CH658391A5 - METHOD FOR PRODUCING HUMAN GAMMA INTERFERON. - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein neues verbessertes Verfahren zur Herstellung von humanem gamma-Interferon. The invention relates to a new improved process for the production of human gamma interferon.
Es ist bekannt, dass humane Leukozyten unter Einwirkung von mitogenen Mitteln gamma-Interferon (Immuninterferon) erzeugen. Das gamma-Interferon scheidet sich von dem unter Einwirkung von Virus in den Leukozyten gebildeten bzw. durch Virus oder synthetische Polynukleotide induzierten in Fibroblastzellen produzierten Leukozyteninterferon (alpha-Interferon) und Fibroblastinterferon (beta-Inter-feron) sowohl in seinen physikochemischen als auch biologischen Eigenschaften ab. Die zellenteilungshemmende Aktivität und die Funktion der Zellen des Immunsystems beeinflussende Wirkung des gamma-Interferons ist ausgeprägt günstiger als die entsprechenden Aktivitäten des alpha- oder beta-Interferons. Deshalb kann mit einer immer sehr verbreiteten Verwendung des gamma-Interferons in der Therapie durch tumorösen Krankheiten gerechnet werden [Nature 294,7, (1981), Cellular Immunology 49,390 (1980)]. It is known that human leukocytes produce gamma interferon (immune interferon) under the influence of mitogenic agents. The gamma interferon differs from the leukocyte interferon (alpha-interferon) and fibroblast interferon (beta-interferon) produced in fibroblast cells under the influence of virus in the leukocytes or induced by virus or synthetic polynucleotides in both its physicochemical and biological properties from. The cell division-inhibiting activity and the function of the cells of the immune system influencing effect of the gamma-interferon is markedly cheaper than the corresponding activities of the alpha or beta-interferon. Therefore, the use of gamma interferon in the therapy of tumorous diseases is always very widespread [Nature 294.7, (1981), Cellular Immunology 49, 390 (1980)].
Das gamma-Interferon wird auf bekannte Weise so hergestellt, dass man die Leukozytenfraktion, buffy-coat, des Blutes abtrennt, die Erythrozyten durch Gradientzentrifu-gieren oder vorteilhaft durch Haemolyse mit Ammoniumchlorid entfernt, die gereinigten Leukozyten inkubiert, mit einem geeigneten aspezifischen mitogenen Mittel behandelt und schliesslich das erzeugte gamma-Interferon aus der su-pernatierenden Flüssigkeit isoliert. Als mitogenes Mittel kann Concanavalin A [Infect. Immun. 26, 36 (1979)], Phytohaemagglutinin [Proc. Nati. Acad. Sei. USA 78,1601 (1981)] oder Enterotoxin [Int. Res. Commun. Sys. Med. Sei., 7,595 The gamma interferon is produced in a known manner in such a way that the leukocyte fraction, buffy-coat, of the blood is separated off, the erythrocytes are removed by gradient centrifugation or advantageously removed by hemolysis with ammonium chloride, and the purified leukocytes are incubated, treated with a suitable specific mitogenic agent and finally the gamma interferon produced is isolated from the supernatant liquid. As a mitogenic agent, Concanavalin A [Infect. Immune. 26, 36 (1979)], phytohaemagglutinin [Proc. Nati. Acad. Be. USA 78, 1601 (1981)] or enterotoxin [Int. Res. Commun. Sys. Med. Be., 7.595
(1979)] eingesetzt werden. (1979)] can be used.
