CN100523217C - 一种检测肺癌相关的cyp2a13抗性基因的方法及其抗性基因 - Google Patents
一种检测肺癌相关的cyp2a13抗性基因的方法及其抗性基因 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及与肺癌患病风险相关的致癌物代谢酶基因CYP2A13的抗性等位基因的一种检测方法,所述方法为PCR-RFLP,即聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性分析。本发明同时涉及与肺癌患病风险相关的致癌物代谢酶基因CYP2A13的抗性等位基因。本发明进一步涉及检测上述抗性基因的试剂盒及使用。另外,本发明将致癌物代谢酶基因CYP2A13的C3375T(Arg257Cys)功能多态性与肺癌的患病风险联系起来,从而鉴定了肺癌的一个新型抗性基因,为肺癌的人群预防和吸烟的行为干预提供了新的遗传咨询内容及其分子判据。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤的人群预防中的个体抗性及其遗传学检测方法。具体地,本发明涉及与肺癌患病风险相关的致癌物代谢酶基因CYP2A13的抗性等位基因型及其检测方法。本发明进一步涉及上述抗性基因型的检测试剂盒,以及该试剂盒的应用。另外,本发明还涉及上述检测方法和抗性基因在肺癌预防和吸烟行为干预以及相关遗传咨询中的应用。
背景技术
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,已经证实吸烟和烟气暴露是肺癌的最重要风险因素。但肺癌的发生是环境与遗传相互作用的结果,吸烟人群中只有部分个体最终罹患肺癌。因此,判定肺癌抗性基因和以此为基础的遗传咨询和吸烟行为干预,对肿瘤的人群预防,降低吸烟相关的肿瘤发病率有重要的公共卫生意义。
烟草包含40种以上的致癌物质,大部分都通过导致DNA损伤来诱发肺癌。烟碱,又叫尼古丁(nicotine),是烟草中的生物碱。烟碱在烟草的加工、卷烟燃吸或者是在烟气吸入的瞬间,可生成4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone,NNK),它是强烈的动物致癌物,可诱发小白鼠、大白鼠及叙利亚金色田鼠发生肺癌[1]。研究表明,在新陈代谢活动中,NNK可使动物活体和离体的人体组织中的DNA(脱氧核糖核酸)甲基化,这从各种组织中分离出7-甲基鸟嘌呤及O-6-甲基鸟嘌呤而得到证明[2]。其中的亚硝胺类衍生物NNK在体内需氧化激活后才能成为最终的致癌物并诱发肺癌。文献报道了对NNK氧化能力最高的代谢酶CYP2A13主要在肺和呼吸道等组织表达[3],该基因存在一个功能的单核苷酸多态(single nucleotidepolymorphism,SNP)位点,位于第五外显子的一个碱基替换C3375T导致编码氨基酸改变(Arg257Cys),并且在体外实验中CYP2A13的257Cys变异体酶比野生型酶对NNK等底物的氧化活性显著要低,提示该等位基因在致癌物靶点组织的表达可能起到降低致癌物代谢活化和减轻其基因毒性的保护作用[4]。虽然CYP2A13的Arg257Cys多态性的功能虽然在体外实验中进行了酶学验证,但在群体水平考察它在肿瘤病因学中的意义,特别是与肺癌抗性的相关性,至今无任何文献报道。
另一方面,已报道的对CYP2A13 C3375T功能SNP进行聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性分析(PCR-RFLP)分析有一定缺陷[4]。因为CYP2A基因亚家族的几个成员(CYP2A6,CYP2A7,CYP2A13)的基因组核苷酸序列的同源性非常高,在进行基因片段的DNA扩增时,很可能造成非特异性扩增和分析结果的错误。因此,需要对基因特异性引物设计和PCR的扩增条件进行优化,以保证在基于群体或社区的遗传咨询和吸烟行为干预前进行特异性和准确性都很高的高通量基因分型。
因此,本发明的目的是判明CYP2A13的C3375T功能SNP与肺癌抗性的相关性,并提供用PCR-RFLP对该位点进行高通量基因分型的方法。
发明内容
发明人直接考察了致癌物代谢酶基因CYP2A13的C3375T功能SNP与肺癌患病风险的相关性。通过基于医院的大规模病例对照研究,进行了大量的临床和实验室实验和大样本的统计分析,判明携带CYP2A13的T3375(Cys257)等位基因型的个体对肺癌罹患风险表现出显著的抗性,首次在群体水平,鉴定了CYP2A13的影响致癌物NNK氧化活性的Arg257Cys功能多态与肺癌患病风险的相关性。从而本发明鉴定了致癌物代谢酶系统中与肺癌罹患风险关联的一个抗性等位基因型。
本发明提供了一种检测与肺癌罹患风险关联的抗性等位基因型CYP2A13C3375T的方法,具体而言,该方法为PCR-RFLP法。
