CH684486A5

CH684486A5 - A process for the determination of alkaline phosphatase.

Info

Publication number: CH684486A5
Application number: CH150992A
Authority: CH
Inventors: Regine Dr Schmidt
Original assignee: Fraunhofer Ges Forschung
Priority date: 1991-05-29
Filing date: 1992-05-11
Publication date: 1994-09-30
Also published as: DE4117619A1; DE4117619C2

Description

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Beschreibung description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Alkalischen Phosphatase gemäss dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1. The invention relates to a method for determining the alkaline phosphatase according to the preamble of claim 1.

Die Alkalische Phosphatase (AP) ist ein Enzym, welches im alkalischen Bereich die Spaltung von Estern der Orthophosphorsäure mit verschiedenen Alkoholen und Phenolen katalysiert. Alkaline phosphatase (AP) is an enzyme that catalyzes the cleavage of esters of orthophosphoric acid with various alcohols and phenols in the alkaline range.

Orthophosphorsäuremonoester + H2O ~ Alkohol + o-Phosphat Orthophosphoric acid monoester + H2O ~ alcohol + o-phosphate

Die Alkalische Phosphatase kann ausserdem auch manche Verbindungen mit Phosphorylanhydriden hydrolysieren; z.B. Adenosin-, lnosin- oder Uridintriphosphat bzw. Thiaminpyrophosphat. Weiterhin ist das Enzym in der Lage, eine Reihe von transphosphorylierenden Reaktionen zu katalysieren. Sein pH-Optimium liegt zwischen 9.2 und 9.8 und hängt mit von der Art und Konzentration des Substrates sowie vom Puffer ab. Mg2+-, Mn2+-, Zn2+- und Co2+-lonen aktivieren, Phosphat- und Arsenationen, sowie verschiedene Alkohole und L-Cystein inhibieren das Enzym. Die Alkalische Darmphosphatase wird ausserdem von einigen L-Aminosäuren, z.B. L-Phenylalanin, gehemmt. The alkaline phosphatase can also hydrolyze some compounds with phosphoryl hydrides; e.g. Adenosine, inosine or uridine triphosphate or thiamine pyrophosphate. The enzyme is also able to catalyze a number of transphosphorylating reactions. Its pH-Optimium is between 9.2 and 9.8 and depends on the type and concentration of the substrate as well as on the buffer. Mg2 +, Mn2 +, Zn2 + and Co2 + ions activate, phosphate and arsenate ions, as well as various alcohols and L-cysteine inhibit the enzyme. The alkaline intestinal phosphatase is also used by some L-amino acids, e.g. L-phenylalanine, inhibited.

Das Enzym kommt vor allem dort in Zellmembranen vor, wo aktive Transportvorgänge ablaufen, z.B. im Bürstensaum von Enterozyten und proximalen Tubuluszellen der Niere, in der Membran am Gallepol der Leberzellen, im Kapillar- und Arteriolenendothel. Weiterhin lässt sich die Alkalische Phosphatase z.B. im endoplasmatischen Retikulum, im Golgi-Apparat und in Lysosomen von Enterozyten sowie in den Granula neutrophiler Leukozyten nachweisen. Die Alkalische Phosphatase kommt beispielsweise in der Leber, in den Knochen, im Dünndarm, in den Nieren, in der Galle und in geringem Ausmass in der Placenta vor. Der Anstieg der AP-Aktivität im Plasma hat insbesondere für den Nachweis von Lebererkrankungen und Erkrankungen des Knochenskeletts diagnostische Bedeutung, d.h. die Alkalische Phosphatase kann zur Beurteilung verschiedener Zellarten, wie z.B. von Osteoblasten oder von Knochenmarkszellen, herangezogen werden. The enzyme is mainly found in cell membranes where active transport processes take place, e.g. in the brush border of enterocytes and proximal tubular cells of the kidney, in the membrane at the bile pole of the liver cells, in the capillary and arteriolen endothelium. Furthermore, the alkaline phosphatase e.g. in the endoplasmic reticulum, in the Golgi apparatus and in lysosomes of enterocytes as well as in the granules of neutrophil leukocytes. Alkaline phosphatase occurs, for example, in the liver, in the bones, in the small intestine, in the kidneys, in the bile and to a small extent in the placenta. The increase in AP activity in plasma is of diagnostic importance in particular for the detection of liver diseases and diseases of the bone skeleton, i.e. the alkaline phosphatase can be used to assess different types of cells, e.g. osteoblasts or bone marrow cells.

Die meisten Enzyme, die im Serum bestimmt werden, sind Zell-Enzyme, die im Extrazellular-Raum nur erscheinen, weil die Zellen, in denen sie normalerweise ihre Funktion ausüben, vermehrt durchlässig geworden sind. Es ist selbstverständlich, dass Enzyme, die in hoher Konzentration in einem Organ vorhanden sind, beim Leckwerden der Zellen höhere Spiegel im Plasma erreichen als solche mit geringer Aktivität in den geschädigten Zellen. Somit spiegelt sich das Enzymmuster des erkrankten Organs im Serum wider und es werden beispielsweise erhöhte AP-Spiegel bei Morbus Paget, bei Osteosarkomen, Gelbsucht, Hepatitis und ähnlichen Krankheitsbildern beobachtet. Most of the enzymes that are determined in the serum are cell enzymes that appear in the extracellular space only because the cells in which they normally perform their function have become increasingly permeable. It goes without saying that enzymes which are present in a high concentration in an organ, when the cells leak, reach higher levels in the plasma than those with low activity in the damaged cells. The enzyme pattern of the diseased organ is thus reflected in the serum and, for example, increased AP levels are observed in Paget's disease, in osteosarcomas, jaundice, hepatitis and similar clinical pictures.

Die klinische Chemie sowie die Diagnostik erfordern somit eine einfach zu handhabende und zugleich gut reproduzierbare Methode zur quantitativen Bestimmung der Alkalischen Phosphatase. Diesem Zweck dient in der Regel die direkte photometrische oder fluorometrische Bestimmung von Verbindungen, die durch die AP bewirkte hydrolytische Spaltung aus zugesetzten spezifischen Substraten hervorgegangen sind. Bei den durch die Alkalische Phosphatase freigesetzten Verbindungen handelt es sich in der Regel um chromogene bzw. mesomeriestabilierte Alkohole, insbesondere Phenolderivate, und Phosphatreste. In der Regel werden erstere qualitativ bzw. quantitativ bestimmt. Clinical chemistry and diagnostics therefore require an easy-to-use and at the same time reproducible method for the quantitative determination of alkaline phosphatase. For this purpose, the direct photometric or fluorometric determination of compounds which have resulted from the hydrolytic cleavage caused by the AP from added specific substrates is generally used. The compounds released by the alkaline phosphatase are generally chromogenic or mesomerically stabilized alcohols, in particular phenol derivatives, and phosphate residues. As a rule, the former are determined qualitatively or quantitatively.

