CN100335608C - 一种惰性载体式固态连续化发酵的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及惰性载体连续化固态发酵的方法及装置；该装置包括：固态发酵罐的上盖的孔中插入进液管、出气管和种子液输运管，进液管与贮液罐1相通；固态发酵罐内腔中部充满惰性载体，惰性载体的两端填上滤纸；固态发酵罐的底部设置一根发酵液的输送管，该输送管与发酵液贮液罐连通，和一空气输送管，该空气输送管上设有蠕动泵2和空气流量计。该发酵方法是在传统的固态发酵的基础上采用惰性多孔吸附材料作为固态发酵中培养基的载体，连续进料，连续出料，整个只需要接种一次，过程操作参数可调。由于多孔吸附载体在无游离水状态下固态发酵，利于气液固传递，发酵水平比液体发酵提高3～5倍；发酵液直接流出，省去分离步骤；不产生大量废液。

Description

一种惰性载体式固态连续化发酵的装置和方法
技术领域
本发明属于发酵的装置和方法，特别涉及一种惰性载体式固态连续化发酵的方法。
技术背景
固态发酵是人类利用微生物生产产品历史最悠久的技术之一，几千年前就被人类用以制造各种传统食品。近几年来，固态发酵在有机酸、酒精、抗生素、基因重组菌发酵药物等领域的研究得到迅速发展及应用，具有巨大的应用潜能。
固态发酵一般是指培养基呈固态，没有或几乎没有自由流动水的状态下进行的一种或多种微生物发酵过程。固态发酵直接利用农产品原料(粮食与纤维质原料)等为底物，原料廉价；发酵环境模拟自然生长环境，使微生物保持与自然界相似的生长状态；无大量有机废水产生。随着人们环境保护意识的增强，大家开始关注固态发酵这一清洁生产工艺，但是传统的固态发酵自身也存在许多缺点，从而限制了它的应用，其中很重要的一个方面就是不能实现发酵过程的连续化，耗费很多人力物力，提高了生产成本。
本世纪六十年代开始，出现了一种新的发酵方式，它是以惰性固态载体为固态发酵过程中的固相，微生物生长的营养是吸附在载体上的培养液，这种发酵方式被称作惰性载体吸附固态发酵。与传统的固态发酵相比，惰性载体吸附固态发酵在工业生产和研究方面表现出了很大的优势，目前已经有惰性载体吸附固态发酵的文献报道(Zhu，Y.，Smits，J.O.，Knol，W.，Bol，J.，A novel solid-state fermentation system using polyurethane foamas inert carrier.Biotechnol.Lett.1994，16，643-648)，但是目前仍局限在实验室规模，还未实现工业上的连续化，没有真正体现出它的优势。本发明提出了一种惰性载体式固态连续化发酵的方法，真正解决了固态发酵的连续化问题，具有普遍的适用性，在实际应用中大大拓宽了固态发酵的应用范围前景。
发明内容
本发明的目的是为了解决固态发酵中难以实现连续化的问题，提供了一种利用惰性载体连续固态发酵的方法及其专用装置，可以减少人力物力消耗，简化工艺流程和设备设计，提高了生产效率。
本发明的目的主要通过如下措施来实现：
本发明提供的惰性载体式固态连续化发酵的装置(见图1)，包括：贮液罐1，该贮液罐1通过进液管11与固态发酵罐6连通，一根种子液输运管19通过固态发酵罐6上盖上的孔中插入固态发酵罐6内，发酵储液罐10底部设置一根发酵液的输送管13，该输送管13与发酵液贮液罐10连通；其特征在于：还包括带有孔的滤纸5，惰性载体7、空气压缩机8，空气流量计9、蠕动泵2和出气管12；其中固态发酵罐6的上盖的孔中插入出气管12，固态发酵罐6内腔中部充入惰性载体7，惰性载体7的两端各设有一带有孔的滤纸5；固态发酵罐6的底部连通一根空气输送管14，该空气输送管14上设有空气压缩机8和空气流量计9。
