CH693953A5

CH693953A5 - Enriching protein-containing liquids, comprises diluting liquids before enrichment in five to ten times excess of solution

Info

Publication number: CH693953A5
Application number: CH01721/02A
Authority: CH
Inventors: Ulrich Schneider
Original assignee: Tecan Trading Ag
Priority date: 2002-10-15
Filing date: 2002-10-15
Publication date: 2004-05-14

Abstract

Enriching protein-containing liquids comprises diluting the liquids before enrichment in a five to ten times excess of a solution. An Independent claim is also included for a solution for diluting protein-containing liquids.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Anreichern von Proteinlösungen durch hydrophile Wechselwirkungschromatographie (HILIC). Die Erfindung betrifft des Weiteren eine Lösung zum Verdünnen von proteinhaltigen Flüssigkeiten zur Durchführung des Verfahrens. The invention relates to a method for enriching protein solutions by means of hydrophilic interaction chromatography (HILIC). The invention further relates to a solution for diluting protein-containing liquids for carrying out the method.

Die hydrophile Wechselwirkungschromatographie (Hydrophilic-Interaction Liquid Chromatography, im Folgenden HILIC genannt), hat sich in letzter Zeit als ein hocheffizientes Verfahren für die Abtrennung einer Vielzahl von gelösten Stoffen bewährt (vgl. Alpert, A.J., "Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC): A New Method for Separation of Peptides, Nucleic Acids and Other Polar Solutes", J. Chromatogr. 499 , 177-196 (1990)). Insbesondere eignet sich dieses Verfahren, das hydrophile stationäre Phasen und hydrophobe, meist organische mobile Phasen kombiniert, zur Trennung von Biomolekülen wie bspw. Proteinen und dgl. Hydrophilic interaction chromatography (hereinafter referred to as HILIC) has recently proven to be a highly efficient method for the separation of a large number of solutes (cf. Alpert, AJ, "Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC): A New Method for Separation of Peptides, Nucleic Acids and Other Polar Solutes ", J. Chromatogr. 499, 177-196 (1990)). This method, which combines hydrophilic stationary phases and hydrophobic, mostly organic, mobile phases, is particularly suitable for separating biomolecules, such as proteins and the like.

Die Abtrennung durch HILIC beruht, in ähnlicher Weise wie bei der Normalphasen-Chromatographie (Normal-Phase Chromatographyl), auf hydrophilen Wechselwirkungen zwischen den gelösten Stoffen und der hydrophilen stationären Phase. The separation by HILIC is based, in a manner similar to normal phase chromatography (normal phase chromatography), on hydrophilic interactions between the solutes and the hydrophilic stationary phase.

HILIC trennt Verbindungen durch Hindurchleiten einer hydrophoben oder hauptsächlich organischen mobilen Phase durch eine neutrale hydrophile stationäre Phase auf, was die Verbindungen dazu veranlasst, in der Reihenfolge steigender Hydrophilität eluiert zu werden. HILIC stellt insofern das Gegenteil zur Reversed-Phase-Chromatography dar. HILIC separates compounds by passing a hydrophobic or mainly organic mobile phase through a neutral hydrophilic stationary phase, causing the compounds to be eluted in order of increasing hydrophilicity. In this respect, HILIC is the opposite of reversed-phase chromatography.

Mithilfe von HILIC lasen sich vor allem polare Substanzen trennen, das Verfahren ist bereits erfolgreich auf Phosphopeptide, Rohextrakte, Membranproteine, Carbohydrate, Histone, Oligonukleotide, polare Lipide und dgl. angewandt worden. With the help of HILIC, above all, polar substances can be separated, the method has already been successfully applied to phosphopeptides, crude extracts, membrane proteins, carbohydrates, histones, oligonucleotides, polar lipids and the like.

