CH713708B1

CH713708B1 - Device and method of production and purification of exosomes.

Info

Publication number: CH713708B1
Application number: CH00424/17A
Authority: CH
Inventors: Andriolo Gabriella; Provasi Elena; Brambilla Andrea; Giovanna Lo Cicero Viviana; Soncin Sabrina; Barile Lucio; Vassalli Giuseppe; Turchetto Lucia; Radrizzani Marina
Original assignee: Lugano Tech Transfer Ltt Sa
Priority date: 2017-03-30
Filing date: 2017-03-30
Publication date: 2020-10-15
Also published as: CH713708A2

Abstract

L'invenzione rivela un dispositivo e un metodo di produzione e purificazione di esosomi da cellule progenitrici caratterizzato dal fatto di comprendere un circuito chiuso e sterile presentante mezzi di pompaggio ed una pluralità di stazioni di processo collegate serialmente.The invention discloses a device and a method for the production and purification of exosomes from progenitor cells characterized in that it comprises a closed and sterile circuit having pumping means and a plurality of serially connected process stations.

Description

[0001] La presente invenzione si riferisce ad un dispositivo e ad un metodo per la produzione e purificazione di esosomi da cellule progenitrici. Gli esosomi sono vescicole extracellulari con diametro 30-150 nm, coinvolte nei processi di comunicazione intercellulare. Sono di origine endosomiale e vengono secreti da molti tipi cellulari; esprimono marcatori caratteristici, quali CD9, CD63, CD81, Alix e TSG-101, oltre a marcatori tipici delle cellule da cui originano, che ne determinano anche il contenuto in termini di microRNA (Cervio E et al 2015, Stem Cells International; Barile L et al 2016, Eur Heart J). [0001] The present invention relates to a device and a method for the production and purification of exosomes from progenitor cells. Exosomes are extracellular vesicles with a diameter of 30-150 nm, involved in the processes of intercellular communication. They are of endosomal origin and are secreted by many cell types; express characteristic markers, such as CD9, CD63, CD81, Alix and TSG-101, as well as typical markers of the cells from which they originate, which also determine their content in terms of microRNA (Cervio E et al 2015, Stem Cells International; Barile L et al 2016, Eur Heart J).

[0002] Gli esosomi sono attualmente oggetto di svariati studi volti a chiarirne il ruolo, i meccanismi d'azione e le potenziali applicazioni diagnostiche e terapeutiche (Lener et al 2015, J Extracell Vesicle, Barile et al. 2017 Pharmacol Ther.). [0002] Exosomes are currently the subject of various studies aimed at clarifying their role, mechanisms of action and potential diagnostic and therapeutic applications (Lener et al 2015, J Extracell Vesicle, Barile et al. 2017 Pharmacol Ther.).

[0003] Nei laboratori del Cardiocentro Ticino/Istituto Svizzero di Medicina Rigenerativa (CCT/SIRM) in collaborazione con l'istituto di Patologia Victor Babes di Bucarest, Romania sono state prodotte le prime evidenze scientifiche, mediante microscopia elettronica, che le cellule progenitrici cardiache (CPC) umane rilasciano vescicole extracellulari con caratteristiche tipiche degli esosomi (Barile et al. 2012 J Biomed Biotechnol). Presso il Cardiocentro Ticino è stato inoltre dimostrato che tali vescicole inibiscono l'apoptosi di cardiomiociti e promuovono l'angiogenesi, rivestendo un ruolo fondamentale nell'effetto paracrino delle CPC. Anche in vivo, in un modello preclinico di infarto miocardico acuto nel ratto, gli esosomi derivati da CPC riducono il danno tissutale, inibiscono l'apoptosi di cardiomiociti e promuovono l'angiogenesi, migliorando la funzionalità cardiaca post-infarto. Mediatori chiave di questi effetti si ritiene possano essere alcuni specifici microRNA quali miR-132 e miR-210 (Barile L et al 2014, Cardiovasc Res). [0003] In the laboratories of the Cardiocentro Ticino / Swiss Institute of Regenerative Medicine (CCT / SIRM) in collaboration with the Victor Babes Institute of Pathology in Bucharest, Romania, the first scientific evidence was produced by electron microscopy that cardiac progenitor cells (CPC) humans release extracellular vesicles with characteristics typical of exosomes (Barile et al. 2012 J Biomed Biotechnol). At the Cardiocentro Ticino it has also been shown that these vesicles inhibit apoptosis of cardiomyocytes and promote angiogenesis, playing a fundamental role in the paracrine effect of CPC. Even in vivo, in a preclinical model of acute myocardial infarction in the rat, CPC-derived exosomes reduce tissue damage, inhibit cardiomyocyte apoptosis and promote angiogenesis, improving post-infarct cardiac function. Some specific microRNAs such as miR-132 and miR-210 are believed to be key mediators of these effects (Barile L et al 2014, Cardiovasc Res).

[0004] Gli esosomi da CPC rappresentano quindi un promettente candidato per future applicazioni cliniche, basate su un approccio alternativo ed innovativo rispetto alle terapie cellulari attualmente in studio in campo cardiovascolare. Rispetto ad un prodotto cellulare, gli esosomi isolati potrebbero presentare dei vantaggi in termini di sicurezza e maneggevolezza. Potrebbero essere impiegati sia in un contesto autologo che allogenico; in particolare, l'utilizzo allogenico permetterebbe di avere a disposizione un prodotto congelato pronto all'uso, utilizzabile in situazioni di danno acuto. [0004] CPC exosomes therefore represent a promising candidate for future clinical applications, based on an alternative and innovative approach to the cell therapies currently under study in the cardiovascular field. Compared to a cellular product, isolated exosomes could present advantages in terms of safety and handling. They could be employed in both an autologous and an allogeneic context; in particular, allogeneic use would make it possible to have a frozen product ready for use, usable in situations of acute damage.

[0005] In questa prospettiva, nei laboratori della Lugano Cell Factory-Cardiocentro Ticino (LCF-CCT) ci si è focalizzati sullo sviluppo di metodi di produzione a circuito chiuso e controllo qualità per la preparazione su larga scala di esosomi da CPC come prodotto medicinale, in accordo con le Buone Pratiche di Fabbricazione (Good Manufacturing Practices, GMP). [0005] In this perspective, the Lugano Cell Factory-Cardiocentro Ticino (LCF-CCT) laboratories focused on the development of closed-loop production methods and quality control for the large-scale preparation of exosomes from CPC as a medicinal product , in accordance with Good Manufacturing Practices (GMP).

[0006] Le attuali tecniche per la produzione di esosomi rientrano in tutti quei processi denominati „grado ricerca“ che vengono solitamente utilizzati per la preparazione di esosomi per i primi studi preclinici. (Barile L et al 2014, Cardiovasc Res). [0006] The current techniques for the production of exosomes fall within all those processes called "research grade" which are usually used for the preparation of exosomes for the first preclinical studies. (Barile L et al 2014, Cardiovasc Res).

[0007] Un esempio di tale processo è schematizzato in Figura 1, e consta di due fasi distinte, rispettivamente (A) isolamento ed espansione di CPC a partire da tessuto cardiaco e (B) isolamento degli esosomi a partire dal medium condizionato delle CPC. [0007] An example of this process is schematized in Figure 1, and consists of two distinct phases, respectively (A) isolation and expansion of CPCs starting from cardiac tissue and (B) isolation of exosomes starting from the conditioned medium of the CPCs.

[0008] Fase A. Le cellule vengono ottenute a partire da tessuto cardiaco (appendice atriale) che rappresenta uno „scarto“ durante interventi di cardiochirurgia; il paziente/donatore firma un consenso informato per la donazione di tale tessuto a scopo di ricerca. [0008] Phase A. The cells are obtained from heart tissue (atrial appendage) which represents a "waste" during cardiac surgery; the patient / donor signs an informed consent for the donation of this tissue for research purposes.

[0009] Il tessuto viene processato tagliandolo in piccoli frammenti, che vengono posti ad aderire in piastra trattata con gelatina (Sigma), in presenza di terreno di coltura IMDM (Lonza) addizionato con siero bovino fetale (fetal bovine serum, FBS) (Gibco/ThermoFisher) al 20% e incubati a 37°C con 5% CO2. Dopo alcuni giorni, si osserva ai lati dei frammenti la fuoriuscita di cellule (CPC), che si espandono fino a ricoprire la superficie della piastra stessa. Le CPC vengono a quel punto raccolte mediante trattamento con tripsina (Sigma), quindi riseminate in opportune fiasche ed espanse in IMDM 20% FBS a 37°C con 5% CO2(CPC prima raccolta). I frammenti rimasti nella piastra originale vengono lasciati in adesione, in presenza di nuovo terreno IMDM 20% FBS; dopo alcuni giorni si osserva nuovamente la fuoriuscita di cellule, che si espandono fino a ricoprire la superficie della piastra stessa. Le CPC vengono a quel punto raccolte mediante trattamento con tripsina, quindi riseminate in opportune fiasche ed espanse in IMDM 20% FBS a 37°C con 5% CO2(CPC seconda raccolta). Il processo viene ripetuto per una terza volta (CPC terza raccolta). [0009] The tissue is processed by cutting it into small fragments, which are placed to adhere in a plate treated with gelatin (Sigma), in the presence of IMDM culture medium (Lonza) supplemented with fetal bovine serum (FBS) (Gibco / ThermoFisher) at 20% and incubated at 37 ° C with 5% CO2. After a few days, cells (CPC) emerge from the sides of the fragments, which expand to cover the surface of the plate itself. The CPCs are then harvested by treatment with trypsin (Sigma), then re-seeded in suitable flasks and expanded in IMDM 20% FBS at 37 ° C with 5% CO2 (CPC first harvest). The fragments remaining in the original plate are left in adhesion, in the presence of new IMDM 20% FBS medium; after a few days, the release of cells is observed again, which expand until they cover the surface of the plate itself. The CPCs are then harvested by treatment with trypsin, then re-seeded in suitable flasks and expanded in IMDM 20% FBS at 37 ° C with 5% CO2 (CPC second harvest). The process is repeated for a third time (CPC third collection).

