CN100406468C - 抗栓剂kgd-环七肽的设计、制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种以含Lys-Gly-Asp(简称：KGD)功能序列的短链多肽为特征的新型抗栓剂的制备方法与应用。该抗栓剂是一种环七肽分子，通过化学合成方法合成线性长度七肽分子，进而通过二硫键的形成构成(1，7)位共价闭合环化结构的环七肽分子(简称：KGD-环七肽)。该环七肽的序列为Cys-Lys-Gly-Asp-Trp-Asp-Cys，KGD序列是环七肽的功能序列，通过环化结构使KGD序列表现出功能构象，发挥与血小板膜上纤维蛋白原受体GPⅡb/Ⅲa受体专一性识别与结合的能力，表现出较强的抗血小板聚集活性，具有较强的抗血栓形成能力，具有较高的临床应用价值，是一类很有希望的抗血栓形成新药，具有广阔的应用前景。

Description

抗栓剂KGD-环七肽的设计、制备及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更确切地说基于现代生物化学技术与现代蛋白质化学技术制备新型抗栓剂，其设计、制备及应用特点。
背景技术
抗栓剂作为预防、治疗心脑血管疾病要用药的重要辅助手段，在临床医学中广泛应用。对于预防重大疾病的发生(如：脑血栓的系统后遗症)是主要用药，(如：广泛使用的阿斯匹林)，同时，作为溶栓疾病(如：中风、心肌梗塞、心绞痛等)治疗过程中的主要辅助用药(如：tPA-肝素配伍用药，tPA-华法林、阿斯匹林配伍用药等)，无论是在手术治疗(如：广泛使用的微桥介入治疗术)，还是单纯药物性治疗上，都具有举足轻重的地位，在预防病人心脑血管循环系统再次出现栓塞，以及保证治疗过程安全有效地进行方面，都发挥着重要的作用，体现出实际的治疗与预防效果。
抗栓剂作为实际临床医疗过程中的一种重要使用药物，一直以来都备受重视，一直都是医疗界、医药界、以及科学界关注的重要领域。抗栓剂的研究与发展走过了一条漫长道路，根据作用机制，抗栓剂研发历史与现状可以归纳为以下几个方面：
1.通过抑制血栓烷A2的合成
此类抗栓剂以阿斯匹林(Aspirin)为代表。血栓烷A2是内源性的血小板聚集刺激剂，激发体内血栓形成，担负一定的生理功能。在血小板中，以花生四烯酸(AA，arachidonic acid)为底物，通过一系列酶促反应衍生血栓烷A2。阿斯匹林抑制了血栓烷A2合成代谢过程中的一个关键酶——环加氧酶，从而抑制了由中间代谢产物前列腺素最终转变为血栓烷A2。抑制效果是迅速而高效的，血栓烷A2合成抑制导致的血小板聚集抑制可长达血小板的整个生命周期(7至10天时间)。因为阿斯匹林优良的用药性能以及低廉的产品价格，因而是目前医疗临床上最常用的抗栓剂，在中国也是如此，阿斯匹林广泛应用于对脑血管局部缺血与栓塞形成的预防性治疗上，以及减少心肌梗塞再栓塞发生上。但是在长期医疗实践的过程中，阿斯匹林的副作用也逐渐暴露出来，有些甚至是非常严重的副作用，如：引起胃肠道出血、溃疡发生、出血性休克发病率升高，尤其在长期、大剂量使用时更为严重，严重时常常导致停止用药。这些现象越来越引起医学界、科学界的关注和重视。
2.通过抑制环腺苷酸磷酸二酯酶活性
如Dipyridamole(迪普莱达莫)提高细胞内cAMP水平，提高前列腺素I2的效力，抑制血栓烷A2的合成，降低血小板对血栓形成面的粘附性。在医疗上，常用作冠状动脉扩张剂，用于对心绞痛的长期治疗中。(Fitzgerald G.A，Reilly I.A，et al，Circulation，1985，72，1194-1201；Fitzgerald D.J，Fragetta J，et al，J.Clin.Invest，1988，82，1708-1713.)