Es sind eine Reihe von Verfahren bekannt, bei denen die AP-Aktivitäten in verschiedensten Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise in Blut, Plasma, Serum, Urin oder Speichel bestimmt werden. Z.B. ist aus der DE 3 739 284 A1 ein Verfahren bekannt, bei welchem als zugesetzte spezifische Substrate 1-Naphtholphthaleinmonophosphate verwendet werden. Neben p-Nitrophenylphosphat, Naphthylphospha-ten oder Phenolphthaleindiphosphaten sind aber auch Phenolphthaleinmonophosphorsäureester bzw. deren Salze als AP-Substrate bekannt (US-Patente 3 331 857 und 3 331 862). Diese Verfahren sind jedoch für die Bestimmung der Alkalischen Phosphatase in Körperflüssigkeiten nicht geeignet, da der Nachweis der freigesetzten Phenolphthaleinmenge durch andere in der Probenflüssigkeit vorhandene Verbindungen verfälscht wird. Zahlreiche Serumbestandteile, wie beispielsweise Bilirubin haben wie die erwähnten, aus den AP-Substraten freigesetzten Phenolate ein Absorptionsmaximum bei ca. 400-450 nm. A number of methods are known in which the AP activities are determined in a wide variety of body fluids, such as in blood, plasma, serum, urine or saliva. E.g. DE 3 739 284 A1 discloses a process in which 1-naphtholphthalein monophosphates are used as the specific substrates added. In addition to p-nitrophenyl phosphate, naphthyl phosphate or phenolphthalein diphosphates, phenolphthalein monophosphoric acid esters or their salts are also known as AP substrates (US Pat. Nos. 3,331,857 and 3,331,862). However, these methods are not suitable for the determination of alkaline phosphatase in body fluids, since the detection of the amount of phenolphthalein released is falsified by other compounds present in the sample fluid. Numerous serum components, such as bilirubin, like the phenolates released from the AP substrates, have an absorption maximum at about 400-450 nm.

Wie schon erwähnt, kommt die Alkalische Phosphatase in den verschiedensten Geweben vor, d.h. es existieren gewebespezifische Formen dieses Enzyms (Isoenzyme). Die Isoenzyme werden von den Organen an das Blutplasma abgegeben, wobei die charakteristischen Eigenschaften der jeweiligen Isoenzyme beim Übergang vom erzeugenden Organ in das Blutplasma erhalten bleiben. Das Blutplasma gesunder Menschen enthält hauptsächlich das Leber- und Knochen-Isoenzym. Bei ungefähr einem Viertel aller Personen wird im Plasma auch Alkalische Phosphatase gefunden, die im Dünndarm entstanden ist. Der Anteil dieses Dünndarm-Isoenzyms liegt in diesen Fällen bei einem Mittelwert von 10% des gesamten AP-Gehaltes im Plasma. Während der Schwangerschaft, insbesondere während der letzten drei Monate wird auch in der Placenta entstehende, Alkalische Phosphatase in das Blutplasma abgegeben. Die gesamte AP-Aktivität des Plasmas ergibt sich aus der Summe der Aktivitäten aller gewebsspezifi-schen Einzelkomponenten. As already mentioned, alkaline phosphatase occurs in a wide variety of tissues, i.e. there are tissue-specific forms of this enzyme (isoenzymes). The organs release the isoenzymes into the blood plasma, the characteristic properties of the respective isoenzymes being retained during the transition from the producing organ into the blood plasma. The blood plasma of healthy people mainly contains the liver and bone isoenzyme. In about a quarter of all people, alkaline phosphatase, which originated in the small intestine, is also found in the plasma. The proportion of this small intestine isoenzyme in these cases is an average of 10% of the total AP content in the plasma. During pregnancy, particularly during the past three months, alkaline phosphatase that is formed in the placenta is also released into the blood plasma. The total AP activity of the plasma results from the sum of the activities of all tissue-specific individual components.

Die Bestimmung der Aktivität z.B. des Leber- bzw. des Knochenisoenzyms ist von besonderer diagnostischer Bedeutung bei der Untersuchung von Erkrankungen der Leber bzw. des Knochenenzyms. Die Erkrankungen bewirken einen Anstieg der AP-Aktivität im Plasma, da unter diesen Voraussetzungen von der Leber bzw. den Knochen in verstärktem Masse Alkalische Phosphatase an das Plasma abgegeben wird. Der Anstieg der AP-Aktivität des Leber- oder des Knochen-Isoenzyms im Plasma kann demnach dazu dienen, eine Erkrankung dieser Gewebe zu erkennen. The determination of the activity e.g. of the liver or the bone isoenzyme is of particular diagnostic importance when examining diseases of the liver or the bone enzyme. The diseases cause an increase in AP activity in the plasma, since under these conditions, alkaline phosphatase is released to the plasma to an increased extent by the liver or the bones. The increase in the AP activity of the liver or bone isoenzyme in the plasma can therefore serve to recognize a disease of these tissues.

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Eine Differenzierung zwischen den AP-Isoenzymen ist deshalb unbedingt erforderlich, um gezielt Erkrankungen bestimmter Organe ermitteln zu können. Eine Differenzierung zwischen dem Leber- und dem Knochen-Isoenzym gestaltet sich aber äusserst schwierig, da diese beiden Isoenzyme sich nur wenig in ihren chemischen, physikalischen oder immunologischen Eigenschaften, z.B. hinsichtlich ihrer elektrischen Ladung, ihrer Hitzestabilität und in ihrer Antwort auf Inhibitoren (z.B. gegenüber Harnstoff) unterscheiden. Diese geringen Unterschiede reichen nicht aus, um eine brauchbare Differenzierung zwischen diesen beiden Enzymformen und eine hinreichende Quantifizierung jeder Form in einem Gemisch beider Formen zu erreichen. Vor einer quantitativen Bestimmung der einzelnen AP-Isoenzyme in einer Probenflüssigkeit ist es deshalb zwingend erforderlich, das Gemisch der Isoenzyme aufzutrennen. A differentiation between the AP isoenzymes is therefore absolutely necessary in order to be able to specifically identify diseases of certain organs. Differentiation between the liver and the bone isoenzyme is extremely difficult, since these two isoenzymes differ only slightly in their chemical, physical or immunological properties, e.g. differ in terms of their electrical charge, their heat stability and their response to inhibitors (e.g. against urea). These small differences are insufficient to achieve a useful differentiation between these two enzyme forms and a sufficient quantification of each form in a mixture of both forms. Before a quantitative determination of the individual AP isoenzymes in a sample liquid, it is therefore imperative to separate the mixture of the isoenzymes.

