L'invention a pour objet un agent thérapeutique nouveau destiné au traitement thérapeutique de tumeurs cancéreuses, plus précisement un agent destiné a renforcer l'efficacité de substances cytotoxiques utilisées dans le traitement de tumeurs cancéreuses développant le phénomène de résistance multiple aux agents anti-cancéreux (résistance multidrogue multiple - drug resistance "MDR").
Le phénomène de la résistance multidrogue est connu et ne se limite pas seulement aux agents anti-cancéreux. A ce jour, diverses explications sont avancées quant à la compréhension des mécanismes mis en jeu. Pour ce qui est du comportement des cellules tumorales cancéreuses, on a pu mettre en évidence plusieurs systèmes de résistance distincts: s'agissant par exemple de la perméabilité de la membrane cellulaire, l'intervention d'une glyco-protéine spécifique (P-gp) est reconnue, mais il est admis que d'autres facteurs protéiques peuvent intervenir.
L'approche de ce phénomène est donc multiple, sinon complexe, ce qui rend d'autant plus difficile la recherche de solutions appropriées.
L'application de substances ou drogues cytotoxiques dans le traitement des tumeurs cancéreuses se heurte à plusieurs obstacles. La plupart des drogues utilisées à cet effet présentent premièrement une toxicité intrinsèque, non distinctive, source d'effets secondaires néfastes; d'autre part, au vu de cette toxicité intrinsèque, leur administration au patient s'en trouve quantitativement limitée et, dans de nombreux cas, l'activité souhaitée au niveau des tumeurs n'est plus suffisante.
Divers moyens ont été déjà proposés en vue de surmonter de tels obstacles, comme la vectorisation de la substance cytotoxique, par exemple sous forme de son incorporation dans un liposome. Dans un tel cas cependant, si la toxicité intrinsèque de la substance cytotoxique est temporairement occultée et donc avec des effets secondaires limités pour le patient, son activité sur le site tumoral n'est pas forcément rétablie au niveau d'efficacité souhaité.
En outre, pour peu que les cellules tumorales soumises à ce traitement développent le phénomène de résistance multidrogue, innée ou acquise, la substance cytotoxique perd quasiment toute efficacité.
On connaît à ce jour plusieurs substances montrant in vitro une activité inhibitrice de la MDR: ce sont pour l'essentiel des substances non cytotoxiques, généralement de caractère hydrophobe, tels des alcaloïdes par exemple. In vitro, leur utilisation conjointe à une drogue cytotoxique apparaît comme satisfaisante, le phénomène dit MDR étant significativement inhibé au niveau cellulaire pour que la dite drogue joue pleinement son rôle.
Il en est tout autrement, cependant, lorsque l'on tente une transposition de telles observations sur un organisme vivant. Les substances inhibitrices de la MDR, alcaloïdes ou autres, présentent également une toxicité intrinsèque qui limite leur administration en-deçà d'un seuil (taux sérique) où l'activité recherchée (inhibition de la MDR) est également perdue. En outre, bien que la substance cytotoxique soit administrée sous forme libre, ou sous forme de liposome par exemple, on a observé comme facteur limitatif important une augmentation concommittante de la toxicité intrinsèque de la drogue cytotoxique due à un changement significatif de sa distribution pharmacologique dans l'organisme.
De fait, face à de tels inconvénients, l'homme du métier se trouve particulièrement démuni de moyens, s'agissant du traitement in vivo de tumeurs cancéreuses développant le phénomène de résistance multidrogue (MDR). La quinine, récemment proposée à titre de substance inhibitrice de la MDR, illustre exactement ce cas de figure, ce qui la rend jusqu'à ce jour impropre à cette utilisation à fins thérapeutiques.
L'invention a le mérite d'apporter une solution originale et particulièrement efficace au problème évoqué plus haut, ceci d'autant plus qu'elle vise l'utilisation de substances de structure voisine de celle de la quinine. De manière surprenante cependant, de telles substances se sont révélées, à dose comparable, plus efficaces et en même temps nettement moins toxiques dans le contexte présent que la quinine. Comme on l'a vu ci-dessus, cette voie semblait cependant compromise, sinon exclue, quant à l'utilisation de tels alcaloïdes à titre de substances inhibitrices de la résistance multiple aux agents anti-cancéreux, sur le plan thérapeutique.