Nach der Fachliteratur wurden zur Erhöhung der durch mitogene Mittel stimulierten gamma-Interferon-Produktion verschiedene Versuche durchgeführt. Nach einer Methode wird die gamma-Interferon-Produktion durch Vorbehandlung der Leukozyten mit 12-0-Tetradekanoyl-phorbol-13-acetat erhöht [Vilcek und Mitarbeiter: Biochemical Charac-terization ofLymphokines (Academia New York), Seite 323 According to the specialist literature, various experiments were carried out to increase the gamma-interferon production stimulated by mitogenic agents. According to one method, the gamma interferon production is increased by pretreating the leukocytes with 12-0-tetradekanoyl-phorbol-13-acetate [Vilcek et al.: Biochemical Characterization of Lymphokines (Academia New York), page 323
(1980)]. Der Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass das 12-0-Tetradekanoyl-phorbol-13-acetat karzinogen ist und das unter dessen Verwendung erzeugte gamma-Interferon zur Anwendung in der Therapie kaum geeignet ist. Es wurde versucht, die gamma-Interferon-Produktion durch Vorbehandlung der Leukozyten mit Natriumbutylat oder Dexamethason zu steigern; diese Versuche blieben jedoch ohne Erfolg. [Nature 292, 842 (1981)]. (1980)]. The disadvantage of this method is that the 12-0-tetradekanoyl-phorbol-13-acetate is carcinogenic and the gamma interferon produced using it is hardly suitable for use in therapy. Attempts have been made to increase gamma interferon production by pretreating the leukocytes with sodium butylate or dexamethasone; however, these attempts were unsuccessful. [Nature 292, 842 (1981)].
Das Ziel der Erfindung ist bei der aus Leukozyten durch mitogene Mittel induzierte gamma-Interferon-Erzeugung die Erhöhung der Produktion und die Steigerung der Einheitszahl. The aim of the invention is to increase the production and increase the unit number in the production of gamma interferon from leukocytes by mitogenic agents.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von humanem gamma-Interferon, durch Abtrennung der Leukozytenfraktion, des buffy-coat, des Blutes, Entfernung der Erythrozyten, Suspendieren der Leukozyten in einer geeigneten Nährlösung, Behandlung derselben mit einem geeigneten mitogenen Mittel und Abtrennung der interferonhaltigen Lösung von den Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Leukozyten vor der Behandlung mit dem mitogenen Mittel einer Vorbehandlung mit 200 —20000 IE/ ml alpha- oder beta-Interferon unterwirft. The invention relates to a process for the production of human gamma interferon by separating the leukocyte fraction, the buffy coat, the blood, removing the erythrocytes, suspending the leukocytes in a suitable nutrient solution, treating them with a suitable mitogenic agent and separating the interferon-containing ones Solution from the cells, characterized in that the leukocytes are pretreated with 200-20000 IU / ml alpha or beta interferon before treatment with the mitogenic agent.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass falls man die Leukozyten vor der Behandlung mit dem mitogenen Mittel einer Vorbehandlung mit alpha- oder beta-Interferon unterwirft, die gamma-Interferon-Produktion wesentlich — um etwa 500—1000% — erhöht wird. The invention is based on the finding that if the leukocytes are pretreated with alpha- or beta-interferon before treatment with the mitogenic agent, the gamma-interferon production is increased substantially - by about 500-1000%.
Das alpha- oder beta-Interferon kann in einer Menge von 200—20000 IE/ml — eingesetzt werden. The alpha or beta interferon can be used in an amount of 200-20000 IU / ml.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfin-dungsgemässen Verfahrens wird die Vorbehandlung mit 1000—2000 IE/ml — insbesondere 1500 IE/ml — alpha-Interferon durchgeführt. According to an advantageous embodiment of the method according to the invention, the pretreatment is carried out with 1000-2000 IU / ml - in particular 1500 IU / ml - alpha-interferon.
Nach einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird die Vorbehandlung mit 2000—3000 IE/ml — insbesondere 2500 IE/ml — beta-Interferon durchgeführt. According to another advantageous embodiment of the method according to the invention, the pretreatment is carried out with 2000-3000 IU / ml - in particular 2500 IU / ml - beta-interferon.
