CN100478018C

CN100478018C - 一种治疗肝癌的药物及其制备方法

Info

Publication number: CN100478018C
Application number: CNB2006100262781A
Authority: CN
Inventors: 周阿高; 张勇; 孔德云; 葛海良; 任秋华
Original assignee: Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2006-04-29
Filing date: 2006-04-29
Publication date: 2009-04-15
Anticipated expiration: 2026-04-29
Also published as: CN1879818A

Abstract

本发明公开一种治疗H₂₂肝癌药物，它是以斑蝥、陈皮、谷芽为原料。本发明还公开了该药物的制备方法，它包括以下步骤：(1)取斑蝥、陈皮、谷芽，加水，浸泡、煮沸，过滤：(2)药渣加水继续煮沸，过滤；(3)合并两次滤液，浓缩，药液冷却装入灭菌药瓶。本发明具有中药复方药学最大化，毒性最小化，作用部位多靶点的优点。经实验初步验证，本药具有抑制肿瘤生长和调节机体免疫功能的双重效应，为临床治疗肿瘤提供了依据。同时，本药毒副作用较小，适于长期服用，是一种安全有效的药物。

Description

一种治疗肝癌的药物及其制备方法

技术领域

本发明关于一种治疗H₂₂肝癌药物。具体地说是以中草药为原料制备的中成药，本发明还关于该药物的制备方法。

背景技术

中药斑蝥早在十三世纪的《仁斋直指方》中就有记载，可用治于乳癌及腹部癌。古人还常用“斑蝥煮鸡蛋，弃斑蝥食蛋”的偏方治疗肝癌及其它消化系统癌症，至今仍在民间沿用。中医学认为斑蝥性寒味辛，有大毒。据《神农本草经》记载，斑蝥可以治疗痈疽、溃疡、癣疮等病症，具有攻毒蚀疽、破血散结的作用。临床发现其还有多种新用途，治疗一些疑难杂症具有独特的疗效，如治疗风湿痛、神经痛、梅核气、斑秃、乳腺增生、鼻炎、传染疣、肝炎、癌肿等，尤其对原发性肝癌有肯定的治疗效果。

原发性肝癌(PHC，以下简称肝癌)为常见的消化道恶性肿瘤，东亚地区是世界肝癌高发区，其发病率在恶性肿瘤中居第三位，男性肝癌发病率约是女性的3倍，新病例中73％是男性。肝癌病死率高(死亡率/发病率＝0.95)，2000年死亡病例39.6万，在恶性肿瘤死因中排列第二。如何有效地防治本病是医药界面临的一个重要课题。目前，特别对H₂₂肝癌治疗还没有特效的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗H₂₂肝癌，且安全有效，适于长期服用的药物。

本发明的另一目的在于提供治疗H₂₂肝癌药物的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方法来实现的：

本发明发明了由斑蝥为主要成分的药物，然后选择移植性肝癌H₂₂小鼠为模型，观察该药物的抑瘤作用，检测T淋巴细胞增殖功能、NK细胞杀伤功能、T淋巴细胞表型变化及IL-12、IL-4含量。

本发明药物是由下列组分制成的(用量为重量份)

斑蝥10-20份。

本发明药物也可是由下列组分制成的(用量为重量份)

斑蝥10-20份、陈皮5-10份、谷芽5-10份。

本发明药物的配方优选重量(份)配比范围是：

斑蝥12-18份、陈皮6-8份、谷芽6-8份。

本发明药物的最佳重量(份)配比是：

斑蝥15份、陈皮7份、谷芽7份。

本发明药物的制备方法(一)

(1)取斑蝥，加水，浸泡、煮沸，过滤：

(2)药渣加水继续煮沸，过滤；

(3)合并两次滤液，浓缩，药液冷却装入灭菌药瓶。

本发明药物的制备方法(二)

(1)斑蝥、陈皮、谷芽，加水，浸泡、煮沸，过滤：

(2)药渣加水继续煮沸，过滤；

(3)合并两次滤液，浓缩，药液冷却装入灭菌药瓶。

药效学研究：

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1治疗H₂₂肝癌药物的制备：取中药斑蝥置煎煮容器内，加相当于药材量5-7倍的冷水浸泡1-2h，煮沸30min，过滤。药渣加3-5倍量水继续煎煮，煮沸20min，过滤。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材0.01g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4℃冰箱备用。

1.1.2动物：C57BL/6小鼠，雄性，10周龄，购自上海中科院动物中心。

1.1.3瘤株：肝癌H₂₂瘤株，由上海市免疫学研究所提供。

1.1.4试剂：ConA(Sigma公司)，CD3、CD4、CD8单抗(eBioScience公司)，NK细胞杀伤试剂(上海市免疫研究所自配)，³H-TdR(上海原子能研究所)，IFN-γ和IL-4检测试剂盒(晶美公司)。