L'invention a pour objet la cinchonine et la cinchonidine à titre de substances inhibitrices de la résistance multidrogue (MDR) dans le traitement de tumeurs cancéreuses.
L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique, en particulier une composition pharmaceutique développant une activité inhibitrice de la MDR, contenant la cinchonine ou la cinchonidine à titre de principe actif.
La cinchonine et la cinchonidine sont des substances connues, de la classe des alcaloïdes, proposées comme agents thérapeutiques anti-malaria. Leur pharmacologie est connue, en particulier leur toxicité.
Selon l'invention, la cinchonine et la cinchonidine peuvent être avantageusement utilisées, sous forme de composition pharmaceutique, de préférence solubilisées dans un milieu approprié à une administration parentérale, par exemple voie sous-cutanée ou intra-musculaire. Au sein de telles compositions, la cinchonine et la cinchonidine peuvent être également associées à un véhicule particulaire telle une microcapsule ou microparticule, une nanocapsule ou nanoparticule. A titre de véhicule, on peut avantageusement utiliser un liposome.
Selon l'invention, l'effet inhibiteur souhaité peut être obtenu à des doses auxquelles on n'observe pas chez les sujets traités les effets secondaires néfastes dus à la toxicité intrinsèque de la cinchonine ou la cinchonidine. Bien entendu, les doses thérapeutiques optimales dépendront du type de tumeur traité, de la nature de l'agent cytotoxique utilisé conjointement, du sujet traité ou encore d'autres facteurs que l'homme du métier sera en mesure d'appréhender.
Des substances cytotoxiques sensibles au phénomène de la MDR, dont l'activité peut être avantageusement potentiée par l'action concommitante de cinchonine ou de cinchonidine, sont mentionnées ci-après; cette énumération n'est pas exhaustive pour autant.
Ce sont pour l'essentiel des substances hydrophobes, ayant en commun un résidu azoté chargé positivement, tels les alcaloïdes de la vinca, les anthracyclines ou produits analogues, les épipodophyllotoxines ou les antibiotiques antitumoraux par exemple. On peut citer en particulier la vincristine, la vinblastine, la vindésine, la vinorelbine, la doxorubicine, la déoxydoxorubicine, la tétrahydropyranyladriamycine, l'épidoxorubicine, l'aclacinomycine, le déméthoxydaunorubisanthrène, la mithramycine, l'actinomycine D, la puromycine, l'étoposide, le ténoposide, l'émétine, l'éthidium bromide, la cytochalasine, la colchicine et le taxol.
Grâce à l'invention, on est en mesure de proposer un traitement thérapeutique approprié concernant de nombreuses tumeurs cancéreuses présentant à des degrés divers une résistance multiple aux agents anti-cancéreux (MDR). A ce propos, on peut citer entre autres la leucémie aigue myeloblastique, la leucémie aigue lymphoblastique, le neuroblastome, le cancer du poumon à petites cellules, le cancer de l'ovaire, le lymphome malin non hodgkinien et le plasmocytome diffus. Ce sont des cancers qui présentent une MDR induite, en réponse au traitement avec un agent cytotoxique.
On peut également traiter des cancers présentant une MDR innée ou, pour le moins, des cellules cancéreuses caractérisées par la présence, avant tout traitement, du gène correspondant de la P-gp(mdr 1) à un taux relativement élevé. Ce sont, par exemple, l'adénocarcinome du colon, l'adénocarcinome du rein, le carcinome corticosurrénalien, le phéochromocytome, les sarcomes de l'enfant et la leucémie secondaire. Cette liste n'est cependant pas exhaustive.
Les expérimentations décrites ci-après illustreront la présente invention de manière plus détaillée, sans pour autant la limiter.
a) Mise en évidence in vitro de l'activité inhibitrice
a.1. Des portions de 10 000 cellules provenant de la lignée DHD/K12/TRb ("drug resistant cell line"/MDR+) ont été réparties en séries et implantées sur lamelle, 48 heures avant traitement.