所述的惰性载体7包括聚氨酯软质泡沫塑料、聚氯乙烯泡沫塑料、珍珠岩或活性炭；其开孔率大于90.5％，平均最大孔径为0.5～1mm，填充量为罐体积的1/2～4/5。
所述的带孔滤纸5上均匀分布小孔，开孔面积至少为40％，平均最大孔径为0.5mm-1.2mm。
本发明提供的惰性载体式固态连续化发酵的方法，在上述的装置中进行，包括以下步骤：
1)将经过常规高温灭菌方法处理的惰性载体7，充填入发酵罐中，其填充量为罐体积的1/2～4/5；
2)将1～7ml种子液通过种子液输运管加入固态发酵罐，种子液流经具有均匀分布的小孔的滤纸后加入发酵罐中，吸附在惰性载体上的表面，完成接种过程；
3)将经过高压灭菌的发酵液通过蠕动泵源源不断地加入到固态发酵罐中，其流速为0.03～0.07ml/min，其发酵液流经小孔的滤纸，发酵液通过渗透和扩散进入惰性载体内部，并吸附在吸附载体的孔隙表面；随着加入量的渐渐增多，由于发酵液对下部发酵液的驱动作用和发酵液自身的重力作用以及载体的吸附量限制，发酵液在载体中的从上向下渗流，最后流出固态发酵罐，进入发酵储液罐进行收集；
4)在步骤3)的同时，通过固态发酵罐底部的空气输送管14通入无菌空气，其气体流速为5～30ml/min，无菌空气在固态发酵罐内，沿着吸附载体内部的连通孔隙流动，最后从出气管排出；同时发酵温度和时间根据不同的菌种决定。
本发明的工艺流程如下：
Figure C20041010161700051
本发明的突出优点：
(1)由于载体和反应罐的合理选择和设计，实现了反应过程的连续化，解决了长期以来固态发酵不能连续化的问题。本发明中，反应器被设计为立式，发酵液自上面流入，然后靠自身重力从下面流出，反应器内设置有带孔的滤纸，起分散发酵液的作用。操作开始时，先以较低的流量滴加种子液，种子液被滤板所阻隔，均匀的分散开来，然后慢慢的流入下面的惰性载体中，被均匀的吸附住。然后，发酵液以很低的流量加入反应器，经过滤板慢慢渗入载体。载体具有很好的吸水性和孔隙率，吸附在上的发酵液形成液膜，微生物就在液膜内生长，四周是连续相的空气。由于载体的吸水性不是太强，所以一定要保持低的流速，以维持一定的保留时间，使发酵液流出时恰好完成微生物的发酵周期。随着发酵液的不断加入，载体吸附量越来越大，但超过它的吸附上限时，上面的新发酵液凭借施加在载体的压力，将载体中的旧发酵液挤出，使其向下流动，载体再吸附新加入的发酵液。发酵液就以此方式，新旧置换，向下流动，直到流出反应器，发酵周期也就结束。整个过程实现了连续进料出料，而且只需要接种一次，真正实现了固态发酵的连续化。
(2)反应过程的各种参数易于调节。对于传统的固态发酵，基质大都是一些农作物，成分固定，只能通过改变不同底物的配比来调节底物构成，因此可调的余地很小。此外，传统的固态发酵中，内环境是非均一的，各个部位的温度、湿度和pH都可能不同，而且由于是固体基质，这些参数也难以在线测定和改变，这就造成了传统固态发酵难以实现操作参数的调节。惰性载体固态发酵采用的时液体培养基，其各种成分可以任意精确的调节，可以很方便的通过改变发酵液构成来优化培养基，提高产率。此外，由于惰性载体的存在有利于气液交换，反应器的内环境是均匀一致的，温度、湿度和pH等易于在线测定和监控，可以很方便的通过改变以上参数来考察它们对产率的影响。
