BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines pektolytischen Enzympräparats, bei dem ein Stamm der Art Aspergillus niger Van Tieghen mit Tiefenkultivierung verwendet wird, ein gemäss diesem Verfahren hergestelltes Enzympräparat sowie eine Verwendung desselben.
Bekannt ist ein Verfahren zur Gewinnung von pektolytischem Präparat durch Tiefenkultivierung eines Stamms der Art Asp.niger Van Tieghem, welches die Gewinnung von Kulturflüssigkeiten mit einer Aktivität von 1500 E/cm3 (BG-PS 16862) sichert. Als Nachteile dieses Verfahrens sind vorzubringen: das unbefriedigende Niveau der Enzymaktivität der Kulturflüssigkeiten und das unbefriedigend hohe Temperaturoptimum der Wirkung bis 45 "C, die sich negativ auf die ökonomischen Ergebnisse bei der Gewinnung und der Anwendung auswirken.
Aufgabe der Erfindung ist, ein Verfahren zur Gewinnung eines thermostabilen pektolytischen Enzympräparats durch Tiefenkultivierung zu schaffen, was zu einem hohen Ertrag an Enzymaktivität führt.
Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs genannten Art erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass der Stamm Asp.niger -8MX-41, registriert im Journal der NBIMCC (National Bank for Industrial Microorganismes and Cell Cultures) in Sofia (Bulgarien), 125 Lenin Blvd., Block 2, unter der Nr. 378 vom 2. August 1985, in einem Fermentationsnährboden kultiviert, das Enzym aus der Fermentationsflüssigkeit konzentriert und bei einer Temperatur von 30 bis 38 "C getrocknet wird. Die Kultur Asp.niger -8MX-41 wird vorzugsweise nach natürlicher Auslese und durch Einwirkung auf Koniden von Asp.niger -8M mit UV-Strahlen, gefolgt von mehrmaligem Scrining auf der Basis der realisierten Enzymaktivität bei Laborgärungen, erhalten.
Eine zweckmässige Weiterausgestaltung des erfindungsgemässen Verfahrens ist Gegenstand von Anspruch 2.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestelltes Enzympräparat.
Gegenstand der Erfindung ist ausserdem eine Verwendung des erfindungsgemässen Enzympräparates zur Klärung von Obst- und Gemüsesäften.
Nachstehend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Auf Malzagar formt Aspergillus niger -8MX-41 nach etwa 72 Stunden runde Kolonien mit glattem Rand, eingefallenem Zentrum und dichten radialen Falten mit gelbbräunlich gefärbtem zentralem Teil mit einem Durchmesser von 1,7 cm und weisser Peripherie mit einer Breite von 1,2 cm. Nach 7 Tagen und Nächten erreicht der Durchmesser der Kolonie 9 cm und ist schwarz gefärbt. Das Zentrum ist weiter eingefallen, und die radialen Falten sind greller ausgeprägt. Die Kultur scheidet in der Mitte kein Pigment aus. Die Kehrseite der Kolonie ist bleichcremefarben.
Auf Kartoffelagar bildet Aspergillus niger -8MX-41 nach etwa 72 Stunden runde Kolonien mit hellgelblichem zentralem Teil mit einem Durchmesser von 0,5 cm aus, gefolgt von einer zweiten mit einem Durchmesser von 2,2 cm mit schwarzem Pigment und einem 3 mm breiten weissen Peripheriestreifen. Nach rund 7 Tagen und Nächten erreicht der Durchmesser der Kolonie 7 cm. Das helle Zentrum bleibt erhalten und bekommt an der Peripherie eine 2,5 cm breite schwarze Zone und an dem Rand selbst einen 0,5 cm breiten weissen Streifen.
Auf Capek-Dox-Agar formt Aspergillus niger -8MX-41 nach rund 72 Stunden runde Kolonien mit einem Durchmesser von 1,1 cm aus, die ein weisses Zentrum und eine leichtpigmentierte hellcremefarbene Oberfläche besitzen. Gegen den 7. Tag erreicht der Durchmesser der Kolonie 3 bis 4 cm mit weissem Zentrum, gefolgt von einem Ring mit d 0,7 cm mit gelbgrüner Färbung, nach dem eine Zone von 2 cm mit schwarzem Pigment und eine weisse Peripheriezone von 2 bis 3 mm folgen.
