Bei den bisher bekannten, im menschlichen Organismus vorkommenden Lipiden unterscheidet man zwei Gruppen: die humoralen, nicht strukturgebundenen Lipide und solche, welche Bestandteile von Zellstrukturen sind.
Zu den humoralen Lipiden, welche bei höheren Organismen eine biologische Funktion ausüben, gehören beispielsweise Steroidhormone und Prostaglandine. Letztere spielen bei entzündlichen Reaktionen der Gewebe eine Rolle.
Die strukturgebundenen Lipide spielen, neben der Energiespeicher-Funktion, vor allem in den Zellstrukturen, welche verschiedene Kompartimente der Zellen trennen, eine wichtige Rolle. In zunehmendem Mass wird erkannt, wie einzelne Lipide die Signalübertragung durch diese Membranen, z.B. durch die Veränderung der Membranfluidität (laterale Diffusionsgeschwindigkeit der Membranlipide) beeinflussen und steuern können. Im Verlauf eines Teilungszyklus der Zellen ändern sich die Membranzusammensetzung und damit die physikalischen Eigenschaften kontinuierlich. Als Komponenten dieser Membranen gelten vor allem Phospholipide, Sterine und Glykosphingolipide.
Die Glykosphingolipide sind Abkömmlinge der Ceramide, welche aus einem Aminodiol wie das Sphingosin
EMI1.1
und einem langkettigen Fettsäurerest (RCO-) bestehen und der folgenden allgemeinen Formel entsprechen:
EMI2.1
An die mit * bezeichnete Hydroxylgruppe der Ceramide ist ein Kohlehydratanteil gebunden, welcher aus 1 bis 20 oder sogar mehr Zuckereinheiten bestehen kann.
Je nach der Natur des Kohlehydratanteils fallen die Glykosphingolipide in zwei Hauptklassen. Bei Verknüpfung des Ceramids mit einem oder mehreren Monosacchariden sind es die neutralen Glykosphingolipide - auch Cerebroside genannt, während die Verknüpfung mit einem Oligosaccharid, welches durch Acylneuraminsäuren (auch Sialinsäuren genannt) substituiert ist, die sauren Glykosphingolipide - auch Ganglioside genannt - ergibt. Letzteren werden Rezeptorfunktionen, z.B. für Viren und Toxine zugeschrieben; ferner sollen sie eine neuro-regenerative Wirkung haben.
Dieser Stand der Technik wird insbesondere durch folgende Abhandlungen veranschaulicht:
- K. Jungermann und H. Möhler: Biochemie, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York 1980, 448-452;
- S. Hakomori, Annual Review of Biochemistry 52 (1981), 733-764.
Bei den eigentlichen, aus dem Hirn stammenden Cerebrosiden besteht die Fettsäurekomponente meistens aus einer C24-Carbonsäure, welche eine Hydroxylgruppe in alpha -Stellung oder eine Doppelbindung tragen kann. Beispielsweise findet sich im Kerasin die Lignocerinsäure C24H48O2, im Nervon die Nervonsäure C24H46O2, im Cerebron oder Phrenosin die Cerebronsäure C24H48O2 und im Hydroxynervon die Hydroxynervonsäure C24H46O3. In diesen und in den meisten Cerebrosiden besteht der Kohlehydratanteil aus 1 Mol Galaktose.
In neuerer Zeit sind weitere neutrale Glykosphingolipide entdeckt worden, welche eine Fettsäurekomponente mit kürzerer aliphatischer Kette und einen aus mehreren Zuckereinheiten bestehenden Kohlehydratanteil aufweisen. Diese Verbindungen sind aber nicht im Gehirn, sondern in anderen Organen, beispielsweise im Darm, in der Milz, in der Leber und in den Erythrozyten, gefunden worden, weshalb der Name Cerebroside nicht mehr oder nur für die zuvor erwähnte Gruppe verwendet werden sollte.
Überraschenderweise wurde nun eine neue Gruppe der neutralen Glykosphingolipide gefunden, welche sich gegenüber den oben erwähnten, bereits bekannten Verbindungen durch eine andere Fettsäurekomponente und/oder einen anderen Kohlehydratanteil, nämlich 1 Mol D-Glukose, auszeichnen. Diese neue chemische Struktur wiederspiegelt sich in einer bei den Glykosphingolipiden bisher ebenfalls unbekannten wundheilungsfördernden bzw. einer zell- und geweberegenerierenden Wirkung.
Diese Verbindungen lassen sich durch folgende Formel wiedergeben:
EMI4.1
in welcher R<1> den Acylrest der Myristin-, Palmitin- oder Stearinsäure oder die entsprechenden Acylreste mit einer Hydroxylgruppe in alpha -Stellung oder mit einer oder zwei Doppelbindungen in cis-Konfiguration und R2 den Pentadecanyl- oder Heptadecanylrest oder die entsprechenden C15- und C17-Reste mit einer, zwei oder drei Doppelbindungen, von welchen jeweils eine in 1,2-Stellung sitzt und trans-Konfiguration aufweist, die andere oder anderen, wenn vorhanden, cis-Konfiguration aufweisen, bedeutet.
Die chemische Struktur ist im Kohlehydratanteil homogen; dennoch ist die Vielfalt der wundheilungsfördernden Glukosphingolipide bemerkenswert. Dabei ist jedoch zu beachten, dass diese Vielfalt alleine durch Variation des Lipidanteils zustandekommt. Das erscheint biologisch sinnvoll, denn hauptsächlich die aus einer Membran nach aussen exponierten Teile eines Moleküls sind für die biologische Aktivität bestimmend. Die Fluidität von Membranen wird z.B. von Glukosphingolipiden beeinflusst, indem das Amidproton des Ceramids mit den Phosphatgruppen von Phospholipiden in Wechselwirkung treten kann und somit einer Lipidmembran mehr Stabilität verleiht als sie nur durch eine Phospholipid/Steroid-Wechselwirkung allein zustande kommen kann.