So beschreiben bspw. H. Lindner et al., "Separa-tion of acetylated core histones by hydrophilic-interaction liquid chromatography", J. Chromatogr. A, 743 , 137-144 (1996) und "Application of hydrophilic-interaction liquid chromatography to the Separa-tion of phosphorylated H1 histones", J. Chromatogr. A, 782 , 55-62 (1997) die analytische und semi-präparative Isolierung von Histonen. For example, H. Lindner et al., "Separation of acetylated core histones by hydrophilic-interaction liquid chromatography", J. Chromatogr. A, 743, 137-144 (1996) and "Application of hydrophilic-interaction liquid chromatography to the separation of phosphorylated H1 histones", J. Chromatogr. A, 782, 55-62 (1997) the analytical and semi-preparative isolation of histones.

Als Säulenmaterial wird vor allem Polyhydroxy-ethyl-Aspartamid (HEA) verwendet, das die gelösten Stoffe lediglich durch hydrophile Wechselwirkungen zurückhält, wenn Konzentrationen der mobilen Phase im Bereich von 40-85% Acetonitril verwendet werden. The main column material used is polyhydroxy-ethyl-aspartamide (HEA), which only retains the solutes through hydrophilic interactions when concentrations of the mobile phase in the range of 40-85% acetonitrile are used.

Falls nötig werden proteinhaltige Flüssigkeiten vor der Anreicherung in eine Vielzahl von Fraktionen aufgetrennt. Eine Möglichkeit dieser Auftrennung ist die Free Flow Elektrophorese (FFE), bei der die Proteine in einem elektrischen Feld entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt, d.h., ihrer Mobilität, separiert werden. Auf diese Weise ist es möglich, den gesamten Proteingehalt eines Gewebes oder einer Zelle (eukariotisch, prokariotisch) bzw. subzellulare Fraktionen (zellulare Organelle) in weniger komplexe Fraktionen aufzuteilen, die dann weiter analysiert werden können. If necessary, protein-containing liquids are separated into a large number of fractions before enrichment. One possibility of this separation is free flow electrophoresis (FFE), in which the proteins are separated in an electrical field according to their isoelectric point, i.e. their mobility. In this way it is possible to divide the total protein content of a tissue or a cell (eukaryotic, procaryotic) or subcellular fractions (cellular organelles) into less complex fractions, which can then be further analyzed.

Obwohl diese Methode gut geeignet ist, Mischungen in diskrete Fraktionen aufzutrennen, ergeben sich Nachteile. Das in den FFE-Fraktionen vorhandene Material ist auf Grund der dem Prozess innewohnenden Merkmale stark verdünnt, was die Analyse von Proben erschwert, die vorgängig nicht konzentriert wurden. So können bspw. Proteine, die nur in sehr geringen Mengen vorhanden sind, für weitere analytische Schritte verloren gehen. Weiterhin weist das FFE-Trennmedium oftmals Substanzen auf, die vor einer weiteren Analyse entfernt werden müssen, um Interferenzen zu vermeiden. Ein Beispiel für solche Substanzen sind Detergenzien, die nicht in die Chromatographiesysteme gelangen dürfen. Although this method is well suited for separating mixtures into discrete fractions, there are disadvantages. The material present in the FFE fractions is greatly diluted due to the characteristics inherent in the process, which makes it difficult to analyze samples that were not previously concentrated. For example, proteins that are only present in very small quantities can be lost for further analytical steps. Furthermore, the FFE separation medium often has substances that must be removed before further analysis to avoid interference. An example of such substances are detergents that must not get into the chromatography systems.

Des Weiteren wird die Verarbeitung von FFE-Proben durch die o.g. Verfahren oftmals durch einen niedrigen Durchsatz, fehlende Reproduzierbarkeit, zweifelhafte Rückgewinnung und die fehlende Rückgewinnung von Proteinen mit geringer Häufigkeit behindert. Furthermore, the processing of FFE samples by the above Processes often hampered by low throughput, lack of reproducibility, dubious recovery and lack of protein recovery with low frequency.

