CH677407A5

CH677407A5 -

Info

Publication number: CH677407A5
Application number: CH409188A
Authority: CH
Inventors: Walter Dr Weil
Original assignee: Inst Zellforschung Und Biolumi
Priority date: 1987-11-06
Filing date: 1988-11-03
Publication date: 1991-05-15
Also published as: FR2622973A1; DE3737649A1

Description

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Beschreibung description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Lumineszenz von Zellkulturen, wobei diese mît eîner lumineszierfähigen, die natürliche Lumineszenz verstärkende, ersten Substanz versehen werden, anschließend mit einer, die Lumineszenz auslösende, zweiten Substanz behandelt werden, und die Lumineszenz photoelektronisch erfaßt wird, sowie eine Vorrichtung zum Durchführen des Verfahrens. The invention relates to a method for determining the luminescence of cell cultures, these being provided with a luminescent, first natural substance which enhances natural luminescence, then treated with a second substance which triggers luminescence, and the luminescence is detected electronically, and also a Device for performing the method.

Derartige Verfahren sind u.a. aus B. Becker, et al. «Application of Intracellular ATP Determination in Lymphocytes for HLA-typing», Journal of Biolu-minescence and Chemieluminescence, Vol. 1,47-51 (1986) bekannt. Unter Lumineszenz im weiteren Sinne sind alte Emissionen von Strahlungsquanten, vor allem Leuchterscheinungen, zu verstehen, die Stoffe nach quantenhafter Anregung ohne Zuhilfenahme von thermischer Energie zeigen. Bei der sogenannten Biolumineszenz kommt die der Aussendung von Lichtquanten vorausgehende Anregung durch eine enzymatisch gesteuerte Oxidation zustande. Am besten bekannt ist dabei dieser Vorgang beim Leuchtkäfer, im Volksmund auch «Glühwürmchen» genannt, bei dem zum Reaktionseintritt Luciferin, Magnesiumionen, ATP (Adenosintriphosphat) und Sauerstoff vorliegen müssen. Das Enzym Lucifera-se katalysiert die Oxidation des Luciferins, wobei ein Photon ausgesandt wird. Die Zahl der ausgesandten Photonen erlaubt Rückschlüsse auf die Aktivität bzw. Vitalität der Zellen. Such methods include from B. Becker, et al. "Application of Intracellular ATP Determination in Lymphocytes for HLA-typing", Journal of Biolu-minescence and Chemieluminescence, Vol. 1,47-51 (1986). Luminescence in the broader sense is to be understood as old emissions of radiation quanta, especially light phenomena, which show substances after quantum excitation without the aid of thermal energy. In so-called bioluminescence, the excitation preceding the emission of light quanta comes about through an enzymatically controlled oxidation. This process is best known for fireflies, popularly known as “fireflies”, in which luciferin, magnesium ions, ATP (adenosine triphosphate) and oxygen must be present to initiate the reaction. The enzyme luciferase catalyzes the oxidation of luciferin, whereby a photon is emitted. The number of photons emitted allows conclusions to be drawn about the activity or vitality of the cells.

Derartige Vorgänge laufen überwiegend nicht unter der von den Glühwürmchen bekannten intensiven Strahlung ab, so daß die Strahlung nicht ausreicht, um direkt gemessen zu werden. In der Lumineszenz-Technologie werden daher in die Organismen bzw. Zellen lumineszierfähige Substanzen als Verstärker eingebracht, die anschließend durch eine auslösende Substanz ggf. unter Mitwirkung eines zelleigenen Enzyms oxidiert werden, wobei dann die Lumineszenz zu beobachten ist. Aus der Intensität der Lumineszenz kann dann auf die Aktivität des Enzyms bzw. der Zellkultur rückgeschlossen werden. Die Lumineszenz bzw. Biolumineszenztechnik hat in den letzten Jahren immer breitere Anwendung gefunden, da eine «Markierung» von Zellen durch lumineszierfähige Substanzen wesentlich einfacher und ungefährlicher ist, als beispielsweise die Markierung mit radioaktiven Isotopen. Such processes mostly do not take place under the intense radiation known from the fireflies, so that the radiation is not sufficient to be measured directly. In luminescence technology, luminescent substances are therefore introduced as amplifiers into the organisms or cells, which are then oxidized by a triggering substance, possibly with the help of a cell's own enzyme, in which case the luminescence can be observed. The activity of the enzyme or the cell culture can then be deduced from the intensity of the luminescence. The luminescence or bioluminescence technique has found increasing use in recent years, since "labeling" cells with luminescent substances is much easier and less dangerous than, for example, labeling with radioactive isotopes.

Bei der Durchführung derartiger Lumineszenz Analyse-Verfahren werden Zellsuspensionen mit den die Lumineszenz verstärkenden Substanzen hergestellt und in diese Suspensionen, die die Lumineszenz auslösenden Substanzen zugefügt. Dabei senden nicht nur die Zellen eine Strahlung aus, sondern auch die in der Lösung noch vorhandene Verstärkersubstanz strahlt selbst. Daraus resultiert ein nachteiliges Signal/Rauschverhältnis zwischen dem von den Zellen ausgesandten Licht und der diese Zellen umgebenden Lösung. When such luminescence analysis methods are carried out, cell suspensions are produced with the substances that enhance the luminescence and the substances that trigger the luminescence are added to these suspensions. Not only do the cells emit radiation, but the amplifier substance still present in the solution also emits radiation. This results in a disadvantageous signal / noise ratio between the light emitted by the cells and the solution surrounding these cells.

Ferner nachteilig an der Lumineszenz-Technologie ist, daß die abgelösten, in der Suspension aufgeschlämmten Zellen sich in ihrer Morphologie gegenüber den ursprünglich haftenden (adhärenten) Zellen unterscheiden. Den Ausgangspunkt der überwiegend zur Zeit verwendeten Zellkulturen bilden Zelltypen, die in situ im Verband wachsen und entsprechende Gewebe bilden. Solche Zellen benötigen, um sich auch in vitro teilen und vermehren zu können, einen Untergrund, auf dem die wachsende Kultur schließlich einen «Rasen» in Form einer Schicht bildet. Löst man eine solche adhärente Zellkulturschicht auf dem üblichen Weg, d.h. enzymatisch von ihrer Unterlage und bringt sie in Suspension, so ändern diese Zellen ihre Morphologie. Sie runden sich dabei ab und nehmen in etwa Kugelform an. Dieser Zustand weicht morphologisch und physiologisch von jenem ab, in dem sich adhärente oder gar in situ wachsende Zellen normalerweise befinden. Dasselbe gilt für Zellinten, die von vornherein als Suspensionskulturen gezüchtet werden. Soll das Verhalten von adhärenten Zellen studiert werden und möchte man dabei brauchbare Aussagen im Rahmen der Lumineszenz-Analytik machen, so ist es notwendig, das jeweilige Experiment so zu gestalten, daß man so nahe als möglich an den in vivo-Zu-stand der verwendeten Zellkulturen herankommt. Dies ist gegenwärtig mit der Suspensionstechnologie nicht im ausreichenden Maße erreicht. Another disadvantage of the luminescence technology is that the detached cells suspended in the suspension differ in their morphology from the originally adhering (adherent) cells. The starting point of the cell cultures mainly used at the moment are cell types that grow in situ in the dressing and form corresponding tissues. In order to be able to divide and multiply in vitro, such cells need a substrate on which the growing culture finally forms a “lawn” in the form of a layer. If one detaches such an adherent cell culture layer in the usual way, i.e. enzymatically from their substrate and brings them into suspension, these cells change their morphology. They round off and take on an approximately spherical shape. This state differs morphologically and physiologically from that in which there are normally adherent or even in situ growing cells. The same applies to cell inks that are grown from the start as suspension cultures. If the behavior of adherent cells is to be studied and if one wishes to make useful statements in the context of luminescence analysis, it is necessary to design the respective experiment in such a way that it is as close as possible to the in vivo state of the used Cell cultures is approaching. At present, this is not sufficiently achieved with suspension technology.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein Verfahren der eingangs genannten Art derart abzuwandeln, daß Lumineszenzanalysen an adhärenten Zellkulturen vorgenommen werden können, wobei lediglich das von den Zellen ausgestrahlte Licht erfaßt werden soll, um dadurch direkte Aussagen über die Zellaktivität bzw. -Vitalität erhalten zu können. Ferner ist Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zur Durchführung eines derartigen Verfahrens zu schaffen. It is therefore an object of the present invention to modify a method of the type mentioned at the outset in such a way that luminescence analyzes can be carried out on adherent cell cultures, only the light emitted by the cells to be detected in order to obtain direct statements about the cell activity or vitality can. It is also an object of the invention to provide an apparatus for performing such a method.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch folgende Verfahrensschritte gelöst: According to the invention, the object is achieved by the following method steps:

a) Kultivieren der zu untersuchenden Zellkultur auf einem Träger haftend, a) culturing the cell culture to be examined adhering to a support,

b) Behandeln der auf dem Träger haftenden Zellkultur mit einer lumineszenzfähigen ersten Substanz, b) treating the cell culture adhering to the support with a luminescent first substance,

c) Entfernen der nicht vom am Träger haftenden Zellkultur aufgenommenen ersten Substanz, und d) Messen der lediglich von der Zellkultur emittierten Strahlung nach Zugabe der zweiten, die Lumineszenz auslösenden Substanz. c) removing the first substance not taken up by the cell culture adhering to the support, and d) measuring the radiation emitted only by the cell culture after adding the second substance which triggers the luminescence.

Durch Kultivieren der Zellkultur auf einem Träger haftend, weisen die Zellen eine Morphologie auf, die einem in vivo gewachsenen Verband bzw. Gewebe entspricht. Durch Behandeln der am Träger haftenden Zellen mit der lumineszenzfähigen ersten Substanz, wird diese in die Zellkultur eingebracht, ohne daß dabei die Zellen abgelöst werden, d.h., ohne daß sich deren morphologische oder physiologische Eigenschaften ändern. Die nicht von der Zeilkultur aufgenommene erste Substanz kann durch Waschen entfernt werden, so daß, falls die die Strahlung auslösende zweite Substanz zugegeben wird, Strahlung lediglich in den Zellen erzeugt wird. Damit entspricht die ausgestrahlte und somit meßbare Strahlung exakt der Aktivität bzw. Vitalität der Zellen, und die Messung wird nicht durch außerhalb By culturing the cell culture adhering to a support, the cells have a morphology that corresponds to a dressing or tissue that has grown in vivo. By treating the cells adhering to the support with the luminescent first substance, the latter is introduced into the cell culture without the cells being detached, i.e. without changing their morphological or physiological properties. The first substance not taken up by the cell culture can be removed by washing, so that if the second substance which triggers the radiation is added, radiation is only generated in the cells. The emitted and thus measurable radiation thus corresponds exactly to the activity or vitality of the cells, and the measurement is not carried out outside

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des Zellverbandes entstehende Strahlung verfälscht. Dadurch sind beispielsweise sehr einfache Absolutmessungen möglich, ohne daß beispielsweise das Grundrauschen kompensierende Vergleichsmessungen durchgeführt werden müssen. Bei einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ist eine von der Außenwelt abschließbare Kulturschalenvorrichtung vorgesehen, in der zumindest ein Träger lösbar unter sterilen Bedingungen aufnehmbar ist, und der zumindest eine aufgenommene Träger ist abwechslungsweise mit Nährlösungen, Waschlösungen, der lumineszenzfähigen ersten Substanz, sowie der die Lumineszenz auslösenden Substanz behandelbar. Die zu untersuchende Zellkultur wird auf dem Träger kultiviert und alle weiteren Behandlungsschritte werden dann an der fest am Träger haftenden Zellkultur durchgeführt. Dabei bleiben die morphologischen Eigenschaften durchweg erhalten. Dabei ist es auch ermöglicht, nach einer erfolgten Messung, die auf dem Träger haftende Kultur weiter zu züchten, und ggf. zu einem späteren Zeitpunkt weitere Messungen durchzuführen. radiation produced by the cell structure is falsified. In this way, for example, very simple absolute measurements are possible without, for example, comparative measurements that compensate for the background noise having to be carried out. In a device according to the invention for carrying out the method, a culture dish device that can be locked from the outside is provided, in which at least one carrier can be detachably accommodated under sterile conditions, and the at least one carrier that is taken up is alternated with nutrient solutions, washing solutions, the luminescent first substance, and that Treatable luminescent substance. The cell culture to be examined is cultivated on the carrier and all further treatment steps are then carried out on the cell culture firmly adhering to the carrier. The morphological properties are retained throughout. It is also possible, after a measurement has taken place, to continue growing the culture adhering to the support and, if appropriate, to carry out further measurements at a later time.

Mit der auf dem Träger haftenden Zellkultur können außerdem auch Toxizitäts-, Konzentrations-, Wirkungs- und Wirksamkeitstests durchgeführt werden. D.h. die adhärente Zell- bzw. Gewebestruktur kann mit toxischen Substanzen verschiedener Konzentrationen versehen werden, die die enzymatische Tätigkeit bzw. die Lumineszenz beeinflussen. Durch Vergleichsmessungen, d.h. Vergleiche zwischen Zellkulturen auf Trägern ohne Giftstoffe und solchen mit Giftstoffen, kann sehr einfach der Einfluß derartiger Substanzen mittels dem erfindungsgemäßen Verfahren bzw. der Vorrichtung durchgeführt werden. The cell culture adhering to the support can also be used to carry out toxicity, concentration, activity and effectiveness tests. I.e. the adherent cell or tissue structure can be provided with toxic substances of different concentrations, which influence the enzymatic activity or the luminescence. By comparative measurements, i.e. Comparisons between cell cultures on carriers without toxins and those with toxins, the influence of such substances can be carried out very easily by means of the method or the device according to the invention.

In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens wird in Schritt a) als Träger ein dünnes Plättchen aus Kunststoff, Glas oder dgl. verwendet, dessen eine Oberfläche mit einem Zellkui-tur-Monolayer kultiviert wird. Dies hat den Vorteil, daß auf dünnen Plättchen, sogenannte Cover Slips, die Zellen in einer Schicht (sogenannte Monolayer) wachsen können. Durch Konfluenz, d.h. eine dichtest mögliche Anordnung von adhärenten Zellen als Monolayer in einer Kultur, ist eine gleichmäßige dichte einschichtige Zellstruktur auf dem Träger erreicht, die zum einen fest haftend ist und außerdem eine gleichmäßige Strahlungsquelle darstellt. Lumineszenzmessungen mit auf dem Träger haftenden Zellen sind jedoch auch möglich, ohne daß Konfluenz erreicht ist. In a particularly advantageous embodiment of the method, a thin plate made of plastic, glass or the like is used as the carrier in step a), one surface of which is cultivated with a cell culture monolayer. This has the advantage that the cells can grow in one layer (so-called monolayer) on thin platelets, so-called cover briefs. By confluence, i.e. A densest possible arrangement of adherent cells as a monolayer in a culture, a uniform, dense, single-layer cell structure is achieved on the carrier, which is on the one hand firmly adherent and also represents a uniform radiation source. However, luminescence measurements with cells adhering to the support are also possible without confluency.