Die Vorbehandlung kann vorteilhaft 1 —12, besonders vorteilhaft 2 —8, insbesondere 4 Stunden vor der Behandlung mit dem mitogenen Mittel durchgeführt werden. The pretreatment can advantageously be carried out 1-12, particularly advantageously 2-8, in particular 4 hours before the treatment with the mitogenic agent.
Die Zeitdauer der Vorbehandlung mit alpha- oder beta-Interferon beträgt 1 — 12 Stunden, insbesondere etwa 4 Stunden. Die Temperatur der Vorbehandlung liegt im Bereich von 35—39 C'C, man kann besonders vorteilhaft bei 37 CC arbeiten. The duration of the pretreatment with alpha or beta interferon is 1-12 hours, especially about 4 hours. The temperature of the pretreatment is in the range of 35-39 ° C, one can work particularly advantageously at 37 ° C.
Nach der Vorbehandlung und vor der Zugabe des mitogenen Mittels wird das alpha- oder beta-Interferon vorteil2 After the pretreatment and before adding the mitogenic agent, the alpha or beta interferon is beneficial2
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
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haft entfernt (z. B. durch Waschen der Zellen). Zum Auswaschen des alpha- oder beta-Interferons kann eine Hanks-Lösung dienen. Die bei der Vorbehandlung verwendete alpha* oder beta-Interferon kann jedoch auch in der Nährflüs-sigkeit der Zellen bleiben. In diesem Falle muss das erzeugte gamma-Interferon von dem bei der Vorbehandlung verwendeten alpha- oder beta-Interferon nachträglich getrennt werden. removed (e.g. by washing the cells). A Hanks solution can be used to wash out the alpha or beta interferon. However, the alpha * or beta interferon used in the pretreatment can also remain in the nutrient fluid of the cells. In this case, the gamma interferon generated must be subsequently separated from the alpha or beta interferon used in the pretreatment.
Die obige Trennung kann in an sich bekannter Weise durchgeführt werden (z.B. durch Glaschromatographie mit CPG). The above separation can be carried out in a manner known per se (e.g. by glass chromatography with CPG).
Bei dem Verfahren können als Nährflüssigkeit verschiedene Aminosäuren und Vitamine enthaltende Gewebekulturnährlösungen verwendet werden (z.B. Eagle-MEM, RPMI1640, Dulbecco-MEM, Glasgow-modifizierte MEM usw.). Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfin-dungsgemässen Verfahrens kann eine einfache, nicht kostspielige, in Autoklav verwendbare Nährlösung folgender Zusammensetzung Verwendung finden: Tissue culture nutrient solutions containing various amino acids and vitamins can be used as nutrient liquid in the method (e.g. Eagle-MEM, RPMI1640, Dulbecco-MEM, Glasgow-modified MEM, etc.). According to an advantageous embodiment of the method according to the invention, a simple, inexpensive nutrient solution of the following composition that can be used in an autoclave can be used:
Komponente component
Menge amount
Kalciumchlorid Kaliumchlorid Calcium chloride Potassium chloride
Magnesiumsulfat oder eine äquivalente Menge Magnesiumchlorid Natriumchlorid Natriumbicarbonat Natriumdihydrogenphosphat Glukose Ferrinitrat Serum Magnesium sulfate or an equivalent amount of magnesium chloride sodium chloride sodium bicarbonate sodium dihydrogen phosphate glucose ferrinitrate serum
175- 350 mg/ml 300 - 500 mg/ml 175-350 mg / ml 300-500 mg / ml
175- 500 mg/ml 5000 - 7000 mg/ml 200-3500 mg/ml 30- 150 mg/ml 500-5500 mg/ml 0 - 0,2 mg/ml 0,5- 10% 175-500 mg / ml 5000-7000 mg / ml 200-3500 mg / ml 30-150 mg / ml 500-5500 mg / ml 0-0.2 mg / ml 0.5-10%
Die Erzeugung des gamma-Interferons wird in Anwesenheit eines Serums durchgeführt. Zu diesem Zweck sind verschiedene Serum menschlichen und tierischen Ursprungs geeignet. Es kann auch ein gamma-globulinfreies Serum eingesetzt werden. Die Menge des Serums liegt zwischen 0,5 und 10%. The generation of the gamma interferon is carried out in the presence of a serum. Various serums of human and animal origin are suitable for this purpose. A gamma-globulin-free serum can also be used. The amount of serum is between 0.5 and 10%.