Ausserdem ist die Benutzung von Festphasen-Extraktions-Mikrotiter-Platten (Solid Phase Extraction Plate-SPE-96 Vertiefungen) durch die Unterschiede der Fliessgeschwindigkeiten zwischen individuellen Vertiefungen innerhalb einer Platte begrenzt, was zu einem Austrocknen von Vertiefungen bei einer Fliessgeschwindigkeit führt, die höher als das Mittel ist. Dies wiederum führt zu einer irreversiblen Bindung der Proteine an das Material und resultiert daher in einem kompletten Verlust der Probe. Weiterhin kann es zu einem Überlaufen von solchen Vertiefungen bei geringeren Fliessgeschwindigkeiten als das Mittel kommen. In addition, the use of Solid Phase Extraction Plate (SPE-96 wells) is limited by the differences in flow rates between individual wells within a plate, resulting in well drying out at a flow rate higher than the mean is. This in turn leads to an irreversible binding of the proteins to the material and therefore results in a complete loss of the sample. Furthermore, such depressions can overflow at lower flow rates than the agent.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, das es erlaubt, proteinhaltige Flüssigkeiten in praktisch unbegrenztem Ausmass anzureichern, wobei gleichzeitig keine Proteinklassen verloren gehen. The object of the invention is to provide a method which allows protein-containing liquids to be enriched to an almost unlimited extent, with no protein classes being lost at the same time.

Diese Aufgabe wird gemäss den Merkmalen des Anspruchs 14 gelöst, indem die proteinhaltige Flüssigkeit vor dem Anreichern in einem zehnfachen Überschuss einer Lösung verdünnt wird, die einen Alkohol, eine Carbonsäure, ein Halogenid und ein Halogen-2-Propanol-Derivat enthält. This object is achieved in accordance with the features of claim 14 by diluting the protein-containing liquid in a ten-fold excess of a solution which contains an alcohol, a carboxylic acid, a halide and a halogen-2-propanol derivative before the enrichment.

Zusätzliche und weiterführende erfinderische Merkmale ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen. Additional and further inventive features result from the dependent claims.

Die folgenden schematischen Zeichnungen sollen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens erläutern, ohne dass sie den Umfang der Erfindung einschränken sollen. Dabei zeigen: Fig. 1 die Probenbehandlung bei der Verwendung des erfindungsgemässen Verfahrens; und Fig. 2 den Ablauf der Free Flow Elektrophorese (FFE). The following schematic drawings are intended to explain preferred embodiments of the method according to the invention, without being intended to limit the scope of the invention. 1 shows the sample treatment when using the method according to the invention; and FIG. 2 shows the flow of free flow electrophoresis (FFE).