On a procédé à une première incubation de 60 minutes en milieu HAMF 10, répartissant les additifs comme suit:
<tb><TABLE> Columns=2
<tb> <SEP>témoins <SEP>-
<tb> <SEP>série zéro <SEP>doxorubicine (DXR) à 10 mu g/ml
<tb> <SEP>série 1 <SEP>DXR (10 mu g/ml) + cinchonine (5 mu g/ml)
<tb> <SEP>série 2 <SEP>DXR (10 mu g/ml) + cinchonidine (5 mu g/ml)
<tb> <SEP>série 3 <SEP>DXR (10 mu g/ml) + quinine (5 mu g/ml)
<tb> <SEP>série 4 <SEP>DXR (10 mu g/ml) + vérapamil (5 mu g/ml)
<tb></TABLE>
Les séries 3 et 4 sont utilisées à titre comparatif, s'agissant de substances inhibitrices de la MDR connues. On a procédé ensuite à une seconde incubation, de 75 minutes, en milieu HAMF 10 additionné d'une nouvelle quantité de substance inhibitrice (série 1 à 4). L'appréciation semi qualitative de la présence de DXR dans le cytoplasme des cellules traitées a été affectuée en microscopie de fluorescence (double lecture) pour donner les résultats ci-après.
<tb><TABLE> Columns=4
<tb> <SEP>témoins <SEP>0 <SEP>série zéro <SEP>0
<tb> <SEP>série 1 <SEP>++ <SEP>série 2 <SEP>++
<tb> <SEP>série 3 <SEP>++ <SEP>série 4 <SEP>++
0 = absence de fluorescence
+ = unité abstraite de fluorescence
<tb></TABLE>
On constate ainsi que cinchonine et cinchonidine exercent toutes deux un effet inhibiteur de la MDR. Cet effet est comparable à celui constaté pour la quinine et le vérapamil.
a.2. On a procédé à une expérimentation comparable, à l'aide de portions de 5000 cellules chacune, implantées 48 heures avant traitement.
Traitement proprement dit: incubation de 84 heures en milieu HAMF 10 + 10% SVF, en présence ou non des mêmes substances inhibitrices (vérapamil excepté), ajoutées à raison de 5 mu g/ml. Pour ce qui est de l'agent cytotoxique, on a utilisé la mitoxantrone (MXN) en faisant varier sa concentration comme suit:
0,05 - 0,1 - 1-5 - 10 mu g/ml
Le taux de survie des cellules implantées a été apprécié par le moyen du test au bleu. Les résultats observés sont rassemblés dans fig. 1 (1 = cinchonine, 2 = cinchonidine). Ils confirment que cinchonine et cinchonidine exercent toutes deux une activité inhibitrice de la MDR importante et potentialisent l'activité cytotoxique de la mitoxantrone.
b) Mise en évidence ex vivo de l'activité inhibitrice
b.1 A divers groupes de 3 rats chacun, on a injecté par voie intra-veineuse l'une des trois substances inhibitrices ci-après, aux doses non toxiques maximales:
<tb><TABLE> Columns=2
<tb> <SEP>cinchonine <SEP>50 mg/kg (1)
<tb> <SEP>cinchonidine <SEP>25 mg/kg (2)
<tb> <SEP>quinine <SEP>40 mg/kg (3)
<tb></TABLE>
Une heure après l'injection i.v,. on a prélevé des échantillons sanguins de chaque sujet, par ponction cardiaque. On a procédé de même concernant des rats témoins, non traités préalablement.
b.2. Des portions de 10 000 cellules DHD/K12/TRb (voir a.1) ont été implantées 48 heures avant le traitement proprement dit comme indiqué ci-après, l'agent cytotoxique étant la doxorubicine (DXR).
<tb><TABLE> Columns=2
<tb> <SEP>témoin <SEP>-
<tb> <SEP>série zéro <SEP>DXR (10 mu g/ml) + sérum rats témoins
<tb> <SEP>série 1 <SEP>DXR (10 mu g/ml) + sérum rats (1)
<tb> <SEP>série 2 <SEP>DXR (10 mu g/ml) + sérum rats (2)
<tb> <SEP>série 3 <SEP>DXR (10 mu g/ml) + sérum rats (3)
<tb></TABLE>
Après une première incubation d'une heure, on a procédé à 3 lavages successifs au moyen de HAMF 10, puis effectué une seconde incubation des cellules lavées durant une heure, en présence uniquement d'une nouvelle dose du sérum correspondant. L'appréciation semi qualificative de la rétention de DXR par les cellules traitées a été effectuée en microscopie de fluorescence (double lecture) pour donner les résultats ci-après.
