CH718556A1 - In Vitro Drug Allergy Test Procedure - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur In-vitro-Bestimmung von Erkrankungen und Krankheiten, die durch eine Testsubstanz, insbesondere ein Arzneimittel, induziert werden. Das Verfahren umfasst den Schritt des Bereitstellens einer Blutprobe, des Isolierens von Agranulozyten aus der Blutprobe und des Kultivierens der Agranulozyten mit mindestens einer Testsubstanz. Es erfolgt eine gleichzeitige quantitative Messung einer Vielzahl von Zytokinen und/oder zytotoxischen Molekülen. Die Kultivierung wird mit Ausgangszelldichten zwischen 3 × 10 5 Zellen pro 0,2 ml und 8 × 10 5 Zellen pro 0,2 ml durchgeführt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der Zellausgangsdichte für das Vorstehende.The present invention relates to a method for the in vitro determination of disorders and diseases that are induced by a test substance, in particular a drug. The method includes the step of providing a blood sample, isolating agranulocytes from the blood sample and culturing the agranulocytes with at least one test substance. There is a simultaneous quantitative measurement of a large number of cytokines and/or cytotoxic molecules. The cultivation is carried out with starting cell densities between 3 × 10 5 cells per 0.2 ml and 8 × 10 5 cells per 0.2 ml. The present invention also relates to the use of cell output density for the foregoing.
Description
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur In-vitro-Bestimmung von durch eine Testsubstanz induzierten Erkrankungen und Krankheiten sowie die Verwendung von isolierten Agranulozyten aus einer Blutprobe zur Bestimmung von durch eine Testsubstanz induzierten Erkrankungen und Krankheiten, alle gemäß den Oberbegriffen der unabhängigen Ansprüche. The present invention relates to a method for the in vitro determination of diseases and diseases induced by a test substance and the use of isolated agranulocytes from a blood sample for the determination of diseases and diseases induced by a test substance, all according to the preambles of the independent claims .
Technischer HintergrundTechnical background
[0002] Obwohl selten, können Arzneimittelüberempfindlichkeitsreaktionen zu schwerwiegenden Komplikationen und sogar lebenslangen Folgen für den betroffenen Patienten führen. Mangels standardisierter Tests stützt sich die Diagnose von arzneimittelinduzierten Erkrankungen und Krankheiten meist auf die Anamnese durch den Arzt und dermale Allergietests, bei denen die Haut verdächtigten allergieauslösenden Substanzen ausgesetzt und auf Anzeichen einer allergischen Reaktion untersucht wird. Hauttests sowie Bluttests haben sich jedoch als nicht zuverlässig genug erwiesen, um eine Arzneimittelallergie auszuschließen. [0002] Although rare, drug hypersensitivity reactions can result in serious complications and even lifelong consequences for the affected patient. In the absence of standardized tests, the diagnosis of drug-induced illnesses and diseases mostly relies on the physician's medical history and dermal allergy testing, in which the skin is exposed to suspected allergenic substances and examined for signs of an allergic reaction. However, skin tests and blood tests have not proven reliable enough to rule out a drug allergy.
[0003] Insbesondere T-Zell-vermittelte Reaktionen auf Arzneimittel treten erst ein paar Tage nach Beginn der Behandlung mit dem ursächlichen Medikament auf und sind im Test oft serologisch negativ. Die Sensibilisierung erfolgte durch die Bildung von T-Zellen, die in Blutproben schwer nachweisbar sind. Zu den als T-Zell-vermittelte Reaktionen verursachten Krankheiten gehören unter anderem makulopapulöses Exanthem (MPE) oder Hautausschläge, toxische epidermale Nekrolyse (TEN), bullöses Exanthem, Arzneimittelexanthem mit Eosinophilie und systemischen Symptomen (DRESS). [0003] In particular, T cell-mediated reactions to drugs only occur a few days after the start of treatment with the causative drug and are often serologically negative in the test. The sensitization occurred through the formation of T cells, which are difficult to detect in blood samples. Diseases caused as T-cell mediated reactions include maculopapular rash (MPE) or rash, toxic epidermal necrolysis (TEN), rash bullous, drug eruption with eosinophilia and systemic symptoms (DRESS), among others.
[0004] Ein etabliertes diagnostisches Instrument zur In-vitro-Bestimmung von Erkrankungen und Krankheiten, die durch ein Arzneimittel hervorgerufen werden, ist der Lymphozytentransformationstest (LTT). Der LTT misst die Proliferation von T-Zellen gegenüber einem Arzneistoff in vitro, wodurch eine Sensibilisierung gegenüber der Testsubstanz nachgewiesen werden kann. T-Zellen sind entscheidend für das Funktionieren der Immunabwehr und an einer Vielzahl von Immunreaktionen beteiligt. [0004] An established diagnostic tool for the in vitro determination of disorders and diseases caused by a drug is the lymphocyte transformation test (LTT). The LTT measures the proliferation of T cells to a drug in vitro, which can be used to demonstrate sensitization to the test substance. T cells are critical to the functioning of the immune system and are involved in a variety of immune responses.
[0005] Antigen-spezifische T-Zellen sezernieren Zytokine und nehmen an IgE-vermittelten Reaktionen teil. Weitere T-Zellen sind als zytotoxische Effektorzellen aktiv beteiligt. Lymphozytentransformationstests wurden für eine Vielzahl von Arzneimitteln erfolgreich angewendet. Der Test ist allerdings vergleichsweise aufwändig und erfordert die Analyse spezifischer Reaktionen lebender T-Zellen. Die Tests funktionieren mit Vollblut und verwenden Extrakte aus mononukleären Zellen, die mit dem spezifischen Arzneimittel inkubiert und mit einer Reihe von Konzentrationen getestet werden. Die Inkubationszeit liegt im Bereich von etwa einer Woche, und die Proliferation der Zellen wird mittels radioaktiv markiertem Thymidin getestet (siehe auch „the lymphocyte transformation test in the diagnosis of drug hypersensitivity“ [Der Lymphozytentransformationstest in der Diagnostik der Arzneimittelüberempfindlichkeit] (Pichler, WJ, Tilch, J. Allergy 2004: 59: 809-820). [0005] Antigen-specific T cells secrete cytokines and participate in IgE-mediated responses. Other T cells are actively involved as cytotoxic effector cells. Lymphocyte transformation assays have been used successfully for a variety of drugs. However, the test is comparatively complex and requires the analysis of specific reactions of living T cells. The tests work with whole blood and use mononuclear cell extracts that are incubated with the specific drug and tested at a range of concentrations. The incubation period ranges from about a week, and cell proliferation is assayed using radiolabeled thymidine (see also "the lymphocyte transformation test in the diagnosis of drug hypersensitivity" (Pichler, WJ, Tilch, J Allergy 2004:59:809-820).