(3)产率高。载体吸附连续固态发酵过程中，载体与发酵液以及空气之间的关系如附图2所示。惰性固态载体为固定相，流动的发酵液与流动的气体都是流动相，发酵液沿着载体向下流动，而气体沿着载体内的连通孔隙向上流动。液相是不连续的，以液膜方式存在，而气体是连续相，无处不在。微生物就生活在液膜里，靠液膜中的发酵液和附近的空气来生长代谢，惰性载体固态发酵的这种结构为微生物的生长提供了巨大且维持稳定的比表面积，极大地促进了气体地传递。比起液态发酵需要持续不停的搅拌才能保证良好的通气条件，此方法节约了大量能源，而且提高了产率。
本发明的方法是在传统的固态发酵的基础上采用惰性多孔吸附材料作为固态发酵中培养基的载体，连续进料，连续出料，整个只需要接种一次，过程操作参数可调；由于多孔吸附载体在无游离水状态下固态发酵，利于气液固传递，发酵水平比液体发酵提高3～5倍；反应器构造简单，设备投资比液体深层发酵低得多；发酵完毕后，发酵液直接流出发酵罐，节省了分离步骤；不产生大量废液，环境污染小；本发明真正实现了固态发酵的连续化，具有广泛的适用性与推广意义。
附图说明
图1是本发明的发酵装置组成示意图
图2载体吸附连续固态发酵过程中微观结构示意图
图面说明：
贮液罐-1；         蠕动泵-2；       种子液入口-3；
出气口-4；         滤纸-5；         固态发酵罐-6；
惰性载体-7；       空气压缩机-8；   空气流量计-9；
发酵储液罐-10；    进液管-11；      出气管-12；
发酵液的输送管-13；空气输送管-14；  发酵液流动方向-15；
流加的发酵液-16；  吸附的发酵液-17；流动的气体-18；
种子液输运管-19；
具体的实施方式
实施例1连续化固态发酵生产碱性蛋白酶
参考图1，制作一本发明的发酵装置，并在本实施例制作的装置上进行连续化固态发酵生产碱性蛋白酶，下面通过实施例对本发明进行进一步说明。
固态发酵罐6是采用不锈钢材料做成，高12.0cm，内径6.5cm。
固态发酵罐6的上盖的孔中插入一根不锈钢材料做成的进液管11，该进液管11通过一蠕动泵与贮液罐1相通；上盖的另一孔内插入一根出气管4，还有一根种子液输运管19插入上盖进到固态发酵罐6内；固态发酵罐6内腔中部充入惰性载体7，填充量为罐体积的1/2-4/5，该惰性载体7为聚氨酯软质泡沫塑料，被制成直径5mm的立方体，呈多孔状蜂窝结构，具有优良的柔软性、弹性、吸水性以及耐水性等特点。惰性载体7的两端有滤纸5，所述的滤纸5的开孔面积40％，平均最大孔径为0.5mm或1.2mm都可以；固态发酵罐6的底部设置一根发酵液的输送管13，该输送管13与发酵液贮液罐10连通，和一空气输送管14，该空气输送管14上设有空气压缩机8和空气流量计9。
在上述的装置中进行连续化固态发酵生产碱性蛋白酶，载体吸附连续固态发酵过程中微观结构如图2所示，图中：发酵液流动方向-15；滴加的发酵液-16；惰性载体-7；吸附的发酵液-17；流动的气体-18；
1)先将惰性载体7，即聚氨酯软质泡沫塑料在121℃下灭菌20min，然后充填入发酵罐中，填充量为罐体积的1/2-4/5都可以；聚氨酯软质泡沫塑料的开孔率大于90.5％，其平均最大孔径为0.5或1mm都可以；