Als Quelle für die Glukosphingolipide eignen sich Organe und Körperflüssigkeiten von Säugetieren, z.B. Herz, Lunge, Muskeln, Milz, Eingeweide und Blut, vorzugsweise jedoch letzteres. Dabei ist zu beachten, dass dieses Ausgangsmaterial zur Anreicherung des Glukosphingolipids einer Autolyse unterworfen wird, wobei aber schnellwachsende Mikroorganismen zuerst entfernt, abgetötet oder zumindest deren Wachstum durch Zugabe von bakteriostatisch wirkenden Mitteln verhindert werden muss. Im Verlaufe dieser Autolyse werden durch nicht gesteuerte Enzymaktivitäten, wie z.B. Hydrolyse, längere Zuckerketten bis auf das beschriebene Grundgerüst abgebaut, so dass die Anwendung der Autolyse zu einer wesentlich höheren Ausbeute an den Glukosphingolipiden führt.
Die Verbindungen entfalten in vivo eine fördernde Wirkung auf die Zell- und Geweberegeneration. Diese Wirkung lässt sich auch in vitro, mit Hilfe von Zellkulturen, nachweisen. Wird nämlich in einer Zellkultur, beispielsweise eine Fibroblastenkultur, vorerst die Teilungsrate durch Einwirkung eines schädigenden Agens künstlich herabgesetzt und wird die Kultur danach mit den Verbindungen behandelt, so wird die Teilungsrate in kurzer Zeit wieder auf einen normalen, mit jenem einer gesunden, unbeschädigten Kultur vergleichbaren oder identischen Wert gebracht. Dieselbe Behandlung einer parallel geführten, aber gesunden Zellkultur bewirkt hingegen keine Veränderung der Teilungsrate. Es handelt sich also dabei nicht etwa um eine blosse mitotische Wirkung.
Infolge der beschriebenen fördernden Wirkung auf die Regenerationsmechanismen geschädigter Zellen eignen sich die Verbindungen für eine therapeutische Anwendung bei Wunden jeglicher Genese, insbesondere bei schlecht oder langsam heilenden Wunden oder Ulzerationen. In der Tat führen sie insbesondere bei topischer Anwendung auf Wunden, wie Ulcus cruris, diabetischer Gangrän, Strahlenschäden, Verbrennungen und Hauttransplantationen zur Bildung von gesundem, gut durchblutetem neuen Gewebe ohne störende Narben.
Die beschriebenen Glukosphingolipide besitzen die gleiche wundheilungsfördernde Aktivität, ob sie nun in einer angereicherten Fraktion oder in gereinigter Form appliziert werden.
Im Tierversuch kann die erwähnte Heilwirkung wie folgt gezeigt werden:
Versuch 1
Ratten werden narkotisiert und die Fellhaare werden ihnen entfernt. Durch flaches Auflegen einer Metallscheibe von 2 cm Durchmesser und einer Temperatur von 270 DEG C während 17 Sekunden wird beidseitig am Rumpf eine Verbrennungswunde verursacht. Die an Glukosphingolipiden angereicherte Fraktion oder die gemischten, im Lipidanteil heterogenen Glukosphingolipide werden in eine Geléegrundlage eingearbeitet und diese wird täglich zweimal auf die Wunde gestrichen. Es wird die Dauer bis zur Endabheilung der Wunden gemessen. Gelées, welche die Glukosphingolipide enthalten, ergeben gegenüber der Kontrollgruppe eine Verkürzung der Abheilungsdauer um bis zu 21%.
Versuch 2
An Minipigs werden dorsal je vier Verbrennungswunden wie in Versuch 1 beschrieben und mit einem Hohlzylinder-Bohrer 4 Stanzwunden mit einem Durchmesser von 2,5 cm gesetzt. Die Wirkstoffe werden in eine Geléegrundlage eingearbeitet und die Wunden werden zweimal täglich mit dem Gelée bestrichen. Die Dauer bis zur Endabheilung wird festgehalten. Die Dauer bis zur Endabheilung wird durch die Glukosphingolipide um bis zu 18% verkürzt.
Versuch 3
An Minipigs werden, wie in Versuch 1 beschrieben, Verbrennungswunden gesetzt. Nach 6, 12, 18 und 22 Tagen täglicher Wundbehandlung werden aus der Behandlungsgruppe Tiere entfernt und in Narkose getötet. Die Wunden werden ausgeschnitten, halbiert und in 4% gepuffertem Formalin fixiert. Diese Gewebestücke werden zu 4 mu m dicken histologischen Paraffinschnitten verarbeitet. Folgende Parameter werden quantitativ erfasst:
1. Länge der epithelialisierten Wundoberfläche
2. Länge der nicht-epithelialisierten Wundoberfläche
3. Länge des Stratum basale der Epidermis
4. Fläche der neugebildeten Epidermis
5. Fläche von Haarfollikeln und Talgdrüsen
Die Auswertung der Parameter ergibt, dass die mit Glukosphingolipid-haltigem Gelée behandelten Tiere eine längere epithelialisierte Wundoberfläche und eine kürzere nicht-epithelialisierte Wundoberfläche haben als die mit einer wirkstofflosen Geléegrundlage behandelten Tiere.
Versuch 4
An narkotisierten Ratten werden 1 cm breite und 5 mm tiefe Stanzwunden gesetzt. In diese Wundlöcher werden Viskose-Zellulose-Hohlzylinder-Schwämme eingesetzt. In die innere Aushöhlung der Hohlzylinder werden täglich 100 mu l einer glukosphingolipid-haltigen Lösung mit einem Gehalt an Glukosphingolipiden von 0,1 bis 15 mu g/ml eingespritzt. 16 und 24 Tage nach der Implantation werden die Schwämme entnommen und auf den Gehalt an Hämoglobin, Desoxyribonukleinsäure und Hydroxyprolin untersucht. Die Wunden, welche mit den Glukosphingolipiden behandelt worden sind, haben einen signifikant höheren Hämoglobin-, DNS- und Hydroxyprolin-Gehalt in den Schwämmen als jene der Kontrolltiere.