Die Kultur formt Konidienträger mit einer Länge von 250 bis 500 11 und einer Dicke von 2 bis 3,5 g abschliessend mit sphärischen Kallumelen mit d =100 bis 200 cm und sphärischen Konidien mit d = 1,5 bis 2,2 p aus, die dunkelbraun bis schwarz gefärbt und mit 0,2 bis 0,5 SL langen Dornen bedeckt sind.
Auf den harten Nährboden bildet Asp.niger -8MX-41 Kolonien mit gut geformtem Luftmyzel und schwachem Substratmyzel aus, das aus septierten Hyphen aufgebaut ist.
Die Kultur wird auf geneigtem agarisiertem Malzextrakt mit einer TS von 6% gehalten.
Die-Unterschiede von Aspergillus niger -8MX-41 der genutzten Produktionskultur drücken sich in der mehrmalig höheren biosynthetischen Enzymaktivität aus. Gegen die 144. Stunde von der Entwicklung häuft die Kultur im Milieu mit optimisierter Zusammensetzung in 1 ml Fermentationsflüssigkeit 4000 + 300 E polygalakturonase Aktivität und 20 + 4 E pektinoesterase-Aktivität und die Produktionskultur entsprechend 1500 i 20 E/ml PGA und 4+05 E/ml PEA an.
Nach Anwendung eines mehrfaktoriellen Experiments 24 und nachfolgender mathematischer Modellierung werden die Fermentationen im Milieu mit folgender Zusammensetzung durchgeführt (Angaben in %): trockene Rübenschnitzel 4,5 -5,5 Weizenkleie 0,75 -1,5 Ammoniumsulfat 0,35 -0,75 Natriumphosphat (bibasisch) 0,125-0,250 Stärke 0,5 -1,5 Magnesiumsulfat 0,025-0,05 Kaliumchlorid 0,025-0,05
Nach Trennung des Myzels wird die Fermentationsflüssigkeit zur Beseitigung der mechanischen Beimengungen filtriert und von den niedermolekularen löslichen Beimengungen durch Ultrafiltration befreit, wobei das Volumen 7- bis 9mal verkleinert und die Trockensubstanz von 1,2 bis 1,5 auf 1,75 bis 2,0% gesteigert wird.
Es folgt eine 8malige Vakuumkonzentration bei einer niedrigeren Temperatur als 360 C und eine lyophile oder Vakuumtrocknung bei einer Temperatur, die 38 "C nicht übersteigt.
Die Vorteile dieses Verfahrens im Vergleich mit den bereits bekannten Verfahren bestehen in der höheren Thermostabilität des Präparats (50 Wirkungsoptimum), in der dreimal höheren biosynthetischen Aktivität bezüglich der Polygalakturonase, und der 5mal höheren Biosynthese bezüglich der Pektinesterase, was sich positiv auf die ökonomische Effektivität des Produktionsprozesses auswirkt, und der hohen Klärungsaktivität des Präparats, bestimmend dessen geringen Aufwandes und der verkürzten Zeitdauer der Depektinisation.
Nachfolgend ein Beispiel:
Zu 45 Liter sterilisiertem und bis auf 27 "C gekühltem Fermentationsgemisch mit der Zusammensetzung (Angaben in %): 4,5 trockene Rübenschnitzel, 0,75 Weizenkleie, 0,35 Ammoniumsulfat, 0,125 Natriumphosphat (bibasisch), 0,5 Stärke, 0,025 Magnesiumsulfat, 0,025 Kaliumchlorid wird 1,5 Liter 24stündiges Inokulat aus Asp.niger -8MX-41 NBIMCC Nr. 378 zugesetzt, das in einem Milieu mit identischer Zusammensetzung des Fermentationsgemisches in einem runden exzentrischen Schuttel mit 220 V/min bei 27,5 i 0,5 "C zubereitet wurde.