本发明还提供了与肺癌罹患风险关联的一个抗性等位基因型CYP2A13C3375T。
本发明还提供了一种通过检测致癌物代谢酶基因CYP2A13多态性判定个体对肺癌抗性的方法。
本发明还提供了用于检测致癌物代谢酶基因CYP2A13 C3375T功能多态性的引物对。
本发明进一步提供了一种检测与肺癌罹患风险关联的一个抗性等位基因型CYP2A13C3375T的试剂盒,以及上述试剂盒在肺癌人群预防与吸烟行为干预中的应用。
本发明还提供了上述检测方法和抗性基因型在在肺癌人群预防与吸烟行为干预中的应用。
根据本发明的一个方面,本发明提供了与肺癌罹患风险关联的一个抗性等位基因型CYP2A13 C3375T的一种检测方法,该方法为PCR-RFLP法。具体的说,包括了如下步骤:
A:对CYP2A13的C3375T所在第五外显子设计基因序列特异性引物,并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的高特异性PCR扩增;
B:对PCR产物以限制性内切酶HhaI进行切割,并以琼脂糖凝胶电泳分析内切酶消化产物的带型,以此判明CYP2A13 C3375T的基因型;
另一方面,本发明还提供了与肺癌罹患风险关联的一个抗性等位基因型CYP2A13C3375T。其中具体为,CYP2A13的T3375(Cys 257)等位基因型为肺癌抗性基因.
另一方面,本发明还提供了一种通过检测致癌物代谢酶基因CYP2A13多态性判定人群或个体对肺癌抗性的方法。其中,该方法包括
A:对CYP2A13的C3375T所在第五外显子设计基因序列特异性引物,并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的高特异性PCR扩增;
B:对PCR产物以限制性内切酶HhaI进行切割,并以琼脂糖凝胶电泳分析内切酶消化产物的带型,以此判明CYP2A13 C3375T的基因型;
C.当所述基因表现CYP2A13 T3375或该基因编码的多肽携带Cys257时,则表明该个体具有一定的肺癌抗性。
另一方面,检测致癌物代谢酶基因CYP2A13的C3375T功能SNP的基因特异性引物对,其序列为:正向引物:见序列表中序列1,反向引物:见序列表中序列2。
另一方面,本发明还提供了一种与肺癌罹患风险关联的抗性等位基因型CYP2A13 C3375T的检测试剂盒,其内装有一个或多个容器,容器内装有用以检测CYP2A13 C3375T抗性等位基因型的一种或多种组分。与之同时提供的可以是经政府食品与药品监督管理部门审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售方面的信息。例如,在DNA的PCR扩增方法实施中,直接检测样品的CYP2A13 C3375T抗性等位基因型的试剂盒,可含有PCR的引物对(见序列表中序列1和见序列表中序列2),dNTP,用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液等的一种或多种。本领域技术人员已知,以上的组分仅是示意性的,所述用于PCR反应的DNA聚合酶可以是TaqDNA聚合酶,例如,HotStar Taq酶Klenow片段,Tth DNA聚合酶,VENT DNA酶等能够用于PCR扩增的酶。但考虑到CYP2A基因家族成员基因组序列高度的同源性,为保证特异性扩增,除了引物和反应条件的优化外,应优选HotStar Taq酶。在PCR产物的RFLP分析中,该试剂盒可含有HhaI及其缓冲液,该基因片段的HhaI酶切图谱等。
并说明使用方法如下:
1)PCR扩增
对样品基因组DNA(其具体制备方法参见实施例),用本发明提供的引物,按照如下反应体系和条件进行PCR扩增:25-μl反应体系为:20~100ng基因组DNA,0.2μM引物,0.2mM dNTP,1.5mM MgCl2,1.0unit HotStarTaqTM DNA聚合酶以及1×缓冲液(QIAGEN,Chatsworth,CA)。95℃15min预变性后进行2个阶段的扩增,其变性和延伸条件一致,均为94℃30s和72℃50s,在第一阶段的13个循环中,退火温度从63℃开始每个循环降0.5℃,第二阶段扩增的退火温度则固定在57.5℃。最后的72℃延伸时间为7min.特异性的375bpPCR产物以1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
2)RFLP分析
对经琼脂糖凝胶电泳鉴定的PCR产物,按照如下反应体系和条件进行限制性内切酶的切割消化:10μl的反应体系为:5μl PCR产物DNA,2单位限制性内切酶HhaI,10×缓冲液1μl,和双蒸馏水。限制性酶切反应终止后,将样品进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,从而进行基因型判定。其中,基因型区分的依据是,375bp的PCR产物以HhaI限制性内切酶消化后,C/C野生型纯合子被切割为两条片段,长度分别为217和158核苷酸;C/T杂合子经消化后,不同长度的该三个片段均出现;而变异型纯合子T/T则因为没有酶切位点而在消化后只出现375bp一个条带。