<tb><TABLE> Columns=4
<tb> <SEP>témoins <SEP>0
<tb> <SEP>série zéro <SEP>0 <SEP>série 1 <SEP>++
<tb> <SEP>série 2 <SEP>++1/2 <SEP>série 3 <SEP>+
0 = absence de fluorescence
+ = unité abstraite de fluorescence
<tb></TABLE>
On constate ainsi que cinchonine et cinchonidine sont efficaces ex vivo concernant l'effet inhibiteur de la MDR, et pour le moins comparables à la quinine. On relève en outre que pour une administration i.v., la cinchonine est moins toxique que la quinine.
c) Comparaison du pouvoir inhibiteur de la cinchonine par rapport à celui de la quinine par expérimentation ex vivo.
c.1. A divers groupes de 3 rats chacun on a injecté par voie intra-péritonéale l'une des trois substances inhibitrices ci-après, aux doses suivantes:
<tb><TABLE> Columns=2
<tb> <SEP>cinchonine <SEP>75 mg/kg (1)
<tb> <SEP>cinchonine <SEP>100 mg/kg (2)
<tb> <SEP>cinchonidine <SEP>100 mg/kg (3)
<tb> <SEP>quinine <SEP>75 mg/kg (4)
<tb> <SEP>quinine <SEP>100 mg/kg (5)*
* 2 rats morts sur 3
<tb></TABLE>
Une heure après l'injection i.p, on a prélevé des échantillons sanguins de chaque sujet, par ponction cardiaque. On a procédé de même concernant des rats témoins, non traités préalablement.
c.2. Des portions de 10 000 cellules DHD/K12/Trb (voir a.1) ont été implantées 24 heures avant le traitement proprement dit, comme indiqué ci-après, l'agent cytotoxique étant de la doxorubicine (DXR) contenant 3% de DXR <1><4>C.
<tb><TABLE> Columns=2
<tb> <SEP>témoins <SEP>-
<tb> <SEP>série zéro <SEP>DXR (5 mu g/ml) + sérum rats témoins
<tb> <SEP>série 1 <SEP>DXR (5 mu g/ml) + sérum rats (1)
<tb> <SEP>série 2 <SEP>DXR (5 mu g/ml) + sérum rats (2)
<tb> <SEP>série 3 <SEP>DXR (5 mu g/ml) + sérum rats (3)
<tb> <SEP>série 4 <SEP>DXR (5 mu g/ml) + sérum rats (4)
<tb> <SEP>série 5 <SEP>DXR (5 mu g/ml) + sérum rats (5)
<tb></TABLE>
Après une incubation de deux heures, suivie de trois lavages successifs au moyen de PBS-BSA, trypsinisation et comptage de cellules, on a procédé à la mesure de la radioactivité intracellulaire à l'aide d'un compteur béta.
De ces mesures, on en déduit un taux de doxorubicine intracytoplasmique directement lié à l'effet inhibiteur de la substance testée. Ces résultats sont rassemblés dans fig. 2.
On constate ainsi, pour une même concentration sérique de substance inhibitrice, que le taux de DXR intracytoplasmique de la série 1 (DXR + cinchonine) est de six fois supérieur à celui de la série zéro (DXR seule); de même, ce taux est environ deux fois supérieur à celui de la série 4 (DXR + quinine), même après dilution des sérums d'un facteur 2, respectivement 4.
On a en outre constaté que cinchonine et cinchonidine sont nettement moins toxiques que la quinine: pour une injection i.p. de 100 mg/kg, deux sujets sur trois traités au moyen de quinine sont décédés après injection.
d) Comparaison in vivo du pouvoir inhibiteur de la cinchonine par rapport à celui de la quinine par expérimentation in vivo
On a procédé à J0 à une injection intrapéritonéale de 1 000 000 de cellules DHD/K12/TRb par rat, afin d'induire chez les sujets la carcinomatose péritonéale d'origine colique utilisée comme modèle expérimental.