Aus der EP 0 131 606 B1 ist ein Verfahren zur differenzierten Bestimmung von Isoenzymen der Alkalischen Phosphatase bekannt. Dabei wird die Probe mit einem Lektin, das N-Acetylglucosamin-Reste zu binden vermag, versetzt, die so erhaltene Mischung wird inkubiert, danach der Lektingebundene von dem freien Isoenzym-Anteil getrennt und die AP-Aktivität in einem oder in beiden der getrennten Medien bestimmt. Aus der EP 0 032 204 B1 ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Isoenzymen der Alkalischen Phosphatase in Flüssigkeiten bekannt, bei welchem man an einen wasserunlöslichen Träger adsorbierte Antikörper gegen das zu bestimmende Isoenzym mit der dieses Enzym enthaltenden Probenflüssigkeit inkubiert, wobei das Isoenzym im Komplex mit dem Antikörper einen reproduzierbaren Anteil seiner Aktivität behält. Die Probenlösung wird entfernt, der mit dem Enzym belacene Antikörper-Träger wird gewaschen und die Aktivität des an den Antikörper gebundenen Enzyms wird bestimmt. Aus der DE 3 420 926 A1 ist ein Verfahren zur differenzierten Bestimmung von Isoenzymen der Alkalischen Phosphatase bekannt. Dabei wird die Differenzierung mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers durchgeführt, der gegen das zu bestimmende Isoenzym gerichtet ist und der nur eine geringe Kreuzreaktivität mit den anderen Isoenzymen aufweist. All diese Verfahren, die an flüssigen Proben durchgeführt werden, haben jedoch den Nachteil, dass vor einer quantitativen Bestimmung der AP-Isoenzymaktivität die einzelnen Isoenzyme erst umständlich auf- bzw. abgetrennt werden müssen. EP 0 131 606 B1 discloses a method for the differentiated determination of isozymes of alkaline phosphatase. A lectin, which is able to bind N-acetylglucosamine residues, is added to the sample, the mixture thus obtained is incubated, then the lectin-bound is separated from the free isoenzyme portion and the AP activity in one or both of the separated media certainly. EP 0 032 204 B1 discloses a method for the quantitative determination of isoenzymes of alkaline phosphatase in liquids, in which antibodies adsorbed on a water-insoluble carrier against the isoenzyme to be determined are incubated with the sample liquid containing this enzyme, the isoenzyme in complex with the antibody retains a reproducible portion of its activity. The sample solution is removed, the antibody carrier loaded with the enzyme is washed and the activity of the enzyme bound to the antibody is determined. DE 3 420 926 A1 discloses a method for the differentiated determination of isozymes of alkaline phosphatase. The differentiation is carried out with the aid of a monoclonal antibody which is directed against the isoenzyme to be determined and which has only a low cross-reactivity with the other isoenzymes. However, all of these methods, which are carried out on liquid samples, have the disadvantage that the individual isoenzymes first have to be separated or separated with difficulty before a quantitative determination of the AP isoenzyme activity.

Aus «Enzyme Histochemistry» von Lodja Z., Gossrau R., Schiebler T.H., Springer Verlag, Berlin (1979), S. 56-64, sind Verfahren bekannt, bei welchen die Alkalische Phosphatase in Zellen von Gewebeproben qualitativ bestimmt wird. Dabei werden die enzymaktiven Stellen der Gewebeprobe selektiv eingefärbt und somit sichtbar gemacht. Diese Einfärbung kann z.B. über eine Azokupplung erfolgen, indem man die Zellen beispielsweise mit Naphthol-AS-phosphat als Substrat inkubiert und den resultierenden aromatischen Alkohol über eine Azokupplung mit einem Diazonium-Salz, beispielsweise mit Fast Blue BB (Echtblausalz BB) in einen Azofarbstoff überführt. Dieser Azofarbstoff fällt membranständig aus und färbt die enzymaktiven Stellen blauviolett. Dieses Verfahren bietet zwar den Vorteil, dass nur das zu bestimmende Isoenzym in der Gewebeprobe enthalten ist und somit eine Abtrennung des zu bestimmenden Isoenzyms aus einem Gemisch von Isoenzymen nicht erforderlich ist, aber leider ist mit diesem Verfahren nur eine qualitative Bestimmung der Alkalischen Phosphatase möglich. Für viele Anwendungsfälle, z.B. in der medizinischen Diagnostik, ist es aber unbedingt erforderlich, die Alkalische Phosphatase quantitativ zu bestimmen, um verlässliche Aussagen über mögliche Erkrankungen machen zu können. Methods are known from “Enzyme Histochemistry” by Lodja Z., Gossrau R., Schiebler T.H., Springer Verlag, Berlin (1979), pp. 56-64, in which the alkaline phosphatase in cells of tissue samples is determined qualitatively. The enzyme-active areas of the tissue sample are stained selectively and thus made visible. This coloring can e.g. via an azo coupling, by incubating the cells, for example, with naphthol AS phosphate as the substrate, and converting the resulting aromatic alcohol into an azo dye using an azo coupling with a diazonium salt, for example with Fast Blue BB (real blue salt BB). This azo dye precipitates out at the membrane and stains the enzyme-active sites blue-violet. Although this method offers the advantage that only the isoenzyme to be determined is contained in the tissue sample and thus it is not necessary to separate the isoenzyme to be determined from a mixture of isoenzymes, unfortunately this method only allows qualitative determination of the alkaline phosphatase. For many applications, e.g. in medical diagnostics, it is absolutely necessary to determine the alkaline phosphatase quantitatively in order to be able to make reliable statements about possible diseases.

Quantitative Bestimmungen der AP-Aktivität von Zellen werden bislang durch Messungen der Enzymkinetik (z.B. nach Bergmeyer H.U., Methods in Enzymatic Analysis Vol. 4, Verlag Chemie, Weinheim (1984)) durchgeführt. Dabei werden die zu untersuchenden Zellen aufgebrochen, das Enzym geht in die wässrige Phase über, in welcher dann die Enzymaktivität über die Messung der Enzymkinetik ermittelt wird. Dafür sind aber sehr hohe Zellzahlen (106—107) erforderlich, da es sich hierbei um ein relativ unempfindliches Verfahren handelt. Die erforderlichen hohen Zellzahlen steigern aber auch gleichzeitig die Kosten der Bestimmung. Ausserdem sind hierfür zusätzliche Arbeitsschritte erforderlich, um die Alkalische Phosphatase in eine wässrige Phase überzuführen, sodass es sich hier um ein sehr arbeits- und kostenintensives Verfahren handelt. Quantitative determinations of the AP activity of cells have hitherto been carried out by measurements of the enzyme kinetics (e.g. according to Bergmeyer H.U., Methods in Enzymatic Analysis Vol. 4, Verlag Chemie, Weinheim (1984)). The cells to be examined are broken open, the enzyme passes into the aqueous phase, in which the enzyme activity is then determined by measuring the enzyme kinetics. However, this requires very high cell counts (106-107), since this is a relatively insensitive process. The high cell numbers required also increase the cost of the determination. In addition, additional work steps are required to convert the alkaline phosphatase into an aqueous phase, so that this is a very labor-intensive and cost-intensive process.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein empfindliches Verfahren bereit zu stellen, mit welchem schnell, einfach und zuverlässig die quantitative Bestimmung der AP-Aktivität durchgeführt werden kann. Ferner soll mit Hilfe des Verfahrens selektiv die AP-Aktivität einzelner Isoenzyme bestimmt werden können, ohne dass vorher eine umständliche, zeitaufwendige und kostspielige Ab- bzw. Auftrennung der Isoenzyme erforderlich ist. The object of the present invention is therefore to provide a sensitive method with which the quantitative determination of the AP activity can be carried out quickly, easily and reliably. Furthermore, the method is intended to be able to selectively determine the AP activity of individual isoenzymes without the cumbersome, time-consuming and costly separation or separation of the isoenzymes beforehand.