[0010] Fase B. Per la produzione di esosomi, una fiasca con CPC (derivate da prima, seconda o terza raccolta) a confluenza viene mantenuta per 7 giorni in terreno DMEM con glucosio 4.5 g/L (Gibco/ThermoFisher) in assenza di siero; viene quindi raccolto il medium condizionato (conditioned medium, CM), che contiene gli esosomi; il CM viene centrifugato a 3000xg e filtrato (0.22 µm) quindi concentrato mediante centrifugazione a 3000xg in Amicon Ultra-15, cut-off 100 kDa (Merck Millipore). Il concentrato viene centrifugato nuovamente a 10000xg, il sovranatante raccolto e ultracentrifugato a 100000xg, in modo da ottenere un precipitato contenente gli esosomi, che vengono poi risospesi in tampone fosfato (PBS). [0010] Phase B. For the production of exosomes, a flask with CPC (derived from first, second or third collection) in confluence is kept for 7 days in DMEM medium with 4.5 g / L glucose (Gibco / ThermoFisher) in the absence of serum; the conditioned medium (CM), which contains the exosomes, is then collected; the CM is centrifuged at 3000xg and filtered (0.22 µm) then concentrated by centrifugation at 3000xg in Amicon Ultra-15, 100 kDa cut-off (Merck Millipore). The concentrate is centrifuged again at 10000xg, the supernatant collected and ultracentrifuged at 100000xg, to obtain a precipitate containing the exosomes, which are then resuspended in phosphate buffer (PBS).

[0011] Questo processo „grado ricerca“ presenta alcune criticità, cioè aspetti non compatibili con la traslazione in clinica. [0011] This "research grade" process has some criticalities, that is, aspects that are not compatible with transfer to the clinic.

[0012] In particolare, l'utilizzo di reagenti di origine animale per l'isolamento e coltura delle CPC può mettere a rischio la sicurezza del prodotto, mentre l'effettuazione di raccolte multiple può metterne a rischio l'omogeneità. [0012] In particular, the use of reagents of animal origin for the isolation and culture of CPCs can jeopardize the safety of the product, while carrying out multiple collections may jeopardize its homogeneity.

[0013] L'impiego di passaggi di centrifugazione e ultracentrifugazione durante il processo di preparazione degli esosomi limita la scala massima del processo stesso a 1-2 L di CM. [0013] The use of centrifugation and ultracentrifugation steps during the exosome preparation process limits the maximum scale of the process itself to 1-2 L of CM.

[0014] Compito tecnico dell'invenzione è pertanto quello di sviluppare un dispositivo e un metodo di produzione, purificazione e controllo qualità su larga scala di esosomi come prodotto medicinale da utilizzare in fase clinica. [0014] The technical aim of the invention is therefore to develop a device and a method for the large-scale production, purification and quality control of exosomes as a medicinal product to be used in the clinical phase.

[0015] Nell'ambito di questo compito tecnico, uno scopo della presente invenzione è fornire un dispositivo e un metodo di produzione di esosomi su larga scala in accordo con le Buone Pratiche di Fabbricazione (Good Manufacturing Practices). Within the scope of this technical task, an object of the present invention is to provide a device and a method for producing large-scale exosomes in accordance with Good Manufacturing Practices.

[0016] Un altro scopo dell'invenzione è quello di fornire un dispositivo a circuito chiuso che garantisca la sterilità del prodotto, e un metodo di produzione e purificazione di esosomi per la preparazione degli esosomi pronti per essere usati come prodotto medicinale, in confezioni monouso. [0016] Another object of the invention is to provide a closed circuit device that guarantees the sterility of the product, and a method of production and purification of exosomes for the preparation of the exosomes ready to be used as a medicinal product, in disposable packages .

[0017] Questi e altri scopi della presente invenzione sono conseguiti da un dispositivo di produzione e purificazione di esosomi da cellule progenitrici caratterizzato dal fatto di comprendere un circuito chiuso e sterile presentante mezzi di pompaggio ed una pluralità di stazioni di processo collegate serialmente in cui una prima stazione di processo comprende un primo medium di coltura contenente dette cellule progenitrici che sono coltivate per la produzione di detti esosomi; una seconda stazione di processo comprende un secondo medium condizionato dagli esosomi prodotti nella prima stazione di processo; una terza stazione di processo comprende mezzi di filtraggio per la chiarificazione di detto medium condizionato; una quarta stazione di processo comprende una o più cartucce a fibre cave per la concentrazione tramite filtrazione tangenziale del medium condizionato chiarificato e mezzi per il ricircolo del medium concentrato per una sua successiva concentrazione; una quinta stazione di processo comprende un tampone di formulazione per la diluizione del medium concentrato; una sesta stazione di processo comprende materiale di scarto in uscita da detta quarta stazione di processo; una settima stazione di processo comprende mezzi di raccolta del medium concentrato-diafiltrato contenente esosomi purificati; una ottava stazione di processo comprende mezzi di stoccaggio di detti esosomi purificati.[0017] These and other objects of the present invention are achieved by a device for the production and purification of exosomes from progenitor cells characterized in that it comprises a closed and sterile circuit having pumping means and a plurality of serially connected process stations in which a first processing station comprises a first culture medium containing said progenitor cells which are cultured for the production of said exosomes; a second processing station comprises a second medium conditioned by the exosomes produced in the first processing station; a third processing station comprises filtering means for the clarification of said conditioned medium; a fourth processing station comprises one or more hollow fiber cartridges for the concentration by cross-flow filtration of the clarified conditioned medium and means for the recirculation of the concentrated medium for its subsequent concentration; a fifth processing station comprises a formulation buffer for dilution of the concentrated medium; a sixth processing station comprises waste material leaving said fourth processing station; a seventh processing station comprises means for collecting the concentrated diafiltered medium containing purified exosomes; an eighth processing station comprises storage means for said purified exosomes.

[0018] L'invenzione inoltre rivela un metodo per la produzione e purificazione di esosomi da cellule progenitrici caratterizzato dal fatto di essere eseguito in un sistema chiuso e sterile e prevede le seguenti fasi: una fase di produzione di un medium condizionato contenente detti esosomi mediante coltivazione di dette cellule progenitrici in un primo medium di coltura; una fase di chiarificazione di detto medium condizionato mediante passaggio in serie su una pluralità di filtri; una fase di raccolta del medium condizionato chiarificato; una fase di concentrazione del medium condizionato mediante filtrazione tangenziale su cartuccia a fibre cave con un cut-off compreso tra 100 e 500 kDa; una fase di ricircolo di detto medium condizionato filtrato per una sua maggiore concentrazione; una fase di scarto del materiale particellare di dimensioni minori del cut-off della cartuccia a fibre cave; una fase di diafiltrazione di detto medium concentrato su cartuccia a fibre cave con cut-off compreso tra 100 e 500 kDa mediante connessione sterile con un tampone di formulazione; una fase di recupero del medium concentrato-diafiltrato contenente esosomi purificati una fase di stoccaggio di detti esosomi purificati in appositi contenitori.[0018] The invention also discloses a method for the production and purification of exosomes from progenitor cells characterized in that it is carried out in a closed and sterile system and involves the following steps: a step of producing a conditioned medium containing said exosomes by culturing said progenitor cells in a first culture medium; a step of clarification of said conditioned medium by passing in series over a plurality of filters; a step of collecting the clarified conditioned medium; a step of concentrating the conditioned medium by cross-flow filtration on a hollow fiber cartridge with a cut-off between 100 and 500 kDa; a recirculation step of said conditioned medium filtered for its greater concentration; a step of rejecting the particulate material smaller than the cut-off of the hollow fiber cartridge; a step of diafiltration of said concentrated medium on a hollow fiber cartridge with a cut-off between 100 and 500 kDa by sterile connection with a formulation pad; a recovery step of the concentrated diafiltered medium containing purified exosomes a storage step of said purified exosomes in suitable containers.

[0019] Le diverse fasi sono pensate come „modulari“ per essere eventualmente in futuro automatizzate, singolarmente o in combinazione in un unico „device“. [0019] The different phases are designed as "modular" to be possibly automated in the future, individually or in combination in a single "device".

[0020] Altri aspetti salienti dell'invenzione sono riportati nelle rivendicazioni dipendenti che seguono. [0020] Other salient aspects of the invention are reported in the following dependent claims.

[0021] Questi ed altri aspetti dell'invenzione saranno maggiormente chiariti alla lettura della descrizione che segue di un suo modo di realizzazione preferito, in cui: figura 1 mostra il processo „grado ricerca“ secondo l'arte nota per la produzione di esosomi da cellule progenitrici cardiache. figura 2 mostra fotografie al microscopio ottico di frammenti di tessuto cardiaco da cui fuoriescono le cellule progenitrici cardiache e di tali cellule in espansione. figura 3 mostra un grafico riportante i numeri di cellule progenitrici cardiache ottenute sia tramite il processo „grado ricerca“ dell'arte nota sia secondo la presente invenzione (condizioni PRE-GMP). figura 4 mostra le curve di crescita delle cellule progenitrici cardiache sia in condizione „grado ricerca“ sia secondo la presente invenzione (condizioni PRE-GMP). figura 5 mostra un grafico riportante i tempi di duplicazione delle cellule progenitrici cardiache sia in condizione „grado ricerca“ sia secondo la presente invenzione (condizioni PRE-GMP). figura 6a e fig. 6b mostrano i risultati ottenuti dalla valutazione dell'immunofenotipo, prima e dopo la produzione di esosomi, mediante colorazione con anticorpi fluorescenti (MSC phenotyping kit, Miltenyi biotec) e analisi al citofluorimetro. (MACSQuant Analyzer 10, Miltenyi biotec), in termini rispettivamente di percentuali di cellule positive e istogrammi relativi all'intensità di fluorescenza per i diversi marcatori Figura 7 mostra l'espressione dei fattori di trascrizione mesodermici e cardio-specifici da parte delle cellule progenitrici cardiache sia in condizione „grado ricerca“ sia secondo la presente invenzione (condizioni PRE-GMP). Figura 8 mostra l'analisi NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) condotta su esosomi ottenuti da cellule progenitrici cardiache sia in condizioni „grado ricerca“ sia in condizioni PRE- GMP. Figura 9 mostra i risultati ottenuti sulla funzionalità degli esosomi ottenuti da cellule progenitrici cardiache sia in condizioni „grado ricerca“ sia in condizioni PRE- GMP.. Figura 10 mostra le curve di crescita delle cellule progenitrici cardiache su diversi substrati di adesione. Figura 11 mostra lo Scale-up del passaggio di concentrazione del medium condizionato da esosomi Figura 12 mostra i risultati ottenuti sulla funzionalità di esosomi concentrati. Figura 13 mostra uno schema del metodo di produzione e purificazione degli esosomi secondo la presente invenzione. Figure 14A e 14 B mostrano rispettivamente la fuoriuscita delle cellule progenitrici cardiache da un frammento di biopsia e l'espansione delle cellule progenitrici cardiache in coltura in condizioni pre-GMP. Figura 15 mostra l'allestimento di banche cellulari di cellule progenitrici cardiache.[0021] These and other aspects of the invention will be further clarified upon reading the following description of a preferred embodiment thereof, in which: Figure 1 shows the "research grade" process according to the known art for the production of exosomes from cardiac progenitor cells. Figure 2 shows optical microscope photographs of heart tissue fragments from which cardiac progenitor cells emerge and of these expanding cells. Figure 3 shows a graph showing the numbers of cardiac progenitor cells obtained both through the "research grade" process of the known art and according to the present invention (PRE-GMP conditions). Figure 4 shows the growth curves of the cardiac progenitor cells both in the „research grade“ condition and according to the present invention (PRE-GMP conditions). Figure 5 shows a graph showing the duplication times of cardiac progenitor cells both in the "research grade" condition and according to the present invention (PRE-GMP conditions). figure 6a and fig. 6b show the results obtained from the evaluation of the immunophenotype, before and after the production of exosomes, by staining with fluorescent antibodies (MSC phenotyping kit, Miltenyi biotec) and cytofluorimeter analysis. (MACSQuant Analyzer 10, Miltenyi biotec), in terms of percentages of positive cells and fluorescence intensity histograms for the different markers, respectively Figure 7 shows the expression of mesodermal and cardio-specific transcription factors by cardiac progenitor cells both in the „research grade“ condition and according to the present invention (PRE-GMP conditions). Figure 8 shows the NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) analysis conducted on exosomes obtained from cardiac progenitor cells under both „research grade“ and PRE-GMP conditions. Figure 9 shows the results obtained on the functionality of exosomes obtained from cardiac progenitor cells both in "research grade" conditions and in PRE-GMP conditions. Figure 10 shows the growth curves of cardiac progenitor cells on different adhesion substrates. Figure 11 shows the Scale-up of the concentration step of the conditioned medium from exosomes Figure 12 shows the results obtained on the functionality of concentrated exosomes. Figure 13 shows a scheme of the method of production and purification of exosomes according to the present invention. Figures 14A and 14B show the leaking of cardiac progenitor cells from a biopsy fragment and the expansion of cultured cardiac progenitor cells under pre-GMP conditions, respectively. Figure 15 shows the cell bank setup of cardiac progenitor cells.

