**ATTENTION** debut du champ DESC peut contenir fin de CLMS **.
REVENDICATIONS
1. Procédé pour obtenir une courbe de pouvoir tampon d'une solution échantillon contenant de l'ionogéne, caractérisé en ce qu'il comprend
- la titration de la solution au moyen d'un acide fort ou d'une base forte qui est ajoutée avec un débit constant à la solution remuée,
- le traitement électrique du signal de sortie d'une électrode pH placée dans la solution au travers d'un circuit différenciateur pour obtenir un signal proportionnel à d pH/dt et le traitement de ce dernier signal au travers d'un circuit formant la réciproque dt/d pH, et
- I'enregistrement automatique graphique du signal dt/d pH par rapport au Ph de la solution pour obtenir la courbe de pouvoir tampon.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution est titrée après que son pH ait été ajusté à la valeur à partir de laquelle on souhaite enregistrer la courbe de pouvoir tampon prevue.
3. Appareil pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens contenant une solution échantillon contenent de l'ionogène, une électrode pH destinée à être introduite dans la solution échantillon et associée avec un dispositif de mesure de pH, des moyens pour introduire dans la solution échantillon un acide fort ou une base forte dans des conditions contrôlées, des moyens pour agiter la solution échantillon, des moyens pour traiter électriquement le changement continu du signal de sortie de cette électrode pH, signal créé lorsque ledit acide ou ladite base est introduite dans la solution échantillon, ces moyens de traitement comprenant un circuit différenciateur suivi d'un circuit formant la réciproque et étant adaptés à convertir le signal de sortie d'électrode en un signal proportionnel à d pH/dt,
puis de convertir ce dernier signal en un signal proportionnel à dt/d pH; et des moyens pour enregistrer automatiquement graphiquement sur une surface le signal résultant proportionnel à dt/d pH par rapport au pH de la solution échantillon, ce qui enregistre une courbe de pouvoir tampon de la solution échantillon.
La présente invention concerne un procédé de détermination du pouvoir tampon d'une solution contenant un ionogène et plus particulièrement pour enregistrer une courbe ss = f(pH) d'une solution ionogène consistant à titrer cette solution avec un acide ou une base forte, à mesurer le pH, à convertir ce pH en pouvoir tampon (ss et à enregistrer ce pouvoir tampon en fonction du pH de la solution, ainsi qu'un appareillage qui permet de mettre en oeuvre ce procédé.
Le terme ionogène décrit un électrolyte faible dont le pKa est situé entre 0 et 14 lorsque l'eau est utilisée comme solvant.
Un ionogène est une substance susceptible de se dissocier en donnant des ions. Parmi les ionogénes citons: acides faibles, bases faibles, ampholytes (acises aminés, peptides, protéines), ainsi que certaines substances insolubles pouvant s'ioniser.
Presque tous les matériaux de notre environnement, comme les fluides biologique et les aliments, contiennent des ionogènes.
D'un point de vue physico-chimique, un ionogène se dissocie par exemple comme suit:
HAH+ +A- (1)
La constante de dissociation à l'équilibre est désignée par
le symbole Ka,
Ka=[H+] [A-] I [HA] (2) les parenthèses signifiant que les composés sont donnés en concentration ou en activité. La grandeur pKa est définie comme suit: pKa = - log Ka (3)
Dans le cas d'une base, la dissociation s'écrit:
RNH3+ a H+ + RNH2 (4)
Les pKa des ionogènes se situent dans un intervalle de O à 14. Les valeurs de pKa de composés appartenent à une classe spécifique de composés, par exemple les composés carboxylés, se situent dans un intervalle plus ou moins large suivant leur nature.
Une des caractéristiques d'un ionogène en solution est sa tendance à contrecarrer le changement de pH lorsqu'une base forte ou un acide fort est ajouté, cette tendance étant plus particulièrement marquée lorsque le pH se situe entre la valeur pKa - 1 et la valeur pKa + 1. Par exemple, lorsque 1 ml de
NaOH 1N est ajouté à 1 L d'eau pure (pH = 7) le pH augmente immédiatement à 11. Par contre, si la même quantité de
NaOH est ajoutée à 1 L d'imidazole (pKa= 6,95) 0,1 M dont environ la moitié a été neutralisée avec HC1 (pH = 7), I'augmentation de pH est seulement de 0,02 environ. Le phénomène est dénommé effet tampon et une solution exhibant cet effet tampon est une solution tampon . Ces solutions ont de très nombreux usages.
Le mécanisme par lequel s'exerce l'effet tampon est bien etabli et l'on peut calculer le pouvoir tampon à partir des valeurs pKa, des concentrations et d'autres paramètres. Ce pouvoir tampon est défini comme suit: 13=dB/dpH (5) où B est la concentration de base forte ajoutée (éq.-gr/L).
Lorsque le pH est égal au pKa, B est à son maximum.
Pour un monoacide, ce maximum est donné par la relation: '3=0,576 CA (6)
OÙ CA est la concentration de l'acide. Lorsque le pH de la solution s'éloigne de la valeur du pKa, ss diminue. Par exemple ss sere égal au dixième de sa valeur maxima lorsque pH = pKa zt 1, et au centième de sa valeur maxima lorsque pH = pKa i 2. Dans le cas d'un polyacide, la situantion est similaire, toutefois les calculs sont plus compliqués.
La valeur ss est proportionnelle à CA et la courbe ss = f(pH) présente un maximum dont la position dépend du pKa de l'ionogène. Les figures 1 (a) - (g) montrent des exemples de courbes ss f(pH) de divers acides (0.05 M). Ces courbes ont été établies par calcul. Les figures montrent que les valeurs de ss augmentent considérablement lorsque le pH est inférieur à 2 ou supérieur à 12. Ceci est dû au pouvoir tampon du solvant eau qui est un ampholyte.
