca2+以替代Mg2+Rv2027194可利用Ca2+作为二价阳离子在浓度为25mM时降低了～50％的效率(图7C)。利用不同的二价阳离子的能力同样暗示它们在活性上可能存在的差异以及它们刺激观察过程采用的的模式的不同。在缺乏任何二价阳离子的情况下，反应进行失败。Mg+2离子的优选浓度对DevS是25mM及对Rv2027194是1mM。
4.通过定点突变和化学稳定性分析证实磷酸化位点在DevS中是His395及在Rv2027c中为His392。在DevS中，位于His395附近的His397不会被ATP磷酸化(图8A，B，C)。
5.位于公认的DevS的ATP结合口袋的Asn503的突变同样破坏了DevS201的磷酸化，标志着结合ATP对于磷酸化是必须的(图8A)。
实施例3.DevR的磷酸化活性。
为了研究磷酸转移反应，将DevS201/Rv2027194(15μM)或DevS578(5μM)如上所述磷酸化30分钟。随后，将DevR/DevRN145蛋白(20μM)加入32P磷酸化的传感器激酶。在指定的时间点，取出等分并储存于-70℃直至分析。随后，样品在15％SDS-PAGE上分析并如所述用放射自显影分析自磷酸化反应。
对DevRN145和DevR突变蛋白的磷酸化分析在与所述的野生型DevR蛋白相同的条件下进行。以下提供了相关发现：
1.DevR/DevRN145通过从DevS578、DevS201和Rv2027194的磷酸转移的磷酸化发生非常迅速。在反应起始的2-5分钟内，传感器激酶中结合的放射性的一半被转移到DevR(图9A，B，C，D，E)。这些快速的动力学将有益于筛选对抗该步骤的化合物/抑制剂(图1中的步骤3和例4)。
2.从DevS201～P到DevR的磷酸转移反应依赖于反应缓冲液中Mg2+离子的存在(图9E)。Mn+2、Ca+2或Co+2在磷酸转移反应中不能替代Mg+2(未提供数据)。同样地对于Rv2027194和DevS578，在磷酸转移反应中Mg2+不能由Ca2+或Co2+或Mn+2或Fe+3取代(未提供数据)。
3.DevS201的存在导致DevR～P变得非常不稳定。如图9A和9D所揭示的，在混合DevS和DevR/DevRN14510分钟后无法观察到两个蛋白中任何一个(即DevS和DevR/DevRN145)的磷酸化状态。在DevS201不存在时，磷酸化的DevR可以稳定超过20分钟，暗示传感器激酶内存在磷酸酯酶活性(未提供数据)。
4.在从DevS578到DevR的磷酸转移中，在DevS578存在时4℃下DevR～P可以稳定至4小时(图9B)与DevS201存在时仅～5分钟的稳定性形成对比。DevS201和DevS578之间在磷酸酯酶的活性上存在的差异可归因于结构变化，因为DevS578是全长蛋白且根据预测含有3个对应于跨膜区域的疏水片段，在进行反应的水介质中可能发生重排列。此发现还暗示N末端的感受结构域掩盖了位于DevS传感器激酶C末端结构域的磷酸酯酶活性。
5.从Rv2027194到DevR/DevRN145的磷酸转移和从DevS201发生的磷酸转移非常相似，在反应起始10分钟后无法观察到DevR～P/DevRN145～P(以上第3点)。此发现暗示了与Rv2027194相关联的磷酸酯酶活性。然而，在30分钟时仍然能够观察到Rv2027194～P暗示了其转磷酸化能力和DevS201相比较低(图9C，E)。
6.对于保守残基的定点突变以及对磷酸化产物酸碱稳定性的分析揭示了在DevR中的磷酸化位点为保守的Asp54。对其他保守残基的突变，组成公认的离子结合口袋的Asp8和保守不变的Lys104，也能破坏DevR的磷酸化(图10)。另一些保守残基Asp9和Asp54到Asn的突变不会破坏DevR的磷酸化虽然其发生速度减慢。这种差异只有在使用DevS578蛋白时才能观察到。利用DevS201没有揭示这样的差异(比较图10A和10B)。此矛盾可归因于分辨DevS201和DevR的困难因为它们具有非常接近的分子量以及对DevR-Asp9突变体的磷酸转移极低的效率(未提供数据)或者因为传感器激酶的N末端结构域部分涉及此反应的过程。DevR的模型中显示了对于功能关键的这些残基的位置(图11)。