[0006] Leider ist es dem etablierten LTT nicht gelungen, eine ausreichende Zuverlässigkeit bei einem breiten Spektrum möglicher Arzneimittelüberempfindlichkeitsreaktionen zu bieten. Außerdem ist der LTT ein aufwendiger Test, der Erfahrung mit Zellkulturen und dem Umgang mit radioaktivem Material voraussetzt. Die Abhängigkeit von einem vergleichsweise kurzen Zeitfenster der Proliferation schränkt das Spektrum potenzieller ursächlicher Arzneimittel, die mit ausreichender Sicherheit mittels des LTT identifiziert werden können, weiter ein. [0006] Unfortunately, the established LTT has failed to provide sufficient reliability across a broad spectrum of potential drug hypersensitivity reactions. In addition, the LTT is a complex test that requires experience with cell cultures and the handling of radioactive material. The reliance on a comparatively short time window of proliferation further limits the spectrum of potential causative drugs that can be identified with sufficient certainty using the LTT.
[0007] Es besteht daher ein Bedarf, ein Verfahren zum Testen von Patientenblutproben in Bezug auf Überempfindlichkeit gegenüber Testverbindungen und insbesondere Arzneimitteln bereitzustellen, das empfindlicher als die vorhandenen ist und mindestens die gleiche Spezifität in Bezug auf den LTT-Test aufweist. There is therefore a need to provide a method for testing patient blood samples for hypersensitivity to test compounds and particularly drugs that is more sensitive than those present and has at least the same specificity with respect to the LTT test.
Kurzdarstellung der ErfindungSummary of the Invention
[0008] Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur In-vitro-Bestimmung von durch eine Testsubstanz induzierten Erkrankungen und Krankheiten bereitzustellen, das mindestens einen Nachteil des Standes der Technik überwindet. Eine besondere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen solchen Test bereitzustellen, der eine bessere Sensitivität bei mindestens gleicher Spezifität als der existierende LTT-Test aufweist. The object of the present invention is to provide a method for the in vitro determination of diseases and diseases induced by a test substance, which overcomes at least one disadvantage of the prior art. A particular object of the present invention is to provide such a test that has better sensitivity with at least the same specificity as the existing LTT test.
[0009] Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen solchen Test bereitzustellen, der leicht standardisiert durchgeführt werden kann und intradermale oder epikutane Allergietests für eine breite Palette von Arzneimitteln ersetzen kann. Another object of the present invention is to provide such a test that can be easily performed in a standardized manner and can replace intradermal or epicutaneous allergy tests for a wide range of drugs.
[0010] Typische Arzneimittel, die mögliche Verursacher von Erkrankungen und Krankheiten gemäß der vorliegenden Erfindung sind, sind Antibiotika wie zum Beispiel β-Lactame, wie Penicilline und Cephalosporine, Sulfonamide, Tetracycline, Rifampicine, Lipiarmicine und Makrolide, sowie typische als Antikonvulsiva verwendete Arzneimittel wie Phenytoin, Lamotrigin, sowie zur Behandlung von Tuberkulose verwendete Arzneimittel wie Isoniazid, Rifampicin, Diuretika wie Acetazolamid, Furosemid, Hydrochlorothiazid, Muskelrelaxanzien wie Suxamethonium, nichtsteroidale Antirheumatika wie Diclofenac, Celecoxib, Ibuprofen, Opioide wie Naloxon, Tramadol, Pethidin, Protonenpumpenhemmer wie Pantoprazol, Omeprazol, Kontrastmittel wie lohexol, lopamidol, Statine wie Atorvastatin, Simvastatin, und Urikostatika wie Allopurinol, Febuxostat. Typical drugs that are possible causative agents of diseases and diseases according to the present invention are antibiotics such as β-lactams such as penicillins and cephalosporins, sulfonamides, tetracyclines, rifampicins, lipiarmicins and macrolides, and typical drugs used as anticonvulsants such as Phenytoin, lamotrigine, as well as drugs used to treat tuberculosis such as isoniazid, rifampicin, diuretics such as acetazolamide, furosemide, hydrochlorothiazide, muscle relaxants such as suxamethonium, nonsteroidal anti-inflammatory drugs such as diclofenac, celecoxib, ibuprofen, opioids such as naloxone, tramadol, pethidine, proton pump inhibitors such as pantoprazole, omeprazole , contrast agents such as lohexol, lopamidol, statins such as atorvastatin, simvastatin, and uricostatics such as allopurinol, febuxostat.
[0011] Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird gemäß dem kennzeichnenden Teil der unabhängigen Ansprüche gelöst, nämlich mit einem Verfahren zur In-vitro-Bestimmung von durch eine Testsubstanz induzierten Erkrankungen und Krankheiten. The object of the present invention is achieved according to the characterizing part of the independent claims, namely with a method for the in vitro determination of diseases and diseases induced by a test substance.