Pour cette raison, il est généralement difficile de déterminer le pouvoir tampon ss d'un soluté aux valeurs extrêmes de pH et l'on se limite généralement à la mesure du pouvoir tampon de solutions ionogènes de concentration moyenne au domaine de pH situé approximativement entre 2 et 12. Ce pouvoir tampon est non seulement proportionnel à C, mais présente aussi un caractère additif lorsque la solution est un mélange. La loi B = f(pH) présente une certaine similarité avec les spectre d'absorption pour lesquels s'applique la loi de BEER-LAMBERT. Le pH correspondrait à la longueur d'onde et P à l'absorption.
En dépit de ces caractéristiques, l'utilisation des courbes ss = f(pH) dans un but analytique a été peu fréquente, une des raisons en est l'absence d'une technique simple et commode
permettant de mesurer la valeur ss d'une solution. Naturellement, il est possible de décuire la valeur p de la courbe conventionelle représentant le pH en fonction du volume d'acide ou de base ajouté, puisque '3est l'inverse de la pente de la courbe de titration. Cependant le travail serait tel, qu'il est impossible d'utiliser ce procédé pour des analyses de routine.
Les calculatrices modernes pourraient faciliter ce travail, mais ceci demande beaucoup de préparation et un équipement important.
L'auteur de la présente invention avait entrepris des recherches pour obtenir des courbes P = f(pH) avec un èquipement aussi simple que celui utilisé pour les titrations automatiques et il y est parvenu. Dans la présente description, l'expression titration du pouvoir tampon s'applique à la titration d'une solution contenent un ionogène avec un acide ou une base forte avec enregistrement simultané d'une courbe ss = f(pH).
On peut imaginer diverses méthodes pour enregistrer des courbes S = f(pH), la plus simple en théorie consisterait à enregistrer sous forme de données numériques le pH en fonction du volume de réactif ajouté, puis à calculer la courbe p = f(pH) à partir de ces données. Cette méthode peu originale dans son principe requièrt beaucoup de préparation et un équipement important, du moins actuellement.
Au lieu de procéder ainsi, nous avons développé une autre méthode qui permet d'obtenir aisément la courbe P = f(pH).
Ce procédé consiste à titrer la solution par addition d'acide fort ou de base forte avec un débit constant la solution étant remuée et à détecter le changement de pH comme changement de signal électrique; un circuit de différenciation et un circuit d'inversion permettent d'obtenir l'inverse de la vitesse de changement du signal. Cette grandeur dt/d pH, donc proportionnele à p = dB/d pH lorsque ledit débit est constant, est enregistrée en fonction du pH.
Les bases théoriques de la présente invention sont les suivantes:
Lorsqu'une solution d'acide faible (ou une base faible sous sa forme protonique) de concentration CA est titrée par une solution d'une base de concentration CB, nous pouvons écrire:
Ca=[HA] + [A-] = CAV/(V+V) (1)
Cb = [M+] = CBV/(V+V) (2) [M+j + [H+] = [OH-J + [A-] (3)
EMI2.1
Le pouvoir tampon de la sulution p i avant titration est donné par la relation thérorique suivante:
EMI2.2
Ainsi, la quantité dt/d pH est proportionnelle d'une part au pouvoir tampon initial p i et d'autre part au volume de baoù Ca et Cb sont les concentrations de l'acide et de la base ajoutée à la solution. V est le volume initial de la solution et v le volume de base ajouté.
Des relations précédentes il résulte que: [A-] = C,v/(V+v)+ [H+] - [OH-] (4)
Si nous introduisons le coefficient de dissociation a= [A-]/([HA] + [A-]) nous obtenons la relation suivante, dans laquelle nA et nB sont les quantités d'acide titré et d3 base ajouté en moles: = = nA + (V + v) ([OH ] - [H+]) (5)
Etant donné que le coefficient de dissociation est lié à la constante de dissociation par la relation: Ka = [H+]a/(l-a) (6)
L'équation 5 devient:
EMI2.3
En dérivant par rapport au pH la relation (7) devient:
EMI2.4
Etant donné que la base est introduite à une vitesse constante r (cm3. sa1) et que nB=CBrt (9) où t est le temps en secondes, on a:
EMI2.5
se ajouté.
Le deuxième terme n'est important qu'aux valeurs extrêmes de pH et peut être négligé quand une concentration adéquate de soude est utilisée. Si cela est nécessaire, on peut dans une certaine mesure éliminer le second terme en soustrayant les résultats obtenus dans un essai à blanc. En conséquence de ce qui précède, le pH peut être utilisé pour l'obtention d'une courbe p = f(pH), courbe qui permet de connaître les ionogènes d'une solution.
I1 existe une autre méthode pour conaître les ionogènes d'une solution au moyen d'une courbe p = f(pH). Elle consiste à titrer avec une base forte, la quantité ajoutée A v étant telle que le pH augmente d'une certaine valeur A pH, par exemple 0,1. On obtient alors un signal électrique proportionnel à A v, ce qui permet de calculer A VIA pH et enregistrer cette valeur en fonction du pH. Dans cette méthode, les équations (1) à (8) continuent de s'appliquer. Ensuite, puisque nB = CBV:
EMI3.1
par conséquent:
EMI3.2
Bien que A v et A pH soient des valeurs finies, si elles sont suffisamment petites, on obtient une courbe ss tout à fait correcte. Toutefois, si ces valeurs sont trop faibles des fluctuations peuvent surgir, conduisant à des erreurs.
Elles devront être choisies expérimentalement de manière à être aussi petites que possible.
Les courbes p = f(pH) sont tracées en même temps que s'effectue la titration, et ceci au moyen d'un équipement électronique appropné.