[0022] L'approccio sperimentale utilizzato per lo sviluppo del dispositivo e del metodo di produzione e purificazione degli esosomi secondo la presente invenzione è schematizzato in Tabella 1 sottostante: [0022] The experimental approach used for the development of the device and the method of production and purification of the exosomes according to the present invention is schematized in Table 1 below:

Tabella 1Table 1

[0023] CPC Da: A: Gelatina Substrati di adesione alternativi: -CELLStart™CTS™(Gibco/ThermoFisher) -Synthemax II® (Corning) -CellBIND® surface (Corning) IMDM-FBS Terreno di coltura privo di siero ecomponenti di origine animale: -StemMACS-MSC Expansion Media Kit XF(Miltenyi biotec) Tripsina Sistemi di dissociazione alternativi: -TripLE™ Select (Gibco/ThermoFisher) Raccolte cellulari multiple Raccolta cellulare singola ESOSOMI Da: A: Ultracentrifugazione Metodi di arricchimento alternativi: -Concentrazione mediante filtrazionediretta o tangenziale[0023] CPC From: To: Gelatin Alternative adhesion substrates: -CELLStart ™ CTS ™ (Gibco / ThermoFisher) -Synthemax II® (Corning) -CellBIND® surface (Corning) IMDM-FBS Serum-free culture medium and source components animal: -StemMACS-MSC Expansion Media Kit XF (Miltenyi biotec) Trypsin Alternative Dissociation Systems: -TripLE ™ Select (Gibco / ThermoFisher) Multiple Cell Collections Single Cell Collection EXOSOMES From: To: Ultracentrifugation Alternative Enrichment Methods: -Concentration by Direct Filtration or ring road

[0024] La gelatina (di origine bovina) è stata sostituita dai substrati di adesione alternativi come indicato in Tabella i quali sono privi di componenti di origine animale; il terreno IMDM 20% FBS (di origine bovina) è stato sostituito con un terreno di coltura serum-free privo di componenti animali, selezionato tra 7 diversi prodotti commerciali; la tripsina (di origine porcina) è stata sostituita con il reagente alternativo TripLE Select; viene effettuata una sola raccolta di CPC anziché le 3 previste nel processo „grado ricerca“; l'ultracentrifugazione è stata sostituita da metodologie alternative di arricchimento/purificazione, quali concentrazione mediante filtrazione diretta o tangenziale. [0024] The gelatin (of bovine origin) has been replaced by alternative adhesion substrates as indicated in the Table which are free of components of animal origin; IMDM 20% FBS medium (bovine origin) was replaced with a serum-free culture medium without animal components, selected from 7 different commercial products; trypsin (of porcine origin) was replaced with the alternative TripLE Select reagent; only one CPC collection is carried out instead of the 3 foreseen in the “research grade” process; ultracentrifugation has been replaced by alternative enrichment / purification methodologies, such as concentration by direct or tangential filtration.

[0025] Isolamento e coltura delle CPC sono stati effettuati in parallelo, a partire dallo stesso campione di tessuto cardiaco, in condizione „ricerca“ (terreno di coltura con FBS, substrato di adesione gelatina) e in due diverse condizioni „pre-GMP“ (terreno di coltura serum-free , substrato di adesione rispettivamente CELLStart™ CTS™ e Synthemax® II); l'esperimento è stato ripetuto 5 volte, utilizzando campioni di tessuto cardiaco prelevati da 5 diversi pazienti/donatori, nell'ambito di uno studio autorizzato dal Comitato Etico. [0025] Isolation and culture of the CPCs were carried out in parallel, starting from the same cardiac tissue sample, in "research" condition (culture medium with FBS, gelatin adhesion substrate) and in two different "pre-GMP" conditions (serum-free culture medium, adhesion substrate CELLStart ™ CTS ™ and Synthemax® II respectively); the experiment was repeated 5 times, using heart tissue samples taken from 5 different patients / donors, as part of a study authorized by the Ethics Committee.

[0026] Il dispositivo 1 di produzione e purificazione di esosomi da cellule progenitrici comprende un circuito chiuso e sterile presentante mezzi di pompaggio 9, 10 e una pluralità di stazioni di processo 2, 3, 4, 5, 7, 8, 11 e 12 collegate serialmente. [0026] The device 1 for the production and purification of exosomes from progenitor cells comprises a closed and sterile circuit having pumping means 9, 10 and a plurality of processing stations 2, 3, 4, 5, 7, 8, 11 and 12 connected serially.

[0027] In particolare la prima stazione di processo 2 comprende un primo medium di coltura in cui le cellule progenitrici (d'ora in poi CP) vengono coltivate per la produzione degli esosomi. [0027] In particular, the first processing station 2 comprises a first culture medium in which the progenitor cells (hereinafter CP) are cultured for the production of the exosomes.

[0028] La seconda stazione di processo 3 comprende invece un secondo medium condizionato, contenente gli esosomi prodotti nella prima stazione di processo. [0028] The second processing station 3 instead comprises a second conditioned medium, containing the exosomes produced in the first processing station.

[0029] La terza stazione di processo 4 comprende una pluralità di filtri disposti in serie per la chiarificazione del medium condizionato. La quarta stazione di processo 5 comprende una cartuccia a fibre cave 6 per la concentrazione del medium condizionato chiarificato attraverso filtrazione tangenziale e mezzi per il ricircolo del medium condizionato filtrato sulla cartuccia a fibre cave per una sua successiva concentrazione. [0029] The third processing station 4 comprises a plurality of filters arranged in series for the clarification of the conditioned medium. The fourth processing station 5 comprises a hollow fiber cartridge 6 for the concentration of the conditioned medium clarified by cross-flow filtration and means for the recirculation of the filtered conditioned medium on the hollow fiber cartridge for its subsequent concentration.

[0030] La quinta stazione di processo 12 comprende un tampone di formulazione per la diluizione del medium condizionato concentrato. The fifth processing station 12 comprises a formulation buffer for dilution of the concentrated conditioned medium.

[0031] La sesta stazione di processo 7 comprende materiale di scarto in uscita dalla quarta stazione di processo. [0031] The sixth processing station 7 comprises waste material leaving the fourth processing station.

[0032] La settima stazione di processo 8 comprende mezzi di raccolta del medium concentrato-diafiltrato contenente detti esosomi purificati. Infine l'ottava stazione di processo 11 comprende mezzi di stoccaggio di detti esosomi purificati. [0032] The seventh processing station 8 comprises means for collecting the concentrated-diafiltered medium containing said purified exosomes. Finally, the eighth processing station 11 comprises storage means for said purified exosomes.

[0033] In particolare i mezzi di pompaggio 9, 10 comprendono una pompa peristaltica o a diaframma. [0033] In particular, the pumping means 9, 10 comprise a peristaltic or diaphragm pump.

[0034] Nella presente invenzione le cellule progenitrici sono cellule progenitrici cardiache. Il dispositivo e il metodo di produzione e purificazione degli esosomi può essere utilizzato anche per molti altri tipi di cellule. In the present invention the progenitor cells are cardiac progenitor cells. The device and method of producing and purifying exosomes can also be used for many other cell types.

[0035] La presente invenzione si caratterizza per il fatto che il passaggio di fluido contenente gli esosomi dalla prima stazione di processo 2 fino allo stoccaggio negli appositi contenitori viene eseguito per mezzo di sacche. [0035] The present invention is characterized by the fact that the passage of fluid containing the exosomes from the first process station 2 to storage in the suitable containers is carried out by means of bags.

[0036] In particolare la seconda stazione di processo 3 comprende una sacca di raccolta del medium condizionato contenente gli esosomi prodotti dalle CP. La quarta stazione di processo 5 comprende una sacca di raccolta del medium condizionato chiarificato denominata „sacca processo“. La quinta stazione di processo 12 comprende una sacca contenente un tampone di formulazione per la diluizione del medium concentrato proveniente dalla sacca processo. [0036] In particular, the second processing station 3 comprises a bag for collecting the conditioned medium containing the exosomes produced by the CPs. The fourth processing station 5 comprises a bag for collecting the clarified conditioned medium called "processing bag". The fifth processing station 12 comprises a bag containing a formulation buffer for diluting the concentrated medium from the processing bag.

[0037] La sesta stazione di processo 7 comprende una sacca di scarto per la raccolta del materiale di scarto proveniente dalla quarta stazione di processo 5. Infine la settima stazione di processo 8 comprende una sacca, denominata „sacca prodotto finito“ dove si raccolgono gli esosomi purificati. [0037] The sixth processing station 7 comprises a waste bag for collecting the waste material coming from the fourth processing station 5. Finally, the seventh processing station 8 comprises a bag, called "finished product bag" where the purified exosomes.

[0038] Vantaggiosamente i mezzi di ricircolo 10 comprendono una pompa peristaltica o a diaframma. [0038] Advantageously, the recirculation means 10 comprise a peristaltic or diaphragm pump.

[0039] La fibra cava presenta un cut-off compreso tra 100 e 500 kDa, preferibilmente 300 kDa. [0039] The hollow fiber has a cut-off between 100 and 500 kDa, preferably 300 kDa.