2)产碱性蛋白酶的菌种为短小芽孢杆菌，接种前先将菌种活化，制成种子液；将5ml种子液从顶部的种子液输运管的种子液入口3滴加入固态发酵罐，种子液流经具有均匀分布的小孔的滤纸后加入发酵罐中，使其吸附在惰性载体中分散均匀，完成接种过程；
3)将经过高压灭菌的发酵液通过蠕动泵源源不断地从顶部加入到固态发酵罐中，发酵液的组成为蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，NaCL0.5％；其发酵液流速控制在0.03ml/min，发酵液流经小孔的滤纸，发酵液通过渗透和扩散进入惰性载体内部，并吸附在吸附载体的孔隙表面。随着加入量的渐渐增多，由于发酵液对下部发酵液的驱动作用和发酵液自身的重力作用以及载体的吸附量限制，发酵液在载体中的从上向下渗流，最后流出固态发酵罐，进入发酵储液罐；48小时后发酵结束，发酵液从底部流出，进入储液罐，得到连续化固态发酵生产碱性蛋白酶。
4)在步骤3)的同时，还通过固态发酵罐底部的空气输送管14通入无菌空气，其气体以10ml/min的流速通入固态发酵罐内，无菌空气在固态发酵罐内，沿着吸附载体内部的连通孔隙流动，最后从出气管出气口4的排出；同时发酵温度保持在32℃，发酵时间48小时。
实施例2
用实施例1制作的发酵装置，只是所用的滤纸5有不同，其中滤纸5的开孔面积50％，平均最大孔径为0.5mm或1.2mm；进行连续化固态发酵生产碱性蛋白酶，其步骤同实施例1的步骤，只是具体发酵条件有所区别，以下给出具体发酵条件。
产碱性蛋白酶的菌种为短小芽孢杆菌，接种前先将菌种活化，制成种子液。发酵液的组成为蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，NaCL0.5％。先将惰性载体，其开孔率大于90.5％，其平均最大孔径为0.75mm的聚氨酯软质泡沫塑料，在121℃下灭菌20min，然后充填入发酵罐中，填充量为罐体积的1/2～4/5。惰性载体两端的滤纸的开孔面积为50％，平均最大孔径为0.7mm；从顶部滴加种子液7ml，使其在惰性载体中分散均匀，然后以蠕动泵从顶部加入发酵液，流速控制在0.05ml/min，温度为32℃，同时从底部通以10ml/min的流速通入无菌空气，48h后发酵结束，发酵液从底部流出，进入储液罐。
实施例3连续化固态发酵生产克拉维酸
用实施例1制作的发酵装置，进行连续化固态发酵生产克拉维酸，其步骤同实施例1，只是具体发酵条件有所区别，以下给出具体发酵条件。
产克拉维酸的菌种为棒状链霉菌，接种前先将菌种活化，制成种子液，发酵液组成为甘油20g/l，黄豆提取液200ml/l，胨5g/l，pH7.0。惰性载体为聚氯乙烯泡沫塑料，将聚氯乙烯泡沫塑料进行常规的高温灭菌，被制成直径5mm的立方体，呈多孔状蜂窝结构，具有优良的柔软性、弹性、吸水性以及耐水性等特点，充填入发酵罐的1/3容积内，惰性载体7的两端有滤纸5，其滤纸的开孔面积60％，平均最大孔径为0.9mm；从顶部滴加6ml种子液，使其在载体中分散均匀，然后以蠕动泵从顶部加入发酵液，流速控制在0.04ml/min，温度为28℃，同时从底部通以20ml/min的流速无菌空气，120h后发酵结束，发酵液从底部流出，进入储液罐。
实施例4
用实施例1制作的发酵装置，进行连续化固态发酵生产克拉维酸，其步骤同实施例1的步骤，只是具体发酵条件有所区别，以下给出具体发酵条件。