Il est à prévoir que la méthode de caractérisation des ionogènes faisant l'objet de la présente invention trouvera de nombreuses applications industrielles et scientifiques. Des modes de mise en oeuvre de l'invention seront décrits dans le texte à l'aide des figures de dessin annexées:
La figure 1 représente les courbes calulées ss = f(pH) d'un certain nombre d'acides,
La figure 2 est une représentation schématique de l'appareillage selon la présente invention permettant d'obtenir des courbes p = f(pH),
La figure 3 est une représentation schématique d'un appareillage permettant d'obtenir des courbes P = f(pH) au moyen d'une calculatrice,
La figure 4 représente des courbes ss = f(pH) calculées et obtenues expérimentalement:
elles sont très voisines,
Les figures 5 (a) et (b) représentent des courbes de titration et des courbes ss f(pH) de jus de chou chinois salé après différents temps de fermentation,
Les figures 6 (a) et (b) représentent des courbes de titration de jus de chou chinois fermenté et d'acide lactique,
Les figures 7 à 19 représentent les courbes B = f(pH) de divers produits comestibles: figure 7 (a): thé vert, (b): thé chauffé, (c): thé noir, figure 8 (a): vinaigre, (b): acide acétique et Tris-C1H, figure 9: boisson commerciale à base d'acides aminés, figure 10 (a): assaisonnement d'origine chimique, (b): acide glutamique, figure 11 (a): sakéjaponais, (b): vin, figure 12 (a): café, (b): café soluble, figure 13: jus de pamplemousse, figure 14: jus de citron, figure 15:
jus d'orange, figure 16: jus de pomme, figure 17: jus de raisin, figure 18: jus d'ananas, figure 19 (a): sauce de soja, (b): courbe calculée à partir de la composition en acides aminés de la sauce de soja.
La figure 20 représente la courbe ss = f(pH) d'un extrait aqueux d'un terreau provenant de la fermentation de paille de riz et les figures 21 (a), (b) et (c) représentent les courbes ss f(pH) d'urine.
Dans les figures 2 et 3, les éléments 1 à 6 représentent une burette, une électrode de verre, une électrode de référence, un agitateur, et un enregistreur X-Y.
Comme nous l'avons déjà indiqué, les ionogènes sont largement distribués dans notre environnement. En particulier, la majorité des aliments sont des mélanges où sont présents des acides organiques, des bases organiques, des acides ami
nés, des protéines etc, dont dépend le goût, la valeur nutritive,
la valeur commerciale, etc.
Le procédé fournit une courbe dont le profil dépend des
ionogènes présents dans l'échantillon. De ce point de vue, le
procédé constitue un nouveau moyen d'identification. Un
avantage de procédé est qu'il ne requièrt pas, comme c'est le
cas dans la majorité des analyses chimiques conventionnelles
de traitement préalable pouvant causer une perte de substance
ionogène. Bien qu'il soit possible d'utiliser le procédé pour
des analyses qualitatives et quantitatives en mesurant la posi
tion et la hauteur des pics, le but de ce procédé est plutôt de
caractériser un mélange d'ionogènes dans un milieu
complexe.
On peut lors de la détermination du pouvoir tampon
ajouter un acide fort ou une base forte à un échantillon de la
solution de manière à ce que le pH se situe dans la région à
partir de laquelle on envisage d'enregistrer les courbes
p = f(pH). Ainsi, il est possible d'enregistrer les courbes
p = f(pH) dans le domaine allant de 2 à 12.
Un exemple d'appareillage pour enregistrer les courbes
B = f(pH) suivant les principes énoncés plus haut sera mainte
nant décrit de façon détaillée.
Suivant le schéma de fonctionnement représenté sur la
figure 2, la différence de potentiel entre l'électrode de verre et
l'électrode de référence est amplifiée pour alimenter un circuit
de différenciation. Le signal à la sortie de ce circuit est propor
tionnel à dE/dt. Ce signal est amplifié et converti en un signal
proportionnel à dt/dE (i.e. inverse de dE/dt) au moyen d'un circuit diviseur - multiplicateur. Etant donné que dE est pro
portionnel à dpH, dt/dE est proportionnel à dt/dpH. Ce si
gnal alimente l'entrée Y d'un enregistreur X-Y, I'entrée X est
reliée au pH-mètre. L'enregistrement de la courbe P = f(pH)
commence au moment de la mise en route de la burette. Le
pH se trouve en abscisses et le pouvoir tampon en ordonnées.
Cet appareillage peut être constitué de façon économique
et sous une forme compacte à partir d'éléments existant dans
le commerce. Il peut présenter toutefois les inconvénients sui
vants: compte tenu de la manière dont la dérivation par rap
port au temps s'effectue, Fappareillage peut ne pas convenir
dans les cas où le temps de réaction est long, par exemple avec
certaines suspensions ou certains milieux non-aqueux. Aussi,
le bruit de fond peut être important si la solution titrante n'est
pas répartie rapidement de façon homogène dans la solution
en faisant évoluer le pH de façon progressive.
Toutefois, les inconvénients énumérés ci-dessus peuvent
être considérablement réduits ou éliminés par diverses amélio
rations techniques, par exemple en améliorant le système de
mélange de la solution, en diminuant la vitesse d'introduction
du réactif ou enfin en contrôlant l'addition de réactif au mo
yen d'une calculatrice.
Un générateur de fonctions a été utilisé pour vérifier que
l'appareillage fonctionnait normalement. I1 a été trouvé que
les relations (14) et (15) sont satisfaites, ce qui permet d'enre
gistrer les courbes p = f(pH) d'échantillons de diverses concen
trations et volumes.
En outre, il est possible de donner aux courbes un aspect
régulier et supprimer le bruit de fond en enregistrant et trans
formant le signal au moyen d'une calculatrice numérique au
lieu d'un circuit analogique. Un appareillage utilisant ce prin
cipe est représenté schématiquement sur la figure 3. L'équipe
ment de titration est le même que celui de la figure 2.
Au point (a) de la figure 3, une quantité choisie de solu
tion titrante (par exemple 10 } est ajoutée au moyen de la
burette. Après une durée de temps t (par exemple 1 s) qui per
met à la solution de devenir à nouveau homogène, le signal du
pH-mètre est enregistré sous forme numérique dans la mé moire 1. Le signal suivant est enregistré dans la mémoire II.