Die im Verfahren verwendeten Leukozyten (buffy-coat) wurden aus einem, in der Blutgerinnung gehemmten, höchstens 72 Stunden lang bei 0—8 °C gelagerten menschlichen Blut gewonnen. The buffy-coat used in the procedure was obtained from human blood which had been inhibited in blood coagulation and stored at 0-8 ° C for a maximum of 72 hours.
Als koagulationshemmendes Mittel kann eine ACD-Lösung (Zitronensäure und Dextrose enthaltende Lösung) oder durch verschiedene Basen (z.B. Adenin oder Guanin) ergänzte ACD-Lösung verwendet werden. Die gesammelten Erythrozyten werden durch Gradientzentrifugieren (z.B. mit Hilfe der durch die schwedische Firma Pharmacia in Verkehr gebrachten Produkte Ficoll oder Percoli) oder vorteilhaft durch Haemolyse mit Ammoniumchlorid entfernt. Man kann vorteilhaft so verfahren, dass man die konzentrierte Leukozytensuspension mit einer 0,5—1%-igen — vorteilhaft 0,83%-igen — Ammoniumchloridlösung (Temperatur: 0—10 °C) in einem Volumenverhältnis zwischen 1 : 3 und 1: 20 — vorteilhaft 1: 5 — vermischt. Die erhaltene Suspension wird 5—20 Stunden lang — vorteilhaft etwa 10 Minuten lang — bei 0—8 °C unter oder ohne Rühren inkubiert. Die Leukozyten werden von den zerfallenen Erythrozyten getrennt (z.B. durch Zentrifugieren). Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird die Behandlung mit Ammoniumchlorid wiederholt und in diesem Falle werden auf 1 Volumensteil der Zellensuspension gerechnet, 10 Volumenteile Ammoniumchloridlösung eingesetzt. An ACD solution (solution containing citric acid and dextrose) or an ACD solution supplemented with various bases (e.g. adenine or guanine) can be used as an anticoagulant. The collected erythrocytes are removed by gradient centrifugation (e.g. using the products Ficoll or Percoli marketed by the Swedish company Pharmacia) or advantageously by hemolysis with ammonium chloride. One can advantageously proceed in such a way that the concentrated leukocyte suspension with a 0.5-1% - advantageously 0.83% - ammonium chloride solution (temperature: 0-10 ° C) in a volume ratio between 1: 3 and 1: 20 - advantageously 1: 5 - mixed. The suspension obtained is incubated for 5-20 hours, advantageously about 10 minutes, at 0-8 ° C with or without stirring. The leukocytes are separated from the disintegrated erythrocytes (e.g. by centrifugation). According to an advantageous embodiment of the method, the treatment with ammonium chloride is repeated and in this case 10 parts by volume of ammonium chloride solution are used for 1 part by volume of the cell suspension.
