DESCRIPTION
La présente invention concerne le dédoublement des mélanges d'énantiomères de composés organiques par un procédé chromatographique, particulièrement pour la production industrielle.
L'industrie chimique consomme de grandes quantités d'énantiomères optiquement purs. En général, les méthodes d'obtention des énantiomères sont laborieuses, hormis les synthéses asymétriques et microbiologiques, I'extraction des produits naturels et les dédoublements chromatographiques. Il est donc de la première importance de maîtriser une de ces méthodes pour rester compétitif dans la production d'énantiomères.
Comme la chromatographie est une des voies les plus simples et rentables, de nombreuses tentatives ont été faites pour utiliser les résultats analytiques à l'échelle industrielle. L'apparition de nouvelles technologies (chromatographie liquide sous haute pression, HPLC) semblait rendre possible un développement fulgurant de phases chromatographiques performantes.
L'absence de telles phases sur le marché s'explique par plusieurs raisons. Pour obtenir un matériel intéressant, il faut que plusieurs critères soient remplis:
- le support doit être mécaniquement rigide pour pouvoir supporter les hautes pressions
la nature du support doit être compatible avec la nature du solvant; un solvant polaire doit être utilisé avec une phase polaire, par exemple l'eau doit être utilisée avec un support hydrophile
- la stabilité chimique du support doit être grande pour que le gain économique résultant de l'emploi de la chromatographie ne soit pas annulé par une destruction rapide de la phase
- le spectre d'application de la méthode.
Il faut que pour une classe de composés une même phase soit utilisable; par exemple pour les acides aminés, il faut pouvoir utiliser la même phase pour dédoubler tous les acides aminés
- I'accessibilité du support. Tel support dont les qualités sont exceptionnelles ne pourra pas être utilisé, étant donné son prix excessif
- les variations du gonflement de la résine; le volume de solvatation du support doit rester constant au cours de la chromatographie
- le choix du sélecteur chiral qui doit être bon marché et efficace
Un racémate peut être dédoublé selon plusieurs systèmes; celui considéré ici repose sur le principe de l'échange de ligands.
Les mères les plus couramment utilisés sont la silice, le polystyrène-divinylbenzène, le polyacrylamide; les composés organiques chiraux les plus couramment utilisées sont les acides aminés et plus particulièrement la proline (FR-A-2 012 102, FR-A-2354 351, SU-A-895 980).
Ce choix résulte du fait que les acides aminés cycliques donnent lieu à des interactions stériques plus grandes que les acides aminés linéaires. De plus, une étude récente [G. Gübitz, W. Jellenz, Chromatographia, 16, 103 (1982)] a montré que plus le cycle augmente plus la capacité de l'acide aminé de dédoubler les isomères augmentait selon la séquence:
acide azétidine carboxylique < proline < acide pipécolinique, le support utilisé étant la silice. L'inconvénient de la silice est sa stabilité chimique insuffisante, surtout lorsque le pH de l'éluant est supérieur à pH 7. A l'heure actuelle, toutes les phases chromatographiques utilisées dans le dédoublement de racémates par chromatographie d'échange de ligands sont à base de L-proline.
Le but de la présente invention est de fournir un procédé pour le dédoublement d'énantiomères amélioré au point de vue de la stabilité du support et du pouvoir séparateur, particulièrement à l'échelle industrielle.
L'objet de la présente invention est donc un procédé chromatographique dans lequel l'acide pipécolinique est greffé sur un polymère d'acrylamide comme décrit dans la revendication 1. La phase stationnaire à base de polyacrylamide est chimiquement stable sur de longues périodes, contrairement à la silice qui se dégrade rapidement après quelques utilisations, surtout lorsque le pH de l'éluant est supérieur à pH 7. La phase stationnaire et sa préparation sont aussi des objets de l'invention. La simplicité de la préparation de cette résine de polyacrylamide/acide pipécolinique permet de dédoubler à l'échelle préparative des acides aminés qui ne se dédoublent pas sur les phases à base de proline, comme l'alanine.
