CN100537599C

CN100537599C - 一种新的抗血小板四肽——nb06及其应用

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Publication number: CN100537599C
Application number: CNB2007100874763A
Authority: CN
Inventors: 牛勃; 王国亮; 罗佳; 王建华; 冯倩佳; 李乐意; 李乐工; 韩锐
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-03-20
Filing date: 2007-03-20
Publication date: 2009-09-09
Anticipated expiration: 2027-03-20
Also published as: CN101045746A

Abstract

本发明涉及一种新的抗血小板聚集四肽—NB06，其氨基酸序列为ω-氨基辛酸-甘氨酸-天门冬氨酸-色氨酰胺肽，酰胺化的C末端可使“V”字形肽顶端的距离拉大，从而增强了目标化合物的生物学活性，同时也提高了其抗水解能力，为其制备抗血小板聚集和治疗心脑血管疾病药物奠定了良好基础。

Description

一种新的抗血小板四肽——NB06及其应用

技术领域：

本发明涉及医药生物技术领域一种新的具有抗血小板聚集作用的线性四肽化合物。

背景技术：

血栓形成、肿瘤转移及骨质破坏吸收，长期以来严重影响着人类的健康。近年来，随着有关细胞间相互作用的学说——细胞粘附理论的不断完善，细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间的粘附、转运，被认为是以上疾病发生的主要环节。进一步研究发现，一种三肽序列RGD(Arg-Gly-Asp)及其相应配体的结合，是细胞相互作用的必需环节，阻断此环节的研究，将对以上疾病的发病机理和临床治疗具有重要的理论和现实意义。

纤维蛋白原α链上的RGD序列与血小板糖蛋白(GP)IIb/IIIa受体发生特异性结合，是血小板血栓形成的最后共同通路。正因为纤维蛋白原上的RGD序列可以与血小板发生特异性结合，使得人工合成的RGD及类似物也有可能竞争性地抑制纤维蛋白原与血小板的结合。所以，在理论上可以完全阻断血小板聚集，抑制任何原因引起的血栓形成。因而，以RGD及其类似物为基础的新药研究已成为世界许多制药公司研究的一个热点。

虽然纤维蛋白原上的RGD序列在生物体内发挥着重要作用，但是作为药物，仅天然的RGD序列并不能达到适宜的强度和选择性。因为它脱离了在天然蛋白中所具有的正确空间构象。所以RGD在天然蛋白质中的构象以及附近的氨基酸序列，对于识别过程极为重要。周围的氨基酸序列可以使RGD维持正确的构象，特别是与RGD序列紧邻的氨基酸残基，对于维持正确的构象更有意义。

对RGD类肽构效关系的研究发现，RGD类肽的立体构象呈“V”字形，而“V”字角度的大小，即“V”字形顶端胍基和羧基的距离，与肽的生物活性密切相关，距离大的可以更好地与受体结合。与RGD序列相连的第四位氨基酸对其活性影响较大。Tomiyama等通过试验证明，RGD类肽的羧基端以疏水性氨基酸为佳，疏水性越强，其抑制纤维蛋白原与血小板GPIIb/IIIa受体结合的能力越强[J.Biol Chem，1992]。

本发明人曾将RGD类肽氨基端的精氨酸改造为ω-氨基辛酸，并将第四位氨基酸采用高疏水性的氨基酸，获得了系列高活性的RGD类肽，成功地申请并获得了中国发明专利(ZL 02123924.X)。

为了进一步提高目标化合物的生物学活性及其抗水解能力，以期开发成为功能更强的新一代抗血小板凝聚药物，本发明人在上述发明基础上，对四肽化合物的羧基端进行了改造，经过实验研究，最终选择了色氨酰胺作为RGD类肽的C端结构，进而提供了一种新的四肽——ω-氨基辛酸-甘氨酸-天门冬氨酸-色氨酰胺肽(NB06)。本发明所涉及的新四肽序列结构，迄今尚未见到相关报道。

发明内容：

本发明提供了一种新的四肽，其氨基酸序列为：ω-氨基辛酸-甘氨酸-天门冬氨酸-色氨酰胺肽。酰胺化的C末端使得“V”字形肽顶端的距离增大，增强了目标化合物的生物学活性，同时也提高了其抗水解能力。

本发明提供了一种制备所说抗血小板四肽化合物—NB06的方法。该方法是以本发明人前述专利公开的氨基酸序列X-Gly-Asp-Y为基础，将其中的X选用ω-氨基辛酸，Y选用色氨酰胺来实现的。本发明NB06的主要创新点在于对Y的选择。在前述发明专利中规定：“Y为Trp、Leu、Val、Ile、Phe、Ser中的任意一个”，均为天然氨基酸，末端为羧基。本发明中对应的Y选用了色氨酰胺，末端进行了酰胺化修饰，不属于前述专利中定义的任何一个。

