CN100422314C - 一种获得羽衣甘兰小孢子再生植株的方法及其专用培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种获得羽衣甘兰小孢子再生植株的方法及其专用培养基。该培养方法包括以下步骤：1)将小孢子接种于胚状体诱导培养基中，至终浓度为5×10⁴-5×10⁵个/mL，接着在30-35℃、黑暗条件下高温胁迫处理24-72小时后，再转入24-26℃、黑暗条件下诱导胚状体；2)待鱼雷期至子叶期胚状体形成后，将胚状体先在24-26℃、1500-2500Lux、14-18小时光照/天条件下继续培养5-10天，再将胚状体接种于分化培养基中，在相同条件下培养；3)长出茎、叶后，将植株转接入生根培养基中，在24-26℃、1500-2500Lux、14-18小时光照/天条件下进行生根培养，得到羽衣甘兰再生植株。本发明将在羽衣甘兰的繁育及其品种改良中发挥重要作用。

Description

一种获得羽衣甘兰小孢子再生植株的方法及其专用培养基

技术领域

本发明涉及植物的小孢子培养方法及其专用培养基，特别是涉及获得羽衣甘兰小孢子再生植株的方法及其专用培养基。

背景技术

植物具有杂种优势，因此目前的作物育种侧重在杂交育种上。这样一方面可以利用杂种的生长优势保证作物品种抗病高产，另一方面由于杂种的复杂遗传背景，使其不宜留种使用，从而能保护杂种研制者的利益。在杂交育种中，所用父母本材料的遗传背景必须是纯合的，经配种后才能得到性状一致的杂种。而要得到遗传背景纯合的亲本材料，在许多作物中都必须通过人工辅助自交授粉，经6-10年时间才能达到相对纯合，而且每代筛选材料由于杂合性遗传背景，选择的强度不能太高(避免优良隐性性状丢失)，从而造成筛选的群体量大，选出材料的可靠性及稳定性低，因此这种传统的杂交育种手段非常费时、费力。植物的雄性生殖细胞一花粉，由于经减数分裂后只带有一套亲本的染色体，是单倍性细胞，通过花药或未成熟花粉(小孢子)培养可以获得单倍体植株，再通过染色体加倍可成为双单倍体材料，这样可以使该植株的遗传背景达到完全纯合状态。这样一方面可以克服杂合状态时，显性基因对隐性基因的屏蔽作用，有利于隐性突变或基因重组性状的表达，获得更多的材料类型；另一方面可以一步获得纯合材料，进而可作为亲本材料应用于作物的杂交育种中。通常由小孢子培养来获得纯合材料仅需1-2年时间，不仅大大加速了育种进程，使育种效率也获得大幅提高，因此国际上对作物的单倍体育种研究非常重视，并已在小麦、大麦、油菜和白菜等多种作物上建立了良好的单倍体育种体系。

观赏用羽衣甘兰(Brassica oleracea var.acephala)属十字花科芸苔属甘兰类的观叶植物，又名“叶牡丹”，其着色叶球俯卧，如盛开的牡丹，雍容华贵，鲜艳亮丽，且抗寒性很强，近来在许多城市已成为秋冬至早春的主要景观地被植物。该植物杂种优势明显，生长势强，抗病性好，而且作为观赏植物，杂种一代能在最大程度上保证群体生长特性的一致性，整齐度和观赏价值均得到大幅提高，目前，杂交育种已成为主要的育种手段。但是，由于甘兰类植物是两年生植物，需要长时间严格的低温春化处理才能开花，传统育种中采用反复自交的方法获得纯合材料需要8-10年时间，不仅需时长，效率低，而且对于具有观赏价值的隐性性状难于捕获。迄今为止，有关羽衣甘兰的游离小孢子培养技术及其在育种中的应用，国内外尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于培养羽衣甘兰小孢子再生植株的培养基。