产克拉维酸的菌种为棒状链霉菌，接种前先将菌种活化，制成种子液，发酵液组成为甘油20g/l，黄豆提取液200ml/l，胨5g/l，pH7.0。惰性载体为聚氨酯软质泡沫塑料，被制成直径5mm的立方体，呈多孔状蜂窝结构，具有优良的柔软性、弹性、吸水性以及耐水性等特点。惰性载体7的两端有滤纸5，其滤纸的开孔面积55％，平均最大孔径为1.1mm；将惰性载体采用通常的方法高温灭菌，充填入发酵罐中，从顶部滴加7ml种子液，使其在载体中分散均匀，然后以蠕动泵从顶部加入发酵液，流速控制在0.06ml/min，温度为28℃，同时从底部通以30ml/min的流速无菌空气，120h后发酵结束，发酵液从底部流出，进入储液罐。
实施例5
用实施例1制作的发酵装置，进行连续化固态发酵生产纤维素酶，其步骤同实施例1的步骤，只是具体发酵条件有所区别，以下给出具体发酵条件。
产纤维素酶的菌种为里氏木霉，接种前先将菌种活化，制成种子液，发酵液为蛋白陈3g/L，硫铵2g/L，酵母膏0.5g/L，KH2PO4 4g/L，CaCl2·2H2O 0.3g/L，MgSO4·7H2O 3g/L，吐温-80 0.2ml/L，还可加入本专业技术人员通晓的消泡剂。惰性载体为聚氨酯软质泡沫塑料，被制成直径5mm的立方体，呈多孔状蜂窝结构，具有优良的柔软性、弹性、吸水性以及耐水性等特点。惰性载体7的两端有滤纸5，其滤纸的开孔面积65％，平均最大孔径为0.6mm；将惰性载体高温灭菌，充填入发酵罐的2/3容积内，从顶部滴加7ml种子液，使其在载体中分散均匀，然后以蠕动泵从顶部加入发酵液，流速控制在0.06ml/min，温度为28℃，pH值为4，同时从底部通以30ml/min的流速无菌空气，96h后发酵结束，发酵液从底部流出，进入储液罐。
实施例6
用实施例1制作的发酵装置，进行连续化固态发酵生产纤维素酶，其步骤同实施例1的步骤，只是具体发酵条件有所区别，以下给出具体发酵条件。
产纤维素酶的菌种为里氏木霉，接种前先将菌种活化，制成种子液，发酵液为蛋白陈3g/L，硫铵2g/L，酵母膏0.5g/L，KH2PO4 4g/L，CaCl2·2H2O 0.3g/L，MgSO4·7H2O3g/L，吐温-80 0.2ml/L，通常的消泡剂。惰性载体为聚氯乙烯泡沫塑料，被制成直径5mm的立方体，呈多孔状蜂窝结构，具有优良的柔软性、弹性、吸水性以及耐水性等特点。惰性载体7两端的滤纸5上均匀开孔，其开孔面积为65％，平均最大孔径为1.2mm；将惰性载体高温灭菌，充填入发酵罐的2/5容积内，从顶部滴加5ml种子液，使其在载体中分散均匀，然后以蠕动泵从顶部加入发酵液，流速控制在0.05ml/min，温度为28℃，pH值为4，同时从底部通以30ml/min的流速无菌空气，96h后发酵结束，发酵液从底部流出，进入储液罐。
实施例7
用实施例1制作的发酵装置，进行连续化固态发酵生产黄原胶，其步骤同实施例1的步骤，只是具体发酵条件有所区别，以下给出具体发酵条件。
产黄原胶的菌种为甘兰黑腐单胞菌，接种前先将菌种活化，制成种子液，发酵液为蔗糖4.0％，谷氨酸钠2.2％，新鲜玉米浆2.8％，NaCL 0.1％，FeSO4 0.01％，KH2PO40.01％，调至pH为7.0。将惰性载体包括聚氨酯软质泡沫塑料或活性炭，经过通常的高温灭菌后，充填入发酵罐中，其充填量为发酵罐容积的1/4；开孔率为90.5％，其平均最大孔径为0.9mm；从顶部滴加种子液，使其在载体中分散均匀，然后以蠕动泵从顶部加入发酵液，流速控制在0.03ml/min，温度为28℃，同时从底部通以20ml/min的流速无菌空气，48h后发酵结束，发酵液从底部流出，进入储液罐。