本发明又提供了新的四肽化合物—NB06的药物组合物，所说组合物是以新的四肽化合物—NB06为有效成分，并含有药学上可接受的一种或多种载体。

本发明还提供了所说新的四肽化合物—NB06抗血小板聚集活性实验、稳定性实验，结果表明，与前述发明专利公开的化合物AoGDW肽相比，本发明NB06的抗血小板聚集活性提高了近四倍，并且具有更好的生物学稳定性。

本发明所述结构的化合物，如在NB06的N端或C端增加一个或数个天然或非天然氨基酸，即可形成的新的化合物。

本发明所述结构的化合物，如对NB06进行常规的化学修饰，也可形成的新的化合物。

发明优点：

本发明的优点和积极效果在于，经过对氨基酸序列X-Gly-Asp-Y的修饰和改造，尤其是选用了色氨酰胺取代Y，对末端进行了酰胺化修饰，从而大大提高了本发明所说新的四肽—NB06化合物的抗血小板聚集活性和稳定性，为开发临床有效的新一代抗血小板凝聚药物奠定了良好基础。

附图说明：

图1—NB06化合物的高压液相层析；

图2—NB06化合物的质谱检测分析。

实施方案：

下面给出一些实施例，目的仅仅在于更好地帮助了解本发明，而不是对本发明的限制。

<实施例1>：NB06的固相合成

称取76mg Rink Amide MBHA树脂(载量为0.55mM/克)，于多肽反应瓶中用二氯甲烷溶胀1小时后，抽滤除去二氯甲烷；加入20％吡啶/二甲基甲酰胺5毫升，室温振荡混匀10分钟以脱去Fmoc保护基；抽滤除去脱保护液，重复脱保护一次；称取5倍过量的Fmoc保护的色氨酸，溶于2M DIEA1ml(或0.5ml)中，加入过量5倍的0.5M HBTU/HoBT，混匀，室温活化10分钟；将活化的保护氨基酸转移至反应器，振荡混匀，室温反应60分钟后，负压抽去液体；加入二氯甲烷4ml，振荡混匀30秒，负压抽去洗涤液，重复洗涤共7次；取少量肽树脂，用茚三酮法检测缩合效率，反应阴性说明缩合完全，可进行下一步，否则重复缩合一次；重复进行脱保护—缩合反应，分别将天门冬氨酸、甘氨酸和ω-氨基辛酸引入肽链。反应结束后，将肽—树脂抽真空干燥。

<实施例2>：固相合成肽—树脂的切割

取实施例1得到的肽-树脂，加入2毫升裂解液(95％三氟醋酸、2.5％水、2.5％三异丙基硅烷)，室温下搅拌反应两小时；之后抽滤出切割液，并用少量TFA洗涤反应瓶内的树脂，抽滤出TFA合并入切割液；负压抽干滤出的切割液，行冰乙醚沉淀，分离沉淀，用1ml水溶解。

<实施例3>：NB06的纯化

取少量溶解的切割产物，进行高压液相层析，确定产物的保留时间，并分离产物。反相高压液相纯化的条件为：C8柱(3.9×150mm，waters公司)，流动相A：0.1％TFA/H₂O，B：0.1％TFA/乙腈，梯度洗脱，流速1ml/min，监测214nm吸收峰。结果如图1：有两个主要的洗脱峰，分别是17.422分钟的洗脱峰(记为P1)和17.712分钟的洗脱峰(记为P2)；其中P1为目的化合物，其峰面积约占总面积的40％。收集P1洗脱峰，经真空冻干，即为纯化后的NB06。

<实施例4>：NB06的质谱(MS)鉴定

于中国医学科学院药物所合成室进行质谱检测。结果如图2：主峰明显，分子量为516.2，与理论分子量相符，杂峰低而少。质谱检测表明合成的NB06分子量正确，纯度高。

<实施例5>：NB06与AoGDW肽(ω-氨基辛酸-甘氨酸-天门冬氨酸-色氨酸)的活性对比实验

1)RGD类肽体外抗人血小板聚集实验方法

于清晨空腹经肘静脉采人血，以3.8％枸橼酸钠抗凝(血与抗凝剂的体积比为9:1)，室温下，1000r/分钟离心8分钟，取上层血浆即为富血小板血浆(PRP，platelet-rich plasma)，分离PRP。将余血再以3000r/分钟离心10分钟，取上层血浆得贫血小板血浆(PPP，platelet-poor plasma)，用PPP调整PRP，使血小板数约为25万/μL。取PRP400μL，分别加入0.9％NaCl(阴性对照)及不同浓度的RGD类肽50ul，采用比浊法测定血小板聚集率(Helena Packs-4型血小板聚集仪)，37℃以900r/分钟，在血小板聚集仪上搅拌，孵育2分钟后加入二磷酸腺苷(ADP)50ul，同时开始测定。测定时间为10分钟。记录最大血小板聚集率。

血小板聚集抑制率的计算：

A0：生理盐水组最大血小板聚集率

A：RGD类肽的最大血小板聚集率

2)AoGDW体外抗人血小板聚集的实验结果(n＝6)