实施例4.筛选化合物文库/抑制剂的高通量分析
为了建立自磷酸化和磷酸转移反应的高通量分析以促进对化合物文库的筛选，反应以96孔板的形式按下述进行。
A.高通量形式的自磷酸化反应
简要地，如例2中所述的在10μl反应体积中的自磷酸化反应是所有传感器激酶的典型反应。在磷酸化反应发生60分钟后，通过在PBS中稀释20倍中止反应。磷酸化的反应产物用多头抽真空装置/真空抽吸装置和96孔Millipore HA-多孔板过滤(多孔板带有硝化纤维滤器，但并不仅限于该装备，还可包括和采用24孔或384孔板和自动液体处理系统等及其它们的变体/衍生装置)随后在室温以每孔1ml PBS清洗滤器。
在此之后残留在滤器上的磷酸化的传感器激酶基本均被标记可以反映分析中的磷酸化效果。为了对此进行解释，下面的实验以高通量形式进行在此作为示例，i)估计用于自磷酸化分析的蛋白优选量。
为了滴定自磷酸化反应中的传感器激酶的数量，在25℃将数量递增的DevS201(2.5-35μM)和Rv2027194蛋白(2-30μM)置于总计10μl的反应缓冲液中(50mM Tris.Cl，pH8.0；50mM KCl；25mM MgCl2，10μMATP其中含有2.5μCi的[γ32P]ATP[5000Ci/mmol])60分钟。
反应后立即将产物加入含有200μl PBS的各个滤孔中(滤器事先用200μl的PBS(1升中含有NaCl，8g；KCl，0.2g；Na2HPO4，1.44g；KH2PO4，0.24g)滤过润湿)。稀释的反应产物2分钟后滤出，后用真空抽吸装置用1ml PBS(330μl x3)清洗各孔并在真空上简单干燥(2-3分钟)。随后用半自动化滤器移取装置(Millipore公司)将各滤器从孔中移至各闪烁计数用的小瓶内，残留在滤器上的放射性用DSA1409计数器(Wallac公司)以自动数据存储模式在Optisafe液体闪烁流中通过液体闪烁计数来估计。
分析中结合的Cpm以分析中的传感器激酶的浓度的函数形式表示(图12)。以此为基础，用于10μl自磷酸化反应的蛋白质优选浓度/数量分别确定为30μM的DevS201(图12A)和21μM的Rv2027194(图12B)。在随后的所有高通量自磷酸化反应中除了另外声明传感器激酶均使用这些优选浓度。
b)估计传感器激酶自磷酸化中的MgCl2优选浓度.
为了滴定自磷酸化反应中MgCl2的优选量/浓度，将优选量的传感器激酶(如上所速)与不同数量的MgCl2(0.1-50mM)共同放置，整个反应基本如上述进行。
分析中结合的cpm以MgCl2浓度的函数形式描点作图进而推导出自磷酸化反应中的优选浓度。随着MgCl2浓度的增加DevS201蛋白放射性的残留显示出线性增加直至分析的最后浓度即50(图13A)而在1mM显示了最大结合值而此后无论减少或增加MgCl2浓度Rv2027194放射性残留均下降(图13B)。
在自磷酸化分析中任何磷酸化抑制剂的出现都将抑制γ32P-标记结合到传感器激酶蛋白因此滤器上放射性cpm的总残留量将降低。标记结合/残留的减少将反映出自磷酸化反应的抑制。
B.高通量形式的磷酸转移反应。
与自磷酸化反应相似，依赖于磷酸化的传感器激酶蛋白发生的磷酸转移反应同样以高通量的形式进行。在此反应中，作为反应调节因子的转移后去磷酸化的结果，滤膜上残留的磷酸化信号(放射性)的减少被加以评估以确定转移的效率。
具体地说，首先各传感器激酶的胞质衍生物按以上部分描述的发生自磷酸化(即30μM的DevS201在25mM MgCl2和10μM ATP的存在下和21μM的Rv2027194在1mM MgCl2和10μM ATP的存在下)且因为传感器激酶的磷酸化形式非常稳定，传感器激酶的总体磷酸化用上述相同的过滤-残留分析进行估计。
随后在第二步中，将数量递增的DevR蛋白加入分析混合物。DevR蛋白在分析混合物中存在多于10-15分钟不仅造成磷酸基团从DevR蛋白的传感器激酶转移而且导致了相互反应对即传感器激酶和反应调节因子均发生去磷酸化，造成了磷酸根-标记残留总量的减少。整个反应基本按照对转移磷酸反应后传感器激酶的自磷酸反应的描述进行。