La valeur
volume de solution titrante
(mémoire II) - (mémoire I) est alors calculée et enregistrée sous forme numérique dans la mémoire A. Dans la phase suivante, la troisième valeur de pH est enregistrée dans la mémoire II, tandis que le second pH est transféré de la mémoire II à la mémoire I. Le résultat du calcul est enregistré dans la mémoire B. L'opération se trouve ainsi répétée. Les valeurs enregistrées dans les mémoires A, B, etc, sont converties en signal éléctrique. Ce signal est envoyé sur l'entrée Y de l'enregistreur X-Y. Le signal électrique du pH-mètre est envoyé sur l'entré X.
Dans la méthode analogique on enregistre la valeur dt/d pH, tandis que dans la méthode numérique on enregistre la valeur dv/d pH. La méthode numérique permet donc de tracer les courbes p = f(pH) lorsque la réponse du système est lente. On peut par ailleurs arrondir la forme des courbes par un traitement des données enregistrées dans les mémoires A,
B, . . . On peut enfin élargir le domaine de mesure aux valeurs extrêmes de pH par soustraction des valeurs ss obtenues dans un essai à blanc (i.e. sans ionogène). Il est préférable d'asservir le temps t à la valeur dv/d pH afin de ne pas allonger inutilement la durée d'enregistrement. Ceci ne présente pas de difficulté technique particulière.
Toutefois, il est inévitable que de tels appareillages ne deviennent encombrants et coûteux.
Les appareillages que nous avons décrits sont surtout destinés à la mesure de pouvoir tampon. Ils peuvent cependant avoir d'autres applications. La mesure du pouvoir tampon est basée sur l'équation d'Henderson:
pH=pKa + log [sel]
[acide] et sur la conversion du pH en potentiel électrique au moyen de l'électrode de verre. Dans le cas d'un système rédox, où l'électrode de mesure est constituée d'un matérieau inerte comme le platine, le potentiel est donné par l'équation:
RT [forme oxydée]
E = EO + - Log
nF [forme réduites
0,059 [forme oxydées = EO + ' 9 Log
n [forme réduite]
où n est le nombre d'électrons. Le pH et le potentiel redox
sont donnés par des relations similaires. En d'autres termes, il
est possible de définir un pouvoir tampon redox comme il a
été possible de définir un pouvoir tampon pH.
Il convient
donc de noter que l'appareillage peut aussi être utilisé pour
des investigations sur des systèmes redox complexes, par
exemple sur des matériaux biologiques.
La présente invention sera rendue plus explicite par des
exemples concrets d'utilisation, exemples qui ne limitent nul
lement le champ d'application de l'invention.
L'appareillage utilisé est celui représenté schématique
ment sur la figure 2.
pH-mètre utilisé: modèle HM-SA, fabriqué par Toa Elec
tric Wave Co., Ltd.
Enregistreur utilisé: modèle D8-CP, fabriqué par Riken
Electronics.
La titration était faite au moyen de soude 1,00 N introduite à une vitesse constante, voisine de 10 Ill/sec. La solution était agitée au moyen d'un barreau magnétique (tournant à 1300 tours/min environ) et elle était maintenue dans un bainmarie à 25 C.
La figure 4 représente les courbes ss= = f(pH( théorique (i.e.
calculée) et mesurée d'une solution connue. La solution contenait 0,053 M/L de chlorure de Tris (i.e. tri(hydroxyméthyl)aminométhane) dont le pKa est 8,06 et 0,053 M/L d'acide acétique (pKa = 4,76). Une petite quantité d'acide chlorhydrique était ajoutée à la solution de manière à ce que le pH fût inférieur à 2, ce qui permet d'obtenir la courbe dans la région de bas pH. La figure 4 montre que les deux courbes sont tout à fait analogues.
Maintenant nous allons montrer par des exemples comment les courbes B = f(pH) peuvent être utilisées pour juger de la qualité de produits alimentaires et similaires.
Processus de vieillissement de chou chinois conservé dans de la saumure
Dans ce premier exemple, nous examinons l'évolution des composantes et du goût d'un légume conservé dans de la saumure en fonction de l'évolution des courbes p = f(pH) déterminées suivant le procédé de la présente invention. Nous examinons aussi les différences qui existent entre cette méthode et les méthodes conventionnelles de mesure de pH et d'acidité actuellement utilisées pour les contrôles de qualité et nous comparons les avantages respectifs.
500 g de chou chinois ont été découpés en lamelles de 7 mm de diamètre et mélangés avec 20 g de chlorure de sodium. Le mélange a été tassé dans un récipient prévu pour cet usage et acheté dans le commerce. Le récipient et son contenu ont été ensuite laissés à température ambiante. La concentration saline était celle utilisée pour mariner le chou chinois en une nuit. Selon la littérature, les changements qui s'opèrent en cours de fermentation d'un légume en milieu salin sont complexes. On peut les résumer comme suit: dans un premier temps, ce sont des bactéries aérobies (Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter, Escherichia coli et divers Bacillus) qui se développent. Au bout de quelques jours, ce sont
des bactéries productrices d'acide lactique (Leuc. mesenteroides, Sc. faecalis, Pediococcus) qui commencent à se propager.
La croissance des bactéries aérobies est ralentie par la diminu
tion du pH. Elle cesse complètement lorsqu'un certain niveau
d'acide lactique est atteint. Finalement, la flore lactique se
modifie avec la prolifération de L. plantarum ou L. brevis
(voir Shokuhim Biseibutsugaku (microbiologie alimen
taire) écrit par Yoshii, Kaneko et Yamaguchi, publié par Gi
hodo en 1980). Naturellement, des acides autres que l'acide
lactique peuvent se former aussi pendant la fermentation:
c'est ainsi que divers acides gras ont été mis en évidence dans
des légumes salés. (Takanami et col., Bull. Foods Industry,
Japan, 25, 9 (1978)). Lorsqu'un légume est tassé avec du sel,
l'eau suinte.