Le polyacrylamide possède des propriétés hydrophiles liées à la présence de groupes polaires - CONH2. Pour les systèmes chromatographiques où l'eau est le solvant et dans lesquels le pH peut varier, les polymères chimiquement stables dans un domaine de pH de 1 à 12 sont très utiles, surtout lorsqu'ils sont hydrophiles comme le polyacrylamide. La préparation de ce polymère peut être conduite de telle sorte qu'on peut obtenir soit un polymère linéaire (soluble dans les solvants polaires), soit, si on opère avec un agent réticulant, un polymère réticulé.
Dans ce dernier cas, il est insoluble dans tous les solvants mais peut, selon la quantité d'agent réticulant utilisée, se gonfler plus ou moins de solvant, et se comporter finalement comme une pseudosolution de monomère si la résine fabriquée est très fai blement réticulée, ou au contraire comme des billes dures s'il est très fortement réticulé.
Selon la présente invention, il est possible d'utiliser les deux formes du polyacrylamide. Sous forme soluble, il est nécessaire de le déposer sur une surface étrangère. On choisit celle-ci en fonction du type de chromatographie envisagée. Par exemple, on peut le déposer sur de la silice si on désire un support mécaniquement rigide pour effectuer de la chromatographie sous haute pression. Les phases ainsi obtenues présentent les avantages suivants par rapport à celles décrites dans la littérature:
facilité de préparation
- meilleure stabilité chimique (parce que la silice est protégée par une robe de polyacrylamide)
- meilleures réactions face au soluté (parce que l'acide pipécolinique est entouré d'un environnement hydrophile alors que, lorsqu'il est déposé directement sur la silice, il est dans un environnement neutre ).
En fait, les phases préparées de la sorte ont un comportement supérieur à celles préparées de manière conventionnelle. Leur emploi est cependant limité dans le temps, bien que leur longévité soit supérieure aux phases conventionnelles.
Sous sa forme réticulée, le polyacrylamide peut être utilisé directement en chromatographie liquide. Il faut cependant tenir compte du fait qu'il s'agit d'un polymère organique macroréticulé qui peut se déformer sous l'effet de la pression. Nous avons découvert qu'il est possible d'utiliser de tels gels de polyacrylamide sous pression pour autant qu'on choisisse un bon rapport entre la pression et le débit de l'éluant. On peut utiliser des gels de polyacrylamide commerciaux convenables (par exemple les différentes sortes de Bio
Gel de Bio Rad, comme Bio-Gel P-200), modifiés avec l'acide pipécolinique. Pour la modification, on peut traiter le polyacrylamide dans une solution aqueuse avec du formaldéhyde pour introduire le groupe méthylol. On peut mettre cette résine activée en réaction avec l'acide pipécolinique.
Il est évident qu'il existe aussi d'autres méthodes de couplage de l'acide pipécolinique, par exemple par traitement du polyacrylamide gonflé avec de l'hydroxyde d'hydrazine (pH 9,4, agité pendant environ 6 heures) et traitement du produit lavé avec du nitrite de sodium. On obtient un produit avec des groupes azido, qui sont traités par l'acide pipécolinique. Dans ce procédé, L'acide pipécolinique est lié directement par une liaison de peptide (sans groupe de méthylène comme dans le produit obtenu par le couplage avec le formaldéhyde).
Ainsi, il a été possible d'utiliser des gels de résine à base de polyacrylamide et d'acide pipécolinique avec des pressions de l'ordre de 30 bars. La granulométrie moyenne des billes de résine est située normalement dans le domaine courant, particulièrement de 40120 microns, de préférence de 40 à 80 microns. Dans ces conditions, le gel conserve toutes ses propriétés hydrophiles (grande vitesse d'échange entre le greffon sur le polymère et le soluté dans la phase polaire) et son aptitude à dédoubler les acides aminés par exemple.