因此，此分析显示，和没有加入DevR蛋白即只发生自磷酸化反应的反应相比，滤器上残留的放射性总量减少。滤器上标记残留的减少源于磷酸转移反应后的去磷酸化且与反应混合物中反应调节因子蛋白DevR的数量成高度正比关系(图14A和14B)。普遍而言，由于磷酸转移及随后DevR的去磷酸化反应(图15)，将DevR蛋白(20μM)加入磷酸化的传感器激酶及随后在室温放置15-20分钟导致传感器激酶中放射标记残留的总量减少(超过80％)。
在以高通量形式筛选这一步(磷酸转移反应)的抑制剂时，正确的抑制剂的出现将不会导致滤器上放射性的残留量的减少。换句话说残留的标记将多于真实的磷酸转移反应并可能接近没有加入DevR的反应，标志着抑制程度的存在(图15)。
由于以高通量方式进行的这些自磷酸化和磷酸转移分析在本质上都是定量的，因此这些分析也可有效地用于比较由各种分子/化合物针对所揭示通路中的参与蛋白和它们的反应所引起的抑制或调节的程度/强度/百分比。
用高通量分析筛选文库，抑制剂{例4)。
a)分析的建立基于(i)传感器激酶Dev5、Rv2027的磷酸化特征和(ii)反应调节因子DevR及其N末端衍生物(DevR N145)的磷酸转移性质。
b)该反应根据蛋白浓度和金属离子(Mg2+)浓度进行了优化。
c)此高通量分析还没有发展用于在包括结核分枝杆菌在内的任何系统中分析传感器激酶和反应调节。
实施例5.溴化乙锭(EtBr)和溴酚蓝(BPB)及它们的衍生物作为传感器激酶自磷酸化反应潜力抑制剂的候选抑制剂化合物/分子
已知的双组分系统抑制剂/化合物如咪唑鎓盐、环己烯衍生物、含有酪胺-基序的化合物、苯并噁嗪、顺式-脂肪酸、苯并咪唑衍生物等有着相对相似的结构和相当确定的化学本质即杂环性和/或杂环化合物的卤化和/或氮化。
利用这一知识就一些化合物对DevS传感器激酶的自磷酸化潜力的抑制活性进行了测试。这些化合物包括左旋咪唑、叶酸、甘酰甘酰甘氨酸、溴化乙锭、溴酚蓝、2-4-羟苯基偶氮苯甲酸(HABA)、2-巯基苯并咪唑等。分析中所有的化合物用1mM的浓度测试。
具体地说，在磷酸反应缓冲液中(50mM Tris.Cl，pH8.0、50mM KCl和25mM MgCl2)将12μM DevS201与上述化合物在室温共同放置30分钟。自磷酸化反应通过加入2.5μCi[γ32P]ATP和50μM载体ATP起始。将反应物混和并在25℃额外放置60分钟进行磷酸化。随后，中止反应并如前述用SDS-PAGE分析。
在此反应中，1mM浓度的溴化乙锭(3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓)和BPB(3’，3”，5’，5”-四溴苯酚磺酞)显示了对DevS201自磷酸化明显的抑制(图16A，泳道5和7)。
EtBr和BPB对传感器激酶，DevS201和Rv2027194自磷酸化的抑制活性在一定浓度区间内(在高通量形式中从2.5mM到1μM及在SDS-PAGE形式中从1mM到1μM)进行的进一步分析证实了下述结果。引起DevS201和Rv2027194自磷酸化50％抑制率(IC50)所要求的BPB浓度大约为1.5-1.7mM(图17A，17C)。与此相比，EtBr在测试上限2.5mM对DevS201没有达到50％抑制率而EtBr对Rv2027c的IC50值大约为0.6-0.7mM(图18A，18C)。BPB和EtBr引起的抑制在SDS-PAGE形式中得到重复(图17B，17D和图18B，18D)。在对同一块胶进行考马斯染色后，在含有EtBr和BPB的孔均没有观察到聚集表明自磷酸化抑制不是因为这些物质的存在造成传感器激酶的聚集，因此证实了抑制是真实的而不是其他小组提到的错误的“先导”(Stephenson和Hoch，2000)。
通过这些研究我们提议将这些化合物全新地用于生成衍生物作为DevR-DevS和DevR-Rv2027c双组分信号转导系统中DevS和Rv2027c传感器组氨酸激酶自磷酸化活性的抑制性试剂。根据我们所有的知识和我们所相信的，这些化合物的这种应用至今没有从任何渠道讨论或报导。