La quantité de liquide produite est approximati
vement égale à la quantité d'eau qui reste à l'intérieur du
légume. 20 ml de liquide ont été prélevés après 3, 5, 6 et 8 jours de fermentation et soumis à une titration de pouvoir
tampon selon le procédé de la présente invention. Nous avons
aussi mesuré le pH et titré l'acidité.
Les courbes p = f(pH) obtenues sont représentées sur la
figure 5 (b). Elles présentent les caractéristiques suivantes:
(1) Une région à fort pouvoir tampon à un pH voisin de
3,8
(2) Une région à fort pouvoir tampon à un pH voisin de
9,5
(3) Une région à faible pouvoir tampon à un pH voisin
de7.
Le pouvoir tampon dans ces trois régions augmente consi
dérabIement avec le temps.
On peut calculer le pouvoir tampon à partir de la courbe obtenue avec la solution étalon Tris - acide acétique. On obtient pour valeur de ss dans les régions (1) et (2) après 8 jours environ 0,032. Si on admet que le pouvoir tampon dans chacune de ces deux régions est dû à un seul inogène, la quantité de chacun des deux ionogènes serait de 0,056 M/L. Si on admet en outre que le pouvoir tampon de la région (1) est dû à l'acide lactique, sa concentration est d'environ 0,5% (poids moléculaire de l'acide lactique, 90,1). Par contre, aucune mention n'est faite dans la littérature d'un produit qui pourrait être responsable du pouvoir tampon dans la région (2).
Etant donné l'emplacement de ce pic (pH 9,5), le composé qui est à son origine pourrait être (a) un acide aminé (groupe
NH2), (b) un composé aromatique hétérocyclique (groupe
OH), (c) un phénol, (d) une purine, (e) un composé hétérocyclique saturé renfermant de l'azote, ou (f) une amine à chaîne longue. Compte tenu de la composition de légume et de son évolution pendant la fermentation, c'est le composé (a) qui est le plus probablement responsable du pic à pH 9,5. Puisque le pouvoir tampon à pH 3 n'est pas plus élevé qu'à pH 9,5, on peut en déduire que les groupements carbocyliques appartenent à des acides organiques sont moins nombreux que ceux appartenent à des acides aminés. Ce type d'information ne peut être fourni par les mesures acidimétriques conventionnelles: il faut avoir recours à des méthodes plus longues et plus complexes comme la séparation par chromatographie.
La chromatographie ne permet toutefois pas d'obtenir un profil de distribution des ionogènes comme celui fourni par la tîtration du pouvoir tampon. I1 faut noter que cette information n'a jamais été obtenue par une méthode conventionnelle (i.e. mesure de pH, acidimétrie); c'est le procédé de la présente invention qui a permis de l'obtenir pour la première fois.
En outre, aucune mention n'est faite dans la littérature du composé présentant un effet tampon modéré dans la région (3) i.e. voisine de 7. Il est possible que ce composé soit l'histidine ou un autre dérivé de l'imidazole, ou enfin un ester de l'acide phosphorique.
La caractéristique essentielle du procédé de la présente invention est qu'elle permet de voir d'un coup d'oeil la distribution des ionogènes d'une solution en fonction de leur pKa, bien qu'il faille recourir aux techniques chimiques pour identifier les compsés responsables des différents pics.
Pour ce qui est de la relation entre le goût et le profil des courbes ss = f(pH), on constate qu'après 3 à Sjours, le chou a un goût frais agréable. Ensuite son acidité augmente, et le goût se détériore. Cela signifie que le goût est optimum lorsque les valeurs de ss dans la région (1) et (2) sont comprises entre 0,01 et 0,02. Les courbes P = f(pH) pourraient aussi servir à détecter aisément l'apparition de fermentations anormales.
Lorsqu'on se contente de suivre l'évolution du pH en fonction du temps, on constate qu'il baisse rapidement pendant les 3 à 5 premiers jours, ensuite il change relativement peu. Ce pH est représenté sur la figure 5 (b) par des cercles pleins. On pourrait en déduire que la production d'acides organiques cesse au bout de quelques jours. C'est à cette conclusion que sont arrivés quelques auteurs. En fait, elle est éronnée. En réalité, les courbes ss = f(pH) prouvent que la quantité d'ionogènes (et en particulier d'acides) continue à augmenter, même après 8 jours. Le fait que le pH se maintienne constant est dû à la production simultanée de composés acides et basiques.
La mesure de l'acidité se fait habituellement en ajoutant une base à la solution jusqu'à ce qu'un certain pH soit atteint et en mesurant le volume de base ainsi ajouté. Cette méthode, qui est largement utilisée est dénommée détermination quantitative des acides organiques (voir par exemple le Traité de chimie alimentaire et de nutrition édité par Obara et publié par Kenpakusha en 1980). Cette méthode de détermination
des acides organiques ne rend par compte de la quantité réelle
d'acide lactique présent. Pour que le résultat du dosage soit en
accord avec la quantité d'acide présente, il faut que:
(1) tous les acides organiques soient présents sous la forme d'acides libres, et
(2) que la dissociation de ces acides en ions soit complète au pH de virage de l'indicateur.
Ces deux conditions sont satisfaites, lorsque par exemple de l'acide lactique seul est présent dans la solution. La courbe de neutralisation de la figure 6 (b) montre que les deux indicateurs mentionnés sur cette figure peuvent être utilisés pour déterminer le point de neutralisation. Par contre, les courbes de neutralisation obtenues avec le liquide fermenté (voir figures 5 (a) et 6 (a) ), montrent que les deux conditions énoncées plus haut ne sont pas satisfaites. Une petite quantité d'acide chlorhydrique avait été ajoutée aux échantillons dont les courbes de neutralisation sont représentées sur la figure 5 (a) et 6 (a) pour que ces courbes débutent à un pH plus bas. La courbe ss=f(pH) montre qu'un ionogène est présent (vraisemblablement un composé carboxylé) dont le pKa est d'environ 3,5.