Gelöst wird diese Aufgabe, dadurch, dass man die AP-Aktivität nicht in Körperflüssigkeiten oder in anderen flüssigen bzw. wässrigen Proben quantitativ bestimmt, sondern direkt in den jeweiligen Zellen, indem man die Zellen mit einer alkalischen Lösung eines aromatischen Phosphorsäureesters und eines Diazonium-Salzes inkubiert, und den durch die Alkalische Phosphatase aus dem Phosphorsäureester gebildeten aromatischen Alkohol über eine Azokupplung mittels des Diazonium-Salzes in eine Azover-bindung, einen Azofarbstoff überführt, welcher membranständig ausfällt. Dieser Azofarbstoff wird mittels eines geeigneten organischen Lösungsmittels selektiv aus der Zellmembran herausgelöst und quantitativ durch Messen der Extinktion der resultierenden organischen Lösung bei einer geeigneten Wellenlänge gegen einen entsprechenden Leerwert bestimmt. Aus der Konzentration bzw. aus der Menge des gebildeten Azofarbstoffes und aus der Zahl der untersuchten Zellen wird dann die Menge bzw. die Aktivität der Alkalischen Phosphatase quantitativ ermittelt. This problem is solved by not quantitatively determining the AP activity in body fluids or in other liquid or aqueous samples, but rather directly in the respective cells by treating the cells with an alkaline solution of an aromatic phosphoric acid ester and a diazonium salt incubated, and the aromatic alcohol formed from the phosphoric acid ester by the alkaline phosphatase via an azo coupling by means of the diazonium salt into an azo compound, an azo dye which precipitates in the membrane. This azo dye is selectively dissolved out of the cell membrane using a suitable organic solvent and determined quantitatively by measuring the absorbance of the resulting organic solution at a suitable wavelength against a corresponding blank value. The amount or the activity of the alkaline phosphatase is then determined quantitatively from the concentration or from the amount of the azo dye formed and from the number of cells examined.

Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die gemessenen Extinktionswerte und die daraus er- It was surprisingly found that the measured extinction values and the resulting

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mittelten AP-Aktivitäten hervorragend mit der Zahl der untersuchten Zellen korrelieren, und es wurde überraschenderweise festgestellt, dass die nach dem erfindungsgemässen Verfahren ermittelten AP-Aktivitäten ausgezeichnet mit den AP-Aktivitäten übereinstimmen, die nach der Methode von Bergmeyer (Bergmeyer H.U., Methods in Enzymatic Analysis Vol. 4, Verlag Chemie, Weinheim (1984)) bestimmt wurden, sodass damit ein einfach zu handhabendes und zuverlässiges Verfahren zur quantitativen Bestimmung der AP-Aktivitäten zur Verfügung steht. mean AP activities correlate excellently with the number of cells investigated, and it was surprisingly found that the AP activities determined by the method according to the invention correspond perfectly to the AP activities which are determined by the method of Bergmeyer (Bergmeyer HU, Methods in Enzymatic Analysis Vol. 4, Verlag Chemie, Weinheim (1984)), so that an easy-to-use and reliable method for the quantitative determination of AP activities is available.

Ferner wurde überraschenderweise festgestellt, dass durch die erfindungsgemässe Modifizierung der qualitativen histochemischen Färbung zu einem quantitativen, photometrischen Test die Empfindlichkeit der quantitativen Bestimmung der AP-Aktivität von Zellen gegenüber bekannten Verfahren nach dem Stand der Technik um das 100-fache gesteigert werden konnte, d.h. es konnte die für die Bestimmung erforderliche Zellzahl auf 1/100 reduziert werden. Die für die quantitative Bestimmung der AP-Aktivität erforderliche Zellzahl konnte auf 104 gesenkt werden. Damit ist es mit dem erfindungsgemässen Verfahren möglich geworden, die quantitative Bestimmung der AP-Aktivitäten von Zellen in Mikrotiterplatten durchzuführen und nicht mehr in Küvetten. Somit steht mit dem erfindungsgemässen Verfahren nicht nur ein einfach zu handhabendes und zuverlässiges Verfahren zur quantitativen Bestimmung der AP-Aktivitäten zur Verfügung, sondern auch ein sehr empfindliches und zugleich kostengünstiges Verfahren. Furthermore, it was surprisingly found that by modifying the qualitative histochemical staining according to the invention to a quantitative, photometric test, the sensitivity of the quantitative determination of the AP activity of cells could be increased 100-fold compared to known methods according to the prior art, i.e. the number of cells required for the determination could be reduced to 1/100. The number of cells required for the quantitative determination of AP activity was reduced to 104. It has thus become possible with the method according to the invention to carry out the quantitative determination of the AP activities of cells in microtiter plates and no longer in cuvettes. Thus, the method according to the invention not only provides an easy-to-use and reliable method for the quantitative determination of the AP activities, but also a very sensitive and at the same time inexpensive method.

Ferner wird bei dem erfindungsgemässen Verfahren die AP-Aktivität der intakten Zelle bestimmt, sodass eine arbeits- und kostenintensive Ab- bzw. Auftrennung der Isoenzyme nicht erforderlich wird. Dies bedeutet, dass das erfindungsgemässe Verfahren auch von relativ ungeübten Personen durchgeführt werden kann, und dass es geignet ist, auch in grossangelegten Reihenuntersuchungen eingesetzt zu werden. Furthermore, the AP activity of the intact cell is determined in the method according to the invention, so that labor-intensive and cost-intensive separation or separation of the isoenzymes is not necessary. This means that the method according to the invention can also be carried out by relatively inexperienced persons, and that it is suitable to also be used in large-scale series examinations.

Da bei dem erfindungsgemässen Verfahren die Zellen nicht zerstört werden müssen, bietet diese Methode den weiteren Vorteil, dass an ein und derselben Zellprobe neben der quantitativen Bestimmung der AP-Aktivität auch weitere morphologische Untersuchungen durchgeführt werden können. Since the cells do not have to be destroyed in the method according to the invention, this method offers the further advantage that, in addition to the quantitative determination of the AP activity, further morphological tests can also be carried out on one and the same cell sample.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann an einer Vielzahl von Zellproben durchgeführt werden. Besonders gute Resultate erhält man bei der Untersuchung von Gewebeschnitten, z.B. in der Histologie, von Zellausstrichen und von Zellkulturen. Das erfindungsgemässe Verfahren kann somit beispielsweise in der medizinischen Diagnostik angewendet werden, und die Zellgewinnung kann z.B. über eine Biopsie erfolgen. Da das erfindungsgemässe Verfahren aber auch an in Kultur gezüchteten Zellen durchgeführt werden kann, kann es ebenso in der Toxikologie bzw. in der Pharmakologie zum Substanz-Screening eingesetzt werden. Werden Zellausstriche nach dem erfindungsgemässen Verfahren untersucht, so werden diese vor dem Inkubieren getrocknet, bei der Untersuchung von Zellkulturen werden diese z.B. mit Ethanol auf einem Träger fixiert. The method according to the invention can be carried out on a large number of cell samples. Particularly good results are obtained when examining tissue sections, e.g. in histology, cell smears and cell cultures. The method according to the invention can thus be used, for example, in medical diagnostics, and cell extraction can e.g. done via a biopsy. However, since the method according to the invention can also be carried out on cells grown in culture, it can also be used in toxicology or in pharmacology for substance screening. If cell smears are examined using the method according to the invention, they are dried before incubation; when examining cell cultures, they are e.g. fixed with ethanol on a support.

Für die Untersuchung eignen sich all die Zellarten, in denen Alkalische Phosphatase vorkommt. Dies sind z.B. Zellen der Leber, der Knochen, des Dünndarms, der Nieren, der Galle oder der Placenta. Besonders gute Resultate erhält man bei der Untersuchung von Knochenmarkszellen oder von Osteoblasten. Mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens ist es möglich geworden, Osteoporose auf einfache Art und Weise detektieren zu können, da eine hohe AP-Aktivität der untersuchten Osteoblasten ein Beweisanzeichen für Osteoporose ist. Diese Krankheit kann bis jetzt nur durch eine aufwendige und kostspielige Computer-Tomographie diagnostiziert werden. Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens hat es sich als zweckmässig erwiesen, wenn die zu untersuchenden Zellen adhärent an der Oberfläche eines Trägers immobiliert sind. All the cell types in which alkaline phosphatase occurs are suitable for the investigation. These are e.g. Cells of the liver, bones, small intestine, kidneys, bile or placenta. Particularly good results are obtained when examining bone marrow cells or osteoblasts. With the aid of the method according to the invention, it has become possible to be able to detect osteoporosis in a simple manner, since a high AP activity of the osteoblasts examined is evidence of osteoporosis. Up to now, this disease can only be diagnosed using complex and expensive computer tomography. When carrying out the method according to the invention, it has proven expedient if the cells to be examined are adherently immobilized on the surface of a support.