A J1, on a procédé à l'injection simultanée, par voie intrapéritonéale, de doxorubicine (DXR) libre et de substance inhibitrice, en solution dans du glucose aqueux à 5% et aux doses indiquées.
Groupe 1 : DXR/quinine à la dose de 0,5 mg/kg DXR, respectivement 80 mg/kg quinine.
Groupe 2 : DXR/cinchonine à la dose de 0,5 mg/kg DXR, respectivement 80 mg/kg cinchonine.
Groupe 3 : DXR (0,5 mg/kg)
Groupe 4 : témoins
Les groupes étaient constitués de 5 rats chacun. Ceux-ci ont été sacrifiés à J27 et, après autopsie, on a procédé à la mesure du poids des nodules tumoraux de chaque sujet. Les valeurs répertoriées ci-dessous sont des moyennes obtenues sur 5 sujets par groupe.
Groupe 1 : 0,2 g (+/- 0,2)
Groupe 2 : 0,1 g (+/- 0,1)
Groupe 3 : 4,8 g (+/- 1,2)
Groupe 4 : 5,0 g (+/- 1,2)
On constate ainsi que quinine et cinchonine inhibent significativement la résistance des tumeurs traitées au moyen de doxorubicine. Pour un dosage identique, la cinchonine se montre un peu plus puissante que la quinine dans ce type d'expérimentation; l'avantage complémentaire réside dans la plus faible toxicité de la cinchonine comme démontré précédemment.
The subject of the invention is a new therapeutic agent intended for the therapeutic treatment of cancerous tumors, more precisely an agent intended to reinforce the effectiveness of cytotoxic substances used in the treatment of cancerous tumors developing the phenomenon of multiple resistance to anti-cancer agents ( multiple multidrug resistance - drug resistance "MDR").
The phenomenon of multidrug resistance is known and is not limited only to anti-cancer agents. To date, various explanations have been advanced as to the understanding of the mechanisms involved. With regard to the behavior of cancer tumor cells, we have been able to highlight several distinct resistance systems: for example with regard to the permeability of the cell membrane, the intervention of a specific glyco-protein (P-gp) is recognized, but it is recognized that other protein factors can intervene.
The approach to this phenomenon is therefore multiple, if not complex, which makes the search for appropriate solutions all the more difficult.
The application of cytotoxic substances or drugs in the treatment of cancerous tumors faces several obstacles. Most of the drugs used for this purpose firstly have intrinsic, non-distinctive toxicity, which is a source of harmful side effects; on the other hand, in view of this intrinsic toxicity, their administration to the patient is quantitatively limited and, in many cases, the desired activity in tumors is no longer sufficient.
Various means have already been proposed in order to overcome such obstacles, such as the vectorization of the cytotoxic substance, for example in the form of its incorporation into a liposome. In such a case, however, if the intrinsic toxicity of the cytotoxic substance is temporarily obscured and therefore with limited side effects for the patient, its activity at the tumor site is not necessarily restored to the desired level of effectiveness.
In addition, as long as the tumor cells subjected to this treatment develop the phenomenon of multidrug resistance, innate or acquired, the cytotoxic substance loses almost all effectiveness.
Several substances are known to date showing in vitro an inhibitory activity on MDR: these are essentially non-cytotoxic substances, generally of hydrophobic character, such as alkaloids for example. In vitro, their joint use with a cytotoxic drug appears to be satisfactory, the phenomenon known as MDR being significantly inhibited at the cellular level so that said drug fully plays its role.
It is quite different, however, when attempting to transpose such observations to a living organism. Substances inhibiting MDR, alkaloids or others, also exhibit intrinsic toxicity which limits their administration below a threshold (serum level) where the desired activity (inhibition of MDR) is also lost. Furthermore, although the cytotoxic substance is administered in free form, or in the form of a liposome for example, a concomitant increase in the intrinsic toxicity of the cytotoxic drug has been observed as an important limiting factor due to a significant change in its pharmacological distribution in the organism.
