CN100411757C - 一种对石油和PAHs污染土壤的生物修复方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及环境生物科学中的生物应用技术，具体地说是一种对石油和PAHs污染土壤的生物修复方法，以菌根联合共生体构建成对污染土壤的生物修复体系，所述菌根联合共生体组合为：玉米与Ect.、VAM、Ect.+VAM或Ect.+B；万寿菊或大豆与VAM、VAM+B或VAM+N；白蜡与Ect.、Ect.+VAM或Ect.+N；垂柳与Ect.或Ect.+B+N。本发明具有如下优点：集中现代生物修复技术的微生物修复法，植物修复法为一体，充分发挥菌根根际的调控作用，应用简便、经济实用、适合大面积的原位修复。

Description

一种对石油和PAHs污染土壤的生物修复方法

技术领域

本发明涉及环境生物科学中的生物应用技术，具体地是说一种菌根联合共生体对石油和PAHs污染土壤的生物修复方法。

背景技术

近年来由于工农业和石油工业的迅速发展，对农田、河流、湖泊等污染日益严重；特别是随着工农业的迅速发展及人口的剧增，则各种有毒有害物质也随之进入大气、水体和土壤之中；尤以土壤环境污染日趋严重，污染土壤的修复治理以成为人们十分关注的问题。80年代中期，一种新的生物技术---生物修复，首先在欧洲一些发达国家污染土壤修复中得到了应用，多年来的研究结果证明，这是既安全又经济的方法；所谓生物修复，就是利用微生物及其它生物将土壤、地下水或海洋中的危险污染物现场降解成二氧化碳和水或转化为无害物质的工程技术系统。从已经用于生物修复的载体看，主要是微生物，其次是植物，而菌根作为生物修复载体的应用研究(文献1：王曙光、林先贵菌根在污染土壤生物修复中的作用，农村生态环境2001.17(1)：56-59)才刚刚起步。菌根(mycorrhiza)是自然界中一种普遍的植物共生现象，是自然界土壤中的真菌菌丝与植物营养根系共生所形成的共生体，共生真菌从植物体内获取必要的碳水化合物及其它营养物质，而植物也从真菌那里得到所需的营养及水分等，从而形成一种互利互惠，互通有无的高度统一的联合体；它既具有一般植物根系所具有的特征，又具有专性真菌所具有的特性。菌根对植物的有益作用概述有如下几点：1)扩大宿主植物根系的吸收面积；2)增加宿主植物对磷和其它元素的吸收利用；3)菌根真菌能产生生长刺激素；4)提高植物抗逆性和增强植物抗病能力。所以作为直接连接植物根系和土壤的微生物，菌根真菌能够改善并促进植物的生长发育已有较多的报道，Toner EJ等发现菌根真菌还能直接影响重金属对植物的有效性和毒性，当他以1、10、100ug/kgCd加入土壤中时，菌根化植物吸收Cd比非菌根化植物分别高10％、127％和131(文献2：Joner EJ、Leyval C.Uptake of Cd by roots and hyphae of aGlomusmosseae/Trifolium subtemaneum mycorrhiza fromsoil amended with highand low conentration of cdmium〔J〕.New phytol.1977.135(2)：353-360)由此证明，菌根化植物对重金属有很强的吸收能力，且植物的正常生长发育未受到任何影响。菌根作为植物与真菌的共生体，用于石油和PAHs污染土壤的降解国内尚属空白，但其在降解土壤中PAHs的作用已引起国外一些学者的注意；Binet philippe(文献3：Binet philippe、Jean-morie p、Corinne L.Biodegradation of a polyaromatic hydrocarbon in therhizospere of mycorrhinal plants〔A〕.Abonen-Jonnarth U.DanellE.Fransson P.et.al.2nd lntl conf on Mycor〔C〕.Sweden：Uppo-ala1998.30)等发现菌根化黑麦根际蒽的降解明显高于对照，Dittmann Jens(文献4：Dittmann Jens，Woifgang Heyser.Accumnulation of3-chlorobenzoic acid and degradation of benzoic acid and4-bydroxybenzic acid bymycorrhizal fungi〔A〕.Abonen-JonnarthUdanell E，Franason P.et al.2nd IntI conf on Mycor