Versuch 5
Fibroblasten-Zellkulturen, welche in einem Nährmedium, das mit Bicarbonat und CO2-haltiger Atmosphäre bei pH 7,2 gepuffert ist, gewachsen sind, werden einem neuen Nährmedium ausgesetzt, das kein Bicarbonat enthält und das normaler Atmosphäre ausgesetzt ist, wobei der pH 7,2 durch Zugabe eines geeigneten, nicht-toxischen Puffers, wie 2-[4-(2-Hydroxyäthyl)-piperazin-1-yl]-äthansulfonsäure/NaOH-Lösung (HEPES), stabilisiert wird. Zellen, welche im Nährmedium kein Glukosphingolipid zur Verfügung haben, stellen das Wachstum nahezu ein, während sich Zellen in wirkstoffhaltigem Medium rasch erholen und die gleiche Wachstumsrate erlangen, wie Kontrollkulturen in bicarbonathaltigem Medium.
Gemessen wird die Wachstumsrate z.B. nach dreitägiger Glukosphingolipid-Wirkung, indem den Zellen während 5 Stunden <3>H-Thymidin angeboten wird. Die Zellen werden danach durch osmotischen Schock aufgeschlossen und die DNS wird auf einem Diäthylaminoäthyl-Filterpapier zurückgehalten. Die Radioaktivität dieser Filter wird gemessen.
Beispiel 1
Geschlachteten Kälbern wird das Blut entnommen und an Ort und Stelle sogleich mit Äthanol bis zu einer Konzentration von 20% behandelt, worauf die Bakteriostatika Methylparaben und Propylparaben - d.h. p-Hydroxybenzoesäure-methylester und -n-propylester - bis zu einer Konzentration von je 0,02% zugegeben werden. Während drei Tagen wird das Blut dann der Autolyse bei Raumtemperatur überlassen; es erfolgt dabei eine weitgehende Hämolyse und ein teilweiser Abbau von nicht beständigen Be- standteilen, gleichzeitig werden aus den Membranen Membrankomponenten herausgelöst. Das Autolysat wird nun vom Sediment durch Dekantieren befreit und die überstehende Flüssigkeit wird während drei Tagen statisch oder dynamisch durch eine Membran mit der Ausschlussgrenze 10 000 Daltons dialysiert.
Bei Anwendung der dynamischen Dialyse werden das Dialysat und das Gegendialysat während drei Tagen im Gegenstromverfahren durch die Dialysemembran gepumpt, so dass immer ein optimales, d.h. möglichst grosses, Konzentrationsgefälle zugunsten der Substanzen mit einem Molekulargewicht unterhalb 10 000 Daltons, besteht.
Das Hämodialysat mit einem Trockengewicht von 5-80 mg/ml enthält Glukosphingolipide bis zu einem Gehalt von 15 mu g/ml.
1,5 Liter Hämodialysat wird mit dem fünffachen Volumen einer Lösung von Chloroform und Methanol im Verhältnis 2:1 während 2 Stunden heftig vermischt. Die Phasen werden getrennt und die organische Phase wird in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum getrocknet. Die trockene Substanz wird in 1,5 Liter Wasser gelöst und der Extraktionsvorgang wird weitere zwei Mal in gleicher Weise wiederholt. Das resultierende trockene Material (1,5 bis 5 g) wird in 20 ml Chloroform: Methanol = 2:1 gelöst und auf eine Kieselgelsäule, welche 1 cm Durchmesser hat und 60 cm lang ist, aufgetragen. Die Kieselgelsäule wurde vorher in Hexan äquilibriert. Nach der Probenauftragung wird die Säule während 2 Stunden mit Hexan gespült mit einem Durchfluss von 3 ml/min. Danach wird mit einem linearen Gradienten über 4 Stunden von 100% Hexan noch 80% Hexan/20% Isopropanol mit 2 ml/min. Durchfluss eluiert.
Die Glukosphingolipide werden bei 19% bis 20% Isopropanol eluiert.
Beispiel 2
Die gemäss dem Beispiel 1 gereinigten Glukosphingolipide werden getrocknet und in 1 ml Chloroform: Methanol = 2:1 gelöst. Von dieser Lösung werden 20 mu l in einem Hochdruck-Flüssigchromatographen mit einer C18-Umkehrphasen-Säule eingespritzt und mit 2 ml/min. 98% Methanol/2% Wasser eluiert.
Die Glukosphingolipide werden mit diesem Verfahren anhand des unterschiedlichen Lipidanteils aufgetrennt. Die Absorption des Eluates wird bei 206 nm gemessen. Es werden dabei mindestens 6 verschiedene Glukosphingolipid-Gruppen festgestellt.
Strukturaufklärung
a) Die gemäss Beispiel 1 gereinigten Glukosphingolipide werden im Rotationsverdampfer getrocknet und in 5 ml 1-normaler Salzsäure in 80% Methanol gelöst. Die Lösung wird in einem stabilen verschlossenen Röhrchen während 18 Stunden auf 70 DEG C erhitzt. Die Glukosphingolipide werden dabei in die Komponenten Fettsäuren, Sphingosine und Glukose hydrolysiert.
Das saure abgekühlte Hydrolysat wird 3 mal mit je 10 ml Diäthyläther intensiv gemischt und die organische Phase jeweils entfernt. Die Ätherphasen werden vereinigt, unter Stickstoffatmosphäre getrocknet und in einem kleinen Volumen Chloroform/Methanol gelöst.