本发明所提供的用于培养羽衣甘兰小孢子再生植株的培养基，由胚状体诱导培养基、分化培养基和生根培养基3种培养基组成：

其中，胚状体诱导培养基的配方为：KNO₃ 100-150mg，Ca(NO₃)₂·4H₂O 450-550mg，MgSO₄·7H₂O 100-150mg，KH₂PO₄ 100-150mg，FeSO₄·7H₂O 27.5-28mg，EDTA·Na₂37-37.5mg，KI 0.8-0.85mg，CoCl₂·6H₂0 0.02-0.03mg，H₃BO₃ 6-6.5mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.2-0.3mg，MnSO₄·4H₂O 22-22.5mg，CuSO₄·5H₂O 0.02-0.03mg，ZnSO₄·7H₂O 8.4-8.8mg，肌醇80-120mg，烟酸4-6mg，吡哆醇0.4-0.6mg，硫胺素0.4-0.6mg，甘氨酸1.8-2.2mg，叶酸0.4-0.6mg，生物素0.04-0.06mg，谷氨酰胺700-900mg，丝氨酸80-120mg，谷胱甘肽25-35mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.8-1.2mg，蔗糖100-150g，活性炭0.10-0.30g，用水定容至1L，pH 5.8-5.9；

分化培养基的配方为：NH₄NO₃ 1600-1700mg，KNO₃ 1850-1950mg，CaCl₂·2H₂O400-480mg，MgSO₄·7H₂O 350-400mg，KH₂PO₄ 150-200mg，FeSO₄·7H₂O 27.5-28mg，EDTA·Na₂ 37-37.5mg，KI 0.8-0.85mg，CoCl₂·6H₂O 0.02-0.03mg，H₃BO₃ 6-6.5mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2-0.3mg，MnSO₄·4H₂O 22-22.5mg，CuSO₄·5H₂O 0.02-0.03mg，ZnSO₄·7H₂O 8.4-8.8mg，肌醇80-120mg，烟酸0.4-0.6mg，吡哆醇0.4-0.6mg，硫胺素0.08-0.12mg，甘氨酸1.8-2.2mg，蔗糖25-35g，琼脂8-12g，用水定容至1L，pH 5.8-5.9；

生根培养基的配方为：NH₄NO₃ 800-850mg，KNO₃ 900-1000mg，CaCl₂·2H₂O200-240mg，MgSO₄·7H₂O 175-200mg，KH₂PO₄ 75-100m8，FeSO₄·7H₂O 27.5-28mg，EDTA·Na₂ 37-37.5mg，KI 0.8-0.85mg，CoCl₂·6H₂O 0.02-0.03mg，H₃BO₃ 6-6.5mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2-0.3mg，MnSO₄·4H₂O 22-22.5mg，CuSO₄·5H₂O 0.02-0.03mg，ZnSO₄·7H₂O 8.4-8.8mg，肌醇80-120mg，烟酸0.4-0.6mg，吡哆醇0.4-0.6mg，硫胺素0.08-0.12mg，甘氨酸1.8-2.2mg，蔗糖10-20g，琼脂8-10g，用水定容至1L，pH 5.8-5.9。

本发明的第二个目的是提供一种获得羽衣甘兰小孢子再生植株的方法。

本发明所提供的获得羽衣甘兰小孢子再生植株的方法，包括以下步骤：

1)将小孢子接种于胚状体诱导培养基中，至终浓度为5×10⁴-5×10⁵个/mL，接着在30-35℃、黑暗条件下高温胁迫处理24-72小时后，再转入24-26℃、黑暗条件下诱导胚状体；

2)待鱼雷期至子叶期胚状体形成后，将胚状体先在24-26℃、1500-2500Lux、14-18小时光照/天条件下继续培养5-10天，再将胚状体接种子分化培养基中，在相同条件下培养；

3)长出茎、叶后，将植株转接入生根培养基中，在24-26℃、1500-2500Lux、14-18小时光照/天条件下进行生根培养，得到羽衣甘兰再生植株。

在上述培养方法中，步骤1)中优选的小孢子分离自含60％以上单核靠边期小孢子细胞和40％以下双核期小孢子细胞的花蕾；接种于胚状体诱导培养基中的小孢子浓度优选为10⁵个/mL；高温胁迫处理条件优选为在33℃、黑暗条件下处理24小时；胚状体诱导温度优选为25℃。