本发明还提供了与肺癌患病风险相关的致癌物代谢酶基因CYP2A13的抗性等位基因及其检测方法在肺癌的人群预防和吸烟的行为干预中的应用。例如,由于本发明证实了CYP2A13与对致癌物NNK等的氧化活性降低相关的等位基因(T3375或Cys257)对肺癌的患病风险有显著抗性的保护作用,而且抗性基因型在人群中为频率和外显度都较低的等位基因(实施例2),因此,在肺癌的人群预防和吸烟的行为干预的设计和实施中,就需要对所咨询的对象个体基因组的CYP2A13的C3375T(Arg257Cys)基因型进行分析,以判明该对象个体是否携带有CYP2A13的T3375(Cys257)肺癌抗性等位基因。对CYP2A13野生型纯合子(C3375C,表现肺癌易感性)的个体,则可对吸烟行为进行科学的干预,包括尤其建议尽量减少香烟消费(包括二手烟),尽量消费低烟碱含量的香烟,这样可以针对性地降低这些易感人群的肺癌风险。
附图说明
图1.限制性内切酶HhaI(购自Promega公司)消化375bp PCR扩增产物的电泳图谱。其中,泳道1(自右向左):标准分子量参照物DL2 000(购自TaKaRa公司);泳道2、5、7和8:含C/C野生型纯合子PCR产物的结果,PCR产物被切割为长度分别为217bp和158bp的两条片段;泳道4和6:含C/T杂合子PCR产物的结果,出现了长度分别为217bp、158bp和375bp的三条片段;泳道2:含T/T变异型纯合子PCR产物的结果,只出现375bp的一个条带。
实施例:
实施例1.
该实施例设计并合成了一套引物对,并且在该引物对的基础上,设计了一种检测与肺癌罹患风险关联的抗性等位基因型CYP2A13 C3375T功能多态性的方法。
1.基因组DNA的提取:
采取本领域常规的Miller改良盐析法提取外周血白细胞基因组DNA。
1)取柠檬酸钠或EDTA-Na2抗凝全血5ml(尽量不用肝素抗凝),置于50ml有盖离心管;
2)加入3-5倍体积冷蒸馏水,反复颠倒混匀,冰中放置5分钟,4℃ 2 000rpm离心20分钟;
3)缓慢倾倒上清,沉淀加入预冷的0.1% Triton-X100(体积同上),轻柔混匀沉淀,如上离心,弃上清;
4)沉淀加入4ml裂解液(50Mm Tris-Cl—10mM EDTA,pH8.0),彻底打碎沉淀,然后加入10%SDS至终浓度为0.5%,混匀;
5)加入蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度为200μg/ml,混匀,55℃3小时或37℃过夜消化(以过夜消化为佳);
6)加入6M NaCl 1.2ml,剧烈振荡20秒,2,200rpm离心10分钟,将上清转移至另一个有盖离心管;
7)加入2倍体积预冷无水乙醇,反复颠倒混匀至出现絮状DNA沉淀,挑出DNA至另一Eppendorf管;
8)以75%预冷乙醇洗涤DNA沉淀2次;
9)以0.5ml TE(10mM Tris-Cl—EDTA,pH8.0)或蒸馏水溶解DNA沉淀,电泳检测DNA片段大小,或测260/280nm OD比值。
2.PCR扩增:
用本发明提供的引物,按照如下反应体系和条件进行PCR扩增:25-μl反应体系为:20~100ng基因组DNA,0.2μM引物,0.2mM dNTP,1.5mM MgCl2,1.0unit HotStarTaqTMDNA聚合酶以及1×缓冲液(QIAGEN,Chatsworth,CA)。95℃15min预变性后进行2个阶段的扩增,其变性和延伸条件一致,均为94℃ 30s和72℃ 50s,在第一阶段的13个循环中,退火温度从63℃开始每个循环降0.5℃,第二阶段扩增的退火温度则固定在57.5℃。最后的72℃延伸时间为7min.特异性的375bp PCR产物以1%的琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。
3.RFLP分析:
按照如下反应体系和条件进行限制性内切酶的切割消化:10μl的反应体系为:5μl PCR产物DNA,2单位限制性内切酶HhaI(Promega),10×缓冲液1μl,和双蒸馏水。37℃消化过夜,以溴酚兰载样缓冲液终止酶切反应,将反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离,从而进行基因型判定。其中,基因型区分的依据是,375bp的PCR产物以HhaI限制性内切酶消化后,C/C野生型纯合子被切割为两条片段,长度分别为217和158核苷酸;C/T杂合子经消化后,不同长度的该三个片段均出现;而变异型纯合子T/T则因为没有酶切位点而在消化后只出现375bp一个条带。
实施例2.