3.通过拮抗血栓烷A2受体
Stegmerer在1984年就报道了合成的血栓烷受体拮抗剂对血管血栓的形成具有明显的抑制作用(Stegmerer K，Pill J，et al，Throm Res，1984，35，379-395.)，但随着研究的深入，发现对于Collagen，epinephrine，thrombin，ADP，5-HT，PAF(platelet activating factor)等物质对血小板刺激产生的聚集没有抑制效果.
4.通过单克隆抗体拮抗整合素受体
在这方面，有大量的研究报告，制备特异的整合素受体单克隆抗体对整合素受体有极强的识别与结合效果，对血小板聚集表现出很高的抑制活性。但多项研究也表明，此种抑制是不可逆的，而且抗体与整合素受体结合持续时间很长，达血小板的整个生命周期(7-10天)，副作用显而易见(Coller B.S，Folts.J.D，et al，Blood，1986，68，783-786；Coller B.S，Scadder L.E，Blood，1988，66，1456-1454；Ramadurgam K，Veerapandian B，et al，J.Biol.Chem，1995，270，2268-2273；Kunicki T.J，Ely K.R，et al，J.Biol.Chem，1995，270，16660-16665.)。
5.通过RGD多肽竞争性地抑制整合素受体
目前有以下几类RGD序列肽成为人们的研究工具：人工合成及天然蛋白水解得到的RGD肽；某些天然蛇毒蛋白、神经毒素、以及具有抗栓活性的水蛭蛋白及胞间去整合素；由整合素制备的含有功能性序列的单克隆抗体；人工改造的多功能蛋白。这类研究目前在国际上许多发达国家的实验室都在开展这方面的研究工作，取得了大量的研究信息。在国内，作为在该领域起步较早的主要研究队伍之一，我们也在新型基因工程RGD重组多肽的制备及其功能、结构与作用特点研究方面取得了许多有益的成果与进展，获得了一批代表国际先进水平的成果(Jing J，Tang JG，Biotechnology Letters，2001，22，11，47-52；Yang ZH，Jing J，et al，AppliedBiochemistry and Biotechnology，U.S.A，2002，10，1，1-10.)。目前，该领域的研究仍在不断地深入进行，并陆续取得了许多新的认识与突破(唐建国、井健、杨志宏，发明专利，专利号：99109419)。
6.通过抑制血液中凝血酶的催化活性
凝血酶在转变纤维蛋白原为纤维蛋白，进而形成网状血栓凝块的过程中发挥重要的作用，作为整个血栓形成过程酶促化学的主要一环。目前，已发现直接抑制凝血酶活性的分子有水蛭素(Hirudin)，其氮端可与凝血酶分子第195位丝氨酸形成氢键，抑制凝血酶蛋白质分子的催化活性(Colman R.W，Hirsh J，et al，1994，Homeostasis and Thrombosis.Basic Principles andClinical Practice(3rd Ed)，J.B.Lippincott company，Philadelphia.)。目前，国际上有德国、美国、中国等国几家实验室在研究基于水蛭素分子的抗栓药物开发工作。
7.通过拮抗凝血酶受体
凝血酶分子不仅具有酶促催化活性，它本身还是一个血小板激活因子。这一过程通过与凝血酶受体相互作用实现。凝血酶受体在41位裂解后被激活，此一过程是不可逆的，通过下游调控信号传递，对血小板的激活起作用。拮抗凝血酶受体能够有效地达到抗凝效果。发现一种包含SFLLRN序列、水蛭素结合序列及其他抑制凝血酶受体的分子胞外结构域，具有这种拮抗效果，但基于此的药物尚未出现。
8.通过抑制凝血酶的生成
凝血酶促进可溶性的纤原转化为不溶性的纤维蛋白，在血栓的最终形成方面起到至关重要的作用。研究发现，通过抑制凝血酶的产生也可以达到抗栓的效果。研究发现组织因子抑制剂(TFPI)可与肝素抑制因子Xa形成复合物结合到组织因子VIIa上，抑制凝血酶的产生。