[0040] I contenitori di stoccaggio comprendono vials sterili in polimero resistente a temperature criogeniche. [0040] The storage containers comprise sterile vials made of polymer resistant to cryogenic temperatures.

[0041] Maggiori dettagli della presente invenzione vengono meglio evidenziati nella descrizione che segue di un modo preferito di realizzazione dell'invenzione. [0041] More details of the present invention are better highlighted in the following description of a preferred embodiment of the invention.

Descrizione di un modo preferito di realizzazione dell'invenzioneDescription of a preferred embodiment of the invention

FONTE DI CELLULESOURCE OF CELLS

[0042] Le biopsie di auricola dell'atrio destro del cuore sono ottenute da pazienti, non portatori di concomitanti patologie alle arterie coronarie, sottoposti a intervento chirurgico di riparazione valvolare. Il prelievo del tessuto è svolto in accordo con la Dichiarazione di Helsinki e in accordo a specifica autorizzazione da parte del Comitato Etico locale, sulla base di un consenso informato. Auricle biopsies of the right atrium of the heart are obtained from patients, not carriers of concomitant coronary artery diseases, undergoing valve repair surgery. The sampling of the tissue is carried out in accordance with the Declaration of Helsinki and in accordance with specific authorization from the local Ethics Committee, on the basis of informed consent.

[0043] La biopsia, ricevuta in contenitore sterile contente soluzione cardioplegica (Plasmalyte A 1000 mL + Mannitolo 20% 16 mL + Magnesio Solfato 50% 4 mL + Sodio Bicarbonato 8.4% 13 mL + Lidocaina 1% 13 mL + Potassio Cloruro 2M 13 mL), è processata in condizioni sterili (cappa a flusso laminare in classe A): sono effettuati 2 lavaggi con il tampone fosfato salino Dulbecco senza Calcio e Magnesio (DPBS, Gibco Invitrogen celi culture, Thermo Fisher Scientific, USA) ed il tessuto muscolare è isolato dal tessuto connettivo dopo il trasferimento della biopsia su un supporto sterile (piastra Petri, Corning, USA); il tessuto muscolare viene quindi sminuzzato meccanicamente in modo da ottenere frammenti con dimensione massima di 0.5-1 mm. [0043] The biopsy, received in a sterile container containing cardioplegic solution (Plasmalyte A 1000 mL + Mannitol 20% 16 mL + Magnesium Sulphate 50% 4 mL + Sodium Bicarbonate 8.4% 13 mL + Lidocaine 1% 13 mL + Potassium Chloride 2M 13 mL ), is processed under sterile conditions (class A laminar flow hood): 2 washes are carried out with Dulbecco's calcium and magnesium-free saline phosphate buffer (DPBS, Gibco Invitrogen celi culture, Thermo Fisher Scientific, USA) and the muscle tissue is isolated from connective tissue after transfer of the biopsy to a sterile support (Petri dish, Corning, USA); the muscle tissue is then mechanically minced in order to obtain fragments with a maximum size of 0.5-1 mm.

[0044] I frammenti di tessuto trasferiti in una piastra Petri pulita, dopo essere stati lavati 2 volte con DPBS, sono sottoposti a trattamento con circa 1-2 mL di soluzione enzimatica (TrypLE™ Select Enzyme IX, senza rosso fenolo, Thermo Fisher Scientific, USA) e incubati 10 minuti a temperatura ambiente. Di seguito la soluzione enzimatica è rimossa e i frammenti sono risospesi in circa 2 mL di medium di coltura MSC-BREW GMP Medium (Miltenyi Biotec, Germany). [0044] The tissue fragments transferred into a clean Petri dish, after being washed twice with DPBS, are subjected to treatment with approximately 1-2 mL of enzyme solution (TrypLE ™ Select Enzyme IX, without phenol red, Thermo Fisher Scientific , USA) and incubated for 10 minutes at room temperature. Then the enzyme solution is removed and the fragments are resuspended in approximately 2 mL of culture medium MSC-BREW GMP Medium (Miltenyi Biotec, Germany).

[0045] I frammenti di biopsia ottenuti sono posizionati secondo un reticolo (16 frammenti/fiasca) in presenza di 4-5 mL di medium di coltura in fiasche T115 con apertura superiore a sportello (TPP<®>, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Germany), precedentemente trattate con CELLstart™ CTS™ (Gibco Invitrogen celi culture, Thermo Fisher Scientific, USA) per 2 ore a 37°C 5% CO2secondo le istruzioni del fabbricante. Le fiasche sono incubate a 37°C 5% CO2e giornalmente, con cautela per non fare staccare i frammenti adesi alla superficie della fiasca, è aggiunto 1-2 mL di medium di coltura fino a raggiungere 10 mL di medium per fiasca. [0045] The obtained biopsy fragments are positioned according to a lattice (16 fragments / flask) in the presence of 4-5 mL of culture medium in T115 flasks with top door opening (TPP <®>, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Germany), previously treated with CELLstart ™ CTS ™ (Gibco Invitrogen celi culture, Thermo Fisher Scientific, USA) for 2 hours at 37 ° C 5% CO2 according to the manufacturer's instructions. The flasks are incubated at 37 ° C 5% CO2 and daily, with caution so as not to detach the fragments adhering to the surface of the flask, 1-2 mL of culture medium is added to reach 10 mL of medium per flask.

[0046] Dopo circa 14-21 giorni dai frammenti di biopsia adesi si si osserva fuoriuscita delle CPC, come mostrato in Figura 14 A. [0046] After about 14-21 days from the adhered biopsy fragments, leakage of the CPCs is observed, as shown in Figure 14 A.

COLTURA CELLULE E COSTITUZIONE DELLA MASTERCELL BANKCELL CULTURE AND ESTABLISHMENT OF THE MASTERCELL BANK

[0047] Le cellule sono staccate dalle fiasche contenenti i frammenti di biopsia con la soluzione enzimatica TrypLE™ Select Enzyme IX, ripiastrate alla concentrazione 8-10×10<3>cellule/cm<2>in fiasche tipo T, Hyperflask, Hyperstack o CellStack (Corning, USA), coltivate con il medium di coltura MSC-BREW GMP Medium ed espanse fino al 2° passaggio di coltura (P2). La Figura 14 B mostra delle CPC in coltura in condizioni GMP. [0047] Cells are detached from flasks containing biopsy fragments with TrypLE ™ Select Enzyme IX enzyme solution, replated at concentration 8-10 × 10 <3> cells / cm <2> in flasks type T, Hyperflask, Hyperstack or CellStack (Corning, USA), grown with MSC-BREW GMP Medium and expanded to the 2nd culture pass (P2). Figure 14B shows CPCs cultured under GMP conditions.

[0048] Al passaggio di coltura P2 le cellule vengono congelate per costituire la „Master Celi Bank“ (MCB, figura 15) dopo risospensione in Cryostor<®>CS10 (BioLife Solutions, USA), mediante congelamento a discesa programmata di temperatura (Biofreeze<®>BV45, Consartic, Germany). Una frazione delle cellule viene riseminata e mantenuta in coltura per ulteriori 4 passaggi (fino al P6), andando a costituire la „Post Production Celi Bank“ (PPCB, Figura 15), cioè una piccola banca di CPC mantenute in coltura ben oltre il passaggio P4 a cui viene effettuata la produzione di esosomi; la PPCB viene controllata (si veda capitolo controllo qualità) in particolare per gli aspetti di sicurezza. [0048] At the P2 culture step the cells are frozen to form the "Master Cell Bank" (MCB, Figure 15) after resuspension in Cryostor <®> CS10 (BioLife Solutions, USA), by means of programmed temperature drop freezing (Biofreeze <®> BV45, Consartic, Germany). A fraction of the cells is re-seeded and kept in culture for a further 4 passages (up to P6), forming the "Post Production Cell Bank" (PPCB, Figure 15), i.e. a small bank of CPCs kept in culture well beyond the passage P4 at which the production of exosomes is carried out; the PPCB is checked (see chapter quality control) in particular for the safety aspects.

PRODUZIONE DI ESOSOMI NEL MEDIUM DI COLTURAE PURIFICAZIONE SECONDO SISTEMA CLINICAL-GRADEPRODUCTION OF EXOSOMES IN CULTURE MEDIUM AND PURIFICATION ACCORDING TO CLINICAL-GRADE SYSTEM

[0049] Il processo di produzione degli esosomi a partire dalla MCB di CPC è schematizzato in figura 13 e descritto in dettaglio di seguito. [0049] The production process of the exosomes starting from the MCB of CPC is schematized in figure 13 and described in detail below.

[0050] Un'aliquota di cellule CPC congelate nella MCB, è scongelata e le CPC sono coltivate (8-10×10<3>cellule/cm<2>semina iniziale) con il medium di coltura MSC-BREW GMP Medium mediante il sistema di coltura HYPERFlask<®>e 12 layer HYPERStack® CELLBIND<®>(Corning, USA), fino al 4° passaggio (P4). [0050] An aliquot of CPC cells frozen in the MCB is thawed and the CPCs are cultured (8-10 × 10 <3> cells / cm <2> initial seed) with the MSC-BREW GMP Medium by the HYPERFlask <®> culture system and 12-layer HYPERStack® CELLBIND <®> (Corning, USA), up to the 4th pass (P4).

[0051] Al passaggio P4 il medium di coltura è sostituito in sistema chiuso mediante l'utilizzo di sacche, dopo lavaggio 2 volte con DPBS, con il medium basale MSC-BREW GMP senza aggiunta dei supplementi oppure DMEM ad alto contenuto di glucosio (4.5 g/L) senza rosso fenolo (Gibco Invitrogen cell culture, Thermo Fisher Scientific, USA). [0051] At step P4 the culture medium is replaced in a closed system by using bags, after washing 2 times with DPBS, with the basal medium MSC-BREW GMP without addition of the supplements or DMEM with a high glucose content (4.5 g / L) without phenol red (Gibco Invitrogen cell culture, Thermo Fisher Scientific, USA).

[0052] Le cellule sono incubate 1 settimana a 37°C 5% CO2senza cambio medium. I volumi di medium condizionato contenente gli esosomi prodotti con questo sistema possono essere di 0.5-8 L. Nel caso di utilizzo di un bioreattore i volumi di medium condizionato prodotto saranno maggiori. The cells are incubated for 1 week at 37 ° C 5% CO2 without changing medium. The volumes of conditioned medium containing the exosomes produced with this system can be 0.5-8 L. In the case of using a bioreactor, the volumes of conditioned medium produced will be greater.

[0053] Il medium condizionato è raccolto sterilmente mediante connessione con sacca. The conditioned medium is sterile collected by bag connection.