虽然EtBr已被用作药物或药物前体，例如在治疗利什曼病时作为采用DNA反应试剂的混合治疗方案中的一种寄生虫毒性、抗原生动物药物，以及已在动物体内进行研究将EtBr评估为有潜力的抗肿瘤生长化疗试剂(Kramer和Grunberg，1973)，但其在抑制传感器激酶特别是DevS和Rv2027c方面的作用还没有被提及。相反，尽我们所知和所相信的，BPB或其衍生物从未被用作或暗示为传感器激酶或其他任何酶的抑制剂。
相似地，2-巯基苯并咪唑(2-MBI)作为传感器激酶(DevS201和Rv2027194)自磷酸化反应抑制剂的用途同样以SDS-PAGE和高通量的形式进行了测试。2-MBI对于DevS201和Rv2027194自磷酸化反应的IC50值大约为0.4-0.6mM(图19A和19B)，表明了化合物在抑制这些反应中的功效。自磷酸化反应的抑制也以SDS-PAGE形式加以确认。同一块胶的考马斯染色图表明没有聚集发生，证实了抑制是真实的(未提供数据)。
苯并咪唑及衍生物已被证实为抗微生物、抗真菌、抗蠕虫和抗溃疡性结肠炎试剂(Klimesova等，2002a；Masry等，2000)。2-MBI是用于合成抗溃疡性结肠炎化合物如奥关拉唑(Omeprazole)和兰索拉唑(Lansprazole)的前体化合物。苯并咪唑已被用作成功的抗革兰氏阳性菌的抗菌试剂且有一些报道将它们特别地用作抗肺结核药物(Klimesova等，2002b)。
除了苯并咪唑这些未被描述的杀菌效应，也有报道将其用作双组分系统的抑制剂，特别是2-苯基苯并咪唑及其衍生物。尽管这些化合物已被证明具有很高的体外活性，其中一个衍生物的IC50值为4μM，以及对于易感染的和有抗性的革兰氏阳性菌具有很好的抗菌活性，该系列在生化分析中的能力与其抗菌活性没有很好的关联，暗示其他机理的存在(Deschenes等，1999)。
不考虑这些矛盾和不清楚的观察，我们已经证实了2-巯基苯并咪唑专一抑制传感器激酶自磷酸化反应的功效并根据其在抗肺结核治疗，特别是对抗DevR-DevS和/或DevR-Rv2027c信号转导通路中的作用模式提出对其的全新应用。
溴化乙锭(EtBr)和溴酚蓝(BPB)抑制DevS和Rv2027c的自磷酸化活性。因此它们具有潜力作为发展更多的专利抑制剂的起点。
a)EtBr已被用作生成寄生虫毒性、抗原生动物药物的前体。然而，任何信息中均还没有提出该物质在抑制传感器激酶或作为发展抗肺结核药物的前体方面的作用。
b)BPB从未被用作或暗示成任何生物系统中/酶的抑制剂。因此，这是一个全新报道的用途。它在蛋白质和核酸电泳中被用作染料。
c)2-巯基苯并咪唑也能抑制DevS和Rv2027c的自磷酸化反应。
除了上面这些，值得注意的是在早先报道中提及的自磷酸化抑制是因为蛋白聚集。相反在此提供的实施例中蛋白聚集完全没有发生，抑制剂是正确且真实的。
本发明的主要优点(本发明的新颖性、非显而易见性、创造性步骤及实用性，简要评述)。
在本专利中描述的实验第一次在涉及各蛋白磷酸化的生化水平上提供了关于DevR-DevS双组分系统及Rv2027c和DevR之间交叉对话/交叉沟通的真实本质的证据。DevR-DevS双组分系统代表了涉及结核分枝杆菌毒性的双组分系统的第三个例子，其余两个毒性作用已报道的结核分枝杆菌的双组分系统为Rv0981-0982(Zahrt和Deretic，2001)和phoP(Perez等，2001)。
由于组织缺氧认为是DevR-DevS双组分系统的关键信号，因此认为在潜伏感染中该系统是结核杆菌的一个独特特征就显得十分合理。此外，其他两个牵涉到毒性的双组分系统还需要在生化水平上进行特征描述，因此目前不能用于高通量筛选先导分子。可以合理地推断，由组织缺氧诱导的一个/多个基因的表达受到DevR-DevS系统的调节。因此，本发明提供了筛选新的抗微生物/细菌药物/化合物/分子的途径，通过阻断DevR和DevS/Rv2027c活性能够有效干扰与细菌/分枝杆菌存活和休眠相关的一或多个基因产物的活性。