很长一段时间里，抗血栓药物的研究在基础理论及应用研究中都占有一席之地，但由于机体内调控血栓溶解、血栓形成的机制非常复杂，对不同种类抗栓药物的大量、长期的临床医疗实践已经突出地表明：抗栓药物的专一性及安全性已成为新一代药物研究开发的重要方向。
对血栓形成机制的长期研究已经明确，在由不同刺激剂导致的血栓形成过程中，最后都涉及血小板与纤维蛋白原的结合与血小板的聚集。在这一过程中，作为血小板整合素受体配体的多种粘结蛋白质(如纤维粘结蛋白(fibronectin)、纤维蛋白原(fibrinogen)、玻璃粘结蛋白(vitronectin)、冯-布劳德因子(vWF factor))中的RGD序列发挥了重大的作用，负责与多种整合素受体的识别与结合。含有RGD序列的天然蛇毒成分能竞争性地结合整合素受体，具有很高的抑制血栓形成的能力(Garsky VM，Lumma PK，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.1989，86，4022-4026；Yasuda T，Gold HK，et al，Circulation，1991，83，1038-1047；William JA，Pathol.Biol，1992，40，813-821.)。目前国际上开展较多的是利用RGD多肽的特点作用构建一些新型基因工程抗栓分子或者基因工程双功能分子，实验表明，RGD多肽的引入赋予了基因工程重组产物较高的抗栓活性(Jing J，Tang JG，Biotechnology Letters，2001，22，11，47-52；Yang ZH，Jing J，et al，Applied Biochemistry and Biotechnology，2002，10，1，1-10；Lee G.et al，ProteinEngineering，1993，6，745-753；Church F.C.et al，J.Biol.Chem，1991，266，11975-11979；Yamada T etal，J.Biol.Chem，1995，270，5687-5690；Yamada T，Sekiya F，et al，FEBS Lett，1996，387，11-15；Sanchez E.F，Bush L.R，et al，Throm Res，1997，87，3，289-302.)。与RGD序列相比，KGD序列是近年来才发现了新型整合素受体识别序列(Scarborough R.M，et al，J.Biol.Chem，1991，266，9359-9362.)，KGD序列具有独特的优点，它不仅保留了RGD序列对整合素受体的高亲和性，而且是受体专一性的。含有RGD序列的多肽常常能识别并结合多类整合素受体，不同种类的整合素受体之间的亲和力差别不大，基本在一个数量级上。由于不同的整合素受体在体内具有不同的功能，所以RGD多肽或RGD重组多肽往往除了抗栓活性以外，还能够表现其他多样的生物活性，如控制细胞的迁移、细胞程序性死亡、精卵结合等等。KGD序列由于结构的特殊性，对血小板上含量最丰富的一类整合素受体GPIIb/IIIa是专一性识别与结合的，而对其他种类的整合素受体的亲和力则很低。GPIIb/IIIa受体主要分布在血小板上，对血小板参与血栓形成过程中发挥极其重要作用，对GPIIb/IIIa受体具有专一性意味着对参与血栓形成的血小板具有了导向性，也即意味着对血栓具有导向性，KGD多肽将专一性拮抗血小板上GPIIb/IIIa受体的功能，从而高效专一性地抑制血栓形成。这一点利用在医疗上，将大大有益于血栓类疾病的预防与治疗，大大有益于心脑血管疾病病人。能够解决诸如以往常用抗栓剂(如：Aspirin，Dipyradamole，整合素受体单抗)的诸多副作用和不良反应，同时强有力地预防体内血管血栓形成，由于其高拮抗活性，其用量很少，常常在10-6-10-8M水平左右就能表现出明显的抑制血栓形成的效果。这一点在降低病人医药用量成本方面尤其有好处。