步骤2)中将鱼雷期至子叶期胚状体先在25℃、2000Lux、16小时光照/天条件下继续培养7天。

步骤3)中的生根培养条件优选为25℃、2000Lux、16小时光照/天。

此外，为尽快使单倍体植株得到染色体加倍，可对步骤3)中得到的羽衣甘兰再生植株进行染色体倍性鉴定，并对单倍体植株的生长点部位用体积比为0.15-2.5％的秋水仙素连续处理36-60h，优选为48h，以使染色体加倍。

本发明提供了一种获得羽衣甘兰小孢子再生植株的方法及其专用培养基。该培养方法具有以下优点：1)能在93％的基因型里快速获得胚状体，在87％的基因型里获得单倍体及双单倍体植株，基因型适应性广，出胚率较高；2)可将常规育种中纯合材料的获取时间由8-10年降低为1-2年，且遗传背景完全纯合；3)在双单倍体植株当代，隐性基因及重组基因性状均能得到表达，极大地有利于观赏植物新性状的培育；4)可以对当代及二代的观赏性状如花色、株型和抗寒性等进行高强度优选，具有高效、省时、省力、稳定、可靠的优点。本发明的培养方法及其专用培养基将在羽衣甘兰的繁育及其品种改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为胚状体诱导培养基中培养3天后分裂的羽衣甘兰游离小孢子细胞

图2为由小孢子形成的鱼雷期、子叶期胚

图3为由胚状体发育的羽衣甘兰完整植株

图4为不同基因型的再生植株

图5为不同基因型再生植株当代的性状表现

图6为优选出的优良纯合新材料“冰清”

图7为优选出的新类型材料“粉羽”

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有培养基均用蒸馏水配制。

实施例1、羽衣甘兰小孢子再生植株的培养

将观赏用羽衣甘兰(Brassica oleracea var.acephala)供体母株生长于具有防虫网的塑料大棚内，基因型涵盖了各种类型的观赏用羽衣甘兰，叶型包括全缘圆叶，波浪叶，绉叶，浅裂叶和深裂叶等，叶色包括白色，浅黄，粉红，大红，紫红等，共计15份材料，在3-6月上旬(注意：在整个取材季节，及时打去开花结荚枝以及弱枝，保证新花序的旺盛生长)采集小孢子用本发明的方法进行体外培养，具体过程包括以下步骤：

1)游离小孢子培养

通过细胞核的DAPI荧光染色(Colemen A W，Goff L J.Application offluorochrome to pollen biology I.Mithramycin and 4’，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)as vital stain and for quantification ofnuclear DNA.Stain Technol，1985，60：145-154)，显微镜检，确定小孢子的发育时期，取含70％单核靠边期小孢子细胞和30％双核期小孢子细胞的花蕾，将花蕾用体积比为2.5％的次氯酸钠溶液表面灭菌15分钟，无菌水清洗3次，用杵棒挤压法在B5培养液(Gamborg et al.Plant tissue culture media.In vitro，1976，12：473-478)中释放出游离小孢子，经50μm孔径尼龙网过滤悬浮液，1000rpm离心5分钟，弃上清，以B5培养液重新悬浮沉淀，再重复清洗2次后，将小孢子接种于胚状体诱导培养基(配方见表1)中，至终浓度为10⁵个/mL，分装于培养皿中，每皿2.5mL，接着在33℃、黑暗条件下高温胁迫处理24小时后，再转入25℃、黑暗条件下培养，以诱导胚状体。3天后，培养于胚状体诱导培养基中的小孢子即开始出现一次分裂(见图1)，在以后的培养时间里细胞持续分裂，依次形成细胞团、原胚、球形胚和心型胚，约25天后形成鱼雷期、子叶期胚(见图2)。

2)分化培养

先将鱼雷期至子叶期胚状体在25℃、2000Lux、16小时光照/天条件下培养7天，再将胚状体接种于分化培养基(配方见表1)中，在相同条件下进行分化培养，约20天后长出茎、叶。