Fig. 1 zeigt schematisch die Probenbehandlung bei der Verwendung der hydrophilen Wechselwirkungschromatographie (HILIC). In einem ersten Schritt 1 wird in einem entsprechenden Experiment die proteinhaltige Probe hergestellt, und diese anschliessend in einem Schritt 2 in Lösung gebracht. Im nächsten Schritt 3 wird diese Lösung in einem fünf- bis zehnfachen Überschuss einer Lösung verdünnt, die einen Alkohol, eine Carbonsäure, ein Halogenid und ein Halogen-2-Propanol-Derivat enthält. Bei dem Alkohol kann es sich um einen aliphatischen primären oder sekundären Alkohol (90%), wie z.B. 1-Propanol, 2-Propanol, Butanol oder Mischungen daraus handeln. Bei der Carbonsäure handelt es sich um eine aliphatische Monocarbonsäure wie bspw. Ameisensäure oder Essigsäure, deren Konzentration im Bereich von ungefähr 1 mM bis ungefähr 1000 mM liegen kann. Bei dem in der Lösung enthaltenen Halogenid handelt es sich entweder um ein Alkali- oder Erdalkalisalz wie bspw. NaCI, KCI, MgCI 2 oder dergleichen, oder um ein Tetraalkylammoniumsalz, wie bspw. [N(CH 3 ) 4 ]Br. Die Konzentration des Halogenids liegt im Bereich von ungefähr 1 mM bis ungefähr 100 mM. Das Halogen-2-Propanol-Derivat kann z.B. Penta- oder Hexafluoro-2-Propanol sein, das in einer Konzentration in einem Bereich von ungefähr 1 mM bis ungefähr 500 mM vorliegt. 1 schematically shows the sample treatment when using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). In a first step 1, the protein-containing sample is produced in a corresponding experiment and this is then brought into solution in a step 2. In the next step 3, this solution is diluted in a five to ten-fold excess of a solution which contains an alcohol, a carboxylic acid, a halide and a halogen-2-propanol derivative. The alcohol can be an aliphatic primary or secondary alcohol (90%), e.g. Act 1-propanol, 2-propanol, butanol or mixtures thereof. The carboxylic acid is an aliphatic monocarboxylic acid such as, for example, formic acid or acetic acid, the concentration of which can be in the range from approximately 1 mM to approximately 1000 mM. The halide contained in the solution is either an alkali or alkaline earth salt such as NaCl, KCI, MgCl 2 or the like, or a tetraalkylammonium salt such as [N (CH 3) 4] Br. The concentration of the halide ranges from about 1 mM to about 100 mM. The halogen-2-propanol derivative can e.g. Penta- or hexafluoro-2-propanol, which is present in a concentration in a range from about 1 mM to about 500 mM.

Eine besonders bevorzugte Zusammensetzung der erfindungsgemässen Lösung enthält 90% 2-Propanol, 200 mM Ameisensäure, 10 mM NaCI und 100 mM Hexafluoro-2-Propanol. Diese Lösung wird auch als "Makeup Fluid" bezeichnet. A particularly preferred composition of the solution according to the invention contains 90% 2-propanol, 200 mM formic acid, 10 mM NaCl and 100 mM hexafluoro-2-propanol. This solution is also referred to as "makeup fluid".

Die Verdünnung mit dem "Makeup Fluid" kann entweder durch direkte Verarbeitung im Gegenstrom oder durch so genannte "Offline"-Verarbeitung stattfinden: Bei Verarbeitung mittels "Offline"-Prozessierung wird die Probe zunächst gesammelt und danach mit der entsprechenden Menge an "Makeup Fluid" versetzt und gemischt. Die Mischung wird dann manuell auf das HILIC-SPE-Material gebracht und die Bindung ermöglicht. Bei Verarbeitung mittels Gegenstrom der FFE (d.h., "Counterflow") wird die Probe direkt mittels Gegenstrom wie oben beschrieben verdünnt, wobei die Zusammensetzung des Gegenstrommediums dem des "Makeup Fluid" entspricht; der Gegenstrom wird in diesem Fall mit dem fünf- bis zehnfachen Volumen der Fraktioniereinheit betrieben. Die Bindung der Biomoleküle erfolgt danach durch ein direktes Durchsaugen der Mischung durch eine mit HEA-HILIC-Material beschickte SPE-Platte. Diese Behandlung garantiert zum einen eine vollständige Löslichkeit der Proteine und zum anderen eine quantitative Bindung der Protein-Spezies an das Harz der Säule oder der SPE-Platte. The dilution with the "makeup fluid" can take place either by direct processing in countercurrent or by so-called "offline" processing: When processing using "offline" processing, the sample is first collected and then with the appropriate amount of "makeup fluid" spiked and mixed. The mixture is then manually applied to the HILIC-SPE material and the binding is made possible. When processed by counterflow of the FFE (i.e., "counterflow"), the sample is diluted directly by means of counterflow as described above, the composition of the counterflow medium corresponding to that of the "makeup fluid"; in this case, the counterflow is operated with five to ten times the volume of the fractionation unit. The biomolecules are then bound by sucking the mixture directly through an SPE plate loaded with HEA-HILIC material. This treatment guarantees on the one hand a complete solubility of the proteins and on the other hand a quantitative binding of the protein species to the resin of the column or the SPE plate.