Eine besonders gute Haftung auf der Oberfläche des Trägers ist dadurch erreicht, daß die Zellkultur zunächst auf die Oberfläche des Trägers aufgebracht wird und dieser ein gewisser Zeitraum, vorzugsweise etwa 3 Minuten, gegeben wird, um sich auf der Trägeroberfläche festzusetzen und anschließend eine Nährlösung zugegeben wird. Die «nackte» Zellkultur findet in der kurzen Zeitspanne Kontakt mit der Oberfläche des Trägers und wird dann durch die anschließend vorsichtig aufgebrachte Nährlösung nicht abgespült, so daß ein gezieltes Vermehren nur auf dem Träger stattfindet. Particularly good adhesion to the surface of the support is achieved by first applying the cell culture to the surface of the support and giving it a certain period of time, preferably about 3 minutes, to settle on the support surface and then adding a nutrient solution . The "naked" cell culture comes into contact with the surface of the carrier in the short period of time and is then not rinsed off by the nutrient solution which is subsequently carefully applied, so that targeted propagation takes place only on the carrier.

Dies wird besonders vorteilhaft dadurch verwirklicht, daß der Träger waagrecht gehalten ist, die Zellkultur auf die obere Fläche aufgebracht wird und mit der Nährlösung überschichtet wird. Die Vermehrung der Zellen erfolgt im Brutschrank. Nach 2 bis 3 Tagen ist Konfluenz erreicht. This is achieved particularly advantageously in that the carrier is kept horizontal, the cell culture is applied to the upper surface and is overlaid with the nutrient solution. The cells multiply in the incubator. Confluence is reached after 2 to 3 days.

Ein besonders gutes Trennen von aufgebrachter Schicht und Nährlösung wird dadurch erreicht, daß der Träger nachfolgend an Schritt a) in eine Waschlösung eingelegt wird. Dabei besteht zweckmäßigerweise die Waschlösung aus einer phosphatgepuf-ferten Salzlösung, Dies hat den Vorteil, daß die Zellkultur mit einer für sie verträglichen und lebensgerechten Umgebung versorgt ist. A particularly good separation of the applied layer and nutrient solution is achieved by placing the carrier in a washing solution following step a). The washing solution expediently consists of a phosphate-buffered saline solution. This has the advantage that the cell culture is provided with an environment that is compatible and life-friendly for it.

Ein dauerhafter fester Sitz der Schicht am Träger ist auch dadurch gewährleistet, daß bei dem Waschvorgang, die mit der Zellkultur bewachsene Fläche andauernd nach oben weist. A permanent, tight fit of the layer on the support is also ensured by the fact that during the washing process the surface covered with the cell culture is constantly pointing upwards.

Eine besonders aussagekräftige Lumineszenzmessung ist dadurch ermöglicht, daß nachfolgend an Schritt a) vor Schritt b) eine Kontrolle der auf dem Träger haftenden Zellkultur durchgeführt wird. Die Monolayerschicht auf dem dünnen Plättchen ermöglicht eine Betrachtung beispielsweise durch ein gebräuchliches Lichtmikroskop, ohne daß eine besondere Präparation dafür notwendig ist. Man kann somit vor der eigentlichen Lumineszenzmessung exakt die Oberflächenbesetzung des Trägers feststellen. A particularly meaningful luminescence measurement is made possible by carrying out a check of the cell culture adhering to the support following step a) before step b). The monolayer layer on the thin plate enables viewing, for example, using a conventional light microscope, without the need for any special preparation. The surface coverage of the support can thus be determined exactly before the actual luminescence measurement.

Das Einbringen der lumineszenzfähigen ersten Substanz in die Zellkultur des Trägers, erfolgt besonders schonend und ohne Ablösungsgefahr dadurch, daß in Schritt b) der Träger mit einer die erste Substanz aufweisenden Flüssigkeit überschichtet wird. The introduction of the luminescent first substance into the cell culture of the carrier is carried out particularly gently and without the risk of detachment by covering the carrier with a liquid containing the first substance in step b).

Zweckmäßigerweise ist dabei diese erste Substanz Luminol. This first substance is expediently luminol.

Ein besonders günstiges Entfernen der überschüssigen ersten Substanz in Schritt c) ist dadurch erreicht, daß der Träger in eine Waschlösung getaucht und die erste Substanz abgewaschen wird, ohne dabei die anhaftenden Zellen zu lösen. A particularly favorable removal of the excess first substance in step c) is achieved by immersing the carrier in a washing solution and washing the first substance without loosening the adhering cells.

Ein besonders günstiger, die Aktivität bzw. Vitalität der auf dem Träger haftenden Zellkultur nicht beeinflussender Entfernungsvorgang in Schritt c), ist dadurch erreicht, daß die Waschlösung dieselbe, wie die zum Abwaschen der Nährlösung ist. Dadurch ist erreicht, daß die auf dem Träger haftende Zellkultur auch nach diesem Waschvorgang in demselben für sie verträglichen und lebensnotwendigen Medium aufgenommen ist. Dadurch ist es auch möglich, zwischen den einzelnen Verfahrensschritten, beispielsweise bei einer Automatisierung des Verfahrens, gewisse Stauzeiten durch Aufbewahren des Trägers in dieser Lösung zu überbrücken. A particularly favorable removal process in step c), which does not influence the activity or vitality of the cell culture adhering to the support, is achieved in that the washing solution is the same as that for washing off the nutrient solution. It is thereby achieved that the cell culture adhering to the support is also taken up in this medium, which is compatible and vital for it, after this washing process. This also makes it possible to bridge certain congestion times between the individual process steps, for example when the process is automated, by storing the carrier in this solution.

Eine besonders exakte und aussagekräftige Messung kann dadurch erreicht werden, daß in Schritt d) der plattenförmige Träger in eine eine Meßlösung aufweisendes Gefäß gestellt wird, wobei die Bewuchsfläche auf das photoelektronische Meßgerät zu gerichtet ist. Die «Strahlungsquelle» entspricht somit exakt der mit der Zellkultur bewachsenen Trägeroberfläche, die einen konstanten Abstand zum fotoelektronischen Gerät aufweist, so daß eine besonders einfach zu justierende Meßanordnung ermöglicht ist. A particularly exact and meaningful measurement can be achieved in that in step d) the plate-shaped carrier is placed in a vessel having a measuring solution, the growth area being directed towards the photoelectronic measuring device. The “radiation source” thus corresponds exactly to the carrier surface overgrown with the cell culture, which is at a constant distance from the photoelectronic device, so that a measuring arrangement that is particularly easy to adjust is possible.

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Besonders vorteilhaft stellt das Meßmedium dasselbe Medium wie das Waschmedium zum Abwaschen der Nährlösung bzw. zum Abwaschen der lumineszenzfähigen Substanz dar. Dadurch ist die Zellkultur auch während des eigentlichen Meßvorganges mit der Lösung umspült, mit der sie schon in den vorbereitenden Schritten in Kontakt stand, so daß kein wechselnder Einfluß durch dieses Medium auf die Zellkultur ausgeübt wird. The measuring medium is particularly advantageously the same medium as the washing medium for washing off the nutrient solution or for washing off the luminescent substance. As a result, the cell culture is also washed with the solution during the actual measuring process with which it was already in contact in the preparatory steps, so that no changing influence is exerted on the cell culture by this medium.