Die gereinigten Leukozyten werden in einer geeigneten Zellenkulturnährlösung(z.B, Eagle-MEM, RPMI 1640, Dulbecco-MEM, Glasgow-modifizierte MEM; oder die obenbeschriebene einfache, nicht-kostspielige, keine Amino-5 säure und Vitamine enthaltende Nährlösung) suspendiert und die Zellenzahl wird auf IO6 —108 Zellen/ml eingestellt. Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird zum wiederholten Suspendieren der Zellen und Einstellung der Zellenzahl die obenerwähnte, einfache, nicht-kost-10 spielige, keine Aminosäuren und Vitamine enthaltende Nährlösung verwendet. Die eingesetzte Nährflüssigkeit bzw. Nährlösung wird mit einem Serum menschlichen oder tierischen Ursprungs oder einem gamma-globulinfreien Serum — vorteilhaft mit menschlichem, gamma-globulinfreiem Se-15 rum — ergänzt. Die Menge des Serums beträgt 0,5 —10%. Der Nährflüssigkeit oder Nährlösung kann vorzugsweise ein Antibiotikum zugefügt werden. Zu diesem Zweck kann vorteilhaft Neomycin Verwendung finden, und zwar in einer Menge von etwa 10—50 ng/ml, insbesondere 25 ng/ml. 20 Danach werden die Zellen der erfindungsgemässen Behandlung mit alpha- oder beta-Interferon unterworfen. Zu diesem Zweck kann induzierfreies (virus- oder polynukleo-tidfreies) rohes oder gereinigtes alpha- oder beta-Interferon verwendet werden. Die alpha- oder beta-Interferon-Konzen-25 tration beträgt 200—20000 IE/ml. Die Temperatur der Vorbehandlung liegt zwischen 35 °C und 39 °C und ist vorteilhaft 37 °C. Die Zeitdauer der Vorbehandlung liegt zwischen 1 und 12 Stunden und beträgt vorteilhaft 4 Stunden. The purified leukocytes are suspended in a suitable cell culture nutrient solution (e.g., Eagle-MEM, RPMI 1640, Dulbecco-MEM, Glasgow-modified MEM; or the simple, non-expensive nutrient solution containing no amino-5 acid and vitamins described above) and the cell number is set to IO6-108 cells / ml. According to an advantageous embodiment of the method, the above-mentioned, simple, inexpensive nutrient solution containing no amino acids and vitamins is used to repeatedly suspend the cells and adjust the number of cells. The nutrient liquid or nutrient solution used is supplemented with a serum of human or animal origin or a gamma-globulin-free serum - advantageously with human gamma-globulin-free Se-15 rum. The amount of serum is 0.5-10%. An antibiotic can preferably be added to the nutrient liquid or nutrient solution. Neomycin can advantageously be used for this purpose, in an amount of approximately 10-50 ng / ml, in particular 25 ng / ml. Then the cells are subjected to the treatment according to the invention with alpha or beta interferon. For this purpose, induction-free (virus or polynucleotide-free) crude or purified alpha or beta interferon can be used. The alpha or beta interferon concentration is 200-20000 IU / ml. The pretreatment temperature is between 35 ° C and 39 ° C and is advantageously 37 ° C. The duration of the pretreatment is between 1 and 12 hours and is advantageously 4 hours.
Das bei der Vorbehandlung eingesetzte Interferon kann 30 von den Zellen vorteilhaft durch Waschen abgetrennt werden. Zum Waschen kann vorteilhaft eine Hankslösung verwendet werden. Nach dem Auswaschen des alpha- oder be-ta-Interferons wird die Zellenkonzentration auf den ursprünglichen Wert eingestellt: diese Massnahme wird in ei-35 ner, ein Serum menschlichen oder tierischen Ursprungs oder ein gamma-globulinfreies Serum, vorteilhaft humanes gam-ma-globulinfreies Serum enthaltenden Nährlösung durchgeführt. The interferon used in the pretreatment can advantageously be separated from the cells by washing. A Hanks solution can advantageously be used for washing. After washing out the alpha or beta interferon, the cell concentration is set to the original value: this measure is carried out in a serum of human or animal origin or a gamma-globulin-free serum, advantageously human gam-ma-globulin-free Serum containing nutrient solution performed.