Obwohl diese stark verdünnte Lösung bereits direkt durch HILIC angereichert werden könnte, ist es in vielen Fällen sinnvoller, die Gesamtlösung einem Fraktionierungsschritt zu unterwerfen, bspw. durch die bereits geschilderte Free Flow Elektrophorese (FFE). Selbstverständlich sind auch andere Fraktionierungsschritte denkbar, die zu diskreten Biomolekülmischungen führen; bei Proteinen sind dies insbesondere: (1) Subzelluläre Fraktionierungen, welche zur Anreicherung von zellulären Kompartimenten, "Organellen" führen, (2) biochemische Fraktionierungsmethoden, die z.B. auf Ionenaustausch-, -Affinitäts-, Umkehrpha sen-, Gelfiltrationschromatographie oder andere chromatographische Verfahren zurückgreifen. Im Folgenden soll jedoch das FFE-Verfahren kurz erläutert werden. Although this highly diluted solution could already be directly enriched by HILIC, in many cases it makes more sense to subject the entire solution to a fractionation step, for example using the free flow electrophoresis (FFE) described above. Of course, other fractionation steps are also conceivable, which lead to discrete biomolecule mixtures; in the case of proteins these are in particular: (1) subcellular fractionations, which lead to the accumulation of cellular compartments, "organelles", (2) biochemical fractionation methods, which e.g. use ion exchange, affinity, reverse phase, gel filtration chromatography or other chromatographic methods. However, the FFE procedure is briefly explained below.

Fig. 2 zeigt schematisch den Ablauf des FFE-Verfahrens. Bei diesem Verfahren fliesst senkrecht zu einem zwischen Anode 10 und Kathode 11 angelegten elektrischen Feld ein kontinuierlicher Pufferfilm 12. An einer Seite der Free Flow-Elektrophoresekammer 13 wird an einer definierten Stelle 14 die Proteinprobe zugeführt. Mithilfe von amphoteren Substanzen, die zusammen mit dem Puffer 12 appliziert werden, bildet sich ein pH-Gradient zwischen den beiden Elektroden senkrecht zur Fliessrichtung des Pufferfilms 12 aus, woraus eine Auftrennung 15 der Proteine auf Grund ihrer Ladung im freien Fluss resultiert (FFE-IEF). Am anderen Ende der Free Flow-Elektrophoresekammer 13 werden die Einzelfraktionen 16 durch eine Reihe von Schläuchen 17 beispielsweise in den einzelnen Vertiefungen einer Mikrotiterplatte 18 aufgesammelt. Fig. 2 shows schematically the sequence of the FFE process. In this method, a continuous buffer film 12 flows perpendicular to an electric field applied between anode 10 and cathode 11. The protein sample is fed to a defined location 14 on one side of the free flow electrophoresis chamber 13. With the aid of amphoteric substances, which are applied together with the buffer 12, a pH gradient is formed between the two electrodes perpendicular to the direction of flow of the buffer film 12, which results in a separation 15 of the proteins due to their charge in free flow (FFE-IEF ). At the other end of the free flow electrophoresis chamber 13, the individual fractions 16 are collected through a series of tubes 17, for example in the individual wells of a microtiter plate 18.

Die FFE-Probenahme erfolgt entweder durch "Offline-Fraktionierung" in entsprechende Röhrchen oder durch direkte Fraktionierung in eine 96er-SPE-Mikrotiterplatte und "Online-Abgabe" der Probe durch die Platte mittels einer Vakuumvorrichtung. Die SPE-Platte enthält typischerweise Vertiefungen mit 10 bis 300 mg Polyhydroxyethyl-aspartamid (HEA) oder jedem anderen Material, das in der Lage ist, hydrophile Wechselwirkungen zu zeigen. Das sphärische Material in den Vertiefungen weist typischerweise einen Durchmesser von etwa 12 bis 30 mu m bei einer Porengrösse von 300 bis 1500 auf. The FFE sampling is carried out either by "offline fractionation" into appropriate tubes or by direct fractionation into a 96 SPE SPE microtiter plate and "online delivery" of the sample through the plate using a vacuum device. The SPE plate typically contains wells of 10 to 300 mg polyhydroxyethyl aspartamide (HEA) or any other material that is capable of showing hydrophilic interactions. The spherical material in the depressions typically has a diameter of approximately 12 to 30 μm with a pore size of 300 to 1500.