由上表数据，描记抑制曲线，选取线性段进行回归分析，其线性回归方程为：

Y＝8.3429X+3.6(R²＝0.9836)

由回归方程计算，AoGDW体外抗人血小板聚集的IC₅₀值为5.56uM。

3)NB06体外抗人血小板聚集的实验结果(n＝6)

Y＝31.5X+4.8(R²＝0.985)

由回归方程计算，NB06体外抗人血小板聚集的IC₅₀值为1.43uM。

4)NB06与AoGDW肽的活性对比实验

AoGDW是发明专利02123924.X所述RGD类肽中活性较好的一种，结构与NB06接近。根据实施例1的实验结果来看，NB06的抗人血小板聚集的活性是AoGDW的3.89倍，即本发明提供的的新的四肽—ω-氨基辛酸-甘氨酸-天门冬氨酸-色氨酰胺肽(NB06)，其活性提高了约4倍。

<实施例6>：NB06抗人血小板聚集活性的稳定性实验

按照实施例1所述的活性测定方法，进行NB06抗人血小板聚集活性测定。为观察药物的作用时间强度，即在血浆中的稳定性，分别将NB06、AoGDW和RGDS(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸-丝氨酸)(终浓度分别为1、4和20uM)与PRP(加入量同上)37℃孵育3h后，以浓度为20uM ADP诱导血小板聚集，测定最大血小板聚集率。测定时间为10分钟。所用仪器为Helena Packs-4型血小板聚集仪。相同条件下设对照组作直接检测，以对比孵育与不孵育的活性差别。同时，用生理盐水作阴性对照，以测定最大血小板聚集率。每组设3个平行实验，测定最大血小板聚集率后，计算各组的聚集抑制率(计算方法参考实施例5)。对各抑制率求平均值后，对比不同药品抑制血小板聚集的活性变化。

实验结果如下：

1)生理盐水组不孵育的最大血小板聚集率为87.6，孵育3小时后的血小板聚集率为87.1；

2)NB06(终浓度为1uM)的稳定性实验结果

不孵育组的血小板聚集率分别为：56.2，55.8，54.3，对应的聚集抑制率为：35.8％，36.3％，38.0％，平均聚集抑制率为36.7％。孵育3h组的血小板聚集率分别为：55.1，55.7，54.8，对应的聚集抑制率为：36.7％，36.1％，37.1％，平均聚集抑制率为36.6％。

对比孵育组与不孵育组，NB06的血小板聚集抑制率几乎无差别。这说明，在富血小板血浆(PRP)中孵育3小时后，NB06具有与孵育前相同的抗血小板聚集活性，即NB06具有极好的稳定性。

3)AoGDW(终浓度为4uM)的稳定性实验结果

不孵育组的血小板聚集率分别为：25.8，27.4，24.5，对应的聚集抑制率为：70.6％，68.7％，72.0％，平均聚集抑制率为70.4％。孵育3h组的血小板聚集率分别为：38.3，32.6，40.7，对应的聚集抑制率为：56.0％，62.6％，53.3％，平均聚集抑制率为57.3％。

对比孵育组与不孵育组，AoGDW的血小板聚集抑制率有较明显的变化。与不孵育组相比，AoGDW孵育3小时后的抗血小板聚集活性下降为孵育前的81.4％。这说明AoGDW在富血小板血浆中可能有一定程度的降解，导致其抗血小板聚集活性的下降。

4)RGDS(终浓度为20uM)的稳定性实验结果

不孵育组的血小板聚集率分别为：68.5，70.2，71.6，对应的聚集抑制率为：21.8％，19.9％，18.3％，平均聚集抑制率为20.0％。孵育3小时组的血小板聚集率分别为：85.9，84.2，87.0，对应的聚集抑制率为：1.4％，3.3％，0.1％，平均聚集抑制率为1.6％。

对比孵育组与不孵育组，RGDS的血小板聚集抑制率有非常明显的变化。与不孵育组相比，RGDS孵育3h后的抗血小板聚集活性几乎消失，仅为孵育前活性的8％。这说明RGDS在富血小板血浆中有明显的降解，导致其抗血小板聚集活性明显下降，甚至消失。

5)三种RGD类肽的稳定性实验结果对比

由上述的实验结果可以看出，与血浆在体外共同孵育3小时后，NB06仍具有几乎100％的活性；AoGDW的活性降低为约80％；而RGDS的活性几乎完全丧失。这说明，NB06具有很好的抗血小板稳定性，这与其酰胺化的C末端结构有着密切的关系。

Claims

1、一种新的抗血小板四肽化合物—NB06，其氨基酸序列为ω-氨基辛酸-甘氨酸-天门冬氨酸-色氨酰胺。

2、权利要求1所述四肽化合物—NB06在制备抗血小板凝聚药物中的应用。

3、含有权利要求1所述化合物的药物组合物，其特征是它以所含治疗有效量的四肽化合物—NB06为活性成分，并且含有一种或多种药学上可接受的载体。

4、如权利要求3所述组合物在制备抗血小板凝聚药物中的应用。