Das Auswaschen des alpha- oder beta-Interferons ist kei-40 ne unbedingt nowendige Massnahme, da die Anwesenheit des alpha- oder beta-Interferons die Erzeugung des gamma-Interferons nicht stört. In diesem Falle wird das erzeugte gamma-Interferon von dem anwesenden alpha- oder beta-Interferon nach bekannten Methoden getrennt. 45 Die Zellen werden danach mit einem Interferoninduzer in Kontakt gebracht. Zu diesem Zweck können bekannte und übliche Interferoninduzer verwendet werden (z.B. Concanavalin A, Phytohaemagglutinin, Staphylococcus entero-toxin usw.). Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des so Verfahrens wird als Induzer Concanavalin A in einer Konzentration von vorteilhaft 2,5—30 ng/ml — insbesondere 15 ng/ml — eingesetzt. The washing out of the alpha or beta interferon is not absolutely necessary, since the presence of the alpha or beta interferon does not interfere with the generation of the gamma interferon. In this case, the gamma interferon produced is separated from the alpha or beta interferon present by known methods. 45 The cells are then brought into contact with an interferon inducer. Known and common interferon inducers can be used for this purpose (e.g. Concanavalin A, Phytohaemagglutinin, Staphylococcus entero-toxin etc.). According to an advantageous embodiment of the method in this way, Concanavalin A is used as inducer in a concentration of advantageously 2.5-30 ng / ml - in particular 15 ng / ml.
Die Zeitdauer der Induktion beträgt 5—48 Stunden, vorteilhaft 10—12 Stunden. Die Temperatur liegt zwischen 55 35 °C und 39 °C und beträgt vorteilhaft 37 °C. Nach Abklingen einer bestimmten Zeitdauer (z.B. eine Stunde) kann das Induzer erwünschtenfalls durch Waschen entfernt werden. Diese Massnahme ist jedoch nicht obligatorisch, da die Anwesenheit des Induzers die gamma-Interferon-Erzeugung 6o nicht stört. Im allgemeinen wird das Induzer nicht entfernt. The duration of the induction is 5-48 hours, advantageously 10-12 hours. The temperature is between 55 35 ° C and 39 ° C and is advantageously 37 ° C. After a certain period of time (e.g. one hour) has subsided, the inducer can be removed by washing if desired. However, this measure is not mandatory since the presence of the inducer does not interfere with the gamma interferon production 6o. In general, the inducer is not removed.
Die Zellen werden danach von der supernatierenden Flüssigkeit durch Zentrifugieren getrennt. Diese supernatie-rende Schichte enthält das rohe gamma-Interferon und kann bei niedriger Temperatur (etwa —20 °C) gelagert oder nach 65 bekannten Methoden gereinigt werden. The cells are then separated from the supernatant fluid by centrifugation. This supernatant layer contains the crude gamma interferon and can be stored at a low temperature (about -20 ° C) or cleaned by 65 known methods.
Der Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass die mit alpha- oder beta-Interferon durchgeführte Vorbehandlung eine fünffache-zehnfache Erhöhung der The advantage of the method according to the invention is that the pretreatment carried out with alpha or beta interferon increases the fivefold-tenfold
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gamma-Interferon-Produktion zur Folge hat. Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte gamma-Interferon ist mit den nach bekannten Methoden hergestellten gamma-Interferon sowohl in der physikochemischen Eigenschaften (pH 2 Empfindlichkeit, bei 56 °C und 37 °C gemessene Stabilität) als auch in der biologischen Aktivität (antivirale und antizellulare Wirkung) vollständig gleichwertig. gamma interferon production. The gamma interferon produced by the method according to the invention is, with the gamma interferon produced by known methods, both in the physicochemical properties (pH 2 sensitivity, stability measured at 56 ° C. and 37 ° C.) and in the biological activity (antiviral and anticellular Effect) completely equivalent.
Weitere Einzelheiten der Erfindung sind den nachstehenden Beispielen zu entnehmen. Further details of the invention can be found in the examples below.