Avec une colonne de chromatographie remplie d'un gel tel que celui décrit précédemment, il est alors possible de dédoubler l'alanine. Celle-ci ne peut pas, par exemple, être dédoublée sur une même colonne préparée à partir de proline. La thréonine par exemple, qui est dédoublée avec un facteur de séparation-de 1,2 sur une phase avec la proline, voit celui-ci passer à 1,6 sur une phase à l'acide pipécolinique.
Les figures qui concernent le dédoublement de d,l-thréonine sont destinées à illustrer la supériorité de la présente invention en comparaison avec un procédé de l'art antérieur:
la fig. 1 montre la courbe d'éluant obtenue avec une colonne avec la phase stationnaire modifiée par l'acide pipécolinique (exemple 4),
la fig. 2 montre la courbe d'élution obtenue avec la phase stationnaire modifiée par le L-proline (exemple 6).
Dans ces figures, I'ordonnée signifie le temps de l'élution (qui est proportionnel au volume d'élution) et l'abscisse représente le signal du détecteur (UV, 254 nm).
Il est de plus possible de dédoubler les acides aminés non biogé
niques sur de telles colonnes chromatographiques comme par les iso
mères ortho-, méta- et parafluorophénylalanine.
Les résines utilisées comme phase stationnaire dans le procédé
selon la présente invention présentent des caractéristiques qui se tra
duisent par un pouvoir de dédoublement supérieur aux autres
résines précédemment décrites dans la littérature ou vendues dans le
commerce et une stabilité chimique plus grande que les colonnes
commercialement accessibles, ce qui permet de les utiliser à l'échelle
préparative.
Les exemple suivants serviront à l'illustration de la présente in
vention.
Exemple I
100 g d'acrylamide sont dissous dans 1 litre d'eau déminéralisée
et 500 ml d'alcool sont ajoutés. La température est portée à 80 C et
1 g de persulfate de potassium est ajouté. On agite cette solution
pendant 4 heurs à 80 C puis on laisse revenir à température am
biante. L'alcool et de l'eau sont alors évaporés sous vide; on rajoute
de l'eau pour avoir un volume final de 500 ml.
Exemple 2
100 ml de la solution préparée dans l'exemple 1 sont additionnés
de I g de KOH et de 5 g de formaldéhyde. 2,7 g d'acide pipécolini
que sont alors ajoutés et le mélange est agité 3 heures durant à température ambiante. Le pH de la solution est amené à 7 et on ajoute
50 g de silice 15-40 microns AW. Cette suspension est agitée 2 à
3 heures à température ambiante, filtrée et lavée à l'eau. La silice ainsi obtenue est trempée dans une solution d'acétate de cuivre en excès pendant 1 heure, filtrée et lavée à l'eau jusqu'à absence de cuivre dans le filtrat.
Exemple 3
On procède comme dans l'exemple précédent mais en substituant 5,4 g de (+)-hydrogénotartrate d'acide (+)-pipécolinique aux 2,7 g d'acide D-(+)-pipécolinique et en fixant le pH à 8-10 avec NaOH dilué.
Exemple 4
120 g de méthylolpolyacrylamide, préparés par copolymérisation de méthylolacrylamide et de méthylène-bis-acrylamide, par exemple selon FR-A-2 354 351, et 26 g d'acide D-(+)-pipécolinique sont mis en suspension dans 1 litre d'eau. Le pH est amené à 10 avec NaOH dilué et la solution est abandonnée sous faible agitation pendant 12 heures. Le polymère est alors filtré, lavé à l'eau, mis en contact avec une solution d'acétate de cuivre en excès, filtré, lavé à l'eau jusqu'à absence de cuivre dans l'éluant et séché sur le filtre.