3)生根培养

将长出茎、叶的植株转接入生根培养基(配方见表1)中，在25℃、2000Lux、16小时光照/天条件下进行生根培养，得到羽衣甘兰再生植株(见图3)。

经观察，再生植株可由该胚状体直接形成，但大部分先通过该胚状体的下胚轴形成次生胚，再由次生胚进一步分化形成，约45天得到完整植株。自一个胚状体可以产生数个植株，也有的胚状体由于发育不完善，没有芽点，不能形成再生株。此外，小孢子培养胚状体形成能力及胚状体再生植株的能力明显受基因型的影响。据统计，在受试的15份不同基因型材料中，有14份材料获得小孢子胚状体，占受试基因型的93％，13份材料中获得了再生植株，占受试基因型的87％。

表1用于体外培养羽衣甘兰游离小孢子的培养基配方及灭菌方式

实施例2、羽衣甘兰小孢子再生植株的培养

将观赏用羽衣甘兰(Brassica oleracea var.acephala)供体母株生长于具有防虫网的塑料大棚内，基因型涵盖了各种类型的观赏用羽衣甘兰，叶型包括全缘圆叶，波浪叶，绉叶，浅裂叶和深裂叶等，叶色包括白色，粉红，大红，紫红和淡黄等，共计16份材料，在3-6月上旬采集小孢子用本发明的方法进行体外培养，具体过程包括以下步骤：

1)游离小孢子培养

通过细胞核的DAPI荧光染色，显微镜检，确定小孢子的发育时期，取含80％单核靠边期小孢子细胞和20％双核期细胞的花蕾，将花蕾用体积比为2.5％的次氯酸钠溶液表面灭菌15分钟，无菌水清洗3次，用杵棒挤压法在B5培养液中释放出游离小孢子，经50μm孔径尼龙网过滤悬浮液，1000rpm离心5分钟，弃上清，以B5培养液重新悬浮沉淀，再重复清洗2次后，将小孢子接种于胚状体诱导培养基(配方见表3)中，至终浓度为5×10⁴个/mL，分装于

培养皿中，每皿2.5mL，接着在30℃、黑暗条件下高温胁迫处理48小时后，再转入26℃、黑暗条件下培养，以诱导胚状体。约3-4天后，培养于胚状体诱导培养基中的小孢子即开始出现一次分裂，在以后的培养时间里细胞持续分裂，依次形成细胞团、原胚、球形胚和心型胚，约25天后形成鱼雷期、子叶期胚。

2)分化培养

先将鱼雷期至子叶期胚状体在22℃、2500Lux、14小时光照/天条件下培养10天，再将胚状体接种于分化培养基(配方见表3)中，在相同条件下进行分化培养，约25天后长出茎、叶。

3)生根培养

长出茎、叶后，将植株转接入生根培养基(配方见表3)中，在25℃、2500Lux、16小时光照/天条件下进行生根培养，得到羽衣甘兰再生植株。

经观察，再生植株可由该胚状体直接形成，但大部分先通过该胚状体的下胚轴形成次生胚，再由次生胚进一步分化形成，约45天得到完整植株。自一个胚状体可以产生数个植株，也有的胚状体由于发育不完善，没有芽点，不能形成再生株。此外，小孢子培养胚状体形成能力及胚状体再生植株的能力明显受基因型的影响。据统计，在受试的16份不同基因型材料中，有15份材料获得小孢子胚状体，占受试基因型的94％，14份材料中获得了再生植株，占受试基因型的88％。

4)染色体加倍处理

取步骤3)中得到的184株羽衣甘兰再生植株的幼叶，利用流式细胞仪(FACSCalibur，美国BD公司)进行苗早期的染色体倍性鉴定，结果再生植株的染色体构成复杂，含25％的单倍体，43％的二倍体(双单倍体)，其余还有部分多倍体及混倍体。对单倍体植株的生长点部位用质量百分浓度为0.2％的秋水仙素连续处理48h，以使染色体加倍。开花期的花粉情况观察表明，这些单倍体材料的加倍率为60％左右。此外，用本发明方法获得的羽衣甘兰再生植株的染色体自然加倍的能力在不同基因型中也有差异，以双单倍体为例，在不同基因型中的比率为22-67％。可见通过本发明的游离小孢子培养方法可以有效地获得双单倍体再生株，在短时间内即可实现材料遗传背景的纯合。