Bei einem Verfahren, bei dem die Wirkung einer die Zellstruktur beeinflussenden dritten Substanz gemessen werden soll, wird diese besonders vorteilhaft vor Schritt b) mit der anhaftenden Zellkultur in Berührung gebracht und anschließend wird diese Substanz abgewaschen. In a method in which the effect of a third substance influencing the cell structure is to be measured, this is particularly advantageously brought into contact with the adhering cell culture before step b) and this substance is then washed off.

Gemäß einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem die Wirkung einer die Zellstrukturen beeinflussenden, dritten Substanz gemessen werden soll, kann diese bereits in Schritt a) der Nährlösung zugemischt werden. According to a further variant of the method according to the invention, in which the effect of a third substance influencing the cell structures is to be measured, this can already be added to the nutrient solution in step a).

Eine erfindungsgemäße Vorrichtung weist eine von der Außenwelt abschirmbare Kulturschalenvorrichtung auf, in der zumindest ein Träger lösbar unter sterilen Bedingungen aufnehmbar ist, und der zumindest eine Träger ist abwechslungsweise mit Nährlösung, Waschlösung und erster Substanz behandelbar. A device according to the invention has a culture dish device that can be shielded from the outside world, in which at least one carrier can be detachably accommodated under sterile conditions, and the at least one carrier can be alternately treated with nutrient solution, washing solution and first substance.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, weist der zumindest eine Träger die Form einer dünnen Platte aus Glas, Kunststoff oder dgl. auf, die in waagrechter Position unter eine Fixierieiste einer Kulturschale schiebbar ist, und die Kulturschaienvorrichtung weist mehrere untereinander verbundene Trägeraufnahmebereiche auf. Dadurch können die Träger in der waagrechten Position mit auf der oberen Oberfläche aufgebrachten Kulturschicht gehalten werden, und mehrere derartige Träger gleichzeitig unter gleichen Bedingungen kultiviert werden. Die einzelnen Träger, die mit gleicher und gleichmäßiger Zellkulturschicht versehen sind, können dann mit verschiedenen, beispielsweise toxischen Substanzen behandelt werden, so daß die dann erfolgenden vergleichenden Messungen besonders aussagekräftig sind, da ja von exakt gleichen Zellkulturschichten ausgegangen worden ist. According to a particularly advantageous embodiment of the device according to the invention for carrying out the method, the at least one carrier has the shape of a thin plate made of glass, plastic or the like, which can be pushed in a horizontal position under a fixing bar of a culture dish, and the culture dish device has a plurality of them connected carrier receiving areas. As a result, the supports can be kept in the horizontal position with the culture layer applied to the upper surface, and a plurality of such supports can be cultured simultaneously under the same conditions. The individual supports, which are provided with the same and uniform cell culture layer, can then be treated with different, for example toxic, substances, so that the comparative measurements which then take place are particularly meaningful, since exactly the same cell culture layers have been assumed.

Die Erfindung wird anhand einiger ausgewählter Ausführungsbeispiele im Zusammenhang mit der beiliegenden Zeichnung näher beschrieben und erläutert. Es zeigt die einzige Figur stark schematisiert eine ausgewählte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens, die mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt wird. The invention is described and explained in more detail with the aid of a few selected exemplary embodiments in connection with the accompanying drawing. The single figure shows a highly schematic illustration of a selected variant of the method according to the invention which is carried out with a device according to the invention.

Die in Figur 1 schematisch gezeigte Kulturschale 10 einer erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht aus einer rechteckigen Kunststoffwanne mit einem diese überlappenden Deckel (hier nicht gezeigt). Der Innenraum ist durch eine nicht über die gesamte Länge durchreichende Längsleiste 12 sowie mehrere davon abstehende Querleisten 14, die sich ebenfalls nicht über die ganze Breite erstrecken, in mehrere Bereiche 18 unterteilt. In dem hier gezeigten Ausführungsbeispiel sind sechs Bereiche 18 gezeigt, in weiteren Ausführungsbeispielen sind zehn solche Bereiche vorgesehen. The culture dish 10, shown schematically in FIG. 1, of a device according to the invention consists of a rectangular plastic tub with a cover overlapping it (not shown here). The interior is divided into a plurality of areas 18 by a longitudinal bar 12 which does not extend over the entire length and a plurality of transverse bars 14 projecting therefrom, which likewise do not extend over the entire width. In the exemplary embodiment shown here, six areas 18 are shown; in further exemplary embodiments, ten such areas are provided.

Jeder Bereich 18 ist dazu vorgesehen, einen Träger 20 aufzunehmen. Each area 18 is provided to receive a carrier 20.

Jeder Träger 20 kann dabei unter eine von der Längsleiste 12 etwa mittig zwischen zwei Querleisten 14 ebenfalls in Querrichtung vorspringende Fixierleiste 16 geschoben werden, die ausreichend lang ist, einen Träger 20 in einem Bereich 18 zu halten, es jedoch andererseits ermöglicht, einen Träger 20 durch Ergreifen mit einer Pinzette aus einem Bereich 18 herauszuziehen. Each carrier 20 can be pushed under a fixing strip 16, which also projects in the transverse direction from the longitudinal strip 12 approximately centrally between two transverse strips 14 and is sufficiently long to hold a carrier 20 in an area 18, but on the other hand enables a carrier 20 to pass through Grasp with tweezers to pull out of an area 18.

In der zuvor angesprochenen Ausführung einer Kulturschale mit zehn Bereichen, weist diese ein inneres Längenmaß von 290 mm und eine Innenbreite von etwa 130 mm auf. Die Längsleiste kann, in Abwandlung der oben beschriebenen Ausführung, auch über die gesamte Schalenlänge verlaufen und diese in zwei abgeschlossene Hälften von jeweils fünf Bereichen teilen. Dadurch wird die Möglichkeit geschaffen, in einem abgeschlossenen System gleichzeitig Versuchs- und Kontrollbedingungen zu schaffen, indem die Zellen einer Reihe mit einer Testsubstanz behandelt werden, die gegenüberliegende Reihe aber unbeeinflußt bleibt Die lichte Höhe des Innenraums der Kulturschaie beträgt 18 mm, die Höhe der Längs- bzw. Querleisten ab Innenboden etwa 15 mm. Die Länge der Fixierleiste beträgt 15 mm und sie entspringt aus dem unteren Bereich der Längsleiste knapp oberhalb des Wannenbodens, so daß ein darunter geschobener Träger in der Nähe des Bodens der Kulturschale gehalten ist. Dadurch ist sichergestellt, daß der Träger bei gefüllter Kulturschale stets ausreichend mit Medium bedeckt ist und außerdem das Zellwachstum bei geschlossener Schale unter dem Umkehrmikroskop kontrolliert werden kann. Bei der in Fig. 1 gezeigten Ausführung mit sechs Bereichen 18, Est der Übersicht halber nur eine Fixierleiste 16 mit darunter eingeklemmten Träger 20 gezeigt, es ist selbstverständlich, daß auch die anderen fünf Bereiche 18 gleichermaßen mit Fixierleisten 16 versehen sind und einen Träger 20 aufnehmen können. In the previously mentioned version of a culture dish with ten areas, it has an inner length dimension of 290 mm and an inner width of about 130 mm. In a modification of the embodiment described above, the longitudinal bar can also run over the entire length of the shell and divide it into two closed halves of five areas each. This creates the possibility of simultaneously creating test and control conditions in a closed system by treating the cells of one row with a test substance, but the unaffected row remains unaffected.The clear height of the interior of the culture plate is 18 mm, the height of the longitudinal - or cross bars from the inner floor about 15 mm. The length of the fixing bar is 15 mm and it arises from the lower area of the longitudinal bar just above the bottom of the tub, so that a support pushed under it is held near the bottom of the culture dish. This ensures that the carrier is always adequately covered with medium when the culture dish is full and that cell growth can also be checked under the inverted microscope when the dish is closed. In the embodiment shown in FIG. 1 with six areas 18, for the sake of clarity, only one fixing strip 16 with a carrier 20 clamped underneath is shown; it is self-evident that the other five regions 18 are equally provided with fixing strips 16 and receive a carrier 20 can.