[0054] A seguire, le cellule rimaste nel contenitore di coltura (End of Production Cells, EPC) vengono staccate come sopra descritto e congelate dopo risospensione in Cryostor<®>CS10 (BioLife Solutions, USA), mediante congelatore a discesa programmata di temperatura (Biofreeze<®>BV45, Consartic, Germany); le EPC vengono poi sottoposte a test di controllo qualità. [0054] Subsequently, the cells remaining in the culture container (End of Production Cells, EPC) are detached as described above and frozen after resuspension in Cryostor <®> CS10 (BioLife Solutions, USA), by means of a programmed temperature drop freezer (Biofreeze <®> BV45, Consartic, Germany); the EPCs are then subjected to quality control tests.

[0055] Il processo di purificazione è effettuato in sistema chiuso mediante strumento ÄKTA™ flux 6 (GE Healthcare) con un kit di sacche sterilmente connesse al sistema, realizzato appositamente per il nostro laboratorio e per questo tipo di purificazione clinical-grade degli esosomi partendo dal medium condizionato. [0055] The purification process is carried out in a closed system using the ÄKTA ™ flux 6 instrument (GE Healthcare) with a kit of bags sterile connected to the system, made specifically for our laboratory and for this type of clinical-grade purification of exosomes starting from the conditioned medium.

[0056] La purificazione degli esosomi dal medium condizionato prevede i seguenti passaggi effettuati in sequenza in sistema chiuso e sterile, in particolare con l'utilizzo della macchina ÄKTA™ flux 6 (Figura 13), i cui circuiti interni siano stati sottoposti ad opportuna sanitizzazione, e di connessioni tipo ReadyMate (GE Healthcare): FASE 1 CHIARIFICAZIONE: la sacca contenente il medium condizionato è connessa sterilmente al circuito della macchina per effettuare la chiarificazione mediante il passaggio in serie sui filtri 0.6-0.2 µm, grazie all'utilizzo della pompa di trasferimento della macchina (oppure con una pompa peristaltica esterna). Il medium chiarificato è raccolto sterilmente nella sacca denominata sacca di processo. FASE 2 CONCENTRAZIONE: la sacca di processo è connessa sterilmente in circuito chiuso per effettuare la concentrazione mediante filtrazione tangenziale (TFF, Tangential Flow Filtration) su cartuccia a fibre cave con cut-off 300 kDa (oppure 100/500 kDa), grazie all'utilizzo della pompa di caricamento della macchina (oppure con una pompa esterna peristaltica o a diaframma). Dalla cartuccia a fibre cave il medium in uscita contenente le particelle con dimensioni minori del cut-off della fibra finisce nella sacca dello scarto, il restante medium torna nella sacca di processo per effettuare nuovi passaggi di concentrazione. Il volume finale dopo la concentrazione è di 150-500 mL. I parametri della macchina (ad esempio velocità di flusso, pressione transmembrana) vengono impostati in modo da minimizzare lo „shear stress“ e garantire quindi l'integrità degli esosomi al termine del processo. FASE 3 DIAFILTRAZIONE: il medium concentrato contenuto nella sacca di processo è diluito mediante connessione sterile con il tampone di formulazione (tampone 20 mM TRIS HC1, 1 mM MgC12, 5% saccarosio, 100 mg/mL Human Serum Albumin pH 7.4; oppure soluzione Ringer, oppure PlasmaLite A, oppure altre soluzioni di grado clinico adatte all'infusione in vivo); vengono effettuati una serie di passaggi di diluzione e concentrazione in modo da ottenere una sostituzione del tampone iniziale maggiore o uguale al 95%. Il medium contenuto nella sacca di processo effettua il passaggio di diafiltrazione mediante passaggio sulla cartuccia a fibre cave con cut-off 300 kDa (oppure 100/500 kDa), grazie all'utilizzo della pompa di caricamento della macchina (oppure con una pompa peristaltica esterna). Il volume finale che si ottiene è di 100-400 mL. FASE 4 RECUPERO: Il prodotto contenuto nella sacca di processo è recuperato mediante connessione sterile nella sacca del prodotto finale. Per aumentare la sicurezza dell'intero processo, può essere effettuato un passaggio di filtrazione sterilizzante, mediante l'inserimento di un filtro a capsula (0.2 µm) nel tubo in entrata alla sacca del prodotto finale e l'impiego di una pompa.[0056] The purification of the exosomes from the conditioned medium involves the following steps carried out in sequence in a closed and sterile system, in particular with the use of the ÄKTA ™ flux 6 machine (Figure 13), whose internal circuits have been subjected to appropriate sanitization , and ReadyMate connections (GE Healthcare): PHASE 1 CLARIFICATION: the bag containing the conditioned medium is sterile connected to the machine circuit to carry out the clarification by passing in series on the 0.6-0.2 µm filters, thanks to the use of the machine transfer pump (or with an external peristaltic pump ). The clarified medium is sterile collected in the bag called the process bag. PHASE 2 CONCENTRATION: the process bag is sterile connected in a closed circuit to carry out the concentration by means of tangential filtration (TFF, Tangential Flow Filtration) on a hollow fiber cartridge with cut-off 300 kDa (or 100/500 kDa), thanks to the use of the machine loading pump (or with an external peristaltic or diaphragm pump). From the hollow fiber cartridge the outgoing medium containing the particles with dimensions smaller than the fiber cut-off ends up in the waste bag, the remaining medium returns to the process bag to carry out new concentration steps. The final volume after concentration is 150-500 mL. The machine parameters (eg flow velocity, transmembrane pressure) are set in such a way as to minimize the "shear stress" and thus guarantee the integrity of the exosomes at the end of the process. PHASE 3 DIAFILTRATION: the concentrated medium contained in the process bag is diluted by sterile connection with the formulation buffer (buffer 20 mM TRIS HC1, 1 mM MgC12, 5% sucrose, 100 mg / mL Human Serum Albumin pH 7.4; or Ringer solution , or PlasmaLite A, or other clinical grade solutions suitable for in vivo infusion); a series of dilution and concentration steps are carried out in order to obtain a replacement of the initial buffer greater than or equal to 95%. The medium contained in the process bag carries out the diafiltration step by passing over the hollow fiber cartridge with 300 kDa (or 100/500 kDa) cut-off, thanks to the use of the machine loading pump (or with an external peristaltic pump ). The final volume obtained is 100-400 mL. PHASE 4 RECOVERY: The product contained in the process bag is recovered by sterile connection in the bag of the final product. To increase the safety of the entire process, a sterilizing filtration step can be carried out, by inserting a capsule filter (0.2 µm) in the tube entering the bag of the final product and using a pump.

[0057] La resa attesa del processo di purificazione è pari a circa 1 µg di TSG101, corrispondente a circa 3E12 esosomi, per ogni litro di medium condizionato processato. [0057] The expected yield of the purification process is equal to about 1 µg of TSG101, corresponding to about 3E12 exosomes, for each liter of conditioned medium processed.

STOCCAGGIODELPRODOTTO MEDICINALE(ESOSOMI PURIFICATI DA CPC)STORAGE OF THE MEDICINAL PRODUCT (EXOSOMES PURIFIED BY CPC)

[0058] La sospensione contenente gli esosomi purificati viene aliquotata mediante trasferimento sterile in contenitori primari tipo Crystal® Vials (Aseptic Technologies, Belgio); i contenitori vengono quindi stoccati a -80°C o in vapori di azoto liquido. [0058] The suspension containing the purified exosomes is aliquoted by sterile transfer into primary containers such as Crystal® Vials (Aseptic Technologies, Belgium); the containers are then stored at -80 ° C or in liquid nitrogen vapors.

Strategia di Controllo Qualità GMPGMP Quality Control Strategy

[0059] La strategia di controllo qualità, schematizzata inTabella 2è stata definita tenendo presente gli aspetti peculiari del prodotto medicinale costituito dagli esosomi da CPC. [0059] The quality control strategy, schematized in Table 2, was defined keeping in mind the peculiar aspects of the medicinal product constituted by the exosomes from CPC.

[0060] Tale strategia è volta ad assicurare la massima qualità del prodotto in termini di identità/potenza, purezza e sicurezza. E' basata su alcuni metodi analitici descritti in farmacopea e su altri metodi specificamente sviluppati od ottimizzati nei nostri laboratori. Controlli opportuni vengono effettuati sulle cellule della MCB e della PPCB, così come su ogni lotto di prodotto medicinale (esosomi) e sulle relative EPC. I primi 3-5 lotti di prodotto medicinale preparati a partire da una MCB sono considerati lotti di validazione e vengono sottoposti ad un pannello di controlli più esteso, in particolare per quanto riguarda i test di sicurezza, rispetto ai lotti successivi. [0060] This strategy is aimed at ensuring the highest quality of the product in terms of identity / potency, purity and safety. It is based on some analytical methods described in the pharmacopoeia and on other methods specifically developed or optimized in our laboratories. Appropriate checks are carried out on the MCB and PPCB cells, as well as on each batch of medicinal product (exosomes) and on the related EPCs. The first 3-5 batches of medicinal product prepared from an MCB are considered validation batches and are subjected to a more extensive control panel, particularly as regards safety testing, than subsequent batches.

Descrizione dei metodi analitici per il Controllo Qualità GMP Description of the analytical methods for GMP Quality Control

[0061] Sono di seguito descritti i principali metodi specificamente sviluppati od ottimizzati nei nostri laboratori per il controllo qualità in GMP delle CPC (MCB, PPCB, EPC) e degli esosomi (prodotto medicinale). [0061] The main methods specifically developed or optimized in our laboratories for the GMP quality control of CPCs (MCB, PPCB, EPC) and exosomes (medicinal product) are described below.

ANALISI IMMUNOFENOTIPICA DELLE CPCIMMUNOPHENOTYPICAL ANALYSIS OF CPCs

[0062] Vengono valutati i marcatori di superficie CD73, CD90, CD105, tipici delle cellule staminali mesenchimali (MSC); come marcatori di controllo vengono valutati CD14, CD20, CD34 e CD45, non espressi su MSC (Dominici M et al. 2006. Cytotherapy 8:215-217). [0062] Surface markers CD73, CD90, CD105, typical of mesenchymal stem cells (MSC), are evaluated; CD14, CD20, CD34 and CD45, not expressed on MSC, are evaluated as control markers (Dominici M et al. 2006. Cytotherapy 8: 215-217).

[0063] Le cellule vengono marcate utilizzando il kit per MSC di Miltenyi biotec e analizzate tramite MACSQuant Analyzer (Miltenyi biotec). Cells are labeled using Miltenyi biotec's MSC kit and analyzed by MACSQuant Analyzer (Miltenyi biotec).

[0064] Esempi di risultati ottenuti con questo test sono riportati in Figura 6 B. [0064] Examples of results obtained with this test are shown in Figure 6 B.