5)再生植株的性状优选

小心洗净再生植株根部的琼脂，于当年10月移载入温室花盆中(见图4)，经一周保湿生长后，揭去覆盖的塑料膜，驯化生长约一个月，12月份移栽入地。随着秋季气温的降低，叶片逐步转色，再生株群体表现出在叶色、叶型、株型等上的多样性(见图5)。参照蔬菜研究法(全国高等农业院校通用教材，西南农业大学主编，1986)中的有关甘兰类作物性状调查指标及调查方法，对再生株当代各单株进行颜色、株型、叶型、着色期早晚和抽苔期观赏特性的高强度优选。一方面，由于材料是完全纯合的遗传背景，不会在后代出现表型的分离，因此选择结果的可靠性很高；另一方面，由于隐性基因及重组基因性状都能表达，因此在群体中可能出现一些新的具有观赏价值的类型。经优选，在用上述培育方法获得的再生群体中，出现了株高仅10cm的极矮生类型，其绿色外叶数仅9片，内包叶数大于30片，白色、红心，着色早，上色极其均匀，无斑驳叶片，命名为“冰清”(见图6)。另外一份材料叶型呈羽状细裂，粉紫色，命名为“粉羽”(见图7)，出现了供体材料中没有的新类型。优选株采用严格的套袋自交授粉留种。第二年对优选的材料进行性状的核实，进一步优选后即可进入杂种配制。上述结果表明用本发明的培养方法及其专用培养基不仅可以快速获得纯合材料，而且可以高效地创制出新的观赏类型。

表2用于羽衣甘兰游离小孢子培养的培养基配方及灭菌方式

Claims (7)

1. 用于培养羽衣甘兰小孢子再生植株的培养基，由胚状体诱导培养基、分化培养基和生根培养基3种培养基组成：

其中，胚状体诱导培养基的配方为：KNO₃ 100-150mg，Ca(NO₃)₂·4H₂O 450-550mg，MgSO₄·7H₂O 100-150mg，KH₂PO₄ 100-150mg，FeSO₄·7H₂O 27.5-28mg，EDTA·Na₂37-37.5mg，KI 0.8-0.85mg，CoCl₂·6H₂O 0.02-0.03mg，H₃BO₃ 6-6.5mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.2-0.3mg，MnSO₄·4H₂O 22-22.5mg，CuSO₄·5H₂O 0.02-0.03mg，ZnSO₄·7H₂O 8.4-8.8mg，肌醇80-120mg，烟酸4-6mg，吡哆醇0.4-0.6mg，硫胺素0.4-0.6mg，甘氨酸1.8-2.2mg，叶酸0.4-0.6mg，生物素0.04-0.06mg，谷氨酰胺700-900mg，丝氨酸80-120mg，谷胱甘肽25-35mg，6-苄基腺嘌呤0.8-1.2mg，蔗糖100-150g，活性炭0.10-0.30g，用水定容至1L，pH 5.8-5.9；

分化培养基的配方为：NH₄NO₃ 1600-1700mg，KNO₃ 1850-1950mg，CaCl₂·2H₂O400-480mg，MgSO₄·7H₂O 350-400mg，KH₂PO₄ 150-200mg，FeSO₄·7H₂O 27.5-28mg，EDTA·Na₂ 37-37.5mg，KI 0.8-0.85mg，CoCl₂·6H₂O 0.02-0.03mg，H₃BO₃ 6-6.5mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2-0.3mg，MnSO₄·4H₂O 22-22.5mg，CuSO₄·5H₂O 0.02-0.03mg，ZnSO₄·7H₂O 8.4-8.8mg，肌醇80-120mg，烟酸0.4-0.6mg，吡哆醇0.4-0.6mg，硫胺素0.08-0.12mg，甘氨酸1.8-2.2mg，蔗糖25-35g，琼脂8-12g，用水定容至1L，pH 5.8-5.9；