Bei der quantitativen Bestimmung der AP-Aktivität nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird die ermittelte AP-Menge auf die Zahl der untersuchten Zellen bezogen. Dabei gibt es verschiedene Möglichkeiten, die Zahl der untersuchten Zellen zu ermitteln. Z.B. können die Zellkerne der zu untersuchenden bzw. der untersuchten Zellprobe selektiv angefärbt und anschliessend ausgezählt werden. Ein geeigneter Farbstoff zum Anfärben der Zellkerne ist z.B. das Hämatoxylin. Bei der Verwendung von Hä-matoxylin als Farbstoff ist es möglich, die Zellkerne anzufärben, bevor der membranständig ausfallende Azofarbstoff gebildet wird, da bei der Verwendung von DMSO als Lösungsmittel für den Azofarbstoff nur dieser selektiv gelöst wird, und die Färbung der Zellkerne erhalten bleibt. Mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens ist es also möglich geworden, an nur einer Zellprobe die Zahl der Zellen und die AP-Aktivität zu ermitteln, und noch weitere morphologische Untersuchungen durchzuführen. Es ist aber auch möglich, über einen Parallelansatz nach üblichen Methoden die Zellzahl zu ermitteln. When the AP activity is determined quantitatively by the method according to the invention, the AP amount determined is based on the number of cells examined. There are various ways of determining the number of cells examined. E.g. the cell nuclei of the cell sample to be examined or the cell sample examined can be selectively stained and then counted. A suitable dye for staining the cell nuclei is e.g. the hematoxylin. When using hematoxylin as the dye, it is possible to stain the cell nuclei before the membrane-forming azo dye is formed, since when DMSO is used as the solvent for the azo dye only this is selectively dissolved and the staining of the cell nuclei is retained. With the aid of the method according to the invention, it has thus become possible to determine the number of cells and the AP activity on only one cell sample and to carry out further morphological investigations. However, it is also possible to determine the cell number using a parallel approach using customary methods.

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens hat es sich als zweckmässig erwiesen, wenn nach dem Inkubieren der Zellen mit den Lösungen des Phosphorsäureesters und des Diazonium-salzes und nach dem Entfernen der überschüssigen Lösungen die Zellen getrocknet werden, z.B. an der Luft. Anschliessend werden die Zellen mit dem organischen Lösungsmittel innig kontaktiert, um den membranständig ausgefallenen Azofarbstoff zu lösen. Dies kann z.B. dadurch erfolgen, dass man die Zellen kräftig mit dem Lösungsmittel schüttelt, beispielsweise 5 Minuten lang. When carrying out the process according to the invention, it has proven expedient if, after incubating the cells with the solutions of the phosphoric acid ester and of the diazonium salt and after removing the excess solutions, the cells are dried, e.g. in the air. The cells are then intimately contacted with the organic solvent in order to dissolve the azo dye which has failed in the membrane. This can e.g. by vigorously shaking the cells with the solvent, for example for 5 minutes.

Die Konzentration bzw. die Menge des membranständig ausgefallenen Azofarbstoffes in der resultierenden Lösung wird über die Messung der Extinktion dieser Lösung bei einer geeigneten Wellenlänge und gegen einen geeigneten Leenwert bestimmt. Diesen Leerwert bildet z.B. das reine Lösungsmittel, und geeignet ist eine Wellenlänge dann, wenn der resultierende Azofarbstoff dort eine ausgeprägte Absorption zeigt. Die für den jeweiligen Einzelfall geeignete Wellenlänge hängt vom Absorptionsverhalten The concentration or the amount of the azo dye precipitated in the membrane in the resulting solution is determined by measuring the absorbance of this solution at a suitable wavelength and against a suitable leen value. This blank value forms e.g. the pure solvent, and a wavelength is suitable if the resulting azo dye shows a pronounced absorption there. The wavelength suitable for each individual case depends on the absorption behavior

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des gebildeten Azofarbstoffes ab und kann vom Fachmann aus dem Absorptionsspektrum des jeweiligen Azofarbstoffes, aufgenommen in dem entsprechenden Lösungsmittel, oder aus Tabellen entnommen werden. of the azo dye formed and can be taken by the person skilled in the art from the absorption spectrum of the respective azo dye, taken up in the corresponding solvent, or from tables.

Die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens ist prinzipiell mit all den Phosphorsäureestern möglich, die durch die Alkalische Phosphatase gespalten werden. Bevorzugt sind dabei p-Nitrophenol-phosphat, I-Naphtholphthaleinmonophosphate, oder Phosphorsäureester von Derivaten (allgemeine Formel I) des 3-Hydroxy-2-naphthoesäureanilid (Naphthol AS). Geeignete Derivate des Naphthol AS sind Ulimanns Encyklopädie der technischen Chemie, 4. Auflage, Band 8, Seite 288, Tabelle 15 zu entnehmen. Besonders bevorzugte Derivate sind das 2',4,-Dimethyl-3-hydroxy-2-naphthoesäureanilid (Naphthol AS-MX), das 7-Brom-3-hydroxy-2-naphthoesäureanisidid (Naphthol AS-BI) oder das 4'-Chlor-2'-methyl-3-hydroxy-2-naphthoesäureanilid (Naphtol AS-TR). In principle, the process according to the invention can be carried out with all the phosphoric acid esters which are cleaved by the alkaline phosphatase. Preferred are p-nitrophenol phosphate, I-naphtholphthalein monophosphate, or phosphoric acid esters of derivatives (general formula I) of 3-hydroxy-2-naphthoic acid anilide (Naphthol AS). Suitable derivatives of Naphthol AS can be found in Ulimann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 4th edition, volume 8, page 288, table 15. Particularly preferred derivatives are 2 ', 4, -dimethyl-3-hydroxy-2-naphthoic acid anilide (naphthol AS-MX), 7-bromo-3-hydroxy-2-naphthoic acid aniside (naphthol AS-BI) or 4'- Chloro-2'-methyl-3-hydroxy-2-naphthoic anilide (Naphtol AS-TR).

H H H H

(I) (I)

I II I I II I

R"* C^CC^C=ö,C^CONHR/ R "* C ^ CC ^ C = ö, C ^ CONHR /

H H H H

HC=CH / \ HC = CH / \

R' = -C^ CR, R = H : Naphthol AS R '= -C ^ CR, R = H: Naphthol AS

HC-CH HC-CH

Hc = cH Hc = cH

/ V / V

R/ = -C C-CH , R = H : Naphthol AS-MX R / = -C C-CH, R = H: Naphthol AS-MX

C-CH / H C-CH / H

H3C H3C

"c-cH O \\ "c-cH O \\

R = -C CH, R = Br : Naphthol AS-BI R = -C CH, R = Br: Naphthol AS-BI

H3C0 H3C0

\ / rcH \ / rcH

Hc — cH Hc - cH

/ V / V

R = H, R' = -C C-Cl : Naphthol AS-TR R = H, R '= -C C-Cl: Naphthol AS-TR

W // W //

rcH rcH

H3C H3C

Diese Phosphorsäureester sind kommerziell erwerbbar, so z.B. das Naphthol AS-BI Phosphat bei der Firma Aldrich unter der Katalognummer 22,937-7, oder eine alkalische Naphthol AS-BI Phosphat-Lösung bei der Firma Sigma. These phosphoric acid esters are commercially available, e.g. the naphthol AS-BI phosphate from Aldrich under catalog number 22,937-7, or an alkaline naphthol AS-BI phosphate solution from Sigma.

Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens sind all diejenigen Diazonium-Salze geeignet, die mit dem resultierenden, aromatischen Alkohol über eine Azokupplung Azoverbindungen zu bilden vermögen, wobei zweckmässigerweise darauf zu achten ist, dass die dabei hervorgehenden Azoverbindungen in den gängigen, organischen Lösungsmitteln eine hinreichende Löslichkeit besitzen. Bevorzugte Diazonium-Saize sind Diazoecht-Salze. Geeignete Diazoecht-Salze sind z.B. dem Katalog-Handbuch- All those diazonium salts which are able to form azo compounds with the resulting aromatic alcohol via an azo coupling are suitable for carrying out the process according to the invention, it being expedient to ensure that the azo compounds that result have a sufficient solubility in the common organic solvents . Preferred diazonium salts are diazo-fast salts. Suitable diazo-fast salts are e.g. the catalog manual

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

CH 684 486 A5 CH 684 486 A5

Feinchemikalien, Deutschland, 1990-1991, S. 627-629, der Firma Aldrich zu entnehmen. Besonders bevorzugt sind Variaminblau-Salze, Echtblau-Salze (Fast Blue) oder Echtrot-Salze (Fast Red). Ganz besonders bevorzugt sind das Echtrot-Salz TR (Fast Red TR, Formel II), das Echtrotviolett-Salz LB (Fast Red Violet LB, Formel III), das Echtblau-Salz BB (Fast Blue BB, Formel IV) oder das Echtblau-Salz RR (Fast Blue RR, Formel V). Diese Diazonium-Salze sind kommerziell erwerbbar, z.B, wie schon erwähnt, bei der Firma Aldrich. Fine chemicals, Germany, 1990-1991, pp 627-629, the company Aldrich. Variamin blue salts, real blue salts (Fast Blue) or real red salts (Fast Red) are particularly preferred. The real red salt TR (Fast Red TR, formula II), the real red violet salt LB (Fast Red Violet LB, formula III), the real blue salt BB (Fast Blue BB, formula IV) or the real blue Salt RR (Fast Blue RR, Formula V). These diazonium salts are commercially available, e.g., as already mentioned, from Aldrich.

Hc=cH / \ + _ Hc = cH / \ + _

Cl-C C-N- Cl * h ZnCl Cl-C C-N-Cl * h ZnCl

^ // 2 ^ // 2

HC-C (II) HC-C (II)

CH CH

Hc =5 cH o Hc — c /VU tf w + _ Hc = 5 cH o Hc - c / VU tf w + _

HC C-C-NH-C C-N_ Cl * \ ZnCl_ (III) \\ ), \ / 2 2 HC C-C-NH-C C-N_ Cl * \ ZnCl_ (III) \\), \ / 2 2

H° CH /C~~ CH H ° CH / C ~~ CH

Cl Cl

OCH CH OCH CH

HC = CH O Hc-c } v l( '( \\ + _ (IV) HC C-C-NH-C C—N_ Cl * 3s ZnC W J/ \ / 2 HC = CH O Hc-c} v l ('(\\ + _ (IV) HC C-C-NH-C C-N_ Cl * 3s ZnC W J / \ / 2

HC~CH ,C-CH HC ~ CH, C-CH

ch3ch2o och ch3ch2o och

Hc-cHo Hc-c' Hc-cHo Hc-c '

Ii * U // \\ + _ Ii * U // \\ + _

HC C-C-NH-C C-N_ Cl * k ZllCl0 (V) V ' \ l 2 2 HC C-C-NH-C C-N_ Cl * k ZllCl0 (V) V '\ l 2 2

H°~CH /C = CH H ° ~ CH / C = CH

ch3o ch3o

Ferner werden Diagnostik- bzw. Reagentien-Kits für die Bestimmung der Alkalischen Phosphatase nach dem Stand der Technik kommerziell angeboten, die ebenso für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens geeignet sind, und die aus einer alkalischen Lösung eines Phosphorsäureesters und eines Diazonium-Salzes bestehen. Solche Kits sind z.B. von der Firma Sigma zu beziehen. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens besteht also darin, dass man zu seiner Durchführung auf kommerziell verfügbare Reagentien-Kits zurückgreifen kann. Furthermore, diagnostic or reagent kits for the determination of the alkaline phosphatase according to the prior art are commercially available, which are also suitable for carrying out the process according to the invention and which consist of an alkaline solution of a phosphoric acid ester and a diazonium salt. Such kits are e.g. available from Sigma. A further advantage of the process according to the invention is that it can be used with commercially available reagent kits for its implementation.

Geeignete, organische Lösungsmittel zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens sind all diejenigen Lösungsmittel, die die membranständig ausgefallenen Azoverbindungen zu lösen vermögen, und deren Absorption nicht mit derjenigen dieser Azoverbindung zusammenfallen. Bevorzugte Lösungsmittel sind dipolar aprotisch, besonders bevorzugt sind Dimethylsulfoxid (DMSO), N-Methylpyrrolidon (NMP), Acetonitril, N,N-Dimethylacetamid, oder Dimethylformamid (DMF). Die Wahl des entsprechenden Lösungsmittels für den jeweiligen Einzelfall hängt dabei von dessen Erfordernissen ab, wie z.B. von der Löslichkeit und von der Absorption der gebildeten Azoverbindung. Die richtige Wahl des Lösungsmittels gehört zum handwerklichen Können des Fachmanns und bereitet diesem keine Schwierigkeiten. Suitable organic solvents for carrying out the process according to the invention are all those solvents which are able to dissolve the azo compounds which have failed in the membrane and whose absorption does not coincide with that of this azo compound. Preferred solvents are dipolar aprotic, particularly preferred are dimethyl sulfoxide (DMSO), N-methylpyrrolidone (NMP), acetonitrile, N, N-dimethylacetamide, or dimethylformamide (DMF). The choice of the appropriate solvent for each individual case depends on its requirements, e.g. of the solubility and absorption of the azo compound formed. The correct choice of the solvent is part of the technical skill of the person skilled in the art and does not pose any difficulties for him.

6 6

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 684 486 A5 CH 684 486 A5

Beschreibung der Abbildungen: Description of the pictures:

Abbildung 1 zeigt die Abhängigkeit der AP-Aktivität von der Zahl der untersuchten Zellen am Beispiel von Osteoblasten aus dem Fussbereich einer osteoporotischen Person, sowie die Korrelation der gemessenen Extinktionswerte mit der Zahl der eingesetzten Osteoblasten. Die Ergebnisse wurden nach dem erfindungsgemässen Verfahren gemäss Beispiel 2 ermittelt. Figure 1 shows the dependence of AP activity on the number of cells examined using the example of osteoblasts from the foot area of an osteoporotic person, as well as the correlation of the measured extinction values with the number of osteoblasts used. The results were determined using the method according to the invention in accordance with Example 2.