Wiederum Bezug nehmend auf Fig. 1 werden die in Schritt 4 durch FFE erhaltenen Fraktionen in einem Schritt 5 an das HILIC-SPE-Material gebunden und angereichert. Das SPE-gebundene Material wird anschliessend in einem Schritt 6 gewaschen und dann aus der HILIC-Säule eluiert bzw. zurückgewonnen (Schritt 7). Die Wiedergewinnung des aufkonzentrierten Materials wird durch eine wässrige, nicht-organische Lösung erreicht. Im Allgemeinen ist jede Lösung zur Rückgewinnung der Proteine bei hohen Konzentrationen verwendbar, die keinerlei organische Lösungsmittel enthält und eine Löslichkeit der Proteine erhält. Ein Aus trocknen der Vertiefungen wird dadurch verhindert, dass in allen Vertiefungen eine "On-line-Flüssigkeitspegel-Detektion" durchgeführt wird. 1, the fractions obtained by FFE in step 4 are bound and enriched in a step 5 to the HILIC-SPE material. The SPE-bound material is then washed in a step 6 and then eluted or recovered from the HILIC column (step 7). The recovery of the concentrated material is achieved by an aqueous, non-organic solution. In general, any solution for recovering the proteins at high concentrations that does not contain any organic solvents and is soluble in the proteins can be used. A drying out of the wells is prevented by performing an "on-line liquid level detection" in all wells.

Auf diese Weise werden in Schritt 8 konzentrierte und gereinigte Fraktionen der Proteinflüssigkeit gewonnen, die dann in einem weiteren Schritt 9 einer nachgeschalteten Analyse, bspw. durch Chromatographie, Gel-Elektrophorese und dgl. zugeführt werden können. In this way, concentrated and purified fractions of the protein liquid are obtained in step 8, which can then be sent to a subsequent analysis in a further step 9, for example by chromatography, gel electrophoresis and the like.

Das erfindungsgemässe Verfahren erlaubt die universelle Anreicherung von Proteinproben, vorzugsweise aus FFE-Fraktionen, unabhängig von ihren physiko-chemischen Eigenschaften, wie z.B. Molekular-gewicht, isoelektrischer Punkt oder Hydrophilie/Hydrophobie. Die Proteine werden auf Grund der Auswahl der erfindungsgemässen Verdünnungslösung in Lösung gehalten. Quantitative Beziehungen bleiben dabei auf Grund der Tatsache, dass das Verfahren keine Selektivität gegenüber bestimmten Proteinklassen besitzt, erhalten. Eine "kompatible Elution" macht die Proben direkt kompatibel mit jeder Art von nachgeschalteter Analytik; "kompatible Elution" bedeutet, dass die Proteine in dem Lösungsmittel/Puffer eluiert werden, welches/r der Ausgangsstoff für die folgende Analytik ist (z.B. Startpuffer für die Umkehrphasenchromatographie, falls die konzentrierte Probe auf diese Art chromatographiert werden soll. The method according to the invention allows the universal enrichment of protein samples, preferably from FFE fractions, regardless of their physico-chemical properties, e.g. Molecular weight, isoelectric point or hydrophilicity / hydrophobicity. The proteins are kept in solution on the basis of the selection of the dilution solution according to the invention. Quantitative relationships are preserved due to the fact that the method has no selectivity towards certain protein classes. A "compatible elution" makes the samples directly compatible with any type of downstream analysis; "Compatible elution" means that the proteins are eluted in the solvent / buffer which is the starting material for the following analysis (e.g. starting buffer for reverse phase chromatography, if the concentrated sample is to be chromatographed in this way.