[0012] Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur In-vitro-Bestimmung von durch eine Testsubstanz induzierten Erkrankungen und Krankheiten. Das Verfahren umfasst den Schritt des Bereitstellens einer Blutprobe. Ein weiterer Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Isolieren von Agranulozyten aus der Blutprobe und das Kultivieren der Agranulozyten mit der mindestens einen Testsubstanz. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst ferner den Schritt der gleichzeitigen quantitativen Messung einer Vielzahl von Zytokinen und/oder zytotoxischen Molekülen. Verfahrensgemäß wird die Kultivierung mit Ausgangszelldichten zwischen 1 × 10<6>Zellen pro ml und 4 × 10<6>Zellen pro ml durchgeführt, insbesondere mit Ausgangszelldichten zwischen 1,5 × 10<6>Zellen pro ml und 3 × 10<6>Zellen pro ml. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Kultivierung in einer 96-Well-Platte mit Wells von jeweils 0,2 ml und anfänglichen Zelldichten zwischen 3 × 10<5>Zellen und 8 × 10<5>Zellen pro Well durchgeführt. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform wird die Kultivierung mit Ausgangszelldichten von etwa 2 × 10<6>Zellen pro ml durchgeführt. [0012] One aspect of the present invention relates to a method for the in vitro determination of diseases and diseases induced by a test substance. The method includes the step of providing a blood sample. A further step of the method according to the invention comprises isolating agranulocytes from the blood sample and culturing the agranulocytes with the at least one test substance. The method of the present invention further comprises the step of simultaneously quantitatively measuring a plurality of cytokines and/or cytotoxic molecules. According to the method, the cultivation is carried out with starting cell densities between 1×10 6 cells per ml and 4×10 6 cells per ml, in particular with starting cell densities between 1.5×10 6 cells per ml and 3×10 6 cells per ml cells per ml. In a particularly preferred embodiment, the cultivation is carried out in a 96-well plate with wells of 0.2 ml each and initial cell densities between 3×10 5 cells and 8×10 5 cells per well. In an even more preferred embodiment, the cultivation is carried out with starting cell densities of about 2×10 6 cells per ml.
[0013] Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass durch die Analyse einer spezifischen Kombination von Zytokinen und zytotoxischen Molekülen ein breites Spektrum von T-Zell-vermittelten Immunantworten, die durch Überempfindlichkeit verursacht werden, zuverlässig nachgewiesen werden kann. [0013] Surprisingly, it was found that by analyzing a specific combination of cytokines and cytotoxic molecules, a broad spectrum of T cell-mediated immune responses caused by hypersensitivity can be reliably detected.
[0014] Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren in vitro durchgeführt, wenn die relevanten Reaktionen außerhalb des biologischen Kontexts durchgeführt werden. In der praktischen Anwendung kann eine Blutprobe, vorzugsweise eine Vollblutprobe, beispielsweise durch Entnahme von peripherem Blut durch Punktion eines Blutgefäßes bereitgestellt werden. Alternativ oder zusätzlich, wie dem Fachmann ohne weiteres klar sein dürfte, kann die Blutprobe durch Radialarterienpunktion, Kapillarblutentnahme durch Lanzette, Venenpunktion usw. bereitgestellt werden. In the context of the present invention, the method is carried out in vitro when the relevant reactions are carried out outside the biological context. In practice, a blood sample, preferably a whole blood sample, can be provided, for example, by taking peripheral blood by puncturing a blood vessel. Alternatively or additionally, as will be readily appreciated by those skilled in the art, the blood sample may be provided by radial artery puncture, capillary lancet blood collection, venipuncture, and so on.
[0015] In einer besonderen Ausführungsform ist die Testsubstanz ein Arzneimittel oder ein Arzneimittelkandidat. Weiter oben ist beispielhaft eine Auswahl möglicher Arzneimittel aufgeführt, die schädliche Wirkungen haben können und gegenüber denen eine Überempfindlichkeit bestehen kann. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf die Auswahl dieser genannten Arzneimittel beschränkt. In a particular embodiment, the test substance is a drug or a drug candidate. A selection of possible drugs that can have harmful effects and to which there may be hypersensitivity is listed above as an example. However, the method of the present invention is not limited to the selection of these drugs.
[0016] Agranulozyten sollen im Rahmen der vorliegenden Erfindung synonym zu Nicht-Granulozyten oder mononukleären Leukozyten verwendet werden und gehören zu den weißen Blutkörperchen. Sie werden durch Fehlen oder weniger massenhaftes Vorhandensein von Granula im Zytoplasma definiert. Das Isolieren kann zum Beispiel durch eine Flussgradienten-Dichteabstufung oder zum Beispiel eine Differentialzentrifugation durchgeführt werden, wie dies dem Fachmann bekannt ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform führt das Isolieren zu peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC). In the context of the present invention, agranulocytes are to be used synonymously with non-granulocytes or mononuclear leukocytes and belong to the white blood cells. They are defined by the absence or less abundant presence of granules in the cytoplasm. Isolation can be performed, for example, by flow gradient density grading or, for example, differential centrifugation, as known to those skilled in the art. In a particularly preferred embodiment, the isolation results in peripheral blood mononuclear cells (PBMC).
[0017] Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet gleichzeitige quantitative Messung eine Messung, die in einem Schritt durchgeführt wird und deren Testergebnis auf eine Menge der getesteten Substanzen im Probanden schließen lässt. Dies kann beispielsweise mit Bead-basierten Multiplex-Immunarrays erreicht werden. In the context of the present invention, simultaneous quantitative measurement means a measurement that is carried out in one step and the test result of which indicates a quantity of the tested substances in the subject. This can be achieved, for example, with bead-based multiplex immunoarrays.
[0018] In einer besonderen Ausführungsform ist die Blutprobe eine Vollblutprobe. In a particular embodiment, the blood sample is a whole blood sample.
[0019] In einer alternativen oder zusätzlichen Ausführungsform kann die Blutprobe als Blutplasmaprobe bereitgestellt werden. Ein Vorteil der Verwendung von Plasma ist seine Langlebigkeit und dass es in gefrorener Form gelagert werden kann. In an alternative or additional embodiment, the blood sample can be provided as a blood plasma sample. An advantage of using plasma is its longevity and that it can be stored in frozen form.
[0020] Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass bei den gewählten Ausgangszelldichten nach Inkubation eine optimale Repräsentation von Zytokinen und/oder zytotoxischen Molekülen in den Medien vorhanden ist, um Testergebnisse mit hoher Spezifität und Sensitivität für ein breites Spektrum an Testsubstanzen, insbesondere Arzneimitteln, zu liefern. It was surprisingly found that at the chosen starting cell densities after incubation, an optimal representation of cytokines and/or cytotoxic molecules is present in the media in order to provide test results with high specificity and sensitivity for a wide range of test substances, in particular drugs .