In fact, faced with such drawbacks, those skilled in the art find themselves particularly lacking in resources, as regards the in vivo treatment of cancerous tumors developing the phenomenon of multidrug resistance (MDR). Quinine, recently proposed as an inhibitor of MDR, illustrates exactly this case, which makes it so far unsuitable for this use for therapeutic purposes.
The invention has the merit of providing an original and particularly effective solution to the problem mentioned above, all the more so since it targets the use of substances with a structure close to that of quinine. Surprisingly, however, such substances have proved, at comparable doses, more effective and at the same time significantly less toxic in the present context than quinine. As we saw above, this path seemed however compromised, if not excluded, with regard to the use of such alkaloids as substances which inhibit multiple resistance to anticancer agents, therapeutically.
The subject of the invention is cinchonine and cinchonidine as substances which inhibit multidrug resistance (MDR) in the treatment of cancerous tumors.
A subject of the invention is also a pharmaceutical composition, in particular a pharmaceutical composition developing an MDR inhibiting activity, containing cinchonine or cinchonidine as active ingredient.
Cinchonine and cinchonidine are known substances, of the class of alkaloids, proposed as therapeutic anti-malaria agents. Their pharmacology is known, in particular their toxicity.
According to the invention, cinchonine and cinchonidine can be advantageously used, in the form of a pharmaceutical composition, preferably dissolved in a medium suitable for parenteral administration, for example subcutaneous or intramuscular route. Within such compositions, cinchonine and cinchonidine can also be associated with a particulate vehicle such as a microcapsule or microparticle, a nanocapsule or nanoparticle. As a vehicle, it is advantageous to use a liposome.
According to the invention, the desired inhibitory effect can be obtained at doses at which the harmful side effects due to the intrinsic toxicity of cinchonine or cinchonidine are not observed in the subjects treated. Of course, the optimal therapeutic doses will depend on the type of tumor treated, the nature of the cytotoxic agent used jointly, the subject treated or other factors that those skilled in the art will be able to understand.
Cytotoxic substances sensitive to the phenomenon of MDR, the activity of which can be advantageously potentiated by the concomitant action of cinchonine or cinchonidine, are mentioned below; this list is not exhaustive, however.
They are essentially hydrophobic substances, having in common a positively charged nitrogenous residue, such as vinca alkaloids, anthracyclines or similar products, epipodophyllotoxins or anti-tumor antibiotics for example. Mention may in particular be made of vincristine, vinblastine, vindesine, vinorelbine, doxorubicin, deoxydoxorubicin, tetrahydropyranyladriamycin, epidoxorubicin, aclacinomycin, demethoxydaunorubisanthrene, mithramycin, mithramycin etoposide, tenoposide, emetine, ethidium bromide, cytochalasine, colchicine and taxol.
Thanks to the invention, it is possible to propose an appropriate therapeutic treatment for numerous cancerous tumors exhibiting, to varying degrees, multiple resistance to anti-cancer agents (MDR). In this regard, there may be mentioned, inter alia, acute myeloblastic leukemia, acute lymphoblastic leukemia, neuroblastoma, small cell lung cancer, ovarian cancer, non-Hodgkin's lymphoma and diffuse plasmacytoma. These are cancers which present an induced MDR, in response to treatment with a cytotoxic agent.
It is also possible to treat cancers presenting an innate MDR or, at least, cancer cells characterized by the presence, before any treatment, of the corresponding gene of P-gp (mdr 1) at a relatively high rate. These are, for example, adenocarcinoma of the colon, adenocarcinoma of the kidney, adrenocortical carcinoma, pheochromocytoma, sarcomas of children and secondary leukemia. This list is not exhaustive, however.
The experiments described below will illustrate the present invention in more detail, without however limiting it.
a) Demonstration in vitro of the inhibitory activity
a.1. Portions of 10,000 cells from the DHD / K12 / TRb ("drug resistant cell line" / MDR +) line were divided into series and implanted on a slide, 48 hours before treatment.