Die Kulturschale 10 ist mit einer Leitung 11 verbunden, über die ein Medium in den Innenraum, wie dies durch einen Pfeil 26 angedeutet ist, eingeführt werden kann. The culture dish 10 is connected to a line 11, via which a medium can be introduced into the interior, as indicated by an arrow 26.

Bei der Durchführung des Verfahrens wird auf einen eingelegten Träger 20 mittels einer Pipette 22 eine Zellkultur, bestehend aus Mäusefibroblasten der Linie L 929, wie dies durch den Pfeil 24 angedeutet ist, aufgebracht. Der Innenraum der Kulturschale 10 ist dabei leer. Soll die Zellkultur unter sterilen Bedingungen aufwachsen, so ist auf der Kulturschale 10, der hier nicht gezeigte Deckel aufgebracht und der Innenraum wurde zuvor mit den bereits eingebrachten Trägern 20 sterilisiert. Der (hier nicht gezeigte) Deckel wird dann unter Sterilbedingungen abgenommen. Mittels der Pipette 22 wird anschließend die Zellsuspension auf den Träger 20 aufpipettiert. Es wird anschließend etwa 3 Minuten gewartet, bis die Zellen Kontakt auf der Oberfläche gefunden haben, dann wird über die Leitung 11 ein Nährmedium zugeführt, wobei die Menge so bemessen wird, daß das Nährmedium die Oberflä5 When carrying out the method, a cell culture consisting of mouse fibroblasts of the L 929 line, as indicated by the arrow 24, is applied to an inserted carrier 20 by means of a pipette 22. The interior of the culture dish 10 is empty. If the cell culture is to be grown under sterile conditions, the cover (not shown here) is applied to the culture dish 10 and the interior was previously sterilized with the carriers 20 already introduced. The lid (not shown here) is then removed under sterile conditions. The cell suspension is then pipetted onto the carrier 20 by means of the pipette 22. It is then waited for about 3 minutes until the cells have found contact on the surface, then a nutrient medium is supplied via line 11, the amount being measured so that the nutrient medium is the surface

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che des Trägers 20 überdeckt. Je nach Nährmedium wird bereits nach einem, spätestens nach zwei Tagen Konfluenz auf dem Träger 20 erreicht. Konfluenz bedeutet eine dichtest mögliche Anordnung von haftenden, bzw. adhärenten Zeilen, als Monolayer in Kultur. che of the carrier 20 covered. Depending on the nutrient medium, confluency is achieved on the carrier 20 after one, at the latest after two days. Confluence means the closest possible arrangement of adhering or adherent lines as a monolayer in culture.

Ein derart mit einer Zellkultur 28 an adhärenten Zellen bewachsener Träger 20, auch Cover Slip (CS) genannt, wird mit einer Pinzette vorsichtig aus der Kulturschale 10 entnommen und in eine weitere Kulturschale 30 eingelegt, die im Prinzip gleich wie die Kulturschale 10 aufgebaut ist, so daß insoweit gleiche Bezugszeichen verwendet werden. Die Kulturschale 30 ist dabei mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS = phosphate buffered saline) gefüllt, die als Waschlösung zum Abwaschen der Nährlösung von der Zellkultur 28 dient. Der Träger 20 wird dabei derart unter die Fixierleiste 16 der Kulturschale 30 geschoben, daß die mit der Zellkultur 28 bewachsene Oberfläche nach oben weist. Durch vorsichtiges Schwenken der Kulturschale 30 oder des Trägers 20 wird die adhärente Zelifläche gewaschen. Der Waschgang kann auch dadurch erfolgen, daß der PBS-Waschpuffer durch die Kulturschale 30 durchgeführt wird, wie dies durch die Pfeile 32 bzw. 34 angedeutet ist. Dadurch, daß die Längs- bzw. Querleisten 12 bzw. 14 sich nicht über die gesamte Kulturschale 30 ausbreiten, können mehrere Träger gleichzeitig (d.h. im hier gezeigten Ausführungsbeispiel sechs Träger 20) gespült werden. A carrier 20, also known as cover slip (CS), which is overgrown with a cell culture 28 on adherent cells, is carefully removed from the culture dish 10 with tweezers and inserted into a further culture dish 30, which in principle has the same structure as the culture dish 10, so that the same reference numerals are used. The culture dish 30 is filled with a phosphate-buffered saline (PBS), which serves as a washing solution for washing off the nutrient solution from the cell culture 28. The carrier 20 is pushed under the fixing bar 16 of the culture dish 30 such that the surface covered with the cell culture 28 faces upward. The adherent cell surface is washed by carefully pivoting the culture dish 30 or the carrier 20. The wash cycle can also be carried out by passing the PBS wash buffer through the culture dish 30, as indicated by the arrows 32 and 34, respectively. Due to the fact that the longitudinal or transverse strips 12 or 14 do not spread over the entire culture dish 30, several carriers can be rinsed simultaneously (i.e. six carriers 20 in the exemplary embodiment shown here).

Vor einer weiteren Behandlung wird die geschlossene Kulturschale 30 unter ein Lichtmikroskop 36 geschoben, um den Aufbau und die Struktur der Zellkultur 28 zu kontrollieren. Dabei wird festgestellt, ob tatsächlich Konfluenz erreicht ist, und ob auch lediglich die gewünschte Kultur sich auf dem Träger 20 angesiedelt hat. Before a further treatment, the closed culture dish 30 is pushed under a light microscope 36 in order to control the structure and structure of the cell culture 28. It is determined whether confluence has actually been reached and whether only the desired culture has settled on the carrier 20.

Die Größe der Kulturschale 30 ist dabei derart, daß sie direkt in gängige Lichtmikroskope mit Umkehrvorrichtung eingeführt werden kann, so daß diese Kontrolltätigkeit unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden kann. The size of the culture dish 30 is such that it can be inserted directly into conventional light microscopes with a reversing device, so that this control activity can be carried out under sterile conditions.

In einem weiteren Verfahrensschritt wird der mit adhärenten Zellen versehene Träger 20 aus der Kulturschale 30 entnommen und in eine weitere Kulturschale 40, die was die Ausmaße bzw. die Raumaufteilung betrifft, gleich aufgebaut ist, wie die zuvor beschriebenen Kulturschalen 10 bzw. 30. In a further method step, the carrier 20 provided with adherent cells is removed from the culture dish 30 and into a further culture dish 40, which is constructed in the same way as the previously described culture dishes 10 and 30, as far as the dimensions and the space distribution are concerned.

Auch hier wird der Träger 20 mit der mit adhärenten Zellen versehenen Fläche nach oben gerichtet unter eine Fixierleiste 16 geschoben. Here, too, the carrier 20 with the surface provided with adherent cells is pushed upwards under a fixing strip 16.

Die Kulturschale 40 wird anschließend mit einer 0,01%igen Lösung von Luminol (3-Aminophthalsäu-rehydrazid) derart gefüllt, daß die bewachsene Oberfläche des Trägers 20 überschichtet wird. Dabei kann die Luminollösung, wie dies durch einen Pfeil 42 angedeutet ist, vollautomatisch in die Zellkulturschale 40 eingeführt werden, so daß auch diese Behandlung auch wieder unter sterilen Bedingungen ablaufen kann. The culture dish 40 is then filled with a 0.01% solution of luminol (3-aminophthalic acid rehydrazide) in such a way that the overgrown surface of the support 20 is covered. The luminol solution, as indicated by an arrow 42, can be introduced into the cell culture dish 40 fully automatically, so that this treatment can also be carried out again under sterile conditions.