Diese Lösung wird mit p-Brom-phenacylbromid verestert und das Produkt in einem Hochdruckflüssigchromatographen mit einer C-18-Umkehrphasen-Säule injiziert. Die Säule (25 cm x 0,4 cm) wird mit 1 ml/min. Methanol: Acetoni tril: Wasser = 82:9:9 eluiert und die Absorption des Eluates bei 254 nm wird gemessen. Ein Vergleich der Retentionszeiten der eluierten Substanzen mit denjenigen von käuflichen Fettsäuren, welche in gleicher Weise mit p-Bromphenacylbromid verestert wurden, ergibt, dass die ursprünglich an das Glukosphingolipid gebundenen Fettsäuren folgende Moleküle sind:
<tb><TABLE> Columns=2
<tb> <SEP>Myristinsäure C14H28O2
<tb> <SEP>Palmitinsäure C16H32O2 <SEP>Palmitoleinsäure C16H30O2
<tb> <SEP>Stearinsäure C18H36O2 <SEP>\lsäure C18H34O2
<tb> <SEP>Linolsäure C18H32O2
<tb> <SEP> alpha -Hydroxypalmitinsäure C16H32O3
<tb> <SEP> alpha -Hydroxystearinsäure C18H36O3
<tb></TABLE>
b) Die bei der Hydrolyse gemäss Abschnitt (a) verbleibende wässrige Phase wird mit 0,2 M Natriumboratpuffer auf pH 8,5 eingestellt und in gleicher Weise 3 mal mit je 10 ml Diäthyläther extrahiert. Die gesammelten Ätherphasen werden vereinigt und unter Stickstoffatmosphäre auf 1 ml eingeengt. Dazu wird 1 ml einer Lösung von 1 mg/ml Fluorescamin in Diäthyläther gegeben. Das Fluorescamin bindet die durch die Hydrolyse freigesetzte Aminogruppe der Sphingosine und ergibt ein Produkt, welches durch Anregung bei 380 nm bei 480 nm fluoresziert.
10 mu l dieser Lösung werden in einen Hochdruckflüssig-Chromographen mit einer C18-Umkehrphasen-Säule eingespritzt. Die Säule wird mit einem linearen Gradienten von 60/40 Methanol: Wasser bis 100% Methanol, 1 ml/min während 15 Minuten, eluiert und die Fluoreszenz des Eluates bei 380 nm Exitationswellenlänge und 480 nm Emissionswellenlänge gemessen.
Es werden peaks festgestellt, deren Retentionszeiten den Sphingosinen mit folgenden aliphatischen Ketten entsprechen:
<tb><TABLE> Columns=3
<tb> <SEP>C18-Kette <SEP>4-Hydroxy-C18-Kette
<tb> <SEP>C20-Kette <SEP>4-Hydroxy-C20-Kette
<tb> <SEP>C18-Kette mit 2 Doppelbindungen
<tb> <SEP>C20-Kette, gesättigt (Phytosphingosin)
<tb></TABLE>
c) Die verbleibende wässrige Phase aus den Abschnitten (a) und (b) wird mit 0,3 m Triäthanolamin-Puffer auf pH 7,5 eingestellt. Zu dieser Lösung werden 6,8 mu g/ml Hexokinase (1,0 Einheit/ml), 10 mM Adenosintriphosphat, 6,8, mu g/ml Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase (1,0 Einheit/ml) und 0,8 mM Nicotinsäureamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADP) gegeben. Nach 10-minütiger Inkubation wird die Absorption bei 340 nm gemessen. Dieser Wert ist ein Mass für die vorhandene Glukosemenge.
Charakterisierung
a) Von den gemäss Beispiel 1 gereinigten Glukosphingolipiden werden 5-50 mu g auf eine Kieselgel-Dünnschichtplatte punktförmig aufgetragen. Die Platte wird in Chloroform: Methanol: Wasser = 85:14:1 entwickelt und dann getrocknet. Daraufhin wird sie um 90 DEG gewendet in einem neuen Fliessmittel, nämlich 90% Ameisensäure: Methanol: Chloroform = 12:18:90 entwickelt. Die Dünnschicht-Platte wird nach dem Trocknen mit einer Lösung von 0,1% Orcinol, 2 m H2SO4 und 50%igem Äthanol besprüht und dann während 2 bis 10 Minuten bei 120 DEG C getrocknet. Die Glukosphingolipide erscheinen als violettblauer Fleck bei RfI / RfII = 0,20 / 0,42.
b) 1 mg der nach Beispiel 1 gereinigten Glukosphingolipide wird in 0,5 ml Dimethylsulfoxid gelöst. In einen Protonen-Kernresonanz-Spektrometer werden die chemischen Verschiebungen bei einer Anregung mit 360 MHz gemessen. Das Spektrum ergibt folgende, für Glukosphingolipide charakteri stische funktionelle Gruppen:
<tb><TABLE> Columns=2
<tb>Title: Tabelle I
<tb>Head Col 01 AL=L: Proton(en)
<tb>Head Col 02 AL=L: delta (ppm)
<tb> <SEP>Amidproton von Ceramid <SEP>7,5
<tb> <SEP>Olefinische Protonen <SEP>5,4-5,6
<tb> <SEP>1-H der Glukose <SEP>4,1
<tb> <SEP>Methylengruppen <SEP>1,2
<tb> <SEP>terminale Methylgruppen <SEP>0,85
<tb></TABLE>
c) Eine Lösung von 5 mg/ml der nach Beispiel 1 gereinigten Glukosphingolipide wird in Chloroform:Methanol = 2:1 gelöst und ein Teil dieser Lösung wird auf den Probenträgerdraht eines Felddesorptions-Massenspektrometers gebracht. Das Massenspektrum wird unter folgenden Bedingungen aufgenommen:
Gerät: MAT 212
Beschleunigungsspannung: + 3 kV
Kathoden-Potential: - 5,2 kV
Ionenquellen-Temperatur: 90 DEG C
Emitter-Heizstrom: 23-26 mA
Es werden peaks mit folgenden Massenzahlen festgestellt:
<tb><TABLE> Columns=4
<tb>
<tb>Title: Tabelle II
<tb>Head Col 01 AL=L: Fettsäuren
<tb>Head Col 02 AL=L: Sphingosin
<tb>Head Col 03 AL=L: Doppel
bindung(en)
<tb>Head Col 04 AL=L: Massenzahl
<tb> <SEP>C14 <SEP>C18 <SEP>1 <SEP>671