Im Folgenden wird ein Ausführungsbeispiel für das erfindungsgemässe Verfahren erläutert. An exemplary embodiment of the method according to the invention is explained below.

Zunächst wird ein typisches FFE-Experiment durchgeführt, bei dem die FFE im weiter oben geschilderten IEF-Modus unter denaturierenden Bedingungen gefahren wird. Die Fraktionen (jeweils 1 ml) werden in Mikrotiterplatten (entfernbare 1-ml-Röhrchen) gesammelt. Es ist darauf hinzuweisen, dass jede Art von FFE (Zonenelektrophorese, Isotachophorese, nativ, denaturierend) einsetzbar ist. Das gesammelte Gesamtvolumen kann im Bereich von ungefähr 1 ml bis ungefähr 10 ml liegen. Anschliessend werden die FFE-Fraktionen in einem fünf- bis fünfzehnfachen Überschuss des "Make-up Fluids" verdünnt (bspw. 1 ml FFE in einem Ge samtvolumen von 5 bis 15 ml). Die in dem "Makeup Fluid" gelösten, verdünnten FFE-Fraktionen werden nun auf eine SPE-Platte gegeben. Optional kann an Stelle der SPE-Platte eine Kartusche hergestellt werden, indem eine untere Fritte in eine Patrone eingesetzt wird, anschliessend ungefähr 100 mg in 2-Propanol suspendiertes HEA eingefüllt und schliesslich eine obere Fritte in die Patrone eingesetzt wird. Das HEA wird nun zweimal mit je 1 ml des "Makeup Fluids", 1 ml 200 mM wässriger Ameisensäure und wiederum 1 ml "Makeup Fluid" gewaschen. Nachdem die in "Makeup Fluid" gelösten FFE-Fraktionen auf die Platte oder die Kassette gegeben wurden, können diese durch positiven (Schieben) oder negativen Druck (Saugen) an das Harz gebunden werden. Anschliessend wird die Säule nochmals mit 1 ml "Makeup Fluid" und dann mit zweimal je 1 ml 2-Propanol gewaschen, um noch vorhandene Additive aus vorhergehenden Schritten zu entfernen. Sodann wird das Harz quasi trockengesaugt. Daran anschliessend werden dreimal je 100 mu l einer Eluierungslösung aufgegeben, die keinerlei organisches Lösungsmittel, insbesondere kein 2-Propanol aufweisen darf. Die Zusammensetzung des Eluierungsmittels kann dabei von der Natur der nachgeschalteten Analytik abhängig sein, so wird z.B. bei einer nachgeschalteten Chromatographie der FFE-Fraktionen ein HPLC-Puffer mit geringem organischem Gehalt verwendet werden, während bei nachfolgender 2D Gel-Elektrophorese ein entsprechender 2DE-Probenpuffer verwendet wird. Anschliessend wird das Eluat gesammelt und der nachgeschalteten Analytik zugeführt. First, a typical FFE experiment is carried out, in which the FFE is operated in the IEF mode described above under denaturing conditions. The fractions (1 ml each) are collected in microtiter plates (removable 1 ml tubes). It should be noted that any type of FFE (zone electrophoresis, isotachophoresis, native, denaturing) can be used. The total volume collected can range from about 1 ml to about 10 ml. The FFE fractions are then diluted in a five to fifteen-fold excess of the "make-up fluid" (for example. 1 ml of FFE in a total volume of 5 to 15 ml). The diluted FFE fractions dissolved in the "makeup fluid" are now placed on an SPE plate. Optionally, a cartridge can be produced instead of the SPE plate by inserting a lower frit into a cartridge, then filling approximately 100 mg of HEA suspended in 2-propanol and finally inserting an upper frit into the cartridge. The HEA is now washed twice with 1 ml of the "makeup fluid", 1 ml of 200 mM aqueous formic acid and again 1 ml of "makeup fluid". After the FFE fractions dissolved in "Makeup Fluid" have been added to the plate or the cassette, they can be bound to the resin by positive (pushing) or negative pressure (suction). The column is then washed again with 1 ml of "makeup fluid" and then twice with 1 ml of 2-propanol in order to remove any additives from previous steps. The resin is then sucked dry, so to speak. Then 100 ml of an elution solution are added three times, which must not contain any organic solvent, in particular no 2-propanol. The composition of the eluent can depend on the nature of the downstream analysis, e.g. in a subsequent chromatography of the FFE fractions, an HPLC buffer with a low organic content is used, while in the case of subsequent 2D gel electrophoresis, a corresponding 2DE sample buffer is used. The eluate is then collected and fed to the downstream analysis.