Die Luminol-Einwirkzeit beträgt etwa 1 bis 3 Minuten. Je nach Zellkultur bzw. Versuchsbedingungen können selbstverständlich auch andere Luminol-Konzentrationen verwendet werden. The Luminol exposure time is about 1 to 3 minutes. Depending on the cell culture or experimental conditions, other luminol concentrations can of course also be used.

Nach Ablauf der Einwirkungszeit wird der Träger 20 aus der Kulturschale 40 entnommen und in eine weitere Kulturschale 50 überführt, in der eine auf etwa 37°C erwärmte PBS-Waschpufferlösung eingebracht ist, und in der das überschüssige, d.h. nicht von der Zellkultur 28 aufgenommene Luminol abgewaschen wird. Dieser Vorgang kann wiederum, wie zuvor beschrieben, durch Schwenken der Kulturschale 50 bzw. des Trägers 20 oder auch, wie in Rg. 1 gezeigt, durch Durchströmen der Kulturschale 50 mit dem PBS-Waschpuffer, wie dies durch die Pfeile 52 bzw. 54 angedeutet ist, durchgeführt werden. After the exposure time has expired, the carrier 20 is removed from the culture dish 40 and transferred into a further culture dish 50, in which a PBS wash buffer solution heated to about 37 ° C. is introduced, and in which the excess, i.e. Luminol not taken up by the cell culture 28 is washed off. This process can in turn, as described above, by swiveling the culture dish 50 or the carrier 20 or, as shown in FIG. 1, by flowing the culture dish 50 with the PBS washing buffer, as indicated by the arrows 52 and 54, respectively is to be carried out.

Der Träger 20 ist nun so präpariert, daß er der eigentlichen Messung zugeführt werden kann. The carrier 20 is now prepared so that it can be fed to the actual measurement.

Dazu wird der Träger 20 in eine Quarzküvette 60 eingebracht, die mit vertikal verlaufenden Führungsrillen 62 versehen ist, zwischen die der Träger 20 eingeschoben werden kann. For this purpose, the carrier 20 is introduced into a quartz cuvette 60, which is provided with vertically running guide grooves 62, between which the carrier 20 can be inserted.

Die Führungsrillen 62 sind dabei in der Nähe einer Rückwand 63 der Küvette 60 angeordnet. Die mit Zellen bewachsene Oberfläche des Trägers 20 ist dabei auf eine Vorderseite bzw. Vorderwand 65 der Küvette 60 zu gerichtet. The guide grooves 62 are arranged in the vicinity of a rear wall 63 of the cuvette 60. The cell-covered surface of the carrier 20 is directed toward a front or front wall 65 of the cuvette 60.

Die Küvette 60 ist mit einem Meßmedium gefüllt, das im vorliegenden Fall wiederum dieselbe phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) ist, die bereits zuvor beschrieben wurde und als Waschlösung diente. The cuvette 60 is filled with a measuring medium, which in the present case is again the same phosphate-buffered saline solution (PBS) that has already been described above and was used as a washing solution.

Auf dem Boden der Küvette liegt ein mit Teflon überzogenes Magnetstäbchen, ein sogenannter Rührfisch, das über eine hier nicht gezeigte, unterhalb der Küvette angeordnete Rührvorrichtung in Drehung versetzt wird, um das Meßmedium zu rühren. Durch den Rührvorgang wird die die Lumineszenz auslösende Substanz sofort und gleichmäßig mit den Zellen in Kontakt gebracht. Die Meßküvette 60 weist eine Länge von 40 mm, eine Breite bzw. Höhe von 50 mm auf und faßt in etwa 100 ml Flüssigkeit. Die Küvette wird in einer lichtdicht abgeschirmten, hier nicht gezeigten Meßkammer auf einem Sockel, der auf einer drehbaren Scheibe steht, deponiert. Die Meßkammer weist dabei folgende Innenmaße auf: Länge und Breite jeweils etwa 290 mm, Höhe etwa 265 mm. Im Abstand von der Küvette ist ein Pho-tomultiplier 68 angeordnet, der von der Küvette 60 kommende Strahlung, wie dies durch einen Pfeil 66 angedeutet ist, erfaßt. Die lichtempfindliche Kathode des Photomultipliers ist dabei auf -30°C gekühlt Die einfallenden Photonen werden durch den Pho-tomultiplier 68 in Spannungsimpulse umgewandelt, die von einer nachgeschalteten Elektronik 70 verstärkt und durch einen angeschlossenen Computer 72 gespeichert und verarbeitet werden können. Die Ergebnisse können graphisch oder numerisch durch einen Drucker 74 mittels eines Ausdrucks 76 ausgedruckt werden. On the bottom of the cuvette lies a Teflon-coated magnetic rod, a so-called stirring fish, which is rotated by a stirring device, not shown here, arranged below the cuvette in order to stir the measuring medium. The luminescence-inducing substance is immediately and uniformly brought into contact with the cells by the stirring process. The measuring cuvette 60 has a length of 40 mm, a width or height of 50 mm and holds approximately 100 ml of liquid. The cuvette is deposited in a light-tightly shielded measuring chamber (not shown here) on a base that stands on a rotatable disc. The measuring chamber has the following internal dimensions: length and width each about 290 mm, height about 265 mm. A photomultiplier 68 is arranged at a distance from the cuvette and detects radiation coming from the cuvette 60, as indicated by an arrow 66. The light-sensitive cathode of the photomultiplier is cooled to -30 ° C. The incident photons are converted by the photomultiplier 68 into voltage pulses, which can be amplified by a downstream electronics 70 and stored and processed by a connected computer 72. The results can be printed out graphically or numerically by a printer 74 using a printout 76.

Bei der eigentlichen Messung wird nach einer je nach Fragestellung beliebig langen Vorlaufzeit, während der das Meßobjekt, d.h. die adhärenten Zellen auf dem Träger 20 unbeeinflußt bleibt, 1ml einer 1%igen Peroxidase-Lösung über eine lichtdichte Zuleitung von außen, wie dies durch den Pfeil 64 angedeutet ist, in die in der Meßkammer befindliche Küvette 60 injiziert. Die Peroxidase löst die Oxida- In the actual measurement, depending on the question, a long lead time during which the measurement object, i.e. the adherent cells on the carrier 20 remain uninfluenced, 1 ml of a 1% peroxidase solution is injected into the cuvette 60 located in the measuring chamber via a light-tight supply line from the outside, as indicated by arrow 64. The peroxidase dissolves the oxide

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tionsreaktîon des Luminols aus, die mit einer Lichtemission verbunden ist, d.h. es tritt jetzt die zu messende Lumineszenz auf. Die Strahlungsintensität Ist abhängig von der durch die adhärenten Zellen des Trägers 20 aufgenommenen Menge an Luminol, die wiederum in Abhängigkeit von der Aktivität bzw. Vitalität der Zellen steht. Dadurch können direkt aus der Strahlungsintensität Rückschlüsse auf die Aktivität bzw. Vitalität der Zelten gezogen werden. reaction reaction of luminol, which is associated with light emission, i.e. the luminescence to be measured now occurs. The radiation intensity is dependent on the amount of luminol absorbed by the adherent cells of the carrier 20, which in turn depends on the activity or vitality of the cells. This allows direct conclusions to be drawn about the activity or vitality of the tents from the radiation intensity.