Beispiel 1 example 1
Das entnommene Blut wird in einer ACD-Lösung (Zitronensäure und Dextrose enthaltende wässrige Lösung) bei +4 °C 3 Stunden lang gelagert. Die «buffy coat» Fraktion wird durch Zentrifugieren gesammelt und über Nacht bei +4 °C stehengelassen. 1 Vol. Teil des so erhaltenen Leukozytenkonzentrates wird mit 5 Vol. Teilen einer 0.83%-igen wässrigen Ammoniumchloridlösung (Temperatur H-4°C) vermischt. Die Suspension wird bis Auflösung der Erythrozyten (5—10 Minuten) bei +4 °C gehalten und die Leukozyten werden durch Zentrifugieren isoliert. Die Leukozyten werden in einer Nährlösung folgender Zusammensetzung suspendiert. The blood drawn is stored in an ACD solution (aqueous solution containing citric acid and dextrose) at +4 ° C for 3 hours. The "buffy coat" fraction is collected by centrifugation and left overnight at +4 ° C. 1 part by volume of the leukocyte concentrate obtained in this way is mixed with 5 parts by volume of a 0.83% strength aqueous ammonium chloride solution (temperature H-4 ° C.). The suspension is kept at +4 ° C. until the erythrocytes have dissolved (5-10 minutes) and the leukocytes are isolated by centrifugation. The leukocytes are suspended in a nutrient solution of the following composition.
Komponente Konzentration, mg/1 Concentration component, mg / 1
Kalciumchlorid 265 Calcium chloride 265
Ferrinitrat 0,1 Ferrinitrate 0.1
Kaliumchlorid 400 Potassium chloride 400
Magnesiumsulfatheptahydrat 200 Magnesium sulfate heptahydrate 200
Natriumchlorid 6400 Sodium chloride 6400
Natriumbicarbonat 2750 Natriumdihydrogenphosphat-dihy- Sodium bicarbonate 2750 sodium dihydrogen phosphate dihy
drat 140 third 140
Glukose 4500 Glucose 4500
Das Auflösen der Erythrozyten wird nach der obigen Methode mit der Modifizierung wiederholt, dass 10 Vol. Teile einer 0.83%-igen wässrigen Ammoniumchloridlösung, auf 1 Vol. Teil Leukozytensuspension bezogen, verwendet werden. Die Leukozyten werden in der Nährlösung obiger Zusammensetzung suspendiert und die Zellenzahl wird auf 107 Zellen/ml eingestellt. The dissolution of the erythrocytes is repeated according to the above method with the modification that 10 parts by volume of a 0.83% aqueous ammonium chloride solution, based on 1 part by volume of leukocyte suspension, are used. The leukocytes are suspended in the nutrient solution of the above composition and the number of cells is adjusted to 107 cells / ml.
Die Nährlösung enthält 2 mg/ml humanes Agammase-rum und 25 [xg/ml Neomycin. Die Zellen werden 4 Stunden lang bei 37 °C unter ständigem Rühren mit 1500 IE/ml konzentriertem alpha-Interferon behandelt (bei pH 2 behandeltes, vom Sendai-Virus freies Interferon). Danach wird das verwendete alpha-Interferon durch zweimaliges Waschen mit einer Hankslösung entfernt, die Zellen werden mit 15 (ig/ ml Concanavalin A, bei 37 °C, 12 Stunden lang unter ständigem Rühren inkubiert. Der gamma-Interferon-Gehalt der supernatierenden Schichte beträgt 50000 IE/ml. The nutrient solution contains 2 mg / ml human agammase rum and 25 [xg / ml neomycin. The cells are treated with 1500 IU / ml concentrated alpha interferon (pH 2 treated, Sendai virus-free interferon) for 4 hours at 37 ° C. with constant stirring. The alpha interferon used is then removed by washing twice with a Hanks solution, the cells are incubated with 15 (ig / ml concanavalin A, at 37 ° C. for 12 hours with constant stirring. The gamma interferon content of the supernatant layer is 50000 IU / ml.