Abbildung 2 zeigt die AP-Aktivität / 105 Zellen aus Proben A bis I unterschiedlicher Herkunft. Die Werte wurden nach dem erfindungsgemässen Verfahren gemäss Beispiel 1 ermittelt. Figure 2 shows the AP activity / 105 cells from samples A to I of different origins. The values were determined using the method according to the invention in accordance with Example 1.

Herkunft der Proben: Origin of samples:

A: Osteoblasten aus dem Fussbereich einer weiblichen, gesunden Person A: Osteoblasts from the foot area of a female, healthy person

B: Osteoblasten aus dem Fussbereich einer weiblichen, osteoporotischen Patientin B: Osteoblasts from the foot area of a female, osteoporotic patient

C: Osteoblasten aus der Hüfte einer männlichen, gesunden Person C: Osteoblasts from the hip of a healthy male person

D: Osteoblasten aus dem Knie einer weiblichen, gesunden Person D: Osteoblasts from the knee of a female, healthy person

E: Osteoblasten aus dem Knie einer weiblichen, osteoporotischen Patientin E: Osteoblasts from the knee of a female osteoporotic patient

F: Schädeldachzellen eines fetalen Kalbes F: Skull roof cells of a fetal calf

G: Menschliche Tumorzellen vom Knochen U-2 OS G: Human tumor cells from U-2 OS bone

H: Menschliche Fibroblasten aus der Lunge Flow 2002 H: Human fibroblasts from Lung Flow 2002

I: Muskelzellen eines fetalen Kalbes I: muscle cells of a fetal calf

Im folgenden wird das erfindungsgemässe Verfahren anhand von Beispielen näher erläutert. The method according to the invention is explained in more detail below with the aid of examples.

Beispiel 1: Example 1:

(Bestimmung der AP-Aktivität in verschiedenen Osteoblastenkulturen gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren) (Determination of the AP activity in different osteoblast cultures according to the method according to the invention)

In 2 Gewebekulturplatten mit jeweils 6 Vertiefungen (wells) (Durchmesser je well: 3.5 cm) werden pro well 105 Osteoblasten ausgesät. Dabei handelt es sich bei einer Platte um Osteoblasten einer osteoporotischen, weiblichen Patientin, bei der anderen Platte um Osteoblasten einer gesunden, weiblichen Person. Die Osteoblasten stammen jeweils aus dem Fussbereich der Frauen. 105 osteoblasts are sown per well in 2 tissue culture plates, each with 6 wells (diameter per well: 3.5 cm). One plate is osteoblasts from an osteoporotic female patient, the other plate is osteoblasts from a healthy, female person. The osteoblasts come from the foot area of women.

Nachdem die Osteoblasten angewachsen sind (1 Tag) und sich ausgespreitet haben, werden sie bis zu ihrer Sättigungsdichte 1-2 Tage in Kultivierungsmedien kultiviert. Anschliessend wird das Medium der Platten abgenommen, in phosphatgepufferter Saline gespült, und es wird je Platte von 2 wells die Zellzahl bestimmt. Die übrigen 4 wells pro Platte werden mit 2 ml/well Fixierlösung (= 10 ml 37%-iger Formaldehyd in 90 ml Methanol) 30 Sekunden lang fixiert. Danach wird mit Wasser gespült und je well mit 2 ml einer Lösung beschichtet, die wie folgt hergestellt wurde: After the osteoblasts have grown (1 day) and spread, they are cultured in cultivation media for 1-2 days up to their saturation density. The medium of the plates is then removed, rinsed in phosphate-buffered saline, and the cell number is determined from 2 wells per plate. The remaining 4 wells per plate are fixed with 2 ml / well fixing solution (= 10 ml 37% formaldehyde in 90 ml methanol) for 30 seconds. It is then rinsed with water and coated with 2 ml of a solution, which was prepared as follows:

0.5 ml alkalische FRV-Lösung (= 5 mg/ml Fast Red Violet LB Base in 0.4 m HCl) werden mit 0.5 ml 0.1 M NaN02-Lösung 30 Sekunden kräftig geschüttelt, dann mit 22.5 ml Wasser und 1 ml alkalischer Naphthol AS-BI-Lösung (= 2 mg/ml Naphthol AS-BI Phosphat in 1 M AMPD-Puffer, pH 9.5) versetzt. 0.5 ml alkaline FRV solution (= 5 mg / ml Fast Red Violet LB Base in 0.4 m HCl) are shaken vigorously with 0.5 ml 0.1 M NaN02 solution for 30 seconds, then with 22.5 ml water and 1 ml alkaline naphthol AS-BI- Solution (= 2 mg / ml naphthol AS-BI phosphate in 1 M AMPD buffer, pH 9.5) was added.

Mit dieser Lösung werden die Proben 15 Minuten lang im Dunkeln inkubiert. Anschliessend wird die Farblösung abgesaugt, die Zellen werden gründlich mit Wasser gespült und 2 Minuten lang mit je 2 ml Hämatoxilin-Lösung (= 6 g/l Hämatoxilin, 0.6 g/l NaJÛ3, 52-8 g/l Al2(S04)3) je well gegengefärbt. Die Farblösung wird abgenommen, die Zellen werden mit Leitungswasser gespült, getrocknet und mit 1 ml DMSO pro well 5 Minuten lang geschüttelt. Dabei geht der gebildete Azofarbstoff in Lösung. Die gefärbte DMSO-Lösung wird in Küvetten übergeführt, und es wird die Extinktion dieser Lösung bei 550 nm gegen DMSO gemessen. Die nachfolgende Tabelle enthält die Extinktionen /105 Zellen. This solution is used to incubate the samples in the dark for 15 minutes. The color solution is then suctioned off, the cells are rinsed thoroughly with water and 2 minutes each with 2 ml of hematoxilin solution (= 6 g / l hematoxilin, 0.6 g / l NaJÛ3, 52-8 g / l Al2 (S04) 3) each well counterstained. The color solution is removed, the cells are rinsed with tap water, dried and shaken with 1 ml DMSO per well for 5 minutes. The azo dye formed goes into solution. The colored DMSO solution is transferred to cuvettes and the absorbance of this solution at 550 nm against DMSO is measured. The table below contains the extinctions / 105 cells.

Extinktion (550 nm) Absorbance (550 nm)

osteopor. Person osteopor. person

1.189 1,189

1.116 1,116

0.974 0.974

1.207 1,207

gesunde Person healthy person

0.552 0.552

0.540 0.540

0.579 0.579

0.502 0.502

Beispiel 2: Example 2:

(Ermittelung des Zusammenhanges zwischen der Zellzahl und der AP-Aktivität) (Determination of the relationship between the cell number and the AP activity)

Osteoblasten aus dem Fussbereich einer osteoporotischen Patientin wurden jeweils in ihrer Sättigungsdichte in verschiedenen Gefässen ausgesät. The saturation density of osteoblasts from the foot area of an osteoporotic patient was sown in different vessels.

Flexipermkammern : pro well 1 cm Durchmesser => 10 000 Zellen 24-er well-Schale : pro well 1.5 cm Durchmesser => 25 000 Zellen 6-er well-Schale : pro well 3.5 cm Durchmesser => 100 000 Zellen Flexiperm chambers: 1 cm diameter per well => 10,000 cells 24-well well: 1.5 cm diameter per well => 25,000 cells 6-well well: 3.5 cm diameter per well => 100,000 cells

Von diesen Zellen wurde gemäss Beispiel 1 die AP-Aktivität bei 550 nm bestimmt. Die nachfolgende Tabelle enthält die Zellzahlen und die zugehörigen AP-Aktivitäten. The AP activity at 550 nm was determined from these cells according to Example 1. The following table contains the cell numbers and the associated AP activities.