<tb> <SEP>C16 <SEP>C18 <SEP>1 <SEP>699
<tb> <SEP>C18 <SEP>C18 <SEP>1 <SEP>727
<tb> <SEP>C20 <SEP>C18 <SEP>1 <SEP>755
<tb> <SEP>C14 <SEP>C20 <SEP>1 <SEP>699
<tb> <SEP>C16 <SEP>C20 <SEP>1 <SEP>727
<tb> <SEP>C18 <SEP>C20 <SEP>1 <SEP>755
<tb> <SEP>C20 <SEP>C20 <SEP>1 <SEP>783
<tb> <SEP>C14 <SEP>C18 <SEP>2 <SEP>669
<tb> <SEP>C16 <SEP>C18 <SEP>2 <SEP>697
<tb> <SEP>C18 <SEP>C18 <SEP>2 <SEP>725
<tb> <SEP>C20 <SEP>C18 <SEP>2 <SEP>753
<tb> <SEP>C14 <SEP>C20 <SEP>2 <SEP>697
<tb> <SEP>C16 <SEP>C20 <SEP>2 <SEP>725
<tb> <SEP>C18 <SEP>C20 <SEP>2 <SEP>753
<tb> <SEP>C20 <SEP>C20 <SEP>2 <SEP>781
<tb>
<SEP>C14 <SEP>C18 <SEP>3 <SEP>667
<tb> <SEP>C16 <SEP>C18 <SEP>3 <SEP>695
<tb> <SEP>C18 <SEP>C18 <SEP>3 <SEP>723
<tb> <SEP>C20 <SEP>C18 <SEP>3 <SEP>751
<tb> <SEP>C14 <SEP>C20 <SEP>3 <SEP>695
<tb> <SEP>C16 <SEP>C20 <SEP>3 <SEP>723
<tb> <SEP>C18 <SEP>C20 <SEP>3 <SEP>751
<tb> <SEP>C20 <SEP>C20 <SEP>3 <SEP>679
<tb> <SEP>C14 <SEP>C18 <SEP>0 <SEP>673
<tb> <SEP>C16 <SEP>C18 <SEP>0 <SEP>701
<tb> <SEP>C18 <SEP>C18 <SEP>0 <SEP>729
<tb> <SEP>C20 <SEP>C18 <SEP>0 <SEP>757
<tb> <SEP>C14 <SEP>C20 <SEP>0 <SEP>701
<tb> <SEP>C16 <SEP>C20 <SEP>0 <SEP>729
<tb> <SEP>C18 <SEP>C20 <SEP>0 <SEP>757
<tb> <SEP>C20 <SEP>C20 <SEP>0 <SEP>785
<tb> <SEP>C14, -OH <SEP>C18 <SEP>0 <SEP>687
<tb> <SEP>C16, -OH <SEP>C18 <SEP>0 <SEP>715
<tb> <SEP>C18, -OH <SEP>C18 <SEP>0 <SEP>743
<tb> <SEP>C20, -OH <SEP>C18 <SEP>0 <SEP>771
<tb> <SEP>C14, -OH <SEP>C20 <SEP>0 <SEP>715
<tb> <SEP>C16,
-OH <SEP>C20 <SEP>0 <SEP>743
<tb> <SEP>C18, -OH <SEP>C20 <SEP>0 <SEP>771
<tb> <SEP>C20, -OH <SEP>C20 <SEP>0 <SEP>799
<tb></TABLE>
A distinction is made between two groups of the previously known lipids occurring in the human organism: the humoral, non-structure-bound lipids and those which are components of cell structures.
The humoral lipids, which have a biological function in higher organisms, include, for example, steroid hormones and prostaglandins. The latter play a role in inflammatory tissue reactions.
In addition to the energy storage function, the structure-bound lipids play an important role, above all in the cell structures that separate different compartments of the cells. It is increasingly recognized how individual lipids signal transmission through these membranes, e.g. can influence and control by changing the membrane fluidity (lateral diffusion rate of the membrane lipids). In the course of a cell division cycle, the membrane composition and thus the physical properties change continuously. The main components of these membranes are phospholipids, sterols and glycosphingolipids.
The glycosphingolipids are descendants of the ceramides, which are derived from an aminodiol such as sphingosine
EMI1.1
and a long chain fatty acid residue (RCO-) and correspond to the following general formula:
EMI2.1
A carbohydrate portion is bound to the hydroxyl group of the ceramides, which can consist of 1 to 20 or even more sugar units.
Depending on the nature of the carbohydrate content, the glycosphingolipids fall into two main classes. When the ceramide is linked with one or more monosaccharides, it is the neutral glycosphingolipids - also called cerebrosides, while the linkage with an oligosaccharide which is substituted by acylneuraminic acids (also called sialic acids) results in the acidic glycosphingolipids - also called gangliosides. The latter become receptor functions, e.g. attributed to viruses and toxins; they are also said to have a neuro-regenerative effect.
This prior art is illustrated in particular by the following treatises:
- K. Jungermann and H. Möhler: Biochemistry, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York 1980, 448-452;
- S. Hakomori, Annual Review of Biochemistry 52 (1981), 733-764.
In the actual cerebrosides originating from the brain, the fatty acid component usually consists of a C24 carboxylic acid, which can carry a hydroxyl group in the alpha position or a double bond. For example, lignoceric acid C24H48O2 is found in kerasin, nerve acid C24H46O2 in nerve, cerebronic acid C24H48O2 in cerebron or phrenosine and hydroxynervonic acid C24H46O3 in hydroxynervon. In these and most cerebrosides, the carbohydrate portion consists of 1 mol of galactose.
More neutral glycosphingolipids have recently been discovered, which have a fatty acid component with a shorter aliphatic chain and a carbohydrate component consisting of several sugar units. However, these compounds have not been found in the brain, but in other organs, for example in the intestine, spleen, liver and erythrocytes, which is why the name cerebroside should no longer be used or should only be used for the aforementioned group.