A first 60-minute incubation was carried out in HAMF 10 medium, distributing the additives as follows:
<tb> <TABLE> Columns = 2
<tb> <SEP> witnesses <SEP> -
<tb> <SEP> zero series <SEP> doxorubicin (DXR) at 10 mu g / ml
<tb> <SEP> series 1 <SEP> DXR (10 mu g / ml) + cinchonine (5 mu g / ml)
<tb> <SEP> series 2 <SEP> DXR (10 mu g / ml) + cinchonidine (5 mu g / ml)
<tb> <SEP> series 3 <SEP> DXR (10 mu g / ml) + quinine (5 mu g / ml)
<tb> <SEP> series 4 <SEP> DXR (10 mu g / ml) + verapamil (5 mu g / ml)
<tb> </TABLE>
Series 3 and 4 are used for comparison, in the case of known MDR inhibitor substances. A second incubation, for 75 minutes, was then carried out in HAMF 10 medium supplemented with a new quantity of inhibitory substance (series 1 to 4). The semi qualitative assessment of the presence of DXR in the cytoplasm of the treated cells was affected by fluorescence microscopy (double reading) to give the results below.
<tb> <TABLE> Columns = 4
<tb> <SEP> indicators <SEP> 0 <SEP> zero series <SEP> 0
<tb> <SEP> series 1 <SEP> ++ <SEP> series 2 <SEP> ++
<tb> <SEP> series 3 <SEP> ++ <SEP> series 4 <SEP> ++
0 = absence of fluorescence
+ = abstract fluorescence unit
<tb> </TABLE>
It is thus found that cinchonine and cinchonidine both exert an inhibitory effect on MDR. This effect is comparable to that observed for quinine and verapamil.
a.2. A comparable experiment was carried out, using portions of 5000 cells each, implanted 48 hours before treatment.
Treatment itself: incubation for 84 hours in HAMF 10 + 10% FCS medium, in the presence or absence of the same inhibitory substances (except verapamil), added at a rate of 5 μg / ml. With regard to the cytotoxic agent, mitoxantrone (MXN) was used, varying its concentration as follows:
0.05 - 0.1 - 1-5 - 10 mu g / ml
The survival rate of the implanted cells was assessed by means of the blue test. The results observed are collated in fig. 1 (1 = cinchonine, 2 = cinchonidine). They confirm that cinchonine and cinchonidine both exert an important inhibitory activity on MDR and potentiate the cytotoxic activity of mitoxantrone.
b) Ex vivo demonstration of the inhibitory activity
b.1 To various groups of 3 rats each, one of the following three inhibitory substances was injected intravenously, at the maximum non-toxic doses:
<tb> <TABLE> Columns = 2
<tb> <SEP> cinchonine <SEP> 50 mg / kg (1)
<tb> <SEP> cinchonidine <SEP> 25 mg / kg (2)
<tb> <SEP> quinine <SEP> 40 mg / kg (3)
<tb> </TABLE>
One hour after the i.v. injection. blood samples were taken from each subject by cardiac puncture. The same procedure was carried out for control rats, not previously treated.
b.2. Portions of 10,000 DHD / K12 / TRb cells (see a.1) were implanted 48 hours before the actual treatment as indicated below, the cytotoxic agent being doxorubicin (DXR).
<tb> <TABLE> Columns = 2
<tb> <SEP> witness <SEP> -
<tb> <SEP> zero series <SEP> DXR (10 mu g / ml) + serum control rats
<tb> <SEP> series 1 <SEP> DXR (10 mu g / ml) + rat serum (1)
<tb> <SEP> series 2 <SEP> DXR (10 mu g / ml) + rat serum (2)
<tb> <SEP> series 3 <SEP> DXR (10 mu g / ml) + rat serum (3)
<tb> </TABLE>
After a first incubation of one hour, 3 successive washes were carried out using HAMF 10, then a second incubation of the washed cells was carried out for one hour, in the presence only of a new dose of the corresponding serum. The semi-qualitative assessment of the retention of DXR by the treated cells was carried out by fluorescence microscopy (double reading) to give the results below.