[0021] In einer bestimmten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Blutprobe ein Antikoagulans zugesetzt. Es ist besonders vorteilhaft für ein Antikoagulans, wenn Vollblut verwendet wird. Geeignete Antikoagulantien können Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Heparin, Natriumcitrat, Kaliumoxalat, Natriumfluorid und/oder Natriumiodacetat sein. In a particular embodiment of the present invention, an anticoagulant is added to the blood sample. It is particularly advantageous for an anticoagulant when whole blood is used. Suitable anticoagulants can be ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), heparin, sodium citrate, potassium oxalate, sodium fluoride and/or sodium iodoacetate.
[0022] Die für das vorliegende Verfahren erforderlichen weißen Blutkörperchen sind im Vollblut oder im Blutplasma vorhanden. Der Vorteil der Verwendung eines Antikoagulans besteht darin, dass die Blutzellstruktur besser erhalten bleibt. Vorteilhafterweise wird ein Antikoagulans gewählt, das T-Zellen nicht nachteilig beeinflusst. The white blood cells required for the present method are present in whole blood or in blood plasma. The benefit of using an anticoagulant is that blood cell structure is better preserved. Advantageously, an anticoagulant is chosen that does not adversely affect T cells.
[0023] In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Vielzahl von zytotoxischen Molekülen eine Vielzahl, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Granzym B, Granulysin und Perforin. Besonders bevorzugt ist die Vielzahl von zytotoxischen Molekülen Granzym B und Granulysin. Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass die gleichzeitige quantitative Messung der Menge dieser beiden zytotoxischen Moleküle in Kombination mit einer Vielzahl von Zytokinen verwendet werden kann, um die zytotoxische Funktion von in vivo sensibilisierten Antigenspezifischen T-Zellen nachzuweisen. Indem sie in ein Verfahren zur In-vitro-Bestimmung von Erkrankungen und Krankheiten integriert werden, kann ein breiteres Spektrum potenzieller ursächlicher Arzneimittel zuverlässig identifiziert werden. Der zytotoxizitätsbasierte Aspekt hebt die Abhängigkeit des vorliegenden Tests von der T-Zell-Proliferation weiter auf und kann mittels Immunassays bereits 24, insbesondere 48 bis 72 Stunden nach der Stimulation bzw. Exposition gegenüber der Testsubstanz nachgewiesen werden. In a particular embodiment of the present invention, the plurality of cytotoxic molecules is a plurality selected from the group consisting of: granzyme B, granulysin and perforin. Particularly preferred are the plurality of cytotoxic molecules granzyme B and granulysin. It was surprisingly found that the simultaneous quantitative measurement of the amount of these two cytotoxic molecules in combination with a variety of cytokines can be used to demonstrate the cytotoxic function of in vivo sensitized antigen-specific T cells. By incorporating them into a method for in vitro determination of diseases and diseases, a wider range of potential causative drugs can be reliably identified. The cytotoxicity-based aspect further eliminates the dependency of the present test on T-cell proliferation and can be detected by means of immunoassays as early as 24, in particular 48 to 72 hours after stimulation or exposure to the test substance.
[0024] Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass im Vergleich zum LTT das vorliegende Verfahren zur In-vitro-Bestimmung von Erkrankungen und Krankheiten, die durch eine Testsubstanz induziert werden, die Notwendigkeit von Radioaktivität beseitigt, indem es in den Endstadien der Inkubation und zum Nachweis der Aufnahme mit Szintillationsflüssigkeit kein<3>H-Thymidin mehr benötigt („The lymphocyte transformation test in the diagnostic of drug hypersensitivity“ [Der Lymphozytentransformationstest in der Diagnostik der Arzneimittelüberempfindlichkeit], Pichler, WJ, Allergy 2004: 59: 809-820). A particular advantage of the method is that compared to the LTT, the present method for the in vitro determination of diseases and diseases induced by a test substance eliminates the need for radioactivity by in the final stages of Incubation and proof of uptake with scintillation fluid no longer required <3>H-thymidine ("The lymphocyte transformation test in the diagnostic of drug hypersensitivity" [The lymphocyte transformation test in the diagnosis of drug hypersensitivity], Pichler, WJ, Allergy 2004: 59: 809 -820).
[0025] In einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Vielzahl von Zytokinen eine Vielzahl, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: IL1-b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, IL-22, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, CCL4, CCL2 und TNF-α. Zytokine oder kleine Proteine, die bei der Zellsignalisierung und als immunmodulierende Mittel verwendet werden. Als Antigen-spezifische Stimulation können T-Zellen eine Vielzahl von Zytokinen sezernieren, die verschiedene Effektormechanismen einer Immunantwort koordinieren. Für die In-vitro-Diagnose von Arzneimittelüberempfindlichkeit wurde festgestellt, dass insbesondere die lange Persistenz von Gedächtnis-T-Zellen spezifische Effektorfunktionen bei Exposition gegenüber einem bestimmten Arzneimittel bereitstellt, das eine Überempfindlichkeitsreaktion verursacht. Es wurde festgestellt, dass eine spezifische Auswahl von Zytokinen besonders nützlich ist, um zuverlässige Messungen aus einem breiten Bereich potenzieller Arzneimittel bei der Verwendung von Überempfindlichkeitsreaktionen bereitzustellen. In another particular embodiment of the present invention, the plurality of cytokines is a plurality selected from the group consisting of: IL1-b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, IL-22, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, CCL4, CCL2 and TNF-α. Cytokines or small proteins used in cell signaling and as immunomodulating agents. As antigen-specific stimulation, T cells can secrete a variety of cytokines that coordinate different effector mechanisms of an immune response. For the in vitro diagnosis of drug hypersensitivity, it has been found that, in particular, the long persistence of memory T cells provides specific effector functions upon exposure to a particular drug causing a hypersensitivity reaction. A specific selection of cytokines has been found to be particularly useful in providing reliable measurements from a wide range of potential drugs when using hypersensitivity reactions.