Surprisingly, a new group of neutral glycosphingolipids has now been found, which are distinguished from the above-mentioned, known compounds by a different fatty acid component and / or a different carbohydrate content, namely 1 mol of D-glucose. This new chemical structure is reflected in a wound healing or cell and tissue regenerating effect, which was previously unknown in glycosphingolipids.
These compounds can be represented by the following formula:
EMI4.1
in which R <1> the acyl radical of myristic, palmitic or stearic acid or the corresponding acyl radicals with a hydroxyl group in the alpha position or with one or two double bonds in the cis configuration and R2 the pentadecanyl or heptadecanyl radical or the corresponding C15 and C17 residues with one, two or three double bonds, one of which is in the 1,2-position and has the trans configuration, the other or other, if present, means the cis configuration.
The chemical structure is homogeneous in the carbohydrate portion; nevertheless, the variety of glucosphingolipids that promote wound healing is remarkable. It should be noted, however, that this diversity arises solely by varying the lipid content. This seems biologically sensible, because mainly the parts of a molecule exposed to the outside of a membrane are decisive for the biological activity. The fluidity of membranes is e.g. influenced by glucosphingolipids in that the amide proton of the ceramide can interact with the phosphate groups of phospholipids and thus give a lipid membrane more stability than can only be achieved by a phospholipid / steroid interaction alone.
Organs and body fluids of mammals are suitable as a source of the glucosphingolipids, e.g. Heart, lungs, muscles, spleen, intestines and blood, but preferably the latter. It should be noted that this starting material for the enrichment of the glucosphingolipid is subjected to an autolysis, but fast-growing microorganisms must first be removed, killed or at least their growth must be prevented by adding bacteriostatic agents. In the course of this autolysis, uncontrolled enzyme activities, e.g. Hydrolysis, longer sugar chains broken down to the basic structure described, so that the use of autolysis leads to a substantially higher yield of the glucosphingolipids.
The compounds have a promoting effect on cell and tissue regeneration in vivo. This effect can also be demonstrated in vitro using cell cultures. If, in a cell culture, for example a fibroblast culture, the division rate is first artificially reduced by the action of a damaging agent and if the culture is then treated with the compounds, the division rate will quickly become comparable to that of a healthy, undamaged culture or brought identical value. However, the same treatment of a parallel but healthy cell culture does not change the division rate. So this is not a mere mitotic effect.
As a result of the described promoting effect on the regeneration mechanisms of damaged cells, the compounds are suitable for therapeutic use in wounds of any origin, in particular in poorly or slowly healing wounds or ulcerations. Indeed, especially when applied topically to wounds such as leg ulcers, diabetic gangrene, radiation damage, burns and skin grafts, they lead to the formation of healthy, well-perfused new tissue without disruptive scars.
The glucosphingolipids described have the same wound-promoting activity, whether they are applied in an enriched fraction or in a purified form.
In animal experiments, the healing effects mentioned can be shown as follows:
Trial 1
Rats are anesthetized and their fur is removed. A flat wound on a metal disc with a diameter of 2 cm and a temperature of 270 ° C for 17 seconds causes a burn wound on both sides of the fuselage. The fraction enriched in glucosphingolipids or the mixed glucosphingolipids which are heterogeneous in the lipid fraction are incorporated into a jelly base and this is applied twice a day to the wound. The time taken for the wounds to heal completely is measured. Jellies containing the glucosphingolipids reduce the healing time by up to 21% compared to the control group.
Trial 2
On Minipigs, four burn wounds are made dorsally as described in Experiment 1 and 4 punch wounds with a diameter of 2.5 cm are made with a hollow cylinder drill. The active ingredients are incorporated into a jelly base and the wounds are coated with the jelly twice a day. The duration until the final healing is recorded. The time until final healing is reduced by up to 18% thanks to the glucosphingolipids.
Trial 3
As described in experiment 1, burn wounds are made on minipigs. After 6, 12, 18 and 22 days of daily wound treatment, animals are removed from the treatment group and killed under anesthesia. The wounds are cut out, halved and fixed in 4% buffered formalin. These tissue pieces are processed into 4 µm thick histological paraffin sections. The following parameters are recorded quantitatively:
1. Length of the epithelialized wound surface
2. Length of the non-epithelialized wound surface
3. Length of the basal stratum of the epidermis
4. Area of the newly formed epidermis
5. Area of hair follicles and sebaceous glands
The evaluation of the parameters shows that the animals treated with jelly containing glucosphingolipid have a longer epithelialized wound surface and a shorter non-epithelialized wound surface than the animals treated with an active ingredient-free jelly base.
Trial 4
Punch wounds 1 cm wide and 5 mm deep are made on anesthetized rats. Viscose cellulose hollow cylinder sponges are inserted into these wound holes. 100 μl of a glucosphingolipid-containing solution with a glucosphingolipid content of 0.1 to 15 μg / ml are injected into the inner cavity of the hollow cylinder daily. 16 and 24 days after the implantation, the sponges are removed and examined for the content of hemoglobin, deoxyribonucleic acid and hydroxyproline. The wounds treated with the glucosphingolipids have a significantly higher level of hemoglobin, DNA and hydroxyproline in the sponges than those of the control animals.
Trial 5
Fibroblast cell cultures grown in a nutrient medium buffered with bicarbonate and a CO2-containing atmosphere at pH 7.2 are exposed to a new nutrient medium which contains no bicarbonate and which is exposed to the normal atmosphere, the pH 7, 2 is stabilized by adding a suitable, non-toxic buffer, such as 2- [4- (2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] ethanesulfonic acid / NaOH solution (HEPES). Cells that have no glucosphingolipid in the nutrient medium almost stop growing, while cells in the active substance-containing medium recover quickly and achieve the same growth rate as control cultures in bicarbonate-containing medium.