Die Fermentation verläuft im Fermentor bei 27,5 i 0,5 C Aeration mit steriler Luft bei einem Aufwand von 0,8 bis 1,11/Liter Fermentationsgemisch in der Minute bei einer Peripheriegeschwindigkeit des Rührers von 2,4 bis 3,2 m/s im Laufe von 144 + 8 Stunden. Am Ende des Prozesses häufen sich in 1 cm3 Fermentationsflüssigkeit 4000 i 300 E polygalakturonase und 20 + 4 E pektinesterase Aktivität an.
Nach Beseitigung des Myzels, der unlöslichen Bestandteile des Mediums und einer feinen Filtrierung oder Separierung werden 35 bis 37 Liter Fermentationsflüssigkeit gewonnen, die einer rund 8mal das Volumen verkleinernden Membranultrafiltration, dann einer Vakuumkonzentration (8mal wiederholt) bei einer Temperatur unter 38 "C und einer Vakuumoder lyophilen Trocknung bei einer Temperatur unter 380 "C unterzogen werden. Auf diese Weise werden 300 bis 350 g Präparat mit einer Aktivität 400 000 E/g PGA und 2000 E/g PEA erhalten. Nach Standardisierung in Perlit und Kieselgur werden rund 2 kg Präparat mit 60 000 E/g PGA und 300 E/g PEA gewonnen.
DESCRIPTION
The invention relates to a method for obtaining a pectolytic enzyme preparation, in which a strain of the type Aspergillus niger Van Tieghen with deep cultivation is used, an enzyme preparation produced according to this method and the use thereof.
A method for obtaining pectolytic preparation by deep cultivation of a strain of the species Asp.niger Van Tieghem is known, which ensures the extraction of culture fluids with an activity of 1500 U / cm3 (BG-PS 16862). The disadvantages of this method are: the unsatisfactory level of the enzyme activity of the culture fluids and the unsatisfactorily high temperature optimum of the effect up to 45 "C, which have a negative effect on the economic results in the extraction and use.
The object of the invention is to provide a method for obtaining a thermostable pectolytic enzyme preparation by deep cultivation, which leads to a high yield of enzyme activity.
This object is achieved according to the invention in a method of the type mentioned at the outset in that the strain Asp.niger -8MX-41, registered in the journal of the NBIMCC (National Bank for Industrial Microorganisms and Cell Cultures) in Sofia (Bulgaria), 125 Lenin Blvd. , Block 2, under No. 378 from August 2, 1985, cultivated in a fermentation medium, the enzyme is concentrated from the fermentation liquid and dried at a temperature of 30 to 38 ° C. The culture Asp.niger -8MX-41 is preferred after natural selection and exposure to conid of Asp.niger -8M with UV rays, followed by repeated scrining based on the enzyme activity achieved in laboratory fermentation.
An expedient further development of the method according to the invention is the subject of claim 2.
The invention further relates to an enzyme preparation produced by the process according to the invention.
The invention also relates to the use of the enzyme preparation according to the invention for clarifying fruit and vegetable juices.
The invention is explained in more detail below on the basis of exemplary embodiments.
After about 72 hours, Aspergillus niger -8MX-41 forms round colonies on malt agar with a smooth rim, sunken center and dense radial folds with a yellow-brownish-colored central part with a diameter of 1.7 cm and white periphery with a width of 1.2 cm. After 7 days and nights the diameter of the colony reaches 9 cm and is colored black. The center has collapsed further and the radial folds are more pronounced. The culture does not excrete pigment in the middle. The flip side of the colony is pale cream.
After about 72 hours, Aspergillus niger -8MX-41 forms round colonies on potato agar with a light yellowish central part with a diameter of 0.5 cm, followed by a second with a diameter of 2.2 cm with black pigment and a 3 mm wide white Peripheral strips. After around 7 days and nights, the diameter of the colony reached 7 cm. The bright center is preserved and has a 2.5 cm wide black zone on the periphery and a 0.5 cm wide white stripe on the edge itself.