1.2实验方法

1.2.1造模方法：无菌条件下取生长7-9d传代接种的H₂₂细胞株，将细胞5×10⁶接种于每只小鼠右侧腋窝皮下。

1.2.3动物分组及给药方法：小鼠30只，10只作为正常组，其余均按上法造模。小鼠接种肿瘤5天后，随机分成生理盐水组和实验组，每组10只，生理盐水组予以生理盐水处理，实验组给予治疗H₂₂肝癌药物水煎液0.01g/ml，均灌胃0.2ml/只，连续给药15天。

1.2.4标本采集：停药次日，断颈处死小鼠，剥离肿瘤组织并无菌取脾。

1.3检测指标

1.3.1小鼠体重、瘤重及抑瘤率：胃饲15天后，称取两组小鼠体重；处死小鼠后完整剥离肿瘤，用电子天平称取瘤重，计算抑瘤率。

1.3.2T淋巴细胞增殖功能：采用³H-TdR掺入法。在96孔平底培养板中，每孔加入小鼠脾细胞悬液100μl，浓度为5×10⁶/ml，三复孔培养。同时，分别加入ConA 10μl。于37℃、5％CO₂条件下培养72h。终止培养前16h，每孔加入³H-TdR 1μCi。用细胞收集仪将细胞收集于玻璃纤维滤纸上，β-液闪仪测定cpm值，并计算刺激指数。

1.3.3NK杀伤功能：用1640培养液分别调整小鼠脾细胞(效应细胞)和体外培养的K562细胞(靶细胞)浓度为5×10⁶/ml和1×10⁵/ml。按效∶靶＝50∶1比例，各取100μl加入96孔平底培养板，37℃、5％CO₂条件下共同培养4h。并设自然释放和最大释放组作为实验阴阳性对照。然后1000rpm，离心5min。吸取上清100μl，加入底物液100μl，静置3min显色。再加入1N HCL终止反应，490nm波长读取OD值。计算NK细胞的杀伤百分率。

1.3.4T淋巴细胞表型：采用直接免疫荧光及流式细胞仪分析。取小鼠脾细胞1×10⁶，加入适量PE-Cy5-CD3、FITC-CD4和PE-CD8混合单抗，室温避光孵育20min。1000rpm，离心5min，洗涤2次后，加入300μl固定液，上机检测。

1.3.5细胞因子：采用ELISA法。收集小鼠脾细胞经ConA刺激24h后的培养上清，按照细胞因子检测试剂盒操作说明分别测定IFN-γ和IL-4的含量。

1.4统计学处理：采用Statpal团体T检验统计分析各组别数据的差异显著性。

2结果

2.1治疗H₂₂肝癌药物对荷瘤小鼠体重、瘤重及抑瘤率的影响：结果如图1所示。与正常组比较，两组发生肿瘤的小鼠体重均减轻，而实验组小鼠体重下降明显(P＝0.001)，但实验组小鼠肿瘤重量显著小于生理盐水组小鼠瘤重(P＝0.0015)，抑瘤率达65.76％。表明治疗H₂₂肝癌药物能有效抑制小鼠肝癌细胞的生长。

2.2治疗H₂₂肝癌药物对荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖的影响：两组T淋巴细胞转化功能均较正常小鼠有显著降低。实验组小鼠T淋巴细胞转化刺激指数增加显著(SI＝4.34＞3，P＝0.00129)，具有较强的增殖能力，结果见图2。说明治疗H₂₂肝癌药物能显著上调小鼠的T淋巴细胞增殖功能。

2.3治疗H₂₂肝癌药物对荷瘤小鼠NK细胞杀伤功能的影响：与正常组比较，单纯胃饲生理盐水组NK细胞杀伤活性无显著性差异，说明罹患肝癌后，并不能有效地刺激小鼠NK细胞产生针对肿瘤的免疫应答。实验组小鼠NK细胞杀伤活性显著增高，为生理盐水组的5倍(P＜0.005)，结果见图3。说明治疗H₂₂肝癌药物能增强患瘤小鼠NK细胞的杀伤功能。

2.4治疗H₂₂肝癌药物对荷瘤小鼠T细胞亚群变化的影响：如图4所示，与正常组比较，两肿瘤小鼠组T细胞数量均有明显下降(P＜0.05)，说明其免疫功能低下。同时，两组小鼠外周T细胞亚群比例发生明显变化：

CD4⁺/CD8⁺比例倒置，这可能是因为发生肿瘤后，小鼠体内肿瘤特异性CD8⁺T细胞克隆增殖的结果。而生理盐水组与实验组相比，后者更能改变T淋巴细胞亚群比例。

2.5治疗H₂₂肝癌药物对荷瘤小鼠分泌细胞因子能力的影响：IFN-γ测定显示见图5，实验组小鼠T细胞分泌IFN-γ能力有显著升高(P＜0.05)，说明治疗H₂₂肝癌药物能显著上调CD4⁺Th1细胞的分泌能力，并进而上调小鼠细胞免疫功能，促进CD8⁺细胞毒性T细胞的抗肿瘤作用。IL-4检测结果显示见图6，实验组小鼠T细胞分泌IL-4的能力有显著升高(P＜0.001)，说明治疗H₂₂肝癌药物能显著上调CD4⁺Th2细胞的分泌能力，并进而上调小鼠体液免疫功能。综合以上两种情况，实验组既能上调小鼠细胞免疫功能，又能有效刺激小鼠的体液免疫功能，因此能有效抑制小鼠肿瘤的生长。