The growth rate is measured e.g. after three days of glucosphingolipid activity by offering cells <3> H-thymidine for 5 hours. The cells are then disrupted by osmotic shock and the DNA is retained on a diethylaminoethyl filter paper. The radioactivity of these filters is measured.
example 1
The blood is taken from slaughtered calves and treated on the spot with ethanol up to a concentration of 20%, whereupon the bacteriostatics methyl paraben and propyl paraben - i.e. p-Hydroxybenzoic acid methyl ester and n-propyl ester - are added up to a concentration of 0.02% each. The blood is then left to autolysis at room temperature for three days; Extensive hemolysis and partial degradation of non-stable components take place, at the same time membrane components are released from the membranes. The sediment is then removed from the autolysate by decantation and the supernatant liquid is dialyzed statically or dynamically for three days through a membrane with an exclusion limit of 10,000 daltons.
When using dynamic dialysis, the dialysate and the counter dialysate are pumped through the dialysis membrane in a countercurrent process for three days, so that an optimal, i.e. greatest possible concentration gradient in favor of the substances with a molecular weight below 10,000 Daltons.
The hemodialysate with a dry weight of 5-80 mg / ml contains glucosphingolipids up to a content of 15 mu g / ml.
1.5 liters of hemodialysate is mixed vigorously with five times the volume of a solution of chloroform and methanol in a ratio of 2: 1 for 2 hours. The phases are separated and the organic phase is dried in a rotary evaporator under vacuum. The dry substance is dissolved in 1.5 liters of water and the extraction process is repeated two more times in the same way. The resulting dry material (1.5 to 5 g) is dissolved in 20 ml of chloroform: methanol = 2: 1 and applied to a silica gel column which is 1 cm in diameter and 60 cm in length. The silica gel column was previously equilibrated in hexane. After sample application, the column is rinsed with hexane for 2 hours at a flow rate of 3 ml / min. Then with a linear gradient over 4 hours of 100% hexane, 80% hexane / 20% isopropanol at 2 ml / min. Flow eluted.
The glucosphingolipids are eluted at 19% to 20% isopropanol.
Example 2
The glucosphingolipids purified according to Example 1 are dried and dissolved in 1 ml chloroform: methanol = 2: 1. 20 μl of this solution are injected in a high-pressure liquid chromatograph with a C18 reverse phase column and at 2 ml / min. 98% methanol / 2% water eluted.
The glucosphingolipids are separated using this method based on the different lipid content. The absorption of the eluate is measured at 206 nm. At least 6 different glucosphingolipid groups are found.
Structure elucidation
a) The glucosphingolipids purified according to Example 1 are dried in a rotary evaporator and dissolved in 5 ml of 1 normal hydrochloric acid in 80% methanol. The solution is heated in a stable, sealed tube to 70 ° C. for 18 hours. The glucosphingolipids are hydrolyzed into the components fatty acids, sphingosines and glucose.
The acidic cooled hydrolyzate is mixed intensively 3 times with 10 ml of diethyl ether and the organic phase is removed in each case. The ether phases are combined, dried under a nitrogen atmosphere and dissolved in a small volume of chloroform / methanol.
This solution is esterified with p-bromo-phenacyl bromide and the product is injected in a high pressure liquid chromatograph with a C-18 reverse phase column. The column (25 cm x 0.4 cm) is at 1 ml / min. Methanol: Acetonitrile: water = 82: 9: 9 eluted and the absorption of the eluate at 254 nm is measured. A comparison of the retention times of the eluted substances with those of commercially available fatty acids, which were esterified in the same way with p-bromophenacyl bromide, shows that the fatty acids originally bound to the glucosphingolipid are the following molecules:
<tb> <TABLE> Columns = 2
<tb> <SEP> myristic acid C14H28O2
<tb> <SEP> palmitic acid C16H32O2 <SEP> palmitoleic acid C16H30O2
<tb> <SEP> stearic acid C18H36O2 <SEP> \ oleic acid C18H34O2
<tb> <SEP> linoleic acid C18H32O2
<tb> <SEP> alpha-hydroxypalmitic acid C16H32O3
<tb> <SEP> alpha-hydroxystearic acid C18H36O3
<tb> </TABLE>
b) The aqueous phase remaining in the hydrolysis according to section (a) is adjusted to pH 8.5 with 0.2 M sodium borate buffer and extracted in the same way 3 times with 10 ml of diethyl ether. The collected ether phases are combined and concentrated to 1 ml under a nitrogen atmosphere. For this purpose, 1 ml of a solution of 1 mg / ml fluorescamine in diethyl ether is added. The fluorescamine binds the amino group of the sphingosines released by the hydrolysis and results in a product which fluoresces by excitation at 380 nm at 480 nm.
10 μl of this solution are injected into a high-pressure liquid chromograph with a C18 reverse phase column. The column is eluted with a linear gradient of 60/40 methanol: water to 100% methanol, 1 ml / min for 15 minutes and the fluorescence of the eluate is measured at 380 nm excitation wavelength and 480 nm emission wavelength.
Peaks are determined whose retention times correspond to the sphingosines with the following aliphatic chains:
<tb> <TABLE> Columns = 3
<tb> <SEP> C18 chain <SEP> 4-hydroxy-C18 chain
<tb> <SEP> C20 chain <SEP> 4-hydroxy-C20 chain
<tb> <SEP> C18 chain with 2 double bonds
<tb> <SEP> C20 chain, saturated (phytosphingosine)
<tb> </TABLE>
c) The remaining aqueous phase from sections (a) and (b) is adjusted to pH 7.5 with 0.3 M triethanolamine buffer. 6.8 μg / ml hexokinase (1.0 unit / ml), 10 mM adenosine triphosphate, 6.8 μg / ml glucose-6-phosphate dehydrogenase (1.0 unit / ml) and 0 , 8 mM nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) was given. After incubation for 10 minutes, the absorbance is measured at 340 nm. This value is a measure of the amount of glucose present.