Or, après 8jours, le pH de la solution est 4,1: environ 60% du composé carboxylé est donc déjà neutralisé. En outre, si on dose l'acidité en utilisant l'indicateur mixte, le virage devient imprécis à cause du pouvoir tampon de la solution dans la région voisine de pH 7. Si on utilise comme indicateur la phénolphtaléine, le virage reste tout aussi imprécis, et en plus environ la moitié de l'ionogéne dont le pKa est 9,5 se trouvera inclus dans le résultat du dosage. Dans ces conditions, le dosage des acides organiques par alcalimétrie n'a pas beaucoup de signification.
Par contre, l'examen de la courbe B = f(pH) fournit les renseignements suivants: la solution contient deux ionogènes principaux, dont les pKa respectifs sont d'environ 3,5 et 9,5; la quantité de chacun de ces deux ionogènes peut être estimée à 0,056 M environ après 8 jours; un troisième ionogène est present en petites quantités et son pKa est d'environ 7. Par conséquent, le procédé de la présente invention fournit un ensemble d'informations qui ne peuvent être obtenues par les méthodes conventionneles. Bien qu'il soit nécessaire de recourir aux méthodes chimiques pour identifier les différents ionogènes, cette invention présente le grand avantage de permettre de déterminer la distribution des ionogènes dans des mélanges complexes comme par exemple des produits alimentaires, avec une technique aussi aisée à mettre en oeuvre qu'une titration.
Les résultats obtenus avec d'autres produits alimentaires sont brièvement examinés ci-dessous.
La titration a été faite au moyen de soude 1 N ajoutée à la vitesse de 2 x 9,74 L I/sec. La valeur Eref était de 1,0 V.
Eref représente le signal à l'entrée X du diviseur dont le signal à la sortie peut être modifié suivant le changement de pH.
Thé vert de qualité intermédiaire (fig. 7 (a))
Le thé a été extrait par 20 volumes d'eau chaude pH 6,0.
Prise d'essai 20 ml HCl 1 N 1,5 ml
La courbe obtenue correspond vraisemblablement à un mélange d'acide aminés. Toutefois, une certain quantité d'acides aminés aurait pu être ajoutée au thé avant son conditionnement.
Thé grillé (chauffé) (fig. 7 (b))
Le thé a été extrait par 10 volumes d'eau chaude de pH 5,43.
Prise d'essai 20 ml
HCI 1 N 1,0 ml
La quantité d'acides aminés du thé grillé est nettement plus faible que celle trouvée dans le thé vert.
Thé noir
Le sachet (10 g) provenait de la société Lipton . Le thé a été extrait par 20 volumes d'eau chaude.
Prise d'essai 20 ml
HCI 1N i mi
La courbe obtenue montre un profil d'acides aminés similaire à celui observé avec le thé grillé. Toutefois, la proportion de groupements -COOH par rapport aux groupements -NH2 est différente.
Vinaigre (fig. 8 (a))
Vinaigre de fermentation Summit ayant une acidité de 4,2% et un pH de 2,75.
Prise d'essai (après dilution au 1/20) 2 ml HCl i N i mi
Eau 18 ml
La courbe obtenue est identique à celle de l'acide acétique pur (fig. 8 (b)).
Boisson à base d'acides aminés (fig. 9)
Algin Z est fabriqué par Ajinomoto Co., Inc. Son pH est 3,80. Il contient: L-arginine, L-aspartate de sodium, fructose, glucose, acide citrique, acide D et L-malique, miel, vitamine C, niacine, caramel et parfum.
Prise d'essai (après dilution au 1/4) 5 ml HCl i N imi
Eau 15 mi
Le pic situé dans le voisinage de pH 9 (il est dû aux groupements -NH2) est plus faible que le pic situé dans la région de bas pH. Ceci est dû à la présence d'acides organiques (acide citrique, malique, ascorbique).
Assaisonnement chimique (fig. 10 (a))
Hondashi est fabriqué par Ajinomoto Co., Inc. Une solution à 2% a été centrifugée. Son pH était de 6,02.
Prise d'essai 20 ml HUI 1N 2ml
La courbe obtenue est identique à celle de l'acide glutamique 0,05 M (fig. 10(b)) Sakéjaponais (fig. 11 (a))
Un saké Ozeki une tasse provenant de Ozeki Shuzo
K.K. a été examiné. Le produit avait un pH de 4,30.
A Prise d'essai 20 ml HCliN i mi pH 1,60
B Prise d'essai, après concentration de 100 ml à 20 ml 20 ml
HCllN 3 ml pH 1,45
La courbe obtenue correspond à un mélange d'acides aminés.
Vin (fig. II (b))
Vin rouge Delica provenant de Suntory Limited. Son pH était de 3,30.
Prise d'essai 20 ml HCll N îml
La courbe obtenue est similaire à celle de l'acide tartrique.
Le pouvoir tampon existant dans la région de pH voisine de
il pourrait être dû à un acide - phénol ouà un groupement amine.
Calé moulu (fig. 12 (a))
L'extrait a été préparé par percolation à partir delO g de
café finement moulu provenant de Hills Brothers Med. et de
250 ml d'eau chaude. Le pH l'extrait était 5,13.
Prise d'essai 20 ml
HCllN 1,5ml
Café soluble (fig. 12 (b))
Nous avons utilisé le café soluble MJB à la concentration
de 2%. Le pH du café reconstitué était 5,00.
Prise d'essai 20 ml Hui 1N i mi
Les deux produits présentent un pouvoir tampon dans la
région voisine de pH 4, qui pourrait être dû à la présence d'un
ou plusieurs acides organiques. Le produit responsable du
pouvoir tampon dans la région voisine de pH 9 n'a pas été
identifié. I1 est possible qu'il s'agisse d'un produit phénolique
ou d'un composé aminé.
Jus de pamplemousse (fig. 13)
Nous avons utilisé le jus de pamplemousses provenent de
Floride et dilué au 1/4. Le pH du jus dilué était 3,07.