基于此，国际上已有数个实验室在国际医药巨子(如SmithKline，Merck)的支持下，设计开发基于KGD多肽作用机制的新一代抗栓药物，据统计，大约有6-7个产品目前已进入临床实验研究阶段。目前，基于分子设计技术，我们设计的KGD-环七肽产品(见说明书附图1)，已经经过了实验室阶段的初步基础研究，研究表明，KGD-环七肽表现出较强的血小板聚集抑制活性(IC50为620nM)，同时，表现出很强血小板上纤维蛋白原受体GPIIb/IIIa受体专一性，完全具备天然KGD多肽的抗栓活性与受体专一性，同时，由于KGD-环七肽为短链小肽，分子量仅有826 dalton，它对人体的免疫原性极低，同时又具有易于大量合成与生产的显著优点，非常适合应用于实际临床医疗实践中。经过国际权威专利文献信息检索以及科技文献信息检索，目前，有关KGD-环七肽的研制尚无任何报道，本项研究与开发填补了国内外空白。所以，KGD-环七肽极有希望成为我国自主设计的、具有我国自主知识产权的，有极高专利保护价值的新药。目前，KGD-环七肽的中试规模生产研究以及相关的动物实验研究正在进行中，初步研究成果符合预期设计，报送国家医药监督管理局准备进行实际临床研究的工作也正在准备中。
发明内容
为研制一种高效、安全、经济的新型抗栓剂，应用于实际医疗实践中，以解决目前在抗血栓形成临床实践方面存在的问题，诸如抗栓专一性差造成的内出血现象，抗血栓活性/效能不高而使得用药剂量加大，一方面加剧诸如内出血副作用，另一方面提高药物治疗成本。基于目前国际上关于血栓形成与溶解机理的最新研究成果以及现代分子设计技术，我们优化设计了一个环七肽结构的具有特异功能序列的短链活性多肽。经过在SGI工作站上应用最新结构模拟与分子设计软件包(InsightII Ver2000)，对一系列短链环肽结构进行了结构模拟与优化，经过比较，环七肽(cycle-CKGDWDC)在键长，键角、环肽链结构的稳定性方面均表现出较好的物理化学表征，KGD功能序列突出于此环肽链外侧，呈活性构象状态，其中K(赖氨酸)和D(天冬氨酸)的侧链构象伸展方向以及相对位置均与天然功能性多肽Barbourin、US-2中的构象特点一致，说明CKGDWDC环七肽中KGD序列能够较好地表现出相应的功能构象，识别并结合血小板膜上GPIIb/IIIa受体，从而表现出抑制血小板聚集的活性。同时KGD功能序列的边侧氨基酸W(色氨酸)的结构特点与侧链构象也与天然功能性蛋白质中的结构特点与构象特征一致。同时，在CKGDWDC环七肽结构中，KGDW四肽序列形成一个β-turn结构，其中第一位的K(赖氨酸)侧链与第四位的W(色氨酸)侧链形成氢键联系，维持β-turn结构的稳定性，有利于KGD序列表现出特有的结构特点，而这些对于KGD序列表现出高度的受体专一性是非常重要的，这些结构特征在天然KGD功能型多肽如Barbourin、US-2中也是存在的。
天然KGD功能多肽如Barbourin、US-2长度分别为50-70个氨基酸左右，不太可能通过蛋白质/多肽合成的方法进行大量生产，而只能通过基因工程的方法生产。同时，Barbourin、US-2都是源于蛇毒的蛋白质分子，是Viper类蛇毒的有效成分，所以对人体有着强烈的免疫原性与潜在的致毒性，所以根本不能直接用于人体或者对病人的治疗上。我们设计的KGD-环七肽结构分子量非常小，只有约826dalton，与一般的有机合成化工类药物差不多，而且环链结构紧凑，对人体的免疫原性非常小，与一般有机合成药物相当。所以对人体不会产生免疫反应。
本项研究开发的目的是基于含KGD序列天然蛇毒抗栓肽蛋白质功能与结构特点，利用现代蛋白质工程手段构建新型的具有高效抗栓活性且具有高度受体专一性短链多肽分子，以用于血液生物学、药理学和临床医疗学的基础研究和实际临床应用中。它的化学结构和性质证明它符合我们原定研究的目的。
KGD-环七肽的构建的方法具有创新性，所应用的蛋白质工程方法为发明人自行设计的，主要包括以下步骤：
1.分子设计与优化。