ANALISI DELL'ESPRESSIONEDIFATTORI DITRASCRIZIONE NELLE CPC:RT-PCRANALYSIS OF THE EXPRESSION OF DITRASCRIPTION FACTORS IN CPC: RT-PCR

[0065] I geni GATA4 (Gene ID: 2626), TBX5 (Gene ID: 6910), TBX18 (Gene ID: 9096)e MESP1 (Gene ID: 55897) sono stati selezionati in base alla letteratura come fattori trascrizionali meso-dermici (TBX5, TBX18) e cardio-specifici (GATA-4 e MESP1). Come controllo di retrotrascrizione ed amplificazione si sono usati primer diretti sul gene GAPDH (Gene ID: 2597). [0065] GATA4 (Gene ID: 2626), TBX5 (Gene ID: 6910), TBX18 (Gene ID: 9096) and MESP1 (Gene ID: 55897) genes have been selected based on the literature as meso-dermal transcription factors ( TBX5, TBX18) and cardio-specific (GATA-4 and MESP1). Primers directed on the GAPDH gene (Gene ID: 2597) were used as a reverse transcription and amplification control.

[0066] L'RNA è estratto dalle cellule CPC con il kit TRIzol® Reagent (Thermo Fisher Scientific) e quantificato tramite assorbanza a 260 nm. Cinquecento ng di RNA per campione sono retrotrascritti con il kit GoScript™ Reverse Transcription System (Promega); per ogni campione si appronta anche un cosiddetto „controllo RT-“, un test cioè in cui non si aggiunge la retrotrascrittasi. Per ogni gene, una quantità di cDNA equivalente a 25 ng di RNA di partenza è poi amplificata con il kit GoTaq® DNA Polymerase (Promega) su un termociclatore C1000 (BioRad Laboratories). I prodotti di PCR sono separati su un gel d'agarosio al 2%. RNA is extracted from CPC cells with the TRIzol® Reagent kit (Thermo Fisher Scientific) and quantified by absorbance at 260 nm. Five hundred ng of RNA per sample are back-transcribed with the GoScript ™ Reverse Transcription System (Promega) kit; For each sample, a so-called „RT- control“ is also prepared, ie a test in which no reverse transcription is added. For each gene, an amount of cDNA equivalent to 25 ng of starting RNA is then amplified with the GoTaq® DNA Polymerase kit (Promega) on a C1000 thermocycler (BioRad Laboratories). The PCR products are separated on a 2% agarose gel.

[0067] La presenza della banda specifica in una corsia del gel indica che l'RNA del gene corrispondente era espresso nel campione analizzato; nel corrispondente controllo RT- non dovrebbe invece essere presente alcuna banda. The presence of the specific band in a lane of the gel indicates that the RNA of the corresponding gene was expressed in the analyzed sample; in the corresponding RT- control there should be no band.

[0068] Un esempio di risultati ottenuti con questo test è riportato in Figura 7. [0068] An example of results obtained with this test is reported in Figure 7.

WESTERN BLOTWESTERN BLOT

[0069] Per verificare la purezza dei campioni contenenti esosomi è inoltre necessario investigare sia la presenza di marcatori specifici della frazione esosomiale, sia l'assenza, o almeno la sottorappresentazione, di marcatori cellulari. Un elenco di tali marcatori è stato definito dalla International Society for Extracellular Vesicles (Lötvall Jet al, 2014, J Extracell Vesicles). [0069] In order to verify the purity of the samples containing exosomes it is also necessary to investigate both the presence of specific markers of the exosomal fraction, and the absence, or at least the under-representation, of cell markers. A list of such markers has been defined by the International Society for Extracellular Vesicles (Lötvall Jet al, 2014, J Extracell Vesicles).

[0070] Le preparazioni di esosomi, e gli opportuni controlli positivi e negativi, sono sottoposti ad analisi Western Blot per la identificazione dei seguenti marcatori: 1. TSG101 (Gene ID: 7251), una proteina del complesso ESCRT-I arricchita negli esosomi 2. HSP90B1 (alias: GPR94, Gene ID: 7184), uno chaperone molecolare tipico del reticolo endoplasmatico, e quindi della presenza di contaminanti cellulari nella preparazione[0070] The exosome preparations, and the appropriate positive and negative controls, are subjected to Western Blot analysis for the identification of the following markers: 1. TSG101 (Gene ID: 7251), a protein of the ESCRT-I complex enriched in exosomes 2 . HSP90B1 (alias: GPR94, Gene ID: 7184), a molecular chaperone typical of the endoplasmic reticulum, and therefore of the presence of cellular contaminants in the preparation.

[0071] Per la separazione elettroforetica delle proteine e l' ibridazione Western Blot si utilizza il sistema della BioRad-Laboratories (USA) basato su gel pronti all'uso (Mini-PROTEAN TGX Stain-Free™ gels) ed un sistema di trasferimento ad alta efficienza (Trans-Blot® Turbo™ Transfer System). Si fa riferimento ai protocolli specifici di tali kit per l'esecuzione dell'esperimento. [0071] For the electrophoretic separation of proteins and Western Blot hybridization the system of BioRad-Laboratories (USA) based on ready-to-use gels (Mini-PROTEAN TGX Stain-Free ™ gels) and a high efficiency (Trans-Blot® Turbo ™ Transfer System). Reference is made to the specific protocols of these kits for carrying out the experiment.

[0072] La presenza delle proteine in esame viene indagata utilizzando degli anticorpi primari specifici e non marcati, su cui si fa reagire un anticorpo secondario marcato con un fluoroforo. Il sistema di rilevazione è quindi di tipo fluorescente; con pari sensibilità è possibile utilizzare anche un metodo basato sulla generazione di un segnale luminescente. [0072] The presence of the proteins under examination is investigated using specific and unlabeled primary antibodies, on which a secondary antibody labeled with a fluorophore is reacted. The detection system is therefore of the fluorescent type; with equal sensitivity it is also possible to use a method based on the generation of a luminescent signal.

DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE EDIMENSIONE DEGLI ESOSOMIDETERMINATION OF THE CONCENTRATION AND SIZE OF THE EXOSOMES

[0073] Il test viene effettuato mediante la tecnologia „Nanoparticle Tracking Analysis“ (NTA). [0073] The test is carried out by means of the "Nanoparticle Tracking Analysis" (NTA) technology.

[0074] Lo strumento NanoSight LM10 (Malvern Instruments) analizzando le proprietà di dispersione della luce e di moto Browniano delle particelle in fase liquida è in grado di determinarne la distribuzione dimensionale e la concentrazione. I campioni di interesse (medium condizionato e prodotti della purificazione) sono stati quindi analizzati con questo strumento, ottenendone il titolo (in particelle/ml) e la distribuzione delle dimensioni (in nm di diametro). Esempi di tracciati NanoSight sono riportati in Figura 8. [0074] The NanoSight LM10 instrument (Malvern Instruments) by analyzing the properties of light scattering and Brownian motion of the particles in the liquid phase is able to determine their size distribution and concentration. The samples of interest (conditioned medium and purification products) were then analyzed with this instrument, obtaining the titer (in particles / ml) and the size distribution (in nm of diameter). Examples of NanoSight tracings are shown in Figure 8.

TEST ELISA PER LA QUANTIFICAZIONE DI TSG101ELISA TEST FOR THE QUANTIFICATION OF TSG101

[0075] La quantificazione degli esosomi contenuti nel medium condizionato iniziale e nei prodotti della purificazione in circuito chiuso è effettuata valutando la concentrazione della proteina TSG101, contenuta all'interno delle vescicole esosomiali, mediante il kit ELISA TSG101 (Sandwich ELISA,LSBio LifeSpan Biosciences Inc, USA). [0075] The quantification of the exosomes contained in the initial conditioned medium and in the closed-circuit purification products is carried out by evaluating the concentration of the TSG101 protein, contained within the exosomal vesicles, by means of the TSG101 ELISA kit (Sandwich ELISA, LSBio LifeSpan Biosciences Inc , USA).

[0076] Il kit, un cosiddetto „sandwich ELISA“, richiede la quantificazione in parallelo dei campioni ignoti e di una curva standard di proteina purificata (fornita nel kit). Fornisce una lettura colorimetrica a 450nm proporzionale alla concentrazione iniziale dei campioni. I dati di assorbanza, dopo trasformazione logaritmica, sono utilizzati per tracciare la curva standard e per inferire la concentrazione della proteina TSG101 nei campioni ignoti, esprimendola in ng/ml.. The kit, a so-called "sandwich ELISA", requires the parallel quantification of the unknown samples and a purified protein standard curve (supplied in the kit). Provides a colorimetric reading at 450nm proportional to the initial concentration of the samples. The absorbance data, after logarithmic transformation, are used to plot the standard curve and to infer the concentration of the TSG101 protein in the unknown samples, expressing it in ng / ml.

[0077] Esempi di risultati ottenuti con questo metodo sono riportati in Figura 11 (A, B, C) (ng totali TSG101 = ng/ml * ml campione). ;QUANTIFICAZIONE DELLE PROTEINE TOTALI;[0078] La quantificazione delle proteine totali, nel medium condizionato iniziale e nei prodotti della purificazione con sistema chiuso, può essere fatta con vari kit commerciali; in particolare è stato abbiamo adottato il kit QuantiPro™ BCA Assay Kit (Sigma-Aldrich Chemie GmbH). ;[0079] I campioni da quantificare, diluiti in acqua o tal quali, sono incubati con i reagenti del kit per il tempo necessario allo sviluppo di una reazione colorimetrica. La lettura dell'assorbanza a 562 nm del campione è proporzionale alla quantità di proteine contenute, e, comparata con una curva di standard a quantità nota, permette di ottenere il contenuto totale cercato espresso in µg/ml. ;[0080] Esempi di risultati ottenuti con questo metodo sono riportati in Figura 11 (A, B, C) (µg totali Proteine Totali = µg/ml * ml campione). [0077] Examples of results obtained with this method are reported in Figure 11 (A, B, C) (total ng TSG101 = ng / ml * ml sample). QUANTIFICATION OF TOTAL PROTEINS The quantification of total proteins, in the initial conditioned medium and in the products of the closed system purification, can be done with various commercial kits; in particular we adopted the QuantiPro ™ BCA Assay Kit (Sigma-Aldrich Chemie GmbH). [0079] The samples to be quantified, diluted in water or as such, are incubated with the kit reagents for the time necessary for the development of a colorimetric reaction. The absorbance reading at 562 nm of the sample is proportional to the quantity of proteins contained, and, compared with a standard curve with a known quantity, it allows to obtain the total content sought expressed in µg / ml. [0080] Examples of results obtained with this method are reported in Figure 11 (A, B, C) (µg total Total Proteins = µg / ml * ml sample).