Prise d'essai 5 ml
HCl1N imi
Eau 15 mi
On observe la présence d'un pic provenant de l'acide citri
que. On notera aussi l'existence d'un pouvoir tampon dans le
voisinage de pH 10.
Le pic correspondant à l'acide citrique se trouve légére
ment décalé par rapport à sa position théorique (Fig. 1(f)).
Ceci est à attribuer à la forte activité ionique des ions citrate
tribasiques et peut être corrigé par calcul.
Jus de citron (fig. 14)
Jus de citron (dilué au 1/10é) 2 mi
HCl1N imi
Eau 17 ml
Le pic observé est probablement dû à l'acide citrique. Le
pic au voisinage de pH 10 a disparu, mais ceci peut être dû à la
dilution.
Jus d'orange (fig. 15)
Jus d'orange (dilué au 1/3) 10 ml
HCl1N 2 ml
Eau 18 ml
Des acides autres que l'acide citrique semblent être pré
sents. On observe à nouveau un pic dans la région de pH voi
sinede 10.
Jus de pomme (fig. 16)
Nous avons utilisé du jus de pomme pur provenant de Ka
gomé Co., Inc. Son pH était 3,76.
Prise d'essai (après dilution à 2/3) 5 ml (A)
20 ml (B) Cl 1 N imi
Eau 10 ml
I1 est clair que la composante principale est l'acide mali
que. On notera aussi la présence d'un composé ayant un fort
pouvoir tampon à un pH supérieur à 10. Les mëmes résultats ont été obtenus avec des boissons à base de jus de pomme.
Jus de raisin (fig. 17)
Nous avons utilisé le jus de raisin pur provenant de Ka
gome Co., Inc. Son pH était 3,73.
Prise d'essai (après dilution à 1/2) 10 ml
HC11N îmi
Eau 10 ml
La courbe correspond à l'acide tartrique.
Jus d'ananas (fig. 18)
Jus d'ananas (pH 3,10) 10 ml HCllN imi
Nous avons utilisé le jus d'ananas pur et fraîchement préparé. Selon la littérature, les deux acides organiques principaux sont l'acide citrique et l'acide malique. Dans l'échantillon examiné, le profil de l'acide citrique apparait plus fortement que celui de l'acide malique.
Sauce de soja (fig. 19 (a) J
Nous avons utilisé la sauce de soja fabriquée par Kikkoman Co., Ltd. Son pH était 4,72. 2mi
Prise d'essai
HC11N 2ml
Eau 17 ml
La sauce de soja contient un mélange d'acides aminés. La courbe obtenue expérimentalement devrait résulter de la superposition des profils individuels des acides aminés présents.
Effectivement, la courbe expérimentale est identique à celle calculée à paritr des teneurs en acides aminés de la sauce de soja et à partir des pKa des 18 acides aminés (voir Composition des aliments japonais édité par la Société de publication d'ouvrages médicaux, dentaire et pharmacologiques en 1976).
Les courbes p = f(pH) obtenues sur des produits alimentaires mettent en évidence non seulement les composantes connues, mais aussi des ionogènes mineurs probablement importants. L'importance de la présente invention va croître à mesure que vont s'accumuler les observations pratiques découlant de son utilisation.
I1 est à prévoir que la présente invention trouvera des applications dans le contrôle de qualité de nombreux produits.
Par ailleurs, on sait que les composantes organiques du sol sont très importantes en agriculture. On recommande d'enrichir le sol régulièrement avec des composés organiques et de grandes quantités de compost sont fabriquées à cet effet.
On a cependant fait peu de progrès dans la connaissance des composés dits humiques, surtout à cause de la complexité de leur structure et de leur composition. I1 est très difficile de suivre la formation d'humus dans la fabrication de compost.
L'acide humique est un matériau polymérique de couleur foncée dont l'acidité provient surtout de la présence de groupements carboxylés. Par conséquent, la présente invention pourrait être utilisée pour l'analyse qualitative et quantitative de l'humus. Un exemple d'analyse est représenté sur la figure 20. La figure 20 représente la courbe ss f(pH) obtenue avec un extrait aqueux (pH = 8,60) d'un compost de paille de riz fortement décomposé. 40 g de compost étaient extraits par
100 ml d'eau et les particules insolubles étaient éliminées avant l'analyse. Comme on pouvait s'y attendre, la solution contient un mélange d'ionogènes. La courbe obtenue présente un maximum dans la région de pH de 4 à 6 est dans la région
de pH de 9 à 11.
Bien que l'usage que l'on peut faire de cette courbe n'apparaisse pas clairement à l'heure actuelle, cela
sera possible ultérieurement, en accumulant les résultats expérimentaux sur un grand nombre d'échantillons.
Utilisation du procédé pour l'examen de l'urine humaine
La composition de l'urine varie considérablement suivant les conditions de vie. Bien que de nombreuses recherches et analyses soient faites sur l'urine pour établir un diagnostic, il est pratiquement impossible d'obtenir une image globale des diverses composantes de l'urine. Cela serait trop compliqué à réaliser. La plupart, sinon la totalité des composantes organiques de l'urine sont des ionogènes comme les acides organiques, les acides aminés, les composés hétérocycliques, les peptides et les protéines. La courbe p = f(pH) sera donc un reflet des composantes présentes et de leurs proportions respectives.
Les résultats obtenus avec des échantillons d'urine provenant de trois hommes adultes en bonne santé de 40 à 60 ans sont examinés en détail
Sujet A (fig. 21(a))
Urine (pH 6,7) 10 ml HCllN îml
Sujet B (fig. 21 (b))
Urine (pH 5,37) 10 ml HC1 0,5 ml
Sujet C (fig. 21 (c))
Urine (pH 6,0) 10 ml
HCI 1,5 ml
Lorsqu'on compare les courbes obtenues avec l'urine des trois sujets, on constate qu'elles présentent des différences notables. Les courbes obtenues avec l'urine du sujet A et B sont similaires, avec de légères différences dans la hauteur relative des pics situés à pH 4,9, 6,3 à 6,7 et 9,3. I1 est probable que deux des pics (4,9 et 6,3 à 6,7) sont dûs à des acides organique, le troisième (9,3) à de l'ammoniaque ou à une amine organique.