KGD-环七肽的一级结构的设计主要依据对去整合素Barbourin与US-2的研究，KGD是负责与血小板GPIIb/IIIa受体特异性识别并结合的，位于羧基端的W(色氨酸)辅助KGD功能序列发挥其生物活性。对KGD-环七肽高级结构的评估主要是通过SGI Octane2工作站上运行InsightII(Ver2000)结构模拟计算软件包实现。在进行结构模拟的过程中，两个主要的结构计算参数Iteration(循环计算次数)与RMSD(结构计算均方根偏差)分别设定为1,000与0.01，从计算次数与计算结构精度的两个方面对KGD-环七肽结构预测取得一个高度精确的结果。InsightII(Ver2000)软件包是目前在蛋白质分子结构计算领域普遍采用的，具有最佳运算效率与准确度的功能软件包，尤其在对小分子量多肽或蛋白质的结构预测上，准确度最高，准确度达到80％以上，与实际测定结果基本一致或接近。对于KGD-环七肽这个分子量仅为826dalton的短链小肽而言，其预测结构已基本上可以等同于其真实结构，所以，从InsightII(Ver2000)软件包中计算出来的数据已经可以很好地指导我们进行功能方面的分析与预测。InsightII(Ver2000)软件包的计算结果显示KGDW两端的两个半胱氨酸形成的二硫键结构大大束缚了短链小肽分子的构象柔性，减少了不规则构象产生的机率，整个短链小肽的分子结构呈现出单一、有序的特点，其中KGD功能序列中K(赖氨酸)残基侧链与D(天冬氨酸)残基侧链分别伸向环链的外侧，与外部溶液环境充分接触，赖氨酸与天冬氨酸残基侧链的伸展方向彼此相反。分子结构计算结果显示，W(色氨酸)与K(赖氨酸)形成氢键结构，进一步稳定了这个环七肽的空间构象。这些都与天然去整合素受体拮抗剂中KGD的结构特点与作用机制相一致，所以可以较为肯定地预计，KGD-环七肽能够较好地模拟天然去整合素多肽的功能构象，发挥相应的生物学活性，表现出较高的受体专一性与抗血小板聚集抑制活性。
2.KGD-环七肽的合成与纯化。
采用目前最先进的固相多肽合成技术，合成步骤分两步进行。第一步为CKGDWDC线性七肽的固相合成与鉴定。合成后的多肽分子经过HPLC进行纯化，获得CKGDWDC线性七肽纯品多肽分子。简要地说，多肽是在一个Milligen pepsynthesizer(肽合成仪)，通过Fmoc固相合成方法进行合成的。用90％TFA结合净化剂进行剪切/去保护。第二步为CKGDWDC线性七肽分子的环化，主要反应内容为在可控氧化条件下使第一位的半胱氨酸与第七位的半胱氨酸残基侧链-SH进行共价偶联形成二硫键桥，多肽的环化是通过剪切前用碘对三苯甲基保护的巯基进行在树脂上的氧化，将线性七肽转变为环七肽结构，所有的多肽都通过反相HPLC进行纯化，获得具有正确二硫键结构的KGD-环七肽分子，通过质谱测定进行鉴定，用于后续的生物学活性测定。
3.KGD-环七肽的理化学性质研究与生物学活性测定：
研究内容主要包括以下方面：
(1)通过质谱方法测定纯化的环七肽分子量与样品均一性；
(2)自由巯基检测实验；
(3)SDS-PAGE与Native-PAGE电泳检测线性肽与环性肽不同的电泳行为，对环七肽的荷质比状况及电泳行为、纯度作出进一步评价；
(4)ADP-刺激下血小板聚集抑制活性的测定，即最大半抑制浓度的测定；
(5)ADP-刺激下血小板聚集抑制延迟速率的测定；
经过大量实验研究与测定工作，表明分子设计KGD-环七肽作为新型的具有受体专一性高效抗栓剂，其化学结构不同于目前已知的所有天然抗栓剂以及国内外迄今为止已经研制成功及正在研究的基因工程改造或化学修饰的抗栓剂。其特点如下：
1.KGD-环七肽具有较强的抑制血小板聚集活性；
2.KGD-环七肽具有较高度的血小板上纤维蛋白原受体专一性；
3.KGD-环七肽分子量极小，对人体而言几乎不具有免疫原性；
4.综合以上三个特点，KGD-环七肽是一类高效的抗栓剂，并且，当应用于临床医疗实践中，将具有较高的用药安全性；