ANALISI IMMUNOFENOTIPICA DEGLI ESOSOMIIMMUNOPHENOTYPAL ANALYSIS OF EXOSOMES

[0081] Per la caratterizzazione delle molecole espresse sulla superficie degli esosomi è stato utilizzato il MACSPlex Exosome Kit (Miltenyi biotec), che permette l'analisi di 37 epitopi superficiali grazie ad una combinazione di biglie, caratterizzate da diversa specificità di legame e diverse intensità di fluorescenza, ed un reagente di rilevamento. Questo kit è stato utilizzato seguendo le istruzioni del produttore. In breve, gli esosomi vengono incubati con le biglie a cui si legheranno se esprimono specifici epitopi. Contemporaneamente viene aggiunto anche il reagente di rilevamento, che andrà a legarsi agli esosomi che a loro volta sono stati „catturati“ dalle biglie. Questi complessi, formati da biglie-esosomi-reagente di rilevamento, possono essere analizzati tramite un citofluorimetro a flusso in base alle caratteristiche di fluorescenza delle biglie e del reagente di rilevamento. Segnali positivi nei diversi gruppi di biglie indicano la presenza del corrispettivo epitopo di superficie sugli esosomi. [0081] The MACSPlex Exosome Kit (Miltenyi biotec) was used for the characterization of the molecules expressed on the surface of the exosomes, which allows the analysis of 37 surface epitopes thanks to a combination of beads, characterized by different binding specificities and different intensities fluorescence, and a detection reagent. This kit was used following the manufacturer's instructions. In short, the exosomes are incubated with the beads they will bind to if they express specific epitopes. At the same time, the detection reagent is also added, which will bind to the exosomes which in turn have been "captured" by the marbles. These bead-exosome-detection reagent complexes can be analyzed by a flow cytometer based on the fluorescence characteristics of the beads and the detection reagent. Positive signals in the different groups of beads indicate the presence of the corresponding surface epitope on the exosomes.

TEST DI VALUTAZIONE FUNZIONALE DEGLIESOSOMIFUNCTIONAL EVALUATION TEST OF DEGLIESOSOMES

[0082] Diversi test in vitro possono essere utilizzati per avere un'indicazione dell'attività cardioprotettiva degli esosomi. Questi test prevedono l'utilizzo di cellule miocardiche, che vengono trattate in modo da mimare il danno cellulare da infarto miocardico, e di sostanze in grado di rilevare la vitalità e/o il livello di apoptosi di queste cellule. Nel nostro laboratorio abbiamo sviluppato un test funzionale in cui la vitalità di CPC umane, trattate con staurosporina (un antibiotico che induce apoptosi inibendo le protein kinasi cellulari) in un medium povero di nutrienti, viene rilevata attraverso l'aggiunta di calceina e propidio ioduro. Aggiungendo gli esosomi a queste colture è possibile avere una stima della loro attività protettiva verso l'apoptosi. Alla fine della coltura la vitalità cellulare viene stimata attraverso un derivato non fluorescente della calceina, che può essere trasportato all'intemo della membrana cellulare delle cellule vive dove viene trasformato in calceina fluorescente, e il propidio ioduro (PI), un altro composto fluorescente che può oltrepassare solo le membrane di cellule danneggiate dove si intercala nel DNA. [0082] Several in vitro tests can be used to have an indication of the cardioprotective activity of the exosomes. These tests involve the use of myocardial cells, which are treated to mimic the cell damage caused by myocardial infarction, and of substances capable of detecting the viability and / or the level of apoptosis of these cells. In our laboratory we have developed a functional test in which the viability of human CPCs, treated with staurosporine (an antibiotic that induces apoptosis by inhibiting cellular protein kinases) in a nutrient-poor medium, is detected through the addition of calcein and propidium iodide. By adding exosomes to these cultures it is possible to have an estimate of their protective activity towards apoptosis. At the end of the culture, cell viability is estimated through a non-fluorescent derivative of calcein, which can be transported into the cell membrane of living cells where it is transformed into fluorescent calcein, and propidium iodide (PI), another fluorescent compound that it can only pass through the membranes of damaged cells where it intercalates in DNA.

[0083] Le CPC sono piastrate 24 ore prima dell'inizio del test in piastre 96 well in terreno completo. All'inizio del test la piastra è lavata e le cellule vengono trattate con la staurosporina in medium povero di nutrienti, con o senza l'aggiunta di esosomi precedentemente quantificati al Nanosight. Dopo 16 ore a 37°C, calceina e/o PI vengono somministrati alle cellule e la loro fluorescenza viene rilevata tramite lettore di piastre (Infinite F200 Pro, Tecan Trading AG, Switzerland) dopo mezz'ora di incubazione a 37°C. The CPCs are plated 24 hours prior to the start of the test in 96 well plates in complete medium. At the start of the test the plate is washed and the cells are treated with staurosporin in nutrient-poor medium, with or without the addition of previously quantified exosomes to the Nanosight. After 16 hours at 37 ° C, calcein and / or PI are administered to the cells and their fluorescence is detected by a plate reader (Infinite F200 Pro, Tecan Trading AG, Switzerland) after half an hour of incubation at 37 ° C.

[0084] Un esempio di risultati ottenuti con questo test è riportato in Figura 12. [0084] An example of results obtained with this test is reported in Figure 12.

Considerazioni finaliFinal remarks

[0085] La presente invenzione mostra in Figura 2 immagini di colture ottenute da un tessuto cardiaco rappresentativo e dimostra che in condizioni pre-GMP è possibile isolare ed espandere in coltura CPC con caratteristiche morfologiche simili. Rispetto alle CPC „grado ricerca“, le CPC „pre-GMP“ al passaggio 1 hanno dimensioni cellulari ridotte e crescono più attivamente. [0085] The present invention shows in Figure 2 images of cultures obtained from a representative heart tissue and demonstrates that under pre-GMP conditions it is possible to isolate and expand CPCs with similar morphological characteristics in culture. Compared to the "research grade" CPCs, the "pre-GMP" CPCs in step 1 have a smaller cell size and grow more actively.

[0086] Inoltre come dimostrato dagli esperimenti riportati in figura 3 la resa cellulare (numero medio di CPC ottenute alla prima raccolta, 5 esperimenti) è in genere maggiore in condizioni „pre-GMP“ rispetto alla condizione „grado ricerca“. [0086] Furthermore, as demonstrated by the experiments shown in Figure 3, the cell yield (average number of CPCs obtained at the first collection, 5 experiments) is generally higher in "pre-GMP" conditions than in the "research grade" condition.

[0087] Vantaggiosamente, come mostrato in figura 4, in condizioni „pre-GMP“ la crescita delle CPC è più rapida e le cellule possono essere mantenute in coltura più a lungo rispetto alla condizione „grado ricerca“. In tutte le condizioni, le CPC ottenute alla prima raccolta mostrano crescita più rapida rispetto a quelle delle raccolte successive. [0087] Advantageously, as shown in Figure 4, under "pre-GMP" conditions the growth of the CPCs is faster and the cells can be kept in culture longer than in the "research grade" condition. Under all conditions, the CPCs obtained at the first harvest show faster growth than those from subsequent collections.

[0088] In figura 5 vengono mostrati i tempi di duplicazione delle CPC ottenute dalla prima raccolta e si può notare che i tempi di duplicazione sono significativamente inferiori in condizioni „pre-GMP“ rispetto alla condizione „ricerca“. [0088] Figure 5 shows the duplication times of the CPCs obtained from the first collection and it can be seen that the duplication times are significantly lower in "pre-GMP" conditions than in the "research" condition.

[0089] La Figura 6 mostra che le CPC isolate ed espanse in condizioni „pre-GMP“ (sia STEMMACS CELL START che STEMMACS SYNTHEMAX), come quelle isolate ed espanse in condizione „ricerca“ (IMDM-FBS GELATIN) esprimono marcatori tipici di cellule staminali mesenchimali (CD105, CD73, CD90 variabile), mentre sono negative per marcatori della linea emopoietica (CD14, CD20, CD34, CD45). L'espressione viene mantenuta durante la produzione di esosomi. [0089] Figure 6 shows that CPCs isolated and expanded in "pre-GMP" conditions (both STEMMACS CELL START and STEMMACS SYNTHEMAX), as well as those isolated and expanded in "research" condition (IMDM-FBS GELATIN) express typical markers of mesenchymal stem cells (CD105, CD73, CD90 variable), while they are negative for markers of the hematopoietic lineage (CD14, CD20, CD34, CD45). Expression is maintained during the production of exosomes.

[0090] La Figura 7 mostra che le CPC isolate ed espanse in condizioni „pre-GMP“ (sia STEMMACS CELL START che STEMMACS SYNTHEMAX), come quelle isolate ed espanse in condizione „ricerca“ (IMDM-FBS GELATIN) esprimono fattori di trascrizione mesodermici (TBX-5, TBX-18) e cardio-specifici (GATA-4, MESP-1). L'espressione viene mantenuta durante la produzione di esosomi. [0090] Figure 7 shows that CPCs isolated and expanded under "pre-GMP" conditions (both STEMMACS CELL START and STEMMACS SYNTHEMAX), as well as those isolated and expanded under "research" conditions (IMDM-FBS GELATIN) express transcription factors mesodermal (TBX-5, TBX-18) and cardio-specific (GATA-4, MESP-1). Expression is maintained during the production of exosomes.

[0091] La Figura 8 mostra i profili NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) di esosomi prodotti da CPC di un donatore rappresentativo, isolate ed espanse nelle diverse condizioni. I profili ottenuti in condizioni „pre-GMP“ (sia STEMMACS CELL START che STEMMACS SYNTHEMAX) sono più omogenei di quelli ottenuti in condizione „ricerca“ (IMDM-FBS GELATIN), indicando un miglioramento della qualità del prodotto. Figure 8 shows NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) profiles of exosomes produced by CPC from a representative donor, isolated and expanded under different conditions. The profiles obtained under "pre-GMP" conditions (both STEMMACS CELL START and STEMMACS SYNTHEMAX) are more homogeneous than those obtained under "research" conditions (IMDM-FBS GELATIN), indicating an improvement in product quality.

[0092] La figura 9 indica che gli esosomi da CPC isolate ed espanse sia in condizione „ricerca“ che in condizioni „pre-GMP“ (sia STEMMACS/CELLSTART sia STEMMACS/SYNTHEMAX) inibiscono significativamente l'apoptosi indotta da Staurosporina in cardiomiociti. Figure 9 indicates that isolated and expanded CPC exosomes in both "research" and "pre-GMP" conditions (both STEMMACS / CELLSTART and STEMMACS / SYNTHEMAX) significantly inhibit Staurosporin-induced apoptosis in cardiomyocytes.

[0093] La condizione STEMMACS/CELLSTART è stata selezionata per i successivi esperimenti in quanto più efficiente nel supportare l'adesione dei frammenti di tessuto nella fase iniziale del processo, un'osservazione in linea con la tendenza ad una resa cellulare maggiore (Figura 3) rispetto alla condizione STEMMACS/SYNTHEMAX. The STEMMACS / CELLSTART condition was selected for subsequent experiments as it is more efficient in supporting adhesion of tissue fragments early in the process, an observation consistent with the trend towards higher cell yield (Figure 3 ) with respect to the STEMMACS / SYNTHEMAX condition.