After about 72 hours, Aspergillus niger -8MX-41 forms round colonies with a diameter of 1.1 cm on Capek-Dox agar, which have a white center and a lightly pigmented light cream-colored surface. Towards the 7th day, the diameter of the colony reached 3 to 4 cm with a white center, followed by a ring with d 0.7 cm with a yellow-green color, after which a zone of 2 cm with black pigment and a white peripheral zone of 2 to 3 mm follow.
The culture forms conidium carriers with a length of 250 to 500 11 and a thickness of 2 to 3.5 g, finally with spherical callumelas with d = 100 to 200 cm and spherical conidia with d = 1.5 to 2.2 p dark brown to black colored and covered with 0.2 to 0.5 SL long thorns.
Asp.niger -8MX-41 forms colonies on the hard medium with well-formed aerial mycelium and weak substrate mycelium, which is made up of septated hyphae.
The culture is kept on inclined agarized malt extract with a TS of 6%.
The differences of Aspergillus niger -8MX-41 in the production culture used are expressed in the several times higher biosynthetic enzyme activity. Towards the 144th hour of development, the culture in the medium with optimized composition accumulates 4000 + 300 U polygalacturonase activity and 20 + 4 E pectino esterase activity in 1 ml fermentation liquid and the production culture corresponding to 1500 and 20 U / ml PGA and 4 + 05 U / ml PEA.
After using a multi-factorial experiment 24 and subsequent mathematical modeling, the fermentations are carried out in the environment with the following composition (data in%): dry beet pulp 4.5 -5.5 wheat bran 0.75 -1.5 ammonium sulfate 0.35 -0.75 Sodium phosphate (bibasic) 0.125-0.250 starch 0.5-1.5 magnesium sulfate 0.025-0.05 potassium chloride 0.025-0.05
After separation of the mycelium, the fermentation liquid is filtered to remove the mechanical admixtures and freed from the low-molecular soluble admixtures by ultrafiltration, the volume being reduced 7 to 9 times and the dry matter from 1.2 to 1.5 to 1.75 to 2.0 % is increased.
This is followed by an 8-fold vacuum concentration at a temperature lower than 360 C and a lyophilic or vacuum drying at a temperature which does not exceed 38 "C.
The advantages of this method in comparison with the already known methods are the higher thermal stability of the preparation (50 optimal effects), the three times higher biosynthetic activity with regard to polygalacturonase, and the 5 times higher biosynthesis with respect to pectin esterase, which has a positive effect on the economic effectiveness of the Production process affects, and the high clarifying activity of the preparation, determining its low effort and the shorter duration of the depectinization.
Here is an example:
To 45 liters of sterilized and cooled to 27 "C fermentation mixture with the composition (in%): 4.5 dry beet pulp, 0.75 wheat bran, 0.35 ammonium sulfate, 0.125 sodium phosphate (bibasic), 0.5 starch, 0.025 magnesium sulfate , 0.025 potassium chloride, 1.5 liters of 24-hour inoculate from Asp.niger -8MX-41 NBIMCC No. 378 is added, which in a medium with identical composition of the fermentation mixture in a round eccentric shaker at 220 V / min at 27.5 i 0, 5 "C was prepared.
The fermentation takes place in the fermenter at 27.5 i 0.5 C aeration with sterile air with an expenditure of 0.8 to 1.11 / liter fermentation mixture per minute at a peripheral speed of the stirrer of 2.4 to 3.2 m / s in the course of 144 + 8 hours. At the end of the process, 4000 i 300 U polygalacturonase and 20 + 4 E pectinesterase activity accumulate in 1 cm3 fermentation liquid.
After removal of the mycelium, the insoluble constituents of the medium and a fine filtration or separation, 35 to 37 liters of fermentation liquid are obtained, which is a membrane ultrafiltration which reduces the volume by approximately 8 times, then a vacuum concentration (repeated 8 times) at a temperature below 38 ° C. and a vacuum or be subjected to lyophilic drying at a temperature below 380 ° C. In this way, 300 to 350 g of preparation with an activity of 400,000 U / g PGA and 2000 U / g PEA are obtained. After standardization in pearlite and diatomaceous earth, around 2 kg of preparation with 60,000 U / g PGA and 300 U / g PEA are obtained.