〔C〕.Sweden：Uppe-ala，1998.52)等用两种菌根真菌降解安息香酸四羟基安息香酸，发现在很短时间内两种物质的浓度分别下降了75％，说明菌根真菌具有降解复杂有机物污染的能力。

石油是链烃、环烷烃、芳香烃以及少量非烃化合物的复杂混合物；石油开采，冶炼和运输过程的污染和溢漏事故，及各种石油制品挥发，以及含油废水的排放、污水灌溉等引起一系列的土壤石油污染的问题。PAHs(多环芳烃)污染多数与石油污染有关，尽管PAHs在原油(石油)中的含量较少，但是由于各种环境介质，物理化学和生物等诸因素的作用，使得石油中的各组分被物理、化学因素所转化及生物降解和光解等，可是难于降解的PAHs却继续并广泛分布在环境之中，在一些重污染区，土壤中PAHs含量可达数百、数千甚至数万毫克/公斤。由于PAHs具有致癌性、致畸性、致突性，美国环保局已把16种PAHs列入优先控制污染物黑名单中(文献5：宋玉芳、许华夏等两种植物条件下土壤中矿物油和多环芳烃(PAHs)的生物修复研究2001，12(1)：108-112)PAHs大部分属于难降解的有机物，其降解难度一般随分子量的增大和环数的增加而增加，因此修复和治理这类污染的环境问题势在必行。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以菌根真菌为主，同其它微生物种类相结合，与植物互利共生的菌根联合共生体对石油和PAHs污染土壤的生物修复方法。

为了实现上述目的本发明采用的技术方案为：

以菌根联合共生体构建成对污染土壤的生物修复体系，所述菌根联合共生体组合为，玉米与Ect.、VAM、Ect.+VAM或Ect.+B；

万寿菊或大豆与VAM、VAM+B或VAM+N；

白腊与Ect.、Ect.+VAM或Ect.+N；

垂柳与Ect.或Ect.+B+N。

所述VAM为：Glomus mosseae摩西球囊霉(以下称G.M)、G.geospsra地球囊霉(以下称G.g)、G.cowstrictum和循球囊霉(以下称G.c)；Ect.为：Hebeloma mesophaeum毛边滑锈伞(以下称E1)Lactaria insulsus劣味乳菇(以下称E2)和Cortinarius russus丝膜菌(以下称E3)；B细菌为：Bacillus sp芽孢杆菌属和Zoogloea 8p动胶杆菌属；N固氮菌为：Azotobacter vinelandii棕色固氮菌。

所述菌株的选取过程如下：

(1)从污染源所处环境典型的植被土壤中分离菌种；

(2)通过实验室纯培养筛选具有降解力的菌株，并制备成菌剂；

(3)模拟不同浓度石油、矿物油污染土壤降解速率的驯化实验，以此确认筛选菌种对油污染土壤的降解速率。

本发明具有如下优点：

1.集中现代生物修复技术的微生物修复法，植物修复法为一体。

从已经用于污染土壤生物修复的载体看主要是微生物，其次是植物；而菌根作为生物修复的载体独到之处有：

1)扩大宿主植物根系吸收面积，从而促进污染物吸收和降解，作为真菌与植物共生，所形成的联合共生体菌根，在土壤中形成的纵横交错的外延菌丝网，增加了根系与污染土壤的接触面积；研究表明，菌根在土壤的中吸收面积和吸收长度要比根系分别大10倍和1000倍，同时菌根的形成，能促进植物对营养元素的吸收，改善了微生态环境，从而提高了植物生长量和抗逆性，进而促进了植物对污染物的吸收和降解；