该实施例用实施例1建立起来的方法,对724例肺癌患者和791个对照的健康个体中CYP2A13 C3375T基因型的分布进行了分析。
1.试验对象:该实施例中针对的724例病人和791例对照均为中国北方汉族个体,无直属亲属关系。病例组都是中国医学科学院肿瘤医院在1997—2001年间收治的经组织病理学确诊的原发性肺癌患者,术前未经放射和抗癌化学药物治疗。无肿瘤病史和临床体征的正常对照人群来自在北京地区进行的一项大规模营养流行病学调查,对照组的性别和年龄与病例组的频数相匹配。在收集组织标本或血样的同时,每个研究对象均签署知情同意书并提供详细的社会人口学资料以及吸烟史、每天吸烟量、吸烟起始和戒烟年龄等资料。
2.分析CYP2A13C3375T基因型的分布:724例肺癌患者和791个对照的健康个体中。CYP2A13 C3375T基因型在实验的病例与对照人群中的频率分布见表1所示:C3375T在病例组和对照组的频率分别为11.7%和16.4%;因为变异型纯合子(T/T)在人群中的频率很低,当按照显性模型将T/T纯合子与C/T杂合子归并起来作为一组与野生纯合子(C/C)进行比较,结果显示两组的肺癌发病风险差异显著:携带抗性等位基因型T的个体(基因型为C/T或T/T)的患病风险只有野生型(C/C)个体的0.62倍,其统计学95%的置信区间是0.45到0.87倍。表中校正OR是以CYP2A13 C/C基因型为参考(即该基因型的比值比是1)并对年龄性别和吸烟状况进行校正分析得到,其中的T/T和C/T按照显性遗传模式归并为一组与参考组进行比较,以95%的置信区间表示统计的显著性。也就是,用本发明的方法,解析了CYP2A13的C3375T功能多态位点与肺癌抗性的相关性。
表1:实施例2病例与对照人群中CYP2A13 C3375T基因型的分布及其与肺癌风险的相关性
应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,但所作改动或修改的等价形式同样落在本申请权利书所限定的范围内.
参考文献
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3.Su,T.,Bao,Z.,Zhang,Q.-Y.,Smith,T.J.,Hong J.-Y.,and Ding,X.Human cytochrome P450CYP2A13:predominant expression in the respiratorytract and its highefficiency metabolicactivation of a tobacco-specific carcinogen,4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone.Cancer Res.,60:5074-5079,2000.
4.Zhang,X.,Su,T.,Zhang,Q.Y.,Gu,J.,Caggana,M.,Li,H.,and Ding,X.Geneticpolymorphisms of the human CYP2A13 gene:identification of single-nucleotidepolymorphisms and functional characterization of an Arg257Cys variant.J.Pharmacol.Exp.Ther.,302:416-423,2002.
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所
<120>一种检测肺癌相关的CYP2A13抗性基因的方法及其抗性基因
<130>
<140>200310113359.1
<141>2003-11-12
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>
<400>1
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>
<400>2
Claims (1)
1、与肺癌罹患风险关联的一个抗性等位基因型CYP2A13 C3375T的一种检测试剂盒,其内装一个或多个容器,包括:序列1和序列2所示扩增用基因特异性引物对,dNTP,用于PCR反应的TaqDNA聚合酶及其缓冲液的一种或多种,用于RFLP的限制性内切酶Hha I和相应缓冲液的一种或多种,该基因片段的Hha I酶切图谱。
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