5.通过固相多肽合成方法结合高效液相色谱方法制造的KGD-环七肽纯度高，产量可以较为准确地控制，并且因为主要是采用固相多肽合成方法，所以KGD-环七肽产品易于大量生产，且产品的性能稳定，质量稳定可靠，有效规避了基因工程产品在生产过程中的高风险性及产品性能不稳定缺点。因为不采用微生物发酵及基因工程路线生产，所以不受环境、气候、温度、湿度等条件影响，相对而言，生产成本大大降低。
6.KGD-环七肽与其它目前临床上正在广泛使用的抗栓剂相比，具有较低的毒副作用，对人体无免疫原性或很低，是一类高效的且具有导向性的新型抗栓剂，因为高度受体专一性与导向性，而有可能大大降低用药剂量，进一步降低了用药风险与副作用，同时使治疗成本大大下降，减轻病人负担，所以，KGD-环七肽是一类非常有希望应用于血栓类疾病治疗与预防的实际临床应用中的。
7.整个生产过程不使用有毒物质，不污染环境。
以上特点为KGD-环七肽产品进行后期临床实验研究以及将来应用于临床医疗实践打下了良好的基础，KGD-环七肽分子极有希望成为具有我国自主知识产权的最新一代抗栓制剂。
附图说明
图1.KGD-环七肽一级结构示意图及分子结构式。
图2.KGD-环七肽分子空间结构示意图。
图3.KGD-环七肽合成产物经纯化后的质谱测定图。
图4.KGD-环七肽的SDS-PAGE电泳图谱。1，2为非还原条件下电泳检测；3，4为还原条件下电泳检测。
图5.KGD-环七肽对ADP刺激下血小板聚集抑制的光透射图。A为0.9％NaCl溶液作为对照。
B、C、D为不同浓度KGD-环七肽(0.25，0.5，0.75uM)。
图6.ADP刺激下KGD-环七肽对血小板聚集抑制程度曲线图。
图7.ADP刺激下KGD-环七肽对血小板聚集半抑制图谱。A图表示以0.9％NaCl生理盐水作为阴性对照；B图表示KGD-环七肽IC50值(620nM)。
图8.ADP刺激下KGD-环七肽对血小板聚集抑制速率变化图。
具体实施方式
实施例1.KGD-环七肽的分子设计与多肽合成
实验材料与试剂：多肽合成中所需各种氨基酸为Sigma公司产品；各种层析介质均为瑞典Phamacia公司产品，其他所需分析纯级试剂为北京化工厂产品；部分色谱纯级试剂为美国Sigma公司产品；
实验设备：SGI工作站、InsightII(Ver2000)软件包为美国SGI公司产品；电泳仪为Bio-Rad公司产品；FPLC(AKTA系列)快速蛋白液相层析系统、反相层析柱、蛋白质固相合成仪为瑞典Pharmacia公司产品；质谱仪为美国HP公司产品；大型蛋白质冻干机为美国Labconco公司产品；恒温水浴设备为美国Colora公司产品。
实验方法与结果：
1.KGD-环七肽分子结构设计与结构优化(计算机分子结构模建程序参考相应软件包及SGI工作站使用手册进行)。最终设计的KGD-环七肽短链环型多肽分子的一级结构及高级结构示意图如附图1与附图2所示。
2.KGD-环七肽分子的合成
对KGD-环七肽分子的合成分两步进行。首先在Milligen Pepsynthesizer 9050蛋白质固相合成仪上合成线性结构的CKGDWDC-短链多肽分子，第二步为线性CKGDWDC-多肽分子的环化，即在位于氮端第一位的半胱氨酸与位于羧端第一位的半胱氨酸之间形成二硫桥连接，从而形成CKGDWDC-七肽分子的环状结构。
采用蛋白质固相合成技术合成KGD-环七肽的一级结构，即线性KGD短链多肽分子。这一步在Pharmacia公司生产的Milligen Pepsynthesizer 9050蛋白质固相合成仪上进行，具体合成步骤参考固相合成仪产品使用手册。第一次合成产物大约为40mg，经过脱盐与HPLC等必要的纯化步骤后，除去合成过程中杂质与反应副产物，获得具有较高纯度的KGD-线性七肽分子，用于后面的环化实验，从初次合成的40mg产物中获得纯化的线性多肽分子约15毫克。多肽的环化是通过剪切前用碘对三苯甲基保护的巯基进行在树脂上的氧化，在可控氧化条件下使第一位的半胱氨酸与第七位的半胱氨酸残基侧链-SH进行共价偶联形成二硫键桥，将线性七肽转变为环七肽结构。具体反应步骤参考Milligen Pepsynthesizer 9050蛋白质固相合成仪产品使用手册。对反应体系进行浓缩后，进行HPLC-反相层析操作，除去线性多肽分子及其他反应过程中产生的副产物，获得KGD-环七肽纯品多肽，真空冷冻干燥，获得KGD-环七肽干粉。对KGD-环七肽进行飞行质谱检测，检测图谱如图3所示。测定的KGD-环七肽分子量为819.3dalton，与KGD-环七肽理论分子量(826dalton)基本一致，并且图谱显示多肽均一性较好，无其他杂峰出现，无其他杂蛋白。