Als Vergleich wird das obige Verfahren mit der Modifizierung wiederholt, dass die Behandlung der Leukozyten mit alpha-Interferon vor der Zugabe des Induzers weggelassen wurde. Der Titer des erhaltenen gamma-Interferons beträgt nur 6500 E/ml. For comparison, the above procedure is repeated with the modification that the treatment of the leukocytes with alpha interferon was omitted before the addition of the inducer. The titer of the gamma interferon obtained is only 6500 U / ml.
Beispiel 2 Example 2
Man verfahrt wie im Beispiel 1, mit dem Unterschied, dass als Nährlösung eine Glasgow-MEM Nährflüssigkeit verwendet wird (Virology 14,359 /1961/). Der Wirkstoffge-halt des so erhaltenen rohen gamma-Interferons beträgt 48000 E/ml. The procedure is as in Example 1, with the difference that a Glasgow-MEM nutrient liquid is used as the nutrient solution (Virology 14.359 / 1961 /). The active substance content of the crude gamma interferon thus obtained is 48000 U / ml.
Das obige Verfahren wird so wiederholt, dass die Behandlung mit alpha-Interferon weggelassen wurde. Der Wirkstoffgehalt des so erhaltenen rohen alpha-Interferons beträgt nur 6200 E/ml. The above procedure is repeated so that treatment with alpha interferon has been omitted. The active substance content of the crude alpha interferon thus obtained is only 6200 U / ml.
Beispiel 3 Example 3
Man verfährt wie im Beispiel 1, mit dem Unterschied, dass das bei der Vorbehandlung verwendete alpha-Interfe-ron nicht entfernt wird. Nach der Behandlung mit alpha-Interferon werden die Zellen mit 15 (ig/ml Concanavalin A, bei 37 °C, unter ständigem Rühren 12 Stunden lang inku-biert. Die obenschwimmende (supernatierende) Flüssigkeit enthält 52000 E/ml Interferon. The procedure is as in Example 1, with the difference that the alpha interferon used in the pretreatment is not removed. After treatment with alpha interferon, the cells are incubated with 15 (ig / ml concanavalin A, at 37 ° C., with constant stirring for 12 hours. The above-floating (supernatant) liquid contains 52000 U / ml interferon.
Die so erhaltene, alpha-, beta- und gamma-Interferon enthaltende Mischung wird nach Glaschromatographie (CPG) auf die Komponenten getrennt. Das Rohprodukt wird auf eine, mit CPG-Glas gefüllte Säule geführt. Das alpha-Interferon und die Verunreinigungen gehen durch die Säule und das gamma-Interferon bleibt an der Säule gebunden. Das gamma-Interferon wird von der Säule mit einer, 20 Vol.% Äthylenglykol, 150 Millimol Natriumchlorid und 20 Millimol Phosphatpuffer enthaltenden wässrigen Lösung eluiert. The mixture thus obtained, containing alpha, beta and gamma interferon, is separated on the components after glass chromatography (CPG). The crude product is passed onto a column filled with CPG glass. The alpha interferon and contaminants pass through the column and the gamma interferon remains bound to the column. The gamma interferon is eluted from the column with an aqueous solution containing 20% by volume of ethylene glycol, 150 millimoles of sodium chloride and 20 millimoles of phosphate buffer.
Beispiel 4 Example 4
Man verfahrt wie im Beispiel 1, mit dem Unterschied, dass man anstatt alpha-Interferon 2500 IE/ml beta-Interfe-ron verwendet. Der Interferongehalt des erhaltenen Rohproduktes beträgt 56000 E/ml. The procedure is as in Example 1, with the difference that instead of alpha interferon 2500 IU / ml beta interferon is used. The interferon content of the crude product obtained is 56000 U / ml.
Zum Vergleich wird das obige Verfahren so wiederholt, dass der Behandlung mit beta-Interferon weggelassen wurde. Das gamma-Interferon-Gehalt des erhaltenen Rohproduktes beträgt 6800 E/ml. For comparison, the above procedure is repeated so that treatment with beta interferon has been omitted. The gamma interferon content of the crude product obtained is 6800 U / ml.
4 4th
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
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