2)菌根联合共生体的生物修复能克服微生物修复技术、植物修复技术中的不足，表现为：

a.能够较好解决微生物修复中的工程菌株在田间试用时其存活周期短的问题；

b.该技术处理的污染物浓度比微生物修复法工程菌株处理的浓度高，这是因为菌根化的植物对污染物的耐受程度比细菌、放线菌、酵母菌等土壤微生物高；

c.植物修复虽然是更经济，更适于现场操作的去除环境污染物和技术，但是自然界中的绝大多数植物难以生存在贫瘠的，有毒物质污染的土壤中和干旱气候的条件下，而菌根化的植物却能够克服这种逆境条件的限制。

2.充分发挥菌根根际的调控作用。

菌根根际(即受植物根系和菌根真菌双重影响的土壤区域称为菌根根际)菌根化的植物的光和产物从叶片转送到根，同时转送根的光和产物引起根际分泌物数量和种类的变化，这些分泌物和植物的脱落物支持根周围能修复污染土壤的菌群。据观察菌根化的Pinus syloestris幼苗的外延菌丝表面有很多联合细菌，这种延伸的菌际成分支持了数量庞大的细菌；另外，树木每克外生菌根(鲜重)能支持10⁶和10²的好氧细菌和酵母菌。而菌根根际的微生物数量比周围土壤高1000倍，显然这些数量庞大的微生物群会对污染土壤的修复起到相当大的作用，同时菌根根系分泌物也可作为降解的共代谢底物，从而促进污染物的降解。

3.应用简便、经济实用、适合大面积的原位修复。

由于菌根真菌与植物共生、其生活史与植物也超于同步，因此，使得菌根联合共生体的生物修复方法，同样适合于原位修复；且投加一次菌剂后则菌根真菌随植物的生长而繁育，以致不断感染宿主植物而增加其在土壤的数量，从而与其根际的微生物菌群协同作用，进行联合修复污染的土壤。

4.本发明(植物-微生物联合修复)鉴于菌根对植物的健康中心作用及其的生命代谢活动能减少土壤环境中有毒有害物质的浓度，具有清洁并恢复污染土壤的能力，作为多维一体、协同作用的生物修复法，处于生物修复研究的新领域，其将是污染土壤修复技术的首选因素，是很有应用前景的研究方向；其具备生物降解的全部优点，且二次污染小。

具体实施方式

1.从污染源的生态环境中分离菌种。以辽河油田和沈抚污灌区为考察目标，选取典型的污染源生态类型，1)在辽河油田选取采油机旁的典型植物(芦苇、柳树、碱蓬草和狗尾草)下土样1-2千克；2)在沈抚污灌区选取中度污染区和重度污染区中稻田里和水田改旱田的玉米地里各取土样1～2千克，采用Gerdemann和Nicolson的湿筛倾析法，从该污染土壤中分离得到优势菌根真菌，初步鉴定为VAM菌有Glomus mosseae摩西球囊霉G.qeospsra地球囊霉，G.Constrictum循球囊霉；其它微生物类群的分离采用Raymand的分离方法，分离的微生物类主要以细菌为主，细菌主要是芽孢杆菌属Baciecus sp.其次是动胶杆菌属、假单胞菌，黄单胞菌等，真菌和放线菌较少；而真菌为头孢霉、曲霉、镰刀菌属及青霉属，放线菌则以链霉菌为主。

2.通过实验室纯培养筛选具有降解力的菌株(耐油、降解菌种的筛选)：选用不同浓度的石油或矿物油分别定量，加入培养不同菌种的培养基(常规)中，使供试菌种在其中生长发育，终止培养后，将培养菌种基质中的残油用超声提取紫外分光测定，以此确认筛选菌种对含油基质的降解速率；例如：Ect.菌种经过一级和二级培养的筛选，筛选出Hebeloma mesopsra毛边渭锈伞(E₁)Lactaria insulsus味乳菇(E₂)Cortinarius russus丝膜菌(E₃)三株对油具有一定耐力和降解力的菌种；将所筛选的菌株按常规方法制成菌剂。