Die Meßzeit kann beliebig lange gewählt werden. Da jedoch die meßbare Photonen-Emission relativ schnell abklingt, ist es sinnvoll, die Meßzeit auf maximal 5 Minuten zu beschränken, wobei die Vorlaufzeit etwa höchstens 2 Minuten betragen soll. The measuring time can be chosen as long as desired. However, since the measurable photon emission subsides relatively quickly, it makes sense to limit the measurement time to a maximum of 5 minutes, with the lead time being approximately 2 minutes at the most.

Gemessen wird (in counts per second = cps) die Anfangsintensität und die Kinetik der Photonen-Emission nach Zugabe von Peroxidase. Es können such andere geeignete Enzyme bzw. Enzymgruppen verwendet werden. The initial intensity and the kinetics of the photon emission after adding peroxidase are measured (in counts per second = cps). Other suitable enzymes or enzyme groups can also be used.

In dem zuvor beschriebenen schematischen Verfahrensablauf wurde die Präparation lediglich der Zellkultur beschrieben, so daß die letztendliche Messung Aussagen über die Zellkultur als solche gibt. In the schematic procedure described above, the preparation was described only for the cell culture, so that the final measurement provides information about the cell culture as such.

Dies ist aber nur ein kleiner Anwendungsbereich des erfindungsgemäßen Verfahrens. Ein weiteres Hauptanwendungsgebiet ist die Untersuchung der Toxizität von Verbindungen, die mit der Zellkultur in Verbindung gebracht wurden. Das bedeutet, toxische Substanzen vermindern die Aktivität bzw. Vitalität der Zellkulturen, was bei einer Lumineszenzmessung zu einer verminderten Photonen-Emission führt. However, this is only a small area of application of the method according to the invention. Another main area of application is the study of the toxicity of compounds that have been associated with cell culture. This means that toxic substances reduce the activity or vitality of the cell cultures, which leads to a reduced photon emission when measuring luminescence.

Soll die Wirkung einer toxischen Substanz auf die Zellkultur 28 getestet werden, so sind verschiedene Möglichkeiten gegeben, diese toxische Substanz einwirken zu lassen. If the effect of a toxic substance on cell culture 28 is to be tested, there are various options for allowing this toxic substance to act.

Eine erste Möglichkeit besteht darin, einen Träger 20, nachdem er aus der Kulturschale 30 entnommen wurde, d.h. nachdem die Bewuchsdichte mit einem Mikroskop 36 überprüft wurde, und bevor er in die Kulturschaie 40 mit Luminol eingebracht wird, in eine weitere, hier nicht gezeigte, gleich ausgebildete Kulturschale einzubringen, in der er dann mit der Lösung der zu testenden Substanz überschichtet wird. Die Einwirkzeit richtet sich nach der angenommenen Toxizität bzw. nach der entsprechenden Fragestellung. Beim Testen beispielsweise der Toxizität von Methanol auf die zuvor genannte Mäusefibro-blasten der Linie L 929 wurden Einwirkzeiten zwischen 1 bis 5 Minuten gewählt, wobei verschiedene Konzentrationen an Methanol (100, 90, 80, 70, 40, 10 und 1%) getestet wurden. Nach Ablauf der Einwirkzeit wird der Träger 20 wiederum, wie zuvor beschrieben, in PBS-Puffer gewaschen und danach in die Kulturschale 40 zum Uberschichten mit Luminol gegeben. A first possibility is to remove a carrier 20 after it has been removed from the culture dish 30, i.e. after the growth density has been checked with a microscope 36 and before it is introduced into the culture dish 40 with luminol, it is to be introduced into a further culture dish of the same design, not shown here, in which it is then covered with the solution of the substance to be tested. The exposure time depends on the assumed toxicity or the relevant question. When testing, for example, the toxicity of methanol on the aforementioned mouse fibro-blasts of the L 929 line, exposure times of between 1 and 5 minutes were selected, various concentrations of methanol (100, 90, 80, 70, 40, 10 and 1%) being tested . After the exposure time has expired, the carrier 20 is again washed in PBS buffer, as described above, and then added to the culture dish 40 for coating with luminol.

Im eigentlichen Meßvorgang werden dann in der Küvette 60 einmal die Zellkultur 28 ohne Einfluß der toxischen Substanz Methanol gemessen und anschließend die mit den verschiedenen Konzentrationen behandelten weiteren Proben. In the actual measuring process, the cell culture 28 is then measured once in the cuvette 60 without the influence of the toxic substance methanol, and then the further samples treated with the different concentrations.

Durch die Abnahme der jeweiligen Photoemission kann dann der Einfluß bzw. die Toxizität ermittelt werden. The influence or toxicity can then be determined by reducing the respective photoemission.

Die Messungen sind deshalb besonders aussagekräftig, da die Züchtung der adhärenten Zellen auf den Trägern 20, wie dies zuvor in Zusammenhang mit den Kulturschalen 20 bzw. 30 beschrieben wurde, unter exakt gleichen Bedingungen möglich ist, so daß dann lediglich die Parameter der verschiedenen Toxizitätsmengen bzw. Einwirkzeiten zu berücksichtigen sind. The measurements are therefore particularly meaningful, since the cultivation of the adherent cells on the supports 20, as previously described in connection with the culture dishes 20 or 30, is possible under exactly the same conditions, so that only the parameters of the different amounts of toxicity or Exposure times are to be taken into account.

Diese Verfahrensweise eignet sich als Schnelltest zur Bestimmung von Wirkungs- bzw. Toxizitäts-grenzen der eingesetzten Testsubstanzen, z.B. von Umweltgiften, Arzneistoffen oder dgt. This procedure is suitable as a rapid test for determining the effectiveness or toxicity limits of the test substances used, e.g. of environmental toxins, drugs or dgt.

Eine weitere Möglichkeit zum Einbringen der zu testenden Substanzen besteht darin, diese bereits bei der Anzucht der Zellen diesen beizumischen. Dabei wird die Testsubstanz dem Nährmedium zugemischt, das, wie zuvor beschrieben, im ersten vorbereitenden Schritt der Kulturschaie 10 über die Leitung 11 zugeführt wird. Die durchgeführten Emissionsmessungen geben dann aussagekräftige Informationen darüber, welchen Einfluß diese Substanzen auf die Wachstumsrate bzw. die Vitalität der Zellkulturen ausüben. Diese Möglichkeit bietet sich insbesondere für längerfristige bzw. Langzeittests an und vor allem für die Bestimmung von Wir-kungs- bzw. Toxizitätsgrenzen • hochverdünnter Testsubstanzen. Another way of introducing the substances to be tested is to add them to the cells when they are grown. The test substance is mixed into the nutrient medium which, as described above, is fed to the culture medium 10 via the line 11 in the first preparatory step. The emission measurements carried out then give meaningful information about the influence of these substances on the growth rate or the vitality of the cell cultures. This option is particularly suitable for long-term or long-term tests and especially for the determination of efficacy or toxicity limits • highly diluted test substances.