实施例2.KGD-环七肽分子的理化性质鉴定
1.首先对获得的KGD-环七肽多肽分子进行自由巯基数目鉴定
实验材料与试剂：DTNB试剂；
实验设备：紫外分光光度计为岛津公司产品；恒温水浴设备为美国Colorea公司产品。
实验方法与结果：
调节多肽浓度，使之达到适当浓度范围，取15-30ul待测样品，加入1ml DTNB溶液中，25℃保温，反应0.5小时，然后测定412nm吸光值，根据吸光值大小判断多肽中二硫键含量，并对照标准曲线计算巯基数量。若待检分子中含有自由巯基(-SH)，则会出现显色反应，反应溶液体系呈现橙黄色；若待检分子中无自由巯基，则反应溶液体系不呈现任何颜色。对获得的KGD-环七肽多肽干粉中的实验结果表明，无任何显色现象出现，表明，该物质中无自由巯基存在，所有的半胱氨酸都形成了二硫键连接，以-S-S-键形式存在。
2.SDS-PAGE电泳检测KGD-环七肽
实验材料与试剂：丙烯酰胺(Arc)，甲叉双丙烯酰胺Bis为Boehringer Manngeim公司产品，TEMED、DTT为Promega公司产品。
实验设备：微量蛋白质电泳仪为Bio-Rad公司产品。
实验方法与结果：
对纯化的KGD-环七肽多肽进行SDS-PAGE电泳，分别进行还原状态(加DTT)与非还原状态(不加DTT)情况下蛋白质的电泳检测，实验结果如图4所示，结果表明，加入DTT情况下，蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的位置要相对滞后，比在非还原状态下(不加DTT)，多肽分子的泳动速度要稍微慢一些。显示二硫键形成对整个多肽分子构象具有一定的影响，说明KGD-环七肽的线性结构与环形结构，其分子构象是不同的。
3.通过质谱方法检测KGD-环七肽的分子量及分子均一性。
实验设备：质谱仪为美国Hewlett Packard公司产品。
实验方法与结果：
质谱检测在中国科学院化学所进行，具体步骤参考美国HP质谱测定仪的产品使用说明书及检测软件包使用说明。结果如图3所示，检测表明，KGD-环七肽纯品多肽的分子量为819.3dalton，因为在检测过程中，因为W(色氨酸)及二硫键的存在，会对检测结果产生一定误差，导致质谱测定的数据与理论计算的数据有一定误差，与分子量理论值826dalton在允许误差范围内，与理论值较为接近。同时，实验结果表明，所获得的多肽纯度较高，样品均一性良好。
实施例3.ADP刺激下的血小板聚集抑制实验研究KGD-环七肽的抗栓活性
实验材料与试剂：Wistar小鼠与兔，3.8％枸橼酸钠，PRP(富含血小板血浆)；PPP(贫含血小板血浆)；0.9％NaCl生理盐水。
实验设备：Chron-LG双道血小板聚集检测仪为美国Cole-Parmer公司产品。
实验方法与结果：
富含血小板血浆(PRP，platelet-rich plasma)取自Wistar小鼠与兔。测定由北京医科大学药理学研究室进行，该方法为测定药物抗栓活性的常规方法，为国家卫生部规定和国际通用，用光浊度计监测反应过程中溶液体系中血小板聚集情况，透射光强度将随着血小板聚集率的下降而降低，用生理盐水溶解KGD-环七肽分子，并配制不同浓度，用于监测对ADP刺激下血小板聚集的抑制情况。