3.模拟不同浓度石油、矿油污染土壤降解速率的驯化实验

1)微生物与植物种类的选取：

菌种选用VAM菌根菌、外生菌根菌(Ect.)、固氮菌(Azotobacteria)和细菌(Bacilus)；

VAM菌为：Glomus mosseae摩西球囊霉(以下称GM)，G，geospsra地球囊霉(以下称G.g)，G.cowstrictum，循球囊霉(以下称G.c)；

Ect.菌为：Hebeloma mesopsra毛边滑锈伞(以下称E1)，Lactariainsulsus劣味乳菇(以下称E2)，Cortinarius russus丝膜菌(以下称E3)，三者混合为Ect.；

细菌为：Bacillus sp芽孢杆菌属、Zoogloea sp动胶杆菌属，应用时二者混合的菌剂为B，

固氮菌为：Azotobacter vinandii棕色固氮菌(以下称N)。

宿主植物选取禾本科的农作物玉米、豆科的大豆、花卉的万寿菊、木本植物垂柳和白腊；

2)联合共生体的构建

联合共生体的构建见表1与表2，供试的菌种均以菌剂形式接种，接种量为100-150克/米²；

菌种与宿主植物不同组合搭配共生后，观测各组合搭配的共生体系，对投加油污染土壤的具有代表性宿主植物的生物效应和根际污染土壤的降解速率进行检测，确认联合共生体系生物修复效率，最后筛选出它们的优势组合；

筛选的各类优势组合均表现出对土壤污染油的降解率达53.8～75％，且植物的生物量与对油的降解率呈正相关；随菌根类型不同其优势组合共生体的构建也不尽相同；对农作物的玉米和大豆的优势组合来讲为：Ect.、Ect.+B和VAM；花卉的万寿菊和豆科的大豆优势组合为VAM+B、VAM+N；木本植物的白腊优势组合为Ect.、Ect.+N。

以下是以外生菌根真菌为主的联合共生体对污染土壤的生物效应及降解率：

表1菌根联合共生体在农作物油污染土壤中的生物效应及降解率

注：油测定方法为重量法(《环境监测分析方法》城乡建设环境保护部环境保护局环境监测分析方法编写组，中国环境出版社1986：329_332)及超声提取紫外分光测定法(《环境中石油污染物的分析技术》谢重阁编，中国环境科学出版社1986年)。

表2菌根联合共生体在木本植物油污染土壤中的生物效应及降解率

同时，本发明又以VAM菌根真菌为主构建联合共生体，在模拟修复石油和PAHS污染的土壤中投加矿物油5000mg/kg，供试的VAM菌与细菌搭配(VAM+B)，使宿主植物万寿菊花卉其共生的生物效应即高生长、地径、侧根数、分枝数、花蕾数和总生物量的增长率依次为：5.5％、11.9％、17.8％、114.3％、75％、20.8％；VAM与固N菌搭配，使宿主植物大豆的生物效应即茎重、根瘤重、豆荚重增长率依次为26.7％、11.1％、27.1％、4.0％.。

Claims (2)

1. 一种对石油和PAHs污染土壤的生物修复方法，其特征在于：以菌根联合共生体构建成对污染土壤的生物修复体系；所述菌根联合共生体组合为玉米与Ect.、VAM、Ect.+VAM或Ect.+B；万寿菊或大豆与VAM、VAM+B或VAM+N；白腊与Ect.、Ect.+VAM或Ect.+N；垂柳与Ect.或Ect.+B+N；

所述VAM为：摩西球囊霉、地球囊霉和循球囊霉；所述Ect.为：毛边滑锈伞、劣味乳菇和丝膜菌；所述B细菌为：芽孢杆菌属和动胶杆菌属；所述N固氮菌为：棕色固氮菌。

2. 根据权利要求1所述对石油和PAHs污染土壤的生物修复方法，其特征在于：所述菌株的选取过程如下：

(1)从污染源所处环境典型的植被土壤中分离菌种；

(2)通过实验室纯培养筛选具有降解力的菌株；

(3)模拟不同浓度石油、矿物油污染土壤降解速率的驯化实验，以此确认筛选菌种对油污染土壤的降解速率。