Bei der Emissionsmessung wird dann die Anfangsintensität und die Kinetik der Photonen-Emission nach Zugabe der Peroxidase gemessen. Der Vergleich von vitalen (d.h. unbeeinflußten) Zellen zu toxisch beeinflußten Zellen (hier verschiedene Konzentrationen an Methanol) ergibt eine unterschiedliche Anfangsintensität, wobei die Strahlungsintensität der vitalen Zellen jeweils deutlich höher liegt als diejenige von Zellen, die geschwächt bzw. abgetötet wurden. Es konnte auch bei abgetöteten Zellen noch eine gewisse Strahlung gemessen werden, die damit erklärt werden kann, daß nicht alle Proteine von abgetöteten Zellen sofort denaturieren und daher noch gewisse Mengen an Luminol binden können. In the emission measurement, the initial intensity and the kinetics of the photon emission are then measured after the addition of the peroxidase. The comparison of vital (i.e. unaffected) cells to toxic-influenced cells (here different concentrations of methanol) reveals a different initial intensity, whereby the radiation intensity of the vital cells is significantly higher than that of cells that have been weakened or killed. A certain amount of radiation could also be measured in killed cells, which can be explained by the fact that not all proteins of killed cells denature immediately and can therefore still bind certain amounts of luminol.

Das zuvor anhand der schematischen Darstellung von Fig. 1 beschriebene Verfahren bediente sich in den einzelnen Behandlungsschritten verschiedener Kulturschalen 10, 30,40, 50. Diese Aufteilung in verschiedene Schalen ist insbesondere für wissenschaftliche Untersuchungen, die mit verschiedenen zahlreich variierten Versuchsbedingungen ablaufen sollen, geeignet. The method previously described with reference to the schematic representation of FIG. 1 was used in the individual treatment steps of different culture dishes 10, 30, 40, 50. This division into different dishes is particularly suitable for scientific examinations which are to be carried out with different, varied test conditions.

Soll das Verfahren zur routinehaften Messung der Einflüsse bestimmter Substanzen auf Zellkulturen gemessen werden, beispielsweise die Einwirkung eines Giftes oder Medikamentes auf menschliche Zellen, so kann anstatt der verschiedenen Kulturschalen nur eine einzige verwendet werden, in der dann die einzelnen Schritte aufeinanderfolgend durchgeführt werden. Wie zuvor beschrieben, sind die Kulturschalen 10, 30, 40 und 50 jeweils gleich aufgebaut gewesen, so daß die darin ablaufenden Tätigkeiten auch in einer einzigen Kulturschale durchgeführt werden können. Dabei ist die Kulturschale dann mit entsprechenden Anschlüssen versehen, durch die nacheinanderfolgend die Nährlösung beim Kultivierungsvorgang, anschließend die If the method for the routine measurement of the influences of certain substances on cell cultures is to be measured, for example the effect of a poison or medication on human cells, only one can be used instead of the different culture dishes, in which the individual steps are then carried out in succession. As previously described, the culture dishes 10, 30, 40 and 50 were each constructed identically, so that the activities carried out therein can also be carried out in a single culture dish. The culture dish is then provided with appropriate connections, through which the nutrient solution in the cultivation process takes place, and subsequently the

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diversen Waschlösungen bzw. Luminollösungen zugeführt bzw. abgeführt werden können. Es ist dann nur noch erforderlich, den für die Messung fertig präparierten Träger in eine Meßküvette zu überführen, wobei auch dieser Vorgang vollautomatisch bzw. unter sterilen Bedingungen ablaufen kann, so daß eine vollautomatische Durchführung des Verfahrens mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung möglich ist. Various washing solutions or luminol solutions can be added or removed. It is then only necessary to transfer the carrier prepared for the measurement into a measuring cuvette, this process also being able to run fully automatically or under sterile conditions, so that the method according to the invention can be carried out fully automatically.

Nach Beenden einer Lumineszenzmessung haftet die Zellkultur 28 weiterhin am Träger 20, so daß es möglich ist, diesen Träger nach der Messung wieder aus der Küvette 60 herauszunehmen, beispielsweise mit dem Phosphatpuffer abzuwaschen und erneut in eine Nährlösung oder Pufferlösung zu geben, d.h. die Zellkultur ist nach einer Emissionsmessung nicht verloren, sondern kann zu weiteren Untersuchungszwecken verwendet werden oder auch lediglich aufbewahrt werden. After a luminescence measurement has ended, the cell culture 28 continues to adhere to the carrier 20, so that it is possible to remove this carrier from the cuvette 60 after the measurement, for example by washing it off with the phosphate buffer and re-adding it to a nutrient solution or buffer solution, i.e. the cell culture is not lost after an emission measurement, but can be used for further investigation purposes or can even be kept.

Claims

1. A method for determining the luminescence of cell cultures, these being provided with a luminescent-capable, natural luminescence-enhancing, first substance, then treated with a luminescence-inducing second substance, and the luminescence is photoelectronically detected, characterized by ,

a) culturing the cell culture to be examined adhering to a support,

b) treating the cell culture adhering to the support with the luminescent first substance,

c) removing the excess first substance not taken up by the cell culture adhering to the carrier, and d) measuring the radiation emitted only by the cell culture after adding the second substance which triggers the luminescence.

2. The method according to claim 1, characterized in that in step a) a thin plate made of plastic or glass is used as a carrier, one surface of which is cultivated with a cell culture monolayer.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that first only the cell culture is applied to the surface of the carrier and this is given a certain period, preferably about 3 minutes, and then a nutrient solution is added.

4. The method according to claim 2, characterized in that the carrier is held horizontally, that the cell culture is applied to the upper surface, and that the carrier is covered with the nutrient solution.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the carrier is immersed in a washing solution subsequent to step a).

6. The method according to claim 5, characterized in that the washing solution is a phosphate-buffered salt solution.

7. The method according to claim 5 or 6, characterized in that the surface of the support overgrown with the cell culture faces upwards or is immersed vertically.

8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that a check of the cell culture adhering to the carrier is carried out subsequently to step a), but before step b).

9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that in step b) the cell culture adhering to the support is covered with a liquid having the luminescent first substance.

10. The method according to claim 9, characterized in that the first substance is luminol or another substance which causes luminescence and / or reinforcing substance.

11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that in step c) the carrier is immersed in a washing solution and in this the first substance is washed off insofar as it has not been bound by the cells without loosening the adherent cells .

12. The method according to claim 11, characterized in that in the washing process, the plate-shaped support is directed horizontally with the cell culture layer upwards or immersed vertically.

13. The method according to claim 11 or 12, characterized in that the washing solution is the same as that for washing off the nutrient solution.

14. The method according to any one of claims 1 to 13, characterized in that in step d) a plate-shaped carrier is placed in a vessel having a measuring solution, the area covered with the cell culture being directed towards a photoelectronic measuring device.

15. The method according to claim 14, characterized in that the measuring solution is the same medium as the washing medium for washing off the nutrient solution or the luminescent substance.

16. The method according to any one of claims 1 to 15, in which the effect of a third substance influencing the cell structure is measured, characterized in that the adhering cell culture is brought into contact with the influencing substance before step b), and that this substance is then washed off becomes.

17. The method according to any one of claims 1 to 15, in which the effect of a third substance influencing the cell structure is measured, characterized in that in step a) a nutrient solution for culturing the cell culture is mixed with the influencing substance.

18. Device for carrying out the method according to one of claims 1 to 17, with a cuvette device (60) for receiving a sample provided with a luminescent substance, wherein a second substance which triggers the luminescence can be introduced into the cuvette device (60) and with a photomultiplier device (68, 70, 72, 74, 76) for detecting, counting and evaluating the radiation emitted by the sample, characterized in that at least one culture device (10, 30, 40, 50) that can be shielded from the outside world is provided in

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the at least one carrier (20) is releasably receivable under sterile conditions, and the at least one receptacle (20) can be alternately treated with nutrient solution, washing solution, luminescent first substance.

19. The apparatus according to claim 18, characterized in that the at least one carrier (20) has the shape of a thin plate made of glass or plastic, which in a horizontal position under a fixing strip (16) of a shell (20, 30, 40, 50) is slidable, and that the shell has a plurality of interconnected support receiving areas (18).

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