Exemple 5
On procède comme dans l'exemple 4, mais en substituant l'acide
D-(+)-pipécolinique par 55 g de (+)-hydrogénotartrate d'acide (+)-pipécolinique.
Exemple 6 (comparaison)
On procède comme dans l'exemple 4 mais en substituant les 26 g d'acide D-(+)-pipécolinique par 26 g de L-proline.
Exemple 7
Les résines, préparées dans les exemples 4, 5 et 6, sont conditionnées avec une solution d'acide acétique 0,05M et versées dans une colonne à chromatographie de dimensions 435 x 25 ID mm. On tasse le support en éluant avec une pression croissante une solution d'acide acétique 0,05M à l'aide d'un système chromatographique Büchi LC (pump 851, Detector UV 683, 254 nm) placé avant la colonne remplie de résine vierge pour retenir le cuivre, un polarimétre Perkin-Elmer 241 et un enregistreur à 2 canaux.
Une solution saturée de thréonine est préparée par dissolution à chaud du racémate. On injecte 2 ml de cette solution à l'aide d'une boucle d'injection et chromatographie avec CH3COOH 0,05M avec un débit de 2,3 ml/mn et une pression interne de 30 bars.
Les énantiomères de la thréonine dédoublée sont recueillis manuellement en fractionnant l'éluant. Les deux solutions sont évapo
s rées à sec.
On obtient de la sorte quantitativement les deux énantioméres de la thréonine avec un rendement chimique supérieur à 95% et une pureté optique de 100%. La figure montre la courbe d'élution obtenue d'une part sur la colonne préparée selon l'exemple 4 et, d'autre part, celle selon l'exemple 6.
DESCRIPTION
The present invention relates to the resolution of mixtures of enantiomers of organic compounds by a chromatographic process, particularly for industrial production.
The chemical industry consumes large quantities of optically pure enantiomers. In general, the methods for obtaining enantiomers are laborious, except for asymmetric and microbiological syntheses, extraction of natural products and chromatographic duplication. It is therefore of the first importance to master one of these methods to remain competitive in the production of enantiomers.
As chromatography is one of the simplest and most cost-effective routes, many attempts have been made to use analytical results on an industrial scale. The appearance of new technologies (high pressure liquid chromatography, HPLC) seemed to make possible a rapid development of efficient chromatographic phases.
The absence of such phases on the market is explained for several reasons. To obtain interesting material, several criteria must be met:
- the support must be mechanically rigid to be able to withstand high pressures
the nature of the support must be compatible with the nature of the solvent; a polar solvent must be used with a polar phase, for example water must be used with a hydrophilic support
- the chemical stability of the support must be high so that the economic gain resulting from the use of chromatography is not canceled out by rapid destruction of the phase
- the spectrum of application of the method.
The same phase must be usable for a class of compounds; for example for amino acids, you must be able to use the same phase to split all the amino acids
- accessibility of the support. Such support whose qualities are exceptional cannot be used, given its excessive price.
- variations in the swelling of the resin; the volume of solvation of the support must remain constant during the chromatography
- the choice of the chiral selector which must be inexpensive and effective
A racemate can be split in several systems; that considered here is based on the principle of ligand exchange.
The most commonly used mothers are silica, polystyrene-divinylbenzene, polyacrylamide; the most commonly used chiral organic compounds are amino acids and more particularly proline (FR-A-2 012 102, FR-A-2354 351, SU-A-895 980).
This choice results from the fact that cyclic amino acids give rise to greater steric interactions than linear amino acids. In addition, a recent study [G. Gübitz, W. Jellenz, Chromatographia, 16, 103 (1982)] showed that the more the cycle increases the more the capacity of the amino acid to split the isomers increases according to the sequence:
azetidine carboxylic acid <proline <pipecolinic acid, the support used being silica. The disadvantage of silica is its insufficient chemical stability, especially when the pH of the eluent is greater than pH 7. At present, all the chromatographic phases used in the resolution of racemates by ligand exchange chromatography are based on L-proline.