[0026] In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Vielzahl von Zytokinen eine Gruppe bestehend aus: Interleukin-5 (IL-5), Interleukin 13 (IL-13) und Interferon-y (IFN-γ). Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass die Kombination dieser Zytokine in einem Überstand einer wie oben beschriebenen Kultivierung unabhängig von der Art des Arzneimittelantigens und dem Phänotyp der Arzneimittelreaktion ist, wodurch zuverlässige Ergebnisse für eine breite Palette von Arzneimitteln bereitgestellt werden. Darüber hinaus haben sich diese Zytokine für ein breites Spektrum von Patienten als besonders zuverlässig erwiesen, während andere Zytokine sehr unterschiedliche Reaktionen bei Individuen zeigten. In a particular embodiment of the present invention, the plurality of cytokines is a group consisting of: interleukin-5 (IL-5), interleukin 13 (IL-13), and interferon-γ (IFN-γ). It has surprisingly been found that the combination of these cytokines in a supernatant of a culture as described above is independent of the type of drug antigen and the phenotype of the drug response, thereby providing reliable results for a wide range of drugs. In addition, these cytokines have proven to be particularly reliable for a wide range of patients, while other cytokines have shown very different responses in individuals.
[0027] In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Vielzahl von Zytokinen eine Gruppe von: IL-2, IL-5, IL-13 und IFN-γ. In an alternative embodiment of the present invention, the plurality of cytokines is a group of: IL-2, IL-5, IL-13 and IFN-γ.
[0028] In einer weiteren alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Vielzahl von Zytokinen IL-5 und IFN-γ. In another alternative embodiment of the present invention, the plurality of cytokines are IL-5 and IFN-γ.
[0029] In einer weiteren alternativen Ausführungsform ist die Vielzahl von Zytokinen IL-5 und IL-13. In another alternative embodiment, the plurality of cytokines are IL-5 and IL-13.
[0030] In einer weiteren alternativen Ausführungsform ist die Vielzahl von Zytokinen IL-5 und IL-2. In another alternative embodiment, the plurality of cytokines are IL-5 and IL-2.
[0031] Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass durch Kombination dieser Zytokine mit der obigen Auswahl an zytotoxischen Molekülen bei der gleichzeitigen quantitativen Messung Rückschlüsse auf den Grad und die Schwere der beobachteten Reaktion gezogen werden können. Beispielsweise können Informationen abgeleitet werden, indem relative Werte zwischen den gemessenen Zytokinen und/oder den gemessenen zytotoxischen Molekülen überprüft werden. So wurde beispielsweise festgestellt, dass ein eher harmloses Exanthem aufgrund von Amoxicillin durch erhöhte IFN-γ-Werte angezeigt wird, wobei Patienten mit DRESS typischerweise erhöhte Werte bei IL-5 aufweisen. A further advantage of the method according to the invention is that by combining these cytokines with the above selection of cytotoxic molecules with the simultaneous quantitative measurement, conclusions can be drawn about the degree and severity of the reaction observed. For example, information can be derived by examining relative values between the measured cytokines and/or the measured cytotoxic molecules. For example, it has been found that a rather benign rash due to amoxicillin is indicated by elevated IFN-γ levels, whereas patients with DRESS typically have elevated IL-5 levels.
[0032] In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Konzentration von IL-5, IL-13, IFN-γ, Granzym B und Granulysin in Zellkulturüberständen mittels Bead-Assay-Durchflusszytometrie gemessen. In a particularly preferred embodiment, the concentration of IL-5, IL-13, IFN-γ, granzyme B and granulysin in cell culture supernatants is measured using bead assay flow cytometry.
[0033] Es wurde festgestellt, dass Patienten mit Steven-Johnsons-Syndrom erhöhte Granzym-B- und Granulysin-Werte und schließlich leicht erhöhte IFN-γ-Werte aufweisen. [0033] Patients with Steven-Johnsons syndrome have been found to have elevated levels of granzyme B and granulysin, and finally slightly elevated levels of IFN-γ.
[0034] In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Kultivierung mit Ausgangszelldichten von im Wesentlichen 4 × 10<5>Zellen pro Well bzw. 2 × 10<6>Zellen pro ml durchgeführt. In a particular embodiment of the present invention, the cultivation is carried out with initial cell densities of essentially 4×10 5 cells per well or 2×10 6 cells per ml.
[0035] Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass der gewählte Wert der Ausgangszelldichten besonders günstig für ein zuverlässiges Verfahren zur In-vitro-Bestimmung von durch eine Testsubstanz induzierten Erkrankungen und Krankheiten ist. Durch die Begrenzung der Anzahl der für die Durchführung eines Tests erforderlichen Zellen werden die ansonsten für den Test erforderlichen großen Volumina reduziert, während gleichzeitig eine optimale Menge an Zellen bereitgestellt wird, um ein zuverlässiges Ergebnis mit hoher Sensitivität und Spezifität zu erhalten. Es hat sich herausgestellt, dass sich 4 × 10<5>Zellen pro ml als optimaler Bereich erweisen, wobei im Wesentlichen vorzugsweise 4 × 10<5>mit Schwankungen bis zu ± 15 %, insbesondere bis zu ± 10 % zu verstehen sind. Mit diesem Bereich benötigt das Verfahren weniger Ressourcen, d. h. Blut oder Plasma, und weist dennoch eine ausreichend hohe Zellzahl auf, um das Vorhandensein von erforderlichen Gedächtnis-T-Zellen für die Bestimmung einer Überempfindlichkeit gegenüber einer bestimmten Testsubstanz, beispielsweise einem Arzneimittel, statistisch sicherzustellen. It was surprisingly found that the chosen value of the initial cell densities is particularly favorable for a reliable method for the in vitro determination of diseases and illnesses induced by a test substance. By limiting the number of cells required to perform a test, the large volumes otherwise required for the test are reduced, while at the same time providing an optimal amount of cells to obtain a reliable result with high sensitivity and specificity. It has been found that 4×10 5 cells per ml prove to be the optimum range, which is essentially to be understood as preferably 4×10 5 with fluctuations of up to ±15%, in particular up to ±10%. With this range, the method requires fewer resources, i. H. blood or plasma, and yet has a sufficiently high cell count to statistically ensure the presence of the necessary memory T cells for the determination of hypersensitivity to a particular test substance, e.g. a drug.
[0036] In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Isolieren von Agranulozyten aus der Blutprobe ein Isolieren von mononukleären Zellen aus der Blutprobe. In a particular embodiment of the present invention, isolating agranulocytes from the blood sample is isolating mononuclear cells from the blood sample.