[0094] Si è quindi voluto valutare se il substrato CELLSTART sia necessario durante tutta la fase di espansione cellulare o solo nella fase iniziale di isolamento di CPC. La figura 10 mostra che CPC isolate in STEMMACS/CELLSTART possono essere espanse sia continuando ad utilizzare CELLSTART (pannelli A, B, C, cellule ottenute da 3 donatori rappresentativi), sia trasferendole in fiasche CELLBIND (pannelli D, E, F, cellule ottenute dagli stessi 3 donatori). [0094] We therefore wanted to evaluate whether the CELLSTART substrate is necessary during the whole cell expansion phase or only in the initial phase of CPC isolation. Figure 10 shows that CPCs isolated in STEMMACS / CELLSTART can be expanded either by continuing to use CELLSTART (panels A, B, C, cells obtained from 3 representative donors), or by transferring them into CELLBIND flasks (panels D, E, F, cells obtained from the same 3 donors).

[0095] Il medium condizionato contenente gli esosomi è stato chiarificato mediante centrifugazione e/o filtrazione (0.22 µm) per rimuovere frammenti cellulari, quindi concentrato mediante filtrazione diretta con Amicon Ultra-15 o Centricon Plus 70 100 kDa (Merck Millipore) oppure mediante filtrazione tangenziale con modulo a fibra cava UFP-300-C-2U e sistema AktaFlux (GE Healthcare), effettuando via via uno scale up del processo, da 10-15 mL (corrispondenti a circa 150-200 ng totali di TSG101) a 0.5L di CM (corrispondenti a circa 2500 ng totali di TSG101). Come controlli di processo sono stati utilizzati test per la quantificazione della proteina esosomale TSG-101 (ELISA) e delle proteine totali (v. capitolo metodi analitici). The conditioned medium containing the exosomes was clarified by centrifugation and / or filtration (0.22 µm) to remove cell fragments, then concentrated by direct filtration with Amicon Ultra-15 or Centricon Plus 70 100 kDa (Merck Millipore) or by filtration tangential with hollow fiber module UFP-300-C-2U and AktaFlux system (GE Healthcare), gradually scaling up the process, from 10-15 mL (corresponding to approximately 150-200 ng total of TSG101) to 0.5L of CM (corresponding to approximately 2500 ng total of TSG101). As process controls, tests for the quantification of TSG-101 exosomal protein (ELISA) and total proteins were used (see chapter on analytical methods).

[0096] La figura 11 riporta i risultati in termini di TSG101 e Proteine Totali pre- e post-concentrazione. Si osserva in tutti i casi una resa maggiore per TSG101 che per Proteine Totali, ciò indica che il processo è in grado di concentrare gli esosomi e rimuovere contaminanti proteici di dimensioni inferiori al cut-off utilizzato, con conseguente incremento della purezza, come indicato dal rapporto TSG101/Proteine Totali (Figura 11 D). La Figura 12 dimostra che gli esosomi concentrati sono in grado di proteggere dall'apoptosi CPC in coltura dall'apotosi indotta da staurosporina (per i dettagli del test v. capitolo metodi analitici). [0096] Figure 11 reports the results in terms of TSG101 and Total Proteins pre- and post-concentration. In all cases, a higher yield is observed for TSG101 than for Total Proteins, this indicates that the process is able to concentrate the exosomes and remove protein contaminants smaller than the cut-off used, with a consequent increase in purity, as indicated by the TSG101 / Total Protein ratio (Figure 11 D). Figure 12 demonstrates that concentrated exosomes are able to protect against CPC apoptosis in culture from staurosporine-induced apotosis (for details of the test see chapter Analytical methods).

Considerazioni generali sui metodi di produzione e controlloqualità sopra descrittiGeneral considerations on the methods of production and quality control described above

[0097] Vantaggi: processo integrato che copre tutte le fasi, dalla manipolazione del tessuto di partenza al prodotto medicinale finale; utilizzo di reagenti e sistemi di coltura di alta qualità (assenza di reagenti o materiali di origine animale), strategia di controllo volta ad assicurare la massima qualità per tutti i passaggi e per il prodotto medicinale; coltura CPC su larga scala (da singola biopsia ≥ 500E6 cellule); sistema di produzione di elevata quantità di medium condizionato contente esosomi (fino a 8L per lotto; volumi maggiori con l'utilizzo di un bioreattore); sistema chiuso di purificazione degli esosomi che comprenda almeno i seguenti passaggi: chiarificazione del medium condizionato, concentrazione (TFF) su cartuccia di fibra cava/cassette con membrana (a cut-off definito), diafiltrazione, eventuale filtrazione finale. Nel processo di purificazione qui descritto potrebbero essere integrati ulteriori passaggi basati ad esempio sull'utilizzo di colonne per cromatografia. [0097] Advantages: integrated process covering all stages, from handling the starting tissue to the final medicinal product; use of high quality reagents and culture systems (absence of reagents or materials of animal origin), control strategy aimed at ensuring the highest quality for all steps and for the medicinal product; large-scale CPC culture (from single biopsy ≥ 500E6 cells); system for the production of high quantities of conditioned medium containing exosomes (up to 8L per lot; larger volumes with the use of a bioreactor); closed exosome purification system that includes at least the following steps: clarification of the conditioned medium, concentration (TFF) on hollow fiber cartridge / cassette with membrane (with defined cut-off), diafiltration, eventual final filtration. In the purification process described here, further steps could be integrated based for example on the use of chromatography columns.

[0098] La generazione di una banca cellulare (MCB) permette la produzione successiva di molteplici lotti di esosomi equivalenti tra loro, e quindi la possibilità di trattare, in un contesto allogenico, gruppi di pazienti ad alta numerosità (es. fasi cliniche avanzate o successivo mercato). [0098] The generation of a cell bank (MCB) allows the subsequent production of multiple batches of exosomes equivalent to each other, and therefore the possibility of treating, in an allogeneic context, large groups of patients (e.g. advanced clinical phases or next market).

[0099] Questo tipo di processo potrebbe essere applicato non solo ad esosomi derivati da CPC ma anche ad esosomi prodotti da altri tipi cellulari in coltura (quali ad esempio cellule staminali mesenchimali, cellule muscolari, fibroblasti, cellule del sistema nervoso, cellule dendritiche etc), per diversi impieghi terapeutici. [0099] This type of process could be applied not only to exosomes derived from CPC but also to exosomes produced by other cell types in culture (such as for example mesenchymal stem cells, muscle cells, fibroblasts, nervous system cells, dendritic cells, etc.) , for various therapeutic uses.

[0100] Il dispositivo e metodo di produzione e purificazione di esosomi così concepiti sono suscettibili di numerose modifiche e varianti tutte rientranti nell'ambito del concetto inventivo descritto e rivendicato. [0100] The device and method for producing and purifying exosomes thus conceived are susceptible of numerous modifications and variations, all of which are within the scope of the inventive concept described and claimed.

Claims

1. Device (1) for the production and purification of exosomes from progenitor cells characterized in that it comprises a closed and sterile circuit having pumping means (9, 10) and a plurality of processing stations (2,3,4,5, 7,8,11,12) connected serially in which - a first processing station (2) comprises a first culture medium containing said progenitor cells which are cultured for the production of said exosomes; - a second processing station (3) comprises a second medium conditioned by the exosomes produced in the first processing station; - a third processing station (4) comprises filtering means for the clarification of said conditioned medium; - a fourth processing station (5) comprises one or more hollow fiber cartridges (6) for the concentration of the conditioned medium clarified by cross-flow filtration and means for the recirculation of the concentrated medium for its subsequent concentration; - a fifth processing station (12) comprises a formulation buffer for diluting the concentrated medium; - a sixth processing station (7) comprises waste material in output from said fourth processing station (5); - a seventh processing station (8) comprises means for collecting the concentrated-diafiltered medium containing the purified exosomes; - an eighth processing station (11) comprises storage means for said purified exosomes.

2. Device (1) for producing and purifying exosomes from progenitor cells according to the preceding claim, characterized in that said pumping means (9,10) comprise at least one peristaltic or diaphragm pump.

Device (1) for the production and purification of exosomes from progenitor cells according to one of the preceding claims characterized by the fact that said progenitor cells are cardiac progenitor cells.

4. Device (1) for the production and purification of exosomes from progenitor cells according to one of the preceding claims characterized in that said second processing station (3) comprises a collection bag of said medium conditioned by said exosomes, said fourth processing station (5) comprises a collection bag for said clarified conditioned medium, said fifth processing station (12) comprises a bag sterile connected to said formulation pad, said sixth processing station (7) comprises a bag for collecting waste material and said seventh processing station (8) comprises a bag for collecting said purified exosomes.

5. Device (1) for producing and purifying exosomes from progenitor cells according to one of the preceding claims, characterized in that said recirculation means (10) comprise at least one peristaltic or membrane pump.

6. Device (1) for the production and purification of exosomes from progenitor cells according to one of the preceding claims characterized in that said hollow fibers (6) have a cut-off comprised between 100 and 500 kDa.

7. Device (1) for the production and purification of exosomes from progenitor cells according to the previous claim characterized in that said hollow fibers (6) have a cut-off equal to 300 kDa.

8. Device (1) for the production and purification of exosomes from progenitor cells according to one of the preceding claims characterized in that said storage means comprise vials in polymer resistant to cryogenic temperatures.

9. Method for the production and purification of exosomes from progenitor cells characterized in that it is carried out in a closed and sterile system and includes the following steps: - a step of producing a conditioned medium containing said exosomes by culturing said progenitor cells in a first culture medium; a step of clarification of said conditioned medium by passing in series over a plurality of filters; - a phase of collecting the clarified conditioned medium; - a phase of concentration of the conditioned medium by cross-flow filtration on hollow fiber cartridges with a cut-off between 100 and 500 kDa; - a recirculation step of said conditioned medium filtered for its greater concentration; - a phase of rejecting the particulate material having dimensions smaller than the cut-off of the hollow fiber cartridge; - a step of diafiltration of said concentrated medium on a hollow fiber column with cut-off between 100 and 500 kDa by sterile connection with a formulation pad; - a recovery step of the concentrated-diafiltered medium containing purified exosomes - a storage phase of said purified exosomes in suitable containers.

10. Method for the production and purification of exosomes from progenitor cells according to the preceding claim characterized in that it comprises a further sterilizing filtration step by inserting a filter before the storage step of said purified exosomes.

11. Method for the production and purification of exosomes from progenitor cells according to one of claims 9 or 10 characterized in that during said phase of production of the conditioned medium the progenitor cells are incubated for one week at 37 ° C and at 5% of CO2 .