The object of the present invention is to provide a process for the resolution of enantiomers improved from the point of view of the stability of the support and of the separating power, particularly on an industrial scale.
The object of the present invention is therefore a chromatographic process in which the pipecolinic acid is grafted onto an acrylamide polymer as described in claim 1. The stationary phase based on polyacrylamide is chemically stable over long periods, unlike silica which degrades rapidly after a few uses, especially when the pH of the eluent is greater than pH 7. The stationary phase and its preparation are also objects of the invention. The simplicity of the preparation of this polyacrylamide / pipecolinic acid resin makes it possible to split on the preparative scale amino acids which do not split on the proline-based phases, such as alanine.
Polyacrylamide has hydrophilic properties linked to the presence of polar groups - CONH2. For chromatographic systems where water is the solvent and in which the pH can vary, chemically stable polymers in a pH range from 1 to 12 are very useful, especially when they are hydrophilic such as polyacrylamide. The preparation of this polymer can be carried out in such a way that either a linear polymer (soluble in polar solvents) or, if operating with a crosslinking agent, a crosslinked polymer can be obtained.
In the latter case, it is insoluble in all solvents but may, depending on the amount of crosslinking agent used, swell more or less solvent, and ultimately behave like a pseudosolution of monomer if the resin produced is very weakly crosslinked , or on the contrary like hard balls if it is very strongly crosslinked.
According to the present invention, it is possible to use both forms of the polyacrylamide. In soluble form, it is necessary to deposit it on a foreign surface. This is chosen according to the type of chromatography envisaged. For example, it can be deposited on silica if a mechanically rigid support is desired for carrying out chromatography under high pressure. The phases thus obtained have the following advantages compared to those described in the literature:
ease of preparation
- better chemical stability (because the silica is protected by a polyacrylamide coat)
- better reactions to the solute (because pipecolinic acid is surrounded by a hydrophilic environment whereas, when it is deposited directly on silica, it is in a neutral environment).
In fact, the phases prepared in this way have a higher behavior than those prepared in a conventional manner. Their use is however limited in time, although their longevity is greater than the conventional phases.
In its crosslinked form, polyacrylamide can be used directly in liquid chromatography. However, it must be taken into account that it is a macrocrosslinked organic polymer which can deform under the effect of pressure. We have discovered that it is possible to use such polyacrylamide gels under pressure provided that a good ratio between the pressure and the flow rate of the eluent is chosen. Suitable commercial polyacrylamide gels can be used (e.g. different kinds of Bio
Bio Rad gel, like Bio-Gel P-200), modified with pipecolinic acid. For modification, the polyacrylamide can be treated in an aqueous solution with formaldehyde to introduce the methylol group. This activated resin can be reacted with pipecolinic acid.
It is obvious that there are also other methods of coupling pipecolinic acid, for example by treating the swollen polyacrylamide with hydrazine hydroxide (pH 9.4, stirred for about 6 hours) and treating the product washed with sodium nitrite. A product is obtained with azido groups, which are treated with pipecolinic acid. In this process, pipecolinic acid is linked directly by a peptide bond (without a methylene group as in the product obtained by coupling with formaldehyde).
Thus, it was possible to use resin gels based on polyacrylamide and pipecolinic acid with pressures of the order of 30 bars. The average particle size of the resin beads is normally located in the current range, particularly 40 120 microns, preferably 40 to 80 microns. Under these conditions, the gel retains all of its hydrophilic properties (high exchange rate between the graft on the polymer and the solute in the polar phase) and its ability to split amino acids, for example.
With a chromatography column filled with a gel such as that described above, it is then possible to split the alanine. This cannot, for example, be split on the same column prepared from proline. Threonine for example, which is split with a separation factor of 1.2 on a phase with proline, sees this going to 1.6 on a phase with pipecolinic acid.