[0037] In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Kultivieren eine Inkubationszeit zwischen 24 Stunden und 240 Stunden, insbesondere zwischen 72 Stunden und 168 Stunden. In a particular embodiment of the present invention, the cultivation includes an incubation time of between 24 hours and 240 hours, in particular between 72 hours and 168 hours.
[0038] In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die gleichzeitige quantitative Messung einer Vielzahl von Zytokinen und/oder zytotoxischen Molekülen ein kombinierter Assay auf Zytokine und zytotoxische Moleküle und umfasst einen enzymgekoppelten Immunadsorptionsassay und/oder einen zytometrischen Bead-Assay. In a particular embodiment of the present invention, the simultaneous quantitative measurement of a plurality of cytokines and/or cytotoxic molecules is a combined assay for cytokines and cytotoxic molecules and comprises an enzyme-linked immunosorbent assay and/or a cytometric bead assay.
[0039] In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die durch eine Testsubstanz induzierte Erkrankung bzw. Krankheit eine beliebige, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: T-Zell-vermittelten Formen der Arzneimittelüberempfindlichkeit, wie Stevens-Johnsons-Syndrom (SJS), toxischer epidermaler Nekrolyse (TEN), MPE, pustulösem Exanthem und bullösem Exanthem, Arzneimittelexanthem mit Eosinophilie und systemischen Symptomen (DRESS), ferner kann die durch die Testsubstanz induzierte Erkrankung bzw. Krankheit eine beliebige, aus der Gruppe bestehend aus Vaskulitis, arzneimittelinduzierter Pankreatitis, interstitiellen und eosinophilen Lungenerkrankungen, arzneimittelinduzierten Autoimmunerkrankungen und IgE-vermittelten Sofortreaktionen einschließlich schwerer Anaphylaxie sein. In a particular embodiment of the present invention, the disease or disease induced by a test substance is any selected from the group consisting of: T-cell mediated forms of drug hypersensitivity such as Stevens-Johnsons Syndrome (SJS), toxic epidermal necrolysis (TEN), MPE, pustular rash and bullous rash, drug rash with eosinophilia and systemic symptoms (DRESS), and the test substance-induced disease or disease can be any of the group consisting of vasculitis, drug-induced pancreatitis, interstitial and eosinophilic lung disease, drug-induced autoimmune diseases and IgE-mediated immediate reactions including severe anaphylaxis.
[0040] In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Testsubstanz eine von Sulfamethoxazol (SMX), Sulfapyridin (SPD), Ampicillin (AMP) oder Amoxicillin (AMX). In a particular embodiment of the present invention, the test substance is one of sulfamethoxazole (SMX), sulfapyridine (SPD), ampicillin (AMP) or amoxicillin (AMX).
[0041] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung isolierter Agranulozyten aus einer Blutprobenzelle in Dichten zwischen 3 × 10<5>Zellen pro Weil und 8 × 10<5>Zellen pro Well, insbesondere in Dichten zwischen 3 × 10<5>Zellen pro Weil und 6 × 10<5>Zellen pro Well zur Kultivierung mit einer Testsubstanz und anschließender gleichzeitiger quantitativer Messung einer Vielzahl von Zytokinen und/oder zytotoxischen Molekülen zur Bestimmung von durch die Testsubstanz induzierten Erkrankungen und Krankheiten. Alle gehen von 96-Well-Standardplatten mit 0,2 ml Volumen pro Well aus. A further aspect of the present invention is the use of isolated agranulocytes from a blood sample cell in densities between 3×10 5 cells per well and 8×10 5 cells per well, in particular in densities between 3×10 5 cells per well and 6×10 5 cells per well for culturing with a test substance and subsequent simultaneous quantitative measurement of a large number of cytokines and/or cytotoxic molecules for determining diseases and diseases induced by the test substance. All assume standard 96-well plates with 0.2 ml volume per well.
[0042] In einer besonderen Ausführungsform der Verwendung der vorliegenden Erfindung beträgt die Zelldichte im Wesentlichen 4 × 10<5>Zellen pro Well bzw. pro 0,2 ml. In a particular embodiment of the use of the present invention, the cell density is essentially 4×10 5 cells per well or per 0.2 ml.
[0043] In einerweiteren besonderen Ausführungsform der Verwendung isolierter Agranulozyten sind die zytotoxischen Moleküle Granzym B und Granulysin und sind die Zytokine IL-5, IL-13 und IFN-γ. In another particular embodiment of using isolated agranulocytes, the cytotoxic molecules are granzyme B and granulysin and the cytokines are IL-5, IL-13 and IFN-γ.
[0044] Dem Fachmann wird leicht klar, dass eine Implementierung der vorliegenden Erfindung jede Kombination von oben beschriebenen Merkmalen verkörpern kann, solange sie sich nicht gegenseitig ausschließen. It will be readily apparent to those skilled in the art that an implementation of the present invention may embody any combination of the features described above, as long as they are not mutually exclusive.
[0045] Im Folgenden soll die Erfindung anhand konkreter Ausführungsbeispiele näher erläutert werden, ohne auf diese beschränkt zu sein. Der Fachmann kann beim Betrachten dieser Beispiele weitere vorteilhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ableiten. The invention is to be explained in more detail below using specific exemplary embodiments, without being restricted to these. The person skilled in the art can derive further advantageous embodiments of the present invention from considering these examples.
Figurencharacters
[0046] Fig. 1a bis Fig. 1c zeigen die Untersuchung verschiedener Patientenchargen, bei denen der Verdacht auf eine der Krankheiten MPE, DRESS oder SJS besteht.Figures 1a to 1c show the examination of different batches of patients suspected of having one of the diseases MPE, DRESS or SJS.
Detaillierte BeschreibungDetailed description
Geeignete Verfahren und MaterialienAppropriate methods and materials
[0047] Eine Gerinnungshemmungist mit Heparin erreichbar, z. B. Liquemin (Roche) 5000 E, 0,1 ml/10 ml Blut. Alternativ oder zusätzlich sind auch andere Antikoagulanzien wie EDTA geeignet. Anticoagulation is achievable with heparin, e.g. B. Liquemin (Roche) 5000 U, 0.1 ml/10 ml blood. Alternatively or additionally, other anticoagulants such as EDTA are also suitable.