characterization
a) 5-50 μg of the glucosphingolipids purified according to Example 1 are applied in spots to a thin layer of silica gel. The plate is developed in chloroform: methanol: water = 85: 14: 1 and then dried. Then it is turned around 90 ° in a new superplasticizer, namely 90% formic acid: methanol: chloroform = 12:18:90 developed. After drying, the thin-layer plate is sprayed with a solution of 0.1% orcinol, 2M H2SO4 and 50% ethanol and then dried at 120 ° C. for 2 to 10 minutes. The glucosphingolipids appear as a violet-blue spot at RfI / RfII = 0.20 / 0.42.
b) 1 mg of the glucosphingolipids purified according to Example 1 is dissolved in 0.5 ml of dimethyl sulfoxide. The chemical shifts during excitation at 360 MHz are measured in a proton nuclear magnetic resonance spectrometer. The spectrum shows the following functional groups characteristic of glucosphingolipids:
<tb> <TABLE> Columns = 2
<tb> Title: Table I
<tb> Head Col 01 AL = L: proton (s)
<tb> Head Col 02 AL = L: delta (ppm)
<tb> <SEP> amide proton of ceramide <SEP> 7.5
<tb> <SEP> olefinic protons <SEP> 5.4-5.6
<tb> <SEP> 1-H of glucose <SEP> 4.1
<tb> <SEP> methylene groups <SEP> 1.2
<tb> <SEP> terminal methyl groups <SEP> 0.85
<tb> </TABLE>
c) A solution of 5 mg / ml of the glucosphingolipids purified according to Example 1 is dissolved in chloroform: methanol = 2: 1 and part of this solution is placed on the sample support wire of a field desorption mass spectrometer. The mass spectrum is recorded under the following conditions:
Device: MAT 212
Acceleration voltage: + 3 kV
Cathode potential: - 5.2 kV
Ion source temperature: 90 ° C.
Emitter heating current: 23-26 mA
Peaks with the following mass numbers are found:
<tb> <TABLE> Columns = 4
<tb>
<tb> Title: Table II
<tb> Head Col 01 AL = L: fatty acids
<tb> Head Col 02 AL = L: sphingosine
<tb> Head Col 03 AL = L: double
binding
<tb> Head Col 04 AL = L: mass number
<tb> <SEP> C14 <SEP> C18 <SEP> 1 <SEP> 671
<tb> <SEP> C16 <SEP> C18 <SEP> 1 <SEP> 699
<tb> <SEP> C18 <SEP> C18 <SEP> 1 <SEP> 727
<tb> <SEP> C20 <SEP> C18 <SEP> 1 <SEP> 755
<tb> <SEP> C14 <SEP> C20 <SEP> 1 <SEP> 699
<tb> <SEP> C16 <SEP> C20 <SEP> 1 <SEP> 727
<tb> <SEP> C18 <SEP> C20 <SEP> 1 <SEP> 755
<tb> <SEP> C20 <SEP> C20 <SEP> 1 <SEP> 783
<tb> <SEP> C14 <SEP> C18 <SEP> 2 <SEP> 669
<tb> <SEP> C16 <SEP> C18 <SEP> 2 <SEP> 697
<tb> <SEP> C18 <SEP> C18 <SEP> 2 <SEP> 725
<tb> <SEP> C20 <SEP> C18 <SEP> 2 <SEP> 753
<tb> <SEP> C14 <SEP> C20 <SEP> 2 <SEP> 697
<tb> <SEP> C16 <SEP> C20 <SEP> 2 <SEP> 725
<tb> <SEP> C18 <SEP> C20 <SEP> 2 <SEP> 753
<tb> <SEP> C20 <SEP> C20 <SEP> 2 <SEP> 781
<tb>
<SEP> C14 <SEP> C18 <SEP> 3 <SEP> 667
<tb> <SEP> C16 <SEP> C18 <SEP> 3 <SEP> 695
<tb> <SEP> C18 <SEP> C18 <SEP> 3 <SEP> 723
<tb> <SEP> C20 <SEP> C18 <SEP> 3 <SEP> 751
<tb> <SEP> C14 <SEP> C20 <SEP> 3 <SEP> 695
<tb> <SEP> C16 <SEP> C20 <SEP> 3 <SEP> 723
<tb> <SEP> C18 <SEP> C20 <SEP> 3 <SEP> 751
<tb> <SEP> C20 <SEP> C20 <SEP> 3 <SEP> 679
<tb> <SEP> C14 <SEP> C18 <SEP> 0 <SEP> 673
<tb> <SEP> C16 <SEP> C18 <SEP> 0 <SEP> 701
<tb> <SEP> C18 <SEP> C18 <SEP> 0 <SEP> 729
<tb> <SEP> C20 <SEP> C18 <SEP> 0 <SEP> 757
<tb> <SEP> C14 <SEP> C20 <SEP> 0 <SEP> 701
<tb> <SEP> C16 <SEP> C20 <SEP> 0 <SEP> 729
<tb> <SEP> C18 <SEP> C20 <SEP> 0 <SEP> 757
<tb> <SEP> C20 <SEP> C20 <SEP> 0 <SEP> 785
<tb> <SEP> C14, -OH <SEP> C18 <SEP> 0 <SEP> 687
<tb> <SEP> C16, -OH <SEP> C18 <SEP> 0 <SEP> 715
<tb> <SEP> C18, -OH <SEP> C18 <SEP> 0 <SEP> 743
<tb> <SEP> C20, -OH <SEP> C18 <SEP> 0 <SEP> 771
<tb> <SEP> C14, -OH <SEP> C20 <SEP> 0 <SEP> 715
<tb> <SEP> C16,
-OH <SEP> C20 <SEP> 0 <SEP> 743
<tb> <SEP> C18, -OH <SEP> C20 <SEP> 0 <SEP> 771
<tb> <SEP> C20, -OH <SEP> C20 <SEP> 0 <SEP> 799
<tb> </TABLE>