The figures which relate to the splitting of d, l-threonine are intended to illustrate the superiority of the present invention in comparison with a process of the prior art:
fig. 1 shows the eluent curve obtained with a column with the stationary phase modified by pipecolinic acid (example 4),
fig. 2 shows the elution curve obtained with the stationary phase modified with L-proline (Example 6).
In these figures, the ordinate signifies the elution time (which is proportional to the elution volume) and the abscissa represents the detector signal (UV, 254 nm).
It is also possible to split the amino acids not bioge
nics on such chromatographic columns as by iso
ortho-, meta- and parafluorophenylalanine mothers.
Resins used as stationary phase in the process
according to the present invention have features which are
have a superior duplication power
resins previously described in the literature or sold in the
trade and greater chemical stability than columns
commercially accessible, allowing them to be used at scale
preparatory.
The following examples will be used to illustrate the present in
vention.
Example I
100 g of acrylamide are dissolved in 1 liter of demineralized water
and 500 ml of alcohol are added. The temperature is raised to 80 C and
1 g of potassium persulfate is added. We stir this solution
for 4 hours at 80 C and then allowed to return to am temperature
biante. The alcohol and water are then evaporated under vacuum; we add
water to have a final volume of 500 ml.
Example 2
100 ml of the solution prepared in Example 1 are added
1 g of KOH and 5 g of formaldehyde. 2.7 g pipecolini acid
that are then added and the mixture is stirred for 3 hours at room temperature. The pH of the solution is brought to 7 and added
50 g of silica 15-40 microns AW. This suspension is stirred 2 to
3 hours at room temperature, filtered and washed with water. The silica thus obtained is soaked in a solution of excess copper acetate for 1 hour, filtered and washed with water until there is no copper in the filtrate.
Example 3
The procedure is as in the previous example, but substituting 5.4 g of (+) - acid hydrogenotartrate (+) - pipecolinic to the 2.7 g of D - (+) - pipecolinic acid and fixing the pH at 8-10 with dilute NaOH.
Example 4
120 g of methylolpolyacrylamide, prepared by copolymerization of methylolacrylamide and of methylene-bis-acrylamide, for example according to FR-A-2 354 351, and 26 g of D - (+) - pipecolinic acid are suspended in 1 liter of 'water. The pH is brought to 10 with dilute NaOH and the solution is left with gentle stirring for 12 hours. The polymer is then filtered, washed with water, contacted with an excess copper acetate solution, filtered, washed with water until there is no copper in the eluent and dried on the filter.
Example 5
The procedure is as in Example 4, but substituting the acid
D - (+) - pipecolinic per 55 g of (+) - acid hydrogenotartrate (+) - pipecolinic.
Example 6 (comparison)
The procedure is as in Example 4 but substituting the 26 g of D - (+) - pipecolinic acid with 26 g of L-proline.
Example 7
The resins, prepared in Examples 4, 5 and 6, are conditioned with a 0.05M acetic acid solution and poured into a chromatography column with dimensions 435 x 25 ID mm. The support is packed by eluting with increasing pressure a 0.05M acetic acid solution using a Büchi LC chromatographic system (pump 851, Detector UV 683, 254 nm) placed before the column filled with virgin resin to retain copper, a Perkin-Elmer 241 polarimeter and a 2-channel recorder.
A saturated threonine solution is prepared by hot dissolution of the racemate. 2 ml of this solution are injected using an injection loop and chromatography with 0.05M CH3COOH with a flow rate of 2.3 ml / min and an internal pressure of 30 bars.
The enantiomers of the split threonine are collected manually by fractionating the eluent. Both solutions are evapo
s dry.
The two enantiomers of threonine are thus obtained quantitatively with a chemical yield greater than 95% and an optical purity of 100%. The figure shows the elution curve obtained on the one hand on the column prepared according to example 4 and, on the other hand, that according to example 6.