[0048] Die Isolierungvon Agranulozyten kann durch Verwendung eines Dichtegradientenmediums (z. B. Ficoll™ oder Lymphoprep™) und Zentrifugation durchgeführt werden. Vollblut wird zuerst mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt und dann über das Dichtegradientenmedium geschichtet. Während der Zentrifugation sedimentieren die Zellen mit höherer Dichte (d. h. Granulozyten und Erythrozyten) durch das Dichtegradientenmedium. Die PBMCs setzen sich an der Grenzfläche zwischen dem Dichtegradientenmedium und dem Plasma ab, von dem sie sorgfältig entnommen werden können. Die Zentrifugationsgeschwindigkeit kann auf 400 × g bis 1200 × g eingestellt werden, wie dies dem Fachmann bekannt ist. The isolation of agranulocytes can be performed using a density gradient medium (e.g. Ficoll™ or Lymphoprep™) and centrifugation. Whole blood is first diluted with phosphate buffered saline (PBS) and then layered over the density gradient medium. During centrifugation, the higher density cells (i.e., granulocytes and erythrocytes) sediment through the density gradient medium. The PBMCs settle at the interface between the density gradient medium and the plasma, from which they can be carefully sampled. The centrifugation speed can be adjusted from 400 xg to 1200 xg as known to those skilled in the art.
[0049] ZurKultivierungwurden die Zellen in RPMI-1640 (GIBCO™; Invitrogen) kultiviert, das mit 10 % hitzeinaktiviertem Human-AB-Serum (Schweizerisches Rotes Kreuz, Bern) oder Plasma, 2 mM I-Glutamin (Biochrom) und 25 µg/ml Transferrin (Biotest) ergänzt war. For cultivation, the cells were cultured in RPMI-1640 (GIBCO™; Invitrogen) supplemented with 10% heat-inactivated human AB serum (Swiss Red Cross, Bern) or plasma, 2 mM I-glutamine (Biochrom) and 25 µg/ ml of transferrin (Biotest) was supplemented.
[0050] Testsubstanzenkönnen in verschiedenen Konzentrationen zugegeben werden, praktikabel sind Konzentrationen zwischen 0,1 und 1000 µg des Arzneimittels, insbesondere zwischen 1 und 500 µg des Arzneimittels, wie dies dem Fachmann bekannt ist. Bei lipophilen Arzneimitteln kann Dimethylsulfoxid (DMSO) zugesetzt werden. Die Kultur kann zwischen 1 und 7 d eingestellt werden, geeignet sind 5 d in einem Inkubator bei 37 °C. Zur Kultivierung werden Mikrotiterplatten mit flachem Boden verwendet. Die Dichten liegen in den Bereichen zwischen 3 × 10<5>Zellen pro 0,2 ml und 8 × 10<5>Zellen pro 0,2 ml, insbesondere zwischen 3 × 10<5>Zellen pro 0,2 ml und 6 × 10<5>Zellen pro 0,2 ml. Besonders geeignet sind Zelldichten im Bereich von im Wesentlichen 4 × 10<5>pro 0,2 ml. Test substances can be added in various concentrations; concentrations between 0.1 and 1000 μg of the drug, in particular between 1 and 500 μg of the drug, are practicable, as is known to the person skilled in the art. In the case of lipophilic drugs, dimethyl sulfoxide (DMSO) can be added. The culture can be set for between 1 and 7 days, 5 days in an incubator at 37 °C is suitable. Flat-bottomed microtiter plates are used for cultivation. The densities are in the ranges between 3×10 5 cells per 0.2 ml and 8×10 5 cells per 0.2 ml, in particular between 3×10 5 cells per 0.2 ml and 6× 10 5 cells per 0.2 ml. Cell densities in the range of essentially 4×10 5 per 0.2 ml are particularly suitable.
Beispiel 1example 1
[0051] Die folgenden nicht toxischen Arzneimittelkonzentrationen wurden verwendet: AMX - 125, 250, 500 µg/ml; AMP- 200, 500 µg/ml; SMX - 100-200 g/ml und SPD - 100, 200 µg/ml (alle von Sigma). Lipopolysaccharid (LPS)-freie Arzneimittel stammten aus sterilen Behältern. The following non-toxic drug concentrations were used: AMX - 125, 250, 500 µg/ml; AMP-200, 500 µg/ml; SMX - 100-200 g/ml and SPD - 100, 200 µg/ml (all from Sigma). Lipopolysaccharide (LPS)-free drugs came from sterile containers.
[0052] Zytokine/Chemokine wurden in den Überständen unter Verwendung von im Handel erhältlichen Immunassays, zum Beispiel Bead-basierten Immunassay-Kits (Bio-Rad Laboratories), gemessen. Cytokines/chemokines were measured in the supernatants using commercially available immunoassays, for example bead-based immunoassay kits (Bio-Rad Laboratories).
[0053] PBMCs wurden durch Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation isoliert und in RPMI 1640 (Life Technologies, Basel, Schweiz), ergänzt mit 10 % AB-Serum (Octapharma AG, Lachen, Schweiz), 2 mM GlutaMAX (Biochrom, Berlin, Deutschland), kultiviert. 4 × 10<5>Zellen pro Well PBMCs werden dreifach in 96-Well-Gewebekulturplatten mit U-Boden für 7 Tage (37 °C, 5 % CO2) kultiviert. Für negative Kontrollkulturen wird kein spezifischer Stimulus hinzugefügt. Für die Positivkontrollen werden Pokeweed Mitogen (1 µg/ml) und Tetanus Toxoid (1 µg/ml) unabhängig voneinander zu den Zellkulturen gegeben. PBMCs were isolated by Ficoll density gradient centrifugation and cultured in RPMI 1640 (Life Technologies, Basel, Switzerland) supplemented with 10% AB serum (Octapharma AG, Lachen, Switzerland), 2mM GlutaMAX (Biochrom, Berlin, Germany), cultivated. 4 × 10 5 cells per well PBMCs are cultured in triplicate in 96-well U-bottom tissue culture plates for 7 days (37 °C, 5% CO2). No specific stimulus is added for negative control cultures. For the positive controls, pokeweed mitogen (1 µg/ml) and tetanus toxoid (1 µg/ml) are added independently to the cell cultures.