首先抽取5ml 3.8％枸橼酸钠，然后取新鲜血液45ml混匀，注入到硅化的无菌离心管中，1000rpm离心15min，小心吸去上层血浆(PRP)，计数血小板并调至3×106个/ml。将剩余的血液以3000rpm离心20min，上层较为透明的即为PPP，将PRP300ul于缓冲液(对照)或待测样品加入到测试管中，混匀，在37℃保温3min，加入搅拌磁棒，首先用PPP调零点，之后将对照管(含PPP)和测试管放入测试孔中，在测试管中加入诱导剂ADP至终浓度为10uM，开始搅拌，随时间坐标记录血小板聚集光透射图谱，3min后结束记录，血小板聚集仪自动给出样品的最大聚集率。光透射图谱如图5所示。样品对血小板聚集的抑制率＝(对照的最大聚集率-样品的最大聚集率)/对照的最大聚集率×100％。最大半抑制值IC50的测定是将不同浓度的样品与PRP 37℃保温3min，加入诱导剂ADP(终浓度为10uM)，测定样品的最大聚集率。以抑制率对样品浓度作曲线，当抑制率达到50％时待测样品的浓度为其IC50值。
KGD-环七肽与富含血小板血浆PRP混合，ADP是一种血小板刺激剂，能激活血小板上纤维蛋白原受体GPIIb/IIIa的活性构象，与细胞外基质中的受体配体结合，促使血小板与血小板之间，血小板与细胞外基质之间发生相互作用与聚集。而拮抗整合素受体的行为会阻止血小板聚集现象的发生，因此表现出明显ADP刺激下的血小板聚集抑制效果。本文将其作为评价抗栓活性的一个重要参数。在富含血小板溶液体系中，当加入KGD-环七肽时，ADP刺激下的血小板聚集程度明显下降，实验结果如附图5所示。其中，以阴性对照(0.9％NaCl溶液)透射光强为100％，根据不同浓度下KGD-环七肽产生的血小板聚集程度，估算其达到最大半抑制时的浓度，如附图6所示，KGD-环七肽对血小板聚集抑制的IC50值约为620nM，如附图7所示。
以光透射图谱实验中光透射记录起始阶段图谱变化斜率进行计算，可以测出KGD-环七肽对血小板聚集抑制速率的影响。KGD-环七肽对ADP刺激下血小板聚集速率变化影响曲线如附图7所示。显示随着溶液体系中KGD环七肽浓度的增加，血小板聚集的速率逐渐降低，这表明随着KGD-环七肽的增加，血小板上GPIIb/IIIa受体对ADP刺激性的应激性下降，显示KGD-环七肽对血小板的抑制不仅体现在聚集程度上的抑制，对聚集速率也有一定的抑制效果。KGD-环七肽不同浓度对聚集速率的影响见附图8。进一步说明了KGD-环七肽是通过血小板GPIIb/IIIa受体的相互作用达到抑制效果的。
血小板聚集主要是通过血小板上纤维蛋白原受体GPIIb/IIIa与细胞外基质的相互作用发生的，GPIIb/IIIa受体被强烈拮抗时，血小板与血小板之间、以及血小板与细胞外基质之间的相互作用被抑制。血小板聚集抑制实验清晰地表明KGD-环七肽具有与受体GPIIb/IIIa相互作用的能力。应当说，这一能力的表现是KGD-环七肽分子上的KGD功能序列表现出来的。说明KGD-环七肽中的KGD序列展示出相应的功能活性构象，能够与GPIIb/IIIa受体识别并结合，发挥其受体识别与结合特点，表现其相应的生物活性。研究符合预期主要目的。

Claims (2)

1.一种KGD-环七肽，它的分子式结构式如下：
Figure C2004100743200002C1
2.根据权利要求1所述的KGD-环七肽在制备治疗血栓性疾病的药物中的应用。
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Design of Potent and Specific Integrin Antagonists PEPTIDEANTAGONISTS WITH HIGH SPECIFICITY FORGLYCOPROTEIN IIb-IIIa*. Scarborough R M et al.J. Biol. Chem,Vol.268 No.2. 1993
Design of Potent and Specific Integrin Antagonists PEPTIDEANTAGONISTS WITH HIGH SPECIFICITY FORGLYCOPROTEIN IIb-IIIa*. Scarborough R M et al.J. Biol. Chem,Vol.268 No.2. 1993 *

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