DevR-DevS/DevR-Rv2027c双组分系统除了可为抗肺结核药物发展在新的干扰步骤/阶段提供靶点外，将双组分系统用于肺结核抑制剂的筛选也是全新的。高通量步骤/设置的可行性促进了对巨大数量的潜力药效团/化合物/分子的快速筛选以作为本专利中揭示的磷酸通路的任何阶段(图1，步2和3)的抑制剂。所有参与蛋白的突变蛋白的应用同样促进了噬菌体展示肽文库/随机肽文库/噬菌体展示合成抗体文库在识别潜在“显著的”和/或“正确的”先导肽并去除“错误的”先导中的应用，这些先导肽在随后的分析中可用作肽抑制剂。
传感器激酶最有力的抑制剂通过引起激酶的结构变化造成聚集实现它们的作用，相反，BPB、EtBr或2-MBI不会造成聚集。因此它们代表了新的真实的传感器激酶DevS和Rv2027c的抑制剂。
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序列表
<110>科学与工业研究委员会
<120>筛选方法
<130>357-PCT
<150>US 60/418,837
<151>2002-10-16
<160>28
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
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Claims (10)

1.基于SDS-PAGE的用于鉴别对抗含有双组分系统DevR-DevS和/或DevR-Rv2027c的分枝杆菌的药物的高通量检测方法，所述方法包括步骤：
a)过量表达DevR、DevS和Rv2027c及它们的单结构域衍生物和突变变体蛋白；
b)分别将DevS和Rv2027c蛋白自磷酸化及此后在待测化合物存在的情况下以SDS-PAGE或高通量的形式将磷酸基团转移至DevR并分析反应产物；及
c)测定待测化合物的药物潜力，其中该药物潜力反比于(i)DevS和Rv2027c蛋白的自磷酸化程度，(ii)DevR及其单结构域衍生物基于磷酸转移的去磷酸化程度，和(iii)磷酸化DevS和Rv2027c及其单结构域衍生物的去磷酸化程度。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的DevS衍生物选自DevS201、DevS578、DevS201-H395Q、DevS201-H397Q、DevS201-H397A和DevS201-N503D。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述的Rv2027c衍生物选自Rv2027194和Rv2027194-H392Q。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述的DevR衍生物为DevRN145且同时包括突变蛋白DevR-D8N、DevR-D9N、DevR-D54V、DevR-D54N和DevR-K104E。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述的蛋白在大肠杆菌中过量表达。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述的待测化合物显示的活性选自抗生素活性、和抗微生物活性。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述抗微生物活性为抗菌活性和抗结核活性。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述方法有助于鉴别抗分枝杆菌药物及抵抗由细菌引起的疾病的药物。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述抗分枝杆菌药物是抗肺结核药物。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述由细菌引起的疾病是肺炎、百日咳、李氏杆菌病、肠道细菌疾病以及霍乱。
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