本发明所公开一种治疗H₂₂肝癌药物及其制备方法，其优点表现在：该药物属于中药复方制剂，其配伍符合中药“君臣佐使”原则，具有中药复方药学最大化，毒性最小化，作用部位多靶点的优点。经实验初步验证，本药具有抑制肿瘤生长和调节机体免疫功能的双重效应，为临床治疗肿瘤提供了依据。同时，本药毒副作用较小，适于长期服用，是一种安全有效的药物。

附图说明

图1显示治疗H₂₂肝癌药物对荷瘤小鼠体重及瘤重的影响。

图2显示治疗H₂₂肝癌药物对荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖的影响

注1.正常组T淋巴细胞转化刺激指数为42.01；

注2.与生理盐水组比较，*P＜0.01。

图3显示治疗H₂₂肝癌药物对荷瘤小鼠NK细胞杀伤功能的影响

注：与生理盐水组比较，*P＜0.01。

图4显示治疗H₂₂肝癌药物对荷瘤小鼠T细胞亚群变化的影响。

图5显示治疗H₂₂肝癌药物对荷瘤小鼠分泌IFN-γ能力的影响

注：与生理盐水组比较，*P＜0.01。

图6显示治疗H₂₂肝癌药物对荷瘤小鼠分泌IL-4能力的影响

注：与生理盐水组比较，*P＜0.01。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

治疗H₂₂肝癌药物的制备(一)

取中药斑蝥150g置煎煮容器内，加入750g的冷水浸泡1h，煮沸30min，过滤。药渣加入450g水继续煎煮，煮沸20min，过滤。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材0.01g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4℃冰箱备用。

治疗H₂₂肝癌药物的制备(二)

取中药斑蝥200g置煎煮容器内，加入1400g的冷水浸泡2h，煮沸30min，过滤。药渣加入800g量水继续煎煮，煮沸20min，过滤。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材0.01g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4℃冰箱备用。

治疗H₂₂肝癌药物的制备(三)

取中药斑蝥100g置煎煮容器内，加入600g的冷水浸泡1.5h，煮沸30min，过滤。药渣加入400g水继续煎煮，煮沸20min，过滤。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材0.01g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4℃冰箱备用。

治疗H₂₂肝癌药物的制备(四)

取中药斑蝥50g、陈皮25g、谷芽25g置煎煮容器内，加入600g的冷水浸泡1.5h，煮沸30mi n，过滤。药渣加入400g水继续煎煮，煮沸20min，过滤。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材0.01g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4℃冰箱备用。

治疗H₂₂肝癌药物的制备(五)

取中药斑蝥100g、陈皮50g、谷芽50g置煎煮容器内，加入1400g的冷水浸泡2h，煮沸30mi n，过滤。药渣加入800g量水继续煎煮，煮沸20min，过滤。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材0.01g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4℃冰箱备用。

治疗H₂₂肝癌药物的制备(六)

取中药斑蝥60g、陈皮40g、谷芽35g置煎煮容器内，加入750g的冷水浸泡1h，煮沸30min，过滤。药渣加入450g水继续煎煮，煮沸20min，过滤。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材0.01g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4℃冰箱备用。

Claims

1、一种治疗H₂₂肝癌药物，其特征在于：该药物是由原料药斑蝥、陈皮、谷芽制成，各原料药的重量份比为：斑蝥10-20份、陈皮5-10份、谷芽5-10份。

2、根据权利要求1所述的药物，其特征在于它是由下列重量份的原料药制成：斑蝥12-18份、陈皮6-8份、谷芽6-8份。

3、根据权利要求2所述的药物，其特征在于它是由下列重量份的原料药制成：斑蝥15份、陈皮7份、谷芽7份。

4、根据权利要求1所述的药物制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)取斑蝥，加水，浸泡、煮沸，过滤：

(2)药渣加水继续煮沸，过滤；

(3)合并两次滤液，浓缩，药液冷却装入灭菌药瓶。

5、根据权利要求4所述的药物制备方法，其特征在于：步骤(1)中加水量为药材量5-7倍，浸泡时间为1-2h，煮沸30min。

6、根据权利要求4所述的药物制备方法，其特征在于：步骤(2)中加水量为药材量3-5倍，煮沸20min。

7、根据权利要求4所述的药物制备方法，其特征在于：步骤(3)中药液浓缩为相当于原生药材0.01g/ml。

8、根据权利要求3所述的药物制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)取斑蝥、陈皮、谷芽，加水，浸泡、煮沸，过滤；

(2)药渣加水继续煮沸，过滤；

(3)合并两次滤液，浓缩，药液冷却装入灭菌药瓶。

9、根据权利要求8所述的药物制备方法，其特征在于：步骤(1)中加水量为药材量5-7倍，浸泡时间为1-2h，煮沸30min。