实施例8
用实施例1制作的发酵装置，进行连续化固态发酵生产黄原胶，其步骤同实施例1的步骤，只是具体发酵条件有所区别，以下给出具体发酵条件。
产克拉维酸的菌种为甘兰黑腐单胞菌，接种前先将菌种活化，制成种子液，发酵液为蔗糖4.0％，谷氨酸钠2.2％，新鲜玉米浆2.8％，NaCL 0.1％，FeSO4 0.01％，KH2PO40.01％，调至pH为7.0。将惰性载体包括聚氨酯软质泡沫塑料或珍珠岩，经通常的方法高温灭菌后，再充填入发酵罐中，其充填量为发酵罐容积的1/5；开孔率为90.5％，其平均最大孔径为0.8mm；从顶部滴加5ml种子液，使其在载体中分散均匀，然后以蠕动泵从顶部加入发酵液，流速控制在0.04ml/min，温度为28℃，同时从底部通以30ml/min的流速无菌空气，48h后发酵结束，发酵液从底部流出，进入储液罐。

Claims (4)

1.一种惰性载体式固态连续化发酵的装置，包括：贮液罐(1)，该贮液罐(1)通过进液管(11)与固态发酵罐(6)连通，一根种子液输运管(19)通过固态发酵罐(6)上盖上的孔中插入固态发酵罐(6)内，发酵储液罐(10)底部设置一根发酵液的输送管(13)，该输送管(13)与发酵液贮液罐(10)连通；其特征在于：还包括带有孔的滤纸(5)，惰性载体(7)、空气压缩机(8)，空气流量计(9)、蠕动泵(2)和出气管(12)；其中固态发酵罐(6)的上盖的孔中插入出气管(12)，固态发酵罐(6)内腔中部充入惰性载体(7)，惰性载体(7)的两端各设有一带有孔的滤纸(5)；固态发酵罐(6)的底部连通一根空气输送管(14)，该空气输送管(14)上设有空气压缩机(8)和空气流量计(9)。
2.按权利要求1所述的惰性载体式固态连续化发酵的装置，其特征在于，所述的惰性载体(7)为聚氨酯软质泡沫塑料、聚氯乙烯泡沫塑料、珍珠岩或活性炭，开孔率大于90.5％，其平均最大孔径为0.5～1mm，填充量为罐体积的1/2～4/5。
3.按权利要求1所述的惰性载体式固态连续化发酵的装置，其特征在于，所述的带孔滤纸(5)上均匀分布小孔，开孔面积至少为40％，平均最大孔径为0.5mm-1.2mm。
4.一种应用权利要求1所述的惰性载体式固态连续化发酵的装置进行连续化发酵的方法，包括以下步骤：
1)将经过常规高温灭菌方法处理的惰性载体，充填入发酵罐中，其填充量为罐体积的1/2～4/5；该惰性载体的开孔率至少为90.5％，其平均最大孔径为0.5～1mm；
2)从固态发酵罐上的种子液输运管加入1～7ml种子液，种子液流经载体顶部的具有均匀分布的小孔的滤纸加入发酵罐中，吸附在惰性载体的表面，完成接种过程；
3)将经过高压灭菌的发酵液连续地加入到固态发酵罐中，其流速为0.03～0.07ml/min；
4)在步骤3)的同时，通过固态发酵罐底部的空气输送管(14)通入无菌空气，其气体流速为5～30ml/min，无菌空气在固态发酵罐内，沿着吸附载体内部的连通孔隙流动，保持预定的发酵温度进行固态发酵，发酵液在载体中从上向下渗流，最后流出固态发酵罐，进入发酵储液罐进行收集；发酵温度和时间根据不同的菌种决定。
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