生根培养基的配方为：NH₄NO₃ 800-850mg，KNO₃ 900-1000mg，CaCl₂·2H₂O200-240mg，MgSO₄·7H₂O 175-200mg，KH₂PO₄ 75-100mg，FeSO₄·7H₂O 27.5-28mg，EDTA·Na₂ 37-37.5mg，KI 0.8-0.85mg，CoCl₂·6H₂O 0.02-0.03mg，H₃BO₃ 6-6.5mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2-0.3mg，MnSO₄·4H₂O 22-22.5mg，CuSO₄·5H₂O 0.02-0.03mg，ZnSO₄·7H₂O 8.4-8.8mg，肌醇80-120mg，烟酸0.4-0.6mg，吡哆醇0.4-0.6mg，硫胺素0.08-0.12mg，甘氨酸1.8-2.2mg，蔗糖10-20g，琼脂8-10g，用水定容至1L，pH 5.8-5.9。

2. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述胚状体诱导培养基的配方为：KNO₃ 125mg，Ca(NO₃)₂·4H₂O 500mg，MgSO₄·7H₂O 125mg，KH₂PO₄ 125mg，FeSO₄·7H₂O27.8mg，EDTA·Na₂ 37.3mg，KI 0.83mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，肌醇100mg，烟酸5mg，吡哆醇0.5mg，硫胺素0.5mg，甘氨酸2mg，叶酸0.5mg，生物素0.05mg，谷氨酰胺800mg，丝氨酸100mg，谷胱甘肽30mg，6-苄基腺嘌呤1mg，蔗糖130g，活性炭0.2g，用水定容至1L，pH 5.9；分化培养基的配方为：NH₄NO₃ 1650mg，KNO₃1900mg，CaCl₂·2H₂O 440mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，KH₂PO₄ 170mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，EDTA·Na₂ 37.3mg，KI 0.83mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，肌醇100mg，烟酸0.5mg，吡哆醇O.5mg，硫胺素0.1mg，甘氨酸2mg，蔗糖30g，琼脂10g，用水定容至1L，pH 5.8；生根培养基的配方为：NH₄NO₃ 825mg，KNO₃ 950mg，CaCl₂·2H₂O220mg，MgSO₄·7H₂O 185mg，KH₂PO₄ 85mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，EDTA·Na₂ 37.3mg，KI 0.83mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg，MnSO₄·4H₂O22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，肌醇100mg，烟酸0.5mg，吡哆醇0.5mg，硫胺素0.1mg，甘氨酸2mg，蔗糖15g，琼脂8g，用水定容至1L，pH 5.9。

3. 一种获得羽衣甘兰小孢子再生植株的方法，包括以下步骤：

1)将小孢子接种于权利要求1或2所述的胚状体诱导培养基中，至终浓度为5×10⁴-5×10⁵个/mL，接着在30-35℃、黑暗条件下高温胁迫处理24-72小时后，再转入24-26℃、黑暗条件下诱导胚状体；

2)待鱼雷期至子叶期胚状体形成后，将胚状体先在24-26℃、1500-2500Lux、14-18小时光照/天条件下继续培养5-10天，再将胚状体接种于权利要求1或2所述的分化培养基中，在相同条件下培养；

3)长出茎、叶后，将植株转接入权利要求1或2所述的生根培养基中，在24-26℃、1500-2500Lux、14-18小时光照/天条件下进行生根培养，得到羽衣甘兰再生植株。

4. 根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于：所述步骤1)中的小孢子分离自含60％以上单核靠边期小孢子细胞和40％以下双核期小孢子细胞的花蕾；接种于胚状体诱导培养基中的小孢子浓度为10⁵个/mL；高温胁迫处理条件为在33℃、黑暗条件下处理24小时；胚状体诱导温度为25℃。

5. 根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于：所述步骤2)中将鱼雷期至子叶期胚状体先在25℃、2000Lux、16小时光照/天条件下继续培养7天。

6. 根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于：所述步骤3)中的生根培养条件为25℃、2000Lux、16小时光照/天。

7. 根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于：对步骤3)中得到的羽衣甘兰再生植株进行染色体倍性鉴定，并对单倍体植株的生长点部位用体积比为0.15-2.5％的秋水仙素连续处理36-60h。

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