7 7

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

CH 684 486 A5 CH 684 486 A5

Zellzahl 10 000 25 000 100 000 Cell number 10,000 25,000 100,000

Extinktion (550 nm) 0.10 0.27 1.112 Absorbance (550 nm) 0.10 0.27 1.112

Beispiel 3: Example 3:

(Bestimmung der AP-Aktivität über eine Enzym-Kinetik gemäss dem Stand der Technik) (Determination of the AP activity via enzyme kinetics according to the prior art)

In einer 80 cm2 Kultivierungsflasche wurden Osteoblasten aus dem Fussbereich einer osteoporotischen Patientin bis zu ihrer Sättigungsdichte (500 000 Zellen) angezüchtet. Der Zellrasen wurde gespült, und die Zellen wurden mit einem Schaber mechanisch von der Oberfläche entfernt und in Suspension gebracht. Sie wurden in 1.5 mi phosphatgepufferter Saline, die 0.1 % Tween 20 enthält, aufgenommen und 2 x 10 Minuten im Ultraschall beschallt. Anschliessend wurde der Zellaufschluss 15 Minuten lang bei 3000 rpm und 4°C zentrifugiert, und die Zellüberstände wurden zur Enzym- und Proteinbestimmung eingesetzt. Die Proteinbestimmung erfolgte mit dem Färbereagenz der Fa. BioRAD nach der Methode von Bradford, die Bestimmung der Alkalischen Phosphatase wurde nach der Methode von Bergmeyer durchgeführt. In an 80 cm2 cultivation bottle, osteoblasts from the foot area of an osteoporotic patient were grown to their saturation density (500,000 cells). The cell lawn was rinsed and the cells were mechanically removed from the surface with a scraper and brought into suspension. They were taken up in 1.5 ml of phosphate-buffered saline containing 0.1% Tween 20 and sonicated 2 x 10 minutes. The cell disruption was then centrifuged for 15 minutes at 3000 rpm and 4 ° C., and the cell supernatants were used for the enzyme and protein determination. The protein was determined using the BioRAD staining reagent using the Bradford method, and the alkaline phosphatase was determined using the Bergmeyer method.

Enzymbestimmung: Enzyme determination:

Puffer/Substratlösung : 1 M Diethanoiamin-Puffer, pH 9.8, 15 mM 4-Nitrophenylphosphat (4-NPP) (10.5 g Diethanolamin, 0.56 g 4-NPP und 9 ml 1 N HCl werden in 80 ml H2O gelöst, mit HCl auf pH 9.8 eingestellt und auf 100 ml aufgefüllt) Buffer / substrate solution: 1 M diethanoiamine buffer, pH 9.8, 15 mM 4-nitrophenyl phosphate (4-NPP) (10.5 g diethanolamine, 0.56 g 4-NPP and 9 ml 1N HCl are dissolved in 80 ml H2O, with HCl to pH 9.8 set and made up to 100 ml)

In einer Küvette werden 2 ml Puffer/Substratlösung vorgelegt und mit 0.02 ml Zellüberstand versetzt. Dann wurde 10 Minuten lang die Extinktionsänderung bei 405 nm gemessen und die Volumenaktivität [U/l] und die spezifische Aktivität [U/mg Protein] nach folgenden Formeln ermittelt: 2 ml of buffer / substrate solution are placed in a cuvette and 0.02 ml of cell supernatant are added. The change in absorbance at 405 nm was then measured for 10 minutes and the volume activity [U / l] and the specific activity [U / mg protein] were determined according to the following formulas:

Volumenaktivität = 1000 V / edv - AE/At = 16.38 [U/l] Volume activity = 1000 V / computerized - AE / At = 16.38 [U / l]

spezifische Aktivität = V / edvc = £1 [U/mg Protein] specific activity = V / edvc = £ 1 [U / mg protein]

mit V = 2.02 ml (Probenvolumen), v = 0.02 ml (Testvolumen), with V = 2.02 ml (sample volume), v = 0.02 ml (test volume),

e = 18.5 cm2/mol, d = 1 cm, AE/At = 0.003 und c = Proteinkonzentration des Zellüberstandes = 0.07 mg/ml. e = 18.5 cm2 / mol, d = 1 cm, AE / At = 0.003 and c = protein concentration of the cell supernatant = 0.07 mg / ml.

Somit lässt sich die spezifische Aktivität aus der Enzymkinetik mit der photometrischen Bestimmung nach dem erfindungsgemässen Verfahren vergleichen. The specific activity from the enzyme kinetics can thus be compared with the photometric determination by the method according to the invention.

Die nachfolgende Tabelle enthält die vergleichenden AP-Aktivitäten, ermittelt nach dem Stand der Technik und ermittelt nach dem erfindungsgemässen Verfahren. The following table contains the comparative AP activities, determined according to the prior art and determined using the method according to the invention.

Zellzahl Cell count

Proteingehalt [ng] Protein content [ng]

AP-Aktivität [E 550 nm] AP activity [E 550 nm]

AP-Aktivität [U/mg Protein] AP activity [U / mg protein]

10 000 10,000

1 1

0.1 0.1

- -

100 000 100,000

12 12th

1.1 1.1

(25) (25)

500 000 500,000

50 50

0.6 1:10 verdünnt 0.6 diluted 1:10

81 81

1 000 000 1,000,000

108 108

1.2 1:10 verdünnt 1.2 diluted 1:10

136 136

Claims

1. Method for determining the alkaline phosphatase in cells by incubating the cells with an alkaline solution of an aromatic phosphoric acid ester and a diazonium salt and converting the aromatic alcohol formed by the alkaline phosphatase from the phosphoric acid ester via an azo coupling using the diazonium salt into an azo compound , characterized in that the membrane-failed azo compound is selectively extracted from the cell membrane by means of an organic solvent and quantitatively determined by measuring the absorbance of the resulting organic solution at a suitable wavelength against a corresponding blank value, and that the concentration or the quantity the amount or activity of the alkaline phosphatase is determined quantitatively from the azo compound formed and from the number of cells examined.

2. The method according to claim 1, characterized in that p-nitro-phenol phosphate, 1-naphtholphthalein monophosphate, or phosphoric acid ester of 2 ', 4'-dimethyl-3-hy-

8th

5

10th

15

20th

25th

30th

35

40

45

50

55

60

65

CH 684 486 A5

droxy-2-naphthoic acid anilide, of 7-bromo-3-hydroxy-2-naphthoic acid aniside or of 4'-chloro-2'-methyl-3-hydroxy-2-naphthoic acid anilide.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that dia-zoecht salts are used as the diazonium salt.

4. The method according to claim 3, characterized in that one uses variamin blue salts, real blue salts or true red salts, preferably true red Saiz TR, true red violet salt LB, true blue salt BB or true blue salt RR.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that aprotic dipolar solvents, preferably dimethyl sulfoxide, N-methylpyrrolidone, acetonitrile, N, N-dimethylacetamide, or dimethylformamide are used as the organic solvent.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the alkaline phosphatase is determined in tissue sections, in cell smears or in cell cultures.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the alkaline phosphatase in osteoblasts or in bone marrow cells is determined.

8. Application of the method according to one of claims 1 to 7 for substance screening in toxicology or in pharmacology, or in clinical chemistry for medical diagnosis.

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