<tb> <TABLE> Columns = 4
<tb> <SEP> witnesses <SEP> 0
<tb> <SEP> series zero <SEP> 0 <SEP> series 1 <SEP> ++
<tb> <SEP> series 2 <SEP> ++ 1/2 <SEP> series 3 <SEP> +
0 = absence of fluorescence
+ = abstract fluorescence unit
<tb> </TABLE>
It is thus found that cinchonine and cinchonidine are effective ex vivo concerning the inhibitory effect of MDR, and at the very least comparable to quinine. It is also noted that for i.v. administration, cinchonine is less toxic than quinine.
c) Comparison of the inhibitory power of cinchonine compared to that of quinine by ex vivo experimentation.
c.1. In various groups of 3 rats each one of the following three inhibitory substances was injected intraperitoneally, at the following doses:
<tb> <TABLE> Columns = 2
<tb> <SEP> cinchonine <SEP> 75 mg / kg (1)
<tb> <SEP> cinchonine <SEP> 100 mg / kg (2)
<tb> <SEP> cinchonidine <SEP> 100 mg / kg (3)
<tb> <SEP> quinine <SEP> 75 mg / kg (4)
<tb> <SEP> quinine <SEP> 100 mg / kg (5) *
* 2 out of 3 dead rats
<tb> </TABLE>
One hour after the i.p injection, blood samples were taken from each subject by cardiac puncture. The same procedure was carried out for control rats, not previously treated.
c.2. Portions of 10,000 DHD / K12 / Trb cells (see a.1) were implanted 24 hours before the actual treatment, as indicated below, the cytotoxic agent being doxorubicin (DXR) containing 3% DXR <1> <4> C.
<tb> <TABLE> Columns = 2
<tb> <SEP> witnesses <SEP> -
<tb> <SEP> zero series <SEP> DXR (5 mu g / ml) + serum control rats
<tb> <SEP> series 1 <SEP> DXR (5 mu g / ml) + rat serum (1)
<tb> <SEP> series 2 <SEP> DXR (5 mu g / ml) + rat serum (2)
<tb> <SEP> series 3 <SEP> DXR (5 mu g / ml) + rat serum (3)
<tb> <SEP> series 4 <SEP> DXR (5 mu g / ml) + rat serum (4)
<tb> <SEP> series 5 <SEP> DXR (5 mu g / ml) + rat serum (5)
<tb> </TABLE>
After a two hour incubation, followed by three successive washes with PBS-BSA, trypsinization and cell counting, the intracellular radioactivity was measured using a beta counter.
From these measurements, a level of intracytoplasmic doxorubicin is deduced therefrom directly linked to the inhibitory effect of the substance tested. These results are collated in fig. 2.
It is thus found, for the same serum concentration of inhibitory substance, that the level of intracytoplasmic DXR of series 1 (DXR + cinchonine) is six times higher than that of series zero (DXR alone); similarly, this rate is approximately twice that of series 4 (DXR + quinine), even after dilution of the sera by a factor of 2 and 4 respectively.
It has also been found that cinchonine and cinchonidine are clearly less toxic than quinine: for an i.p. 100 mg / kg, two out of three subjects treated with quinine died after injection.
d) In vivo comparison of the inhibitory power of cinchonine compared to that of quinine by in vivo experimentation
D0 was given an intraperitoneal injection of 1,000,000 DHD / K12 / TRb cells per rat, in order to induce in subjects peritoneal carcinomatosis of colonic origin used as an experimental model.
On D1, a simultaneous injection, by the intraperitoneal route, of free doxorubicin (DXR) and of inhibitory substance, in solution in 5% aqueous glucose and at the doses indicated, was carried out.
Group 1: DXR / quinine at a dose of 0.5 mg / kg DXR, respectively 80 mg / kg quinine.
Group 2: DXR / cinchonine at a dose of 0.5 mg / kg DXR, respectively 80 mg / kg cinchonine.
Group 3: DXR (0.5 mg / kg)
Group 4: witnesses
The groups consisted of 5 rats each. These were sacrificed on D27 and, after an autopsy, the weight of the tumor nodules of each subject was measured. The values listed below are averages obtained on 5 subjects per group.
Group 1: 0.2 g (+/- 0.2)
Group 2: 0.1 g (+/- 0.1)
Group 3: 4.8 g (+/- 1.2)
Group 4: 5.0 g (+/- 1.2)
It is thus found that quinine and cinchonine significantly inhibit the resistance of tumors treated with doxorubicin. For an identical dosage, cinchonine is slightly more powerful than quinine in this type of experiment; the additional advantage lies in the lower toxicity of cinchonine as demonstrated above.