[0054] Zur Arzneimittelstimulation wurden PBMCs entweder mit Amoxicillin (500, 250 und 125 µg/ml) oder Clavulansäure (10, 1, 0,1 µg/ml) oder Phenytoin (100, 50, 10 µg/ml) ergänzt. Nach 7 Tagen wurden Zellkulturüberstände gesammelt und eingefroren (-20 °C) oder sofort für Zytokinmessungen verarbeitet. For drug stimulation, PBMCs were supplemented with either amoxicillin (500, 250, and 125 µg/mL) or clavulanic acid (10, 1, 0.1 µg/mL) or phenytoin (100, 50, 10 µg/mL). After 7 days, cell culture supernatants were collected and frozen (-20°C) or processed immediately for cytokine measurements.
[0055] Die Zytokinkonzentrationen werden mit Hilfe eines individuell angepassten Zytokin-Bead-Assays (Legendplex®, BioLegend, San Diego, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Die IL5-, IL13-, IFNγ-, GzB- und GL-Konzentrationen in den Überständen werden von der LegendPlex-Software berechnet. Für jede durch Arzneimittel hervorgerufene Krankheit wird ein Stimulationsindex als Verhältnis zwischen der in Gegenwart des Arzneimittels bei einer gegebenen Konzentration festgestellten Zytokinkonzentration, dividiert durch die in der Negativkontrolle festgestellte Zytokinkonzentration, berechnet. Ein Arzneimittel gilt als positiv, wenn der SI in mindestens 2 getesteten Konzentrationen 2,0 überschreitet. [0055] Cytokine levels are determined using a customized cytokine bead assay (Legendplex®, BioLegend, San Diego, USA) according to the manufacturer's instructions. The IL5, IL13, IFNγ, GzB and GL concentrations in the supernatants are calculated by the LegendPlex software. For each drug-induced disease, a stimulation index is calculated as the ratio of the cytokine concentration found in the presence of the drug at a given concentration divided by the cytokine concentration found in the negative control. A drug is considered positive if the SI exceeds 2.0 in at least 2 concentrations tested.
[0056] Wie für Fig. 1a bis c wurden CytoLTT-Werte ausgewählt, die auf Anfrage eines verschreibenden Arztes getestet wurden. Der Arzt hatte eine Anamnese und/oder eine verschreibungsbasierte diagnostische Annahme zu einer Krankheit, für die das Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde, um die Diagnose zu bestätigen. Die Daten wurden nach der Erkrankung der Patienten gegliedert. As for Figures 1a-c, CytoLTT values tested at the request of a prescribing physician were selected. The physician had a medical history and/or prescription-based diagnostic assumption of a disease for which the method of the present invention was performed to confirm the diagnosis. The data were classified according to the patient's disease.
[0057] Fig. 1a bis c zeigen die Intensität der durch den SI-Wert charakterisierten Antwort, die für DRESS, für MPE und für SJS getestet wird. Jeder Patient hat ein einzigartiges Reaktionsprofil für die getesteten IL-5, IL-13, IFN-γ, GzB und GL, das auf die Krankheit hinweist. Figures 1a-c show the intensity of the response characterized by the SI value tested for DRESS, for MPE and for SJS. Each patient has a unique response profile for the IL-5, IL-13, IFN-γ, GzB and GL tested that is indicative of the disease.
[0058] Im vorliegenden Beispiel ist die Antwort niemals durch die Sekretion eines einzelnen Zytokins für eine gegebene Erkrankung gekennzeichnet. Das Zytokinprofil ermöglicht erkennbare Unterschiede zwischen den drei Erkrankungen. In the present example, the response is never characterized by the secretion of a single cytokine for a given disease. The cytokine profile allows discernible differences between the three diseases.
[0059] Wie in Fig. 1a ist das dominante Zytokin, das bei MPE festgestellt wird, IFN-γ, wobei die Patienten einen klaren SI-Peak für IFN-γ zeigen, wobei einige SI-Werte fast 100 erreichen, obwohl auch eine Reaktion für die anderen Faktoren klar erkennbar ist. As in Figure 1a, the dominant cytokine found in MPE is IFN-γ, with patients showing a clear SI peak for IFN-γ, with some SI values approaching 100, although also a response for the other factors is clearly recognizable.
[0060] Wie in Fig. 1b ist der kennzeichnende Faktor von DRESS IL-5. Mit sichtbarer Reaktion auf die anderen Faktoren. As in Figure 1b, the hallmark factor of DRESS is IL-5. With visible reaction to the other factors.
[0061] Bei der vergleichsweise selteneren Erkrankung SJS ist das dominant sezernierte Zytokin das zytotoxische Granzym B (GzB), wie in Fig. 1c zu sehen ist. In the comparatively rarer disease SJS, the dominantly secreted cytokine is the cytotoxic granzyme B (GzB), as can be seen in FIG. 1c.
[0062] Mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein auf einem Zytokin-LymphozytenTransformationstest (Zyto-LTT) basierendes Testverfahren bereitgestellt, das für die Bewertung einer Arzneimittelüberempfindlichkeit vom verzögerten Typ geeignet ist. Es eignet sich sowohl zur Bestätigung einer vermuteten Arzneimittelüberempfindlichkeit als auch zur Erkennung des ursächlichen Arzneimittels. The method of the present invention provides a cytokine-lymphocyte transformation assay (cyto-LTT) based assay suitable for evaluating delayed-type drug hypersensitivity. It is suitable both for confirming a suspected drug hypersensitivity and for identifying the causative drug.
Claims (11)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH00424/21A CH718556A1 (en) | 2021-04-21 | 2021-04-21 | In Vitro Drug Allergy Test Procedure |
Applications Claiming Priority (1)
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| CH00424/21A CH718556A1 (en) | 2021-04-21 | 2021-04-21 | In Vitro Drug Allergy Test Procedure |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CH718556A1 true CH718556A1 (en) | 2022-10-31 |
Family
ID=77774634
Family Applications (1)
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| CH00424/21A CH718556A1 (en) | 2021-04-21 | 2021-04-21 | In Vitro Drug Allergy Test Procedure |
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-
2021
- 2021-04-21 CH CH00424/21A patent/CH718556A1/en not_active Application Discontinuation
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