Es kann jede Proteinlösung für das erfindungsgemässe Verfahren verwendet werden, so bspw. zelluläre Extrakte, subzelluläre Fraktionierungen, biochemisch gereinigte Proteine oder synthetische oder natürliche Peptide. Any protein solution can be used for the method according to the invention, for example cellular extracts, subcellular fractionations, biochemically purified proteins or synthetic or natural peptides.

Claims

1. A method for the enrichment of protein-containing liquids by hydrophilic interaction chromatography (HILIC), characterized in that the protein-containing liquid is diluted in a five to ten-fold excess of a solution before the enrichment.

2. The method according to claim 1, characterized in that the protein-containing liquid is subjected to a fractionation step before the enrichment.

3. The method according to claim 2, characterized in that the fractionation step is a free flow electrophoresis (FFE).

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized by the following steps: a) providing a protein-containing liquid, b) diluting the liquid, and c) enriching the diluted liquid by hydrophilic interaction chromatography (HILIC).

5. The method according to claim 4, characterized in that in the enrichment step polyhydroxy-ethyl-aspartamide (HEA) is used.

6. The method according to claim 4 or 5, characterized in that an optional fractionation step is carried out after the dilution of the liquid.

7. The method according to claim 6, characterized in that the fractionation step is a free flow electrophoresis.

8. Solution for diluting protein-containing liquids for use in a process according to one of claims 1 to 7, containing an alcohol, a carboxylic acid, a halide and a halogen-2-propanol derivative.

9. Solution according to claim 8, characterized in that the alcohol is an aliphatic primary or secondary alcohol.

10. Solution according to claim 9, characterized in that the alcohol is selected from the group consisting of 1-propanol, 2-propanol, butanol and mixtures thereof.

11. Solution according to one of claims 8 to 10, characterized in that the carboxylic acid is an aliphatic monocarboxylic acid.

12. Solution according to claim 11, characterized in that the monocarboxylic acid is formic acid or acetic acid.

13. Solution according to one of claims 8 to 12, characterized in that the halide is selected from the group consisting of alkali metal salts, alkaline earth metal salts and tetraalkylammonium salts.

14. Solution according to claim 13, characterized in that the halide is selected from the group consisting of NaCI, KCI, MgCI 2 and [N (CH3) 4] Br.

15. Solution according to one of claims 8 to 14, characterized in that the halogen-2-propanol derivative is penta- or hexafluoro-2-propanol.

16. Solution according to one of claims 8 to 15, characterized in that the concentration of the carboxylic acid is in a range from about 1 mM to about 1000 mM.

17. Solution according to one of claims 8 to 16, characterized in that the concentration of the halide is in a range from about 1 mM to about 100 mM.

18. Solution according to one of claims 8 to 17, characterized in that the concentration of the halogen-2-propanol derivative is in a range from about 1 mM to about 500 mM.

19. Solution according to claim 8, characterized in that it contains 2-propanol, formic acid, NaCl and hexafluoro-2-propanol.

20. Solution according to claim 19, characterized in that it contains 90% 2-propanol, 200 mM formic acid, 10 mM NaCl and 100 mM hexafluoro-2-propanol.