Les courbes montrent que l'urine des trois sujets est riche en ionogène, et en particulier l'un d'eux, qui a un pKa de 9,3.
On note aussi la présence d'ionogène(s) ayant un pKa de 2 à 3; c'est l'urine du sujet C qui en contient le plus. On constate sur la courbe C la présence d'un bruit de fond au niveau du pic situé à pH 9,7. Ce bruit de fond provient de la dissolution de petites quantités de particules solides qui étaient présentes dans l'urine. I1 est possible de calculer la concentration molaire des composés correspondant aux différents pics à partir des valeurs de ss. Dans le cas de l'échantillon C, le composé ayant un pKa de 6,3 est présent à la concentration de 0,06 M, tandis que le composé ayant un pKa de 9,3 est présent à la concentration de 0,12 M environ.
L'interprétation des courbes présentées sera rendu plus aisée dans le futur par l'accumulation de résultats expérimentaux sur un grand nombre d'échantillon. Le fait que les courbes obtenues avec l'urine de sujets sains menant un mode de vie similaire présentent des différences importantes, laisse penser que le procédé pourra trouver des applications cliniques.
I1 est aussi à prevoir que le procédé de la présente invention trouvera des applications dans d'autres domaines, comme la recherche sur les protéines et les peptides.
Pendant longtemps, la titration de protéines par des acides ou des bases a constitué une technique d'investigation très efficace (voir par exemple Les propriétés électriques des protéines de Katsushige Hayashi, édité par le service des publications de l'Université de Tokyo en 1971). I1 est à prévoir, que la détermination de courbes ss f(pH) pour les protéines deviendra aussi une technique d'investigation très efficace.
** ATTENTION ** start of the DESC field may contain end of CLMS **.
CLAIMS
1. Method for obtaining a buffer capacity curve of a sample solution containing ionogen, characterized in that it comprises
- the titration of the solution using a strong acid or a strong base which is added at a constant rate to the stirred solution,
- the electrical processing of the output signal of a pH electrode placed in the solution through a differentiator circuit to obtain a signal proportional to d pH / dt and the processing of this latter signal through a circuit forming the reciprocal dt / d pH, and
- automatic graphic recording of the dt / d pH signal relative to the Ph of the solution to obtain the buffering curve.
2. Method according to claim 1, characterized in that the solution is titrated after its pH has been adjusted to the value from which it is desired to record the expected buffering curve.
3. Apparatus for carrying out the method according to claim 1 or 2, characterized in that it comprises means containing a sample solution containing ionogen, a pH electrode intended to be introduced into the sample solution and associated with a device for measuring pH, means for introducing a strong acid or a strong base into the sample solution under controlled conditions, means for agitating the sample solution, means for electrically treating the continuous change in the output signal of this pH electrode, signal created when said acid or said base is introduced into the sample solution, these processing means comprising a differentiator circuit followed by a circuit forming the inverse and being adapted to convert the electrode output signal into a signal proportional to d pH / dt,
then convert this latter signal into a signal proportional to dt / d pH; and means for automatically graphically recording on a surface the resulting signal proportional to dt / d pH relative to the pH of the sample solution, thereby recording a buffer capacity curve of the sample solution.
The present invention relates to a method for determining the buffering capacity of a solution containing an ionogen and more particularly for recording a curve ss = f (pH) of an ionogenic solution consisting in titrating this solution with a strong acid or base, with measure the pH, convert this pH into a buffering capacity (ss and record this buffering capacity as a function of the pH of the solution, as well as an apparatus which makes it possible to implement this process.
The term ionogenic describes a weak electrolyte whose pKa is between 0 and 14 when water is used as a solvent.
An ionogen is a substance that can dissociate by giving ions. Among the ionogens include: weak acids, weak bases, ampholytes (amino acid, peptides, proteins), as well as certain insoluble substances that can ionize.
Almost all of the materials in our environment, such as biological fluids and food, contain ionogens.
From a physico-chemical point of view, an ionogen dissociates for example as follows:
HAH + + A- (1)
The dissociation constant at equilibrium is designated by
the Ka symbol,
Ka = [H +] [A-] I [HA] (2) the parentheses signifying that the compounds are given in concentration or in activity. The quantity pKa is defined as follows: pKa = - log Ka (3)
In the case of a base, the dissociation is written:
RNH3 + a H + + RNH2 (4)
The pKa of the ionogens lie in the range from 0 to 14. The pKa values of compounds belong to a specific class of compounds, for example carboxylated compounds, lie within a more or less wide range depending on their nature.
One of the characteristics of an ionogen in solution is its tendency to counteract the change in pH when a strong base or a strong acid is added, this tendency being more particularly marked when the pH is between the value pKa - 1 and the value pKa + 1. For example, when 1 ml of
1N NaOH is added to 1 L of pure water (pH = 7), the pH immediately increases to 11. However, if the same amount of
NaOH is added to 1 L of 0.1 M imidazole (pKa = 6.95) of which about half has been neutralized with HCl (pH = 7), the increase in pH is only about 0.02. The phenomenon is called a buffer effect and a solution exhibiting this buffer effect is a buffer solution. These solutions have many uses.
The mechanism by which the buffering effect is exercised is well established and the buffering capacity can be calculated from pKa values, concentrations and other parameters. This buffering capacity is defined as follows: 13 = dB / dpH (5) where B is the strong base concentration added (eq. -gr / L).
When the pH is equal to pKa, B is at its maximum.
For a monoacid, this maximum is given by the relation: '3 = 0.576 CA (6)
WHERE CA is the concentration of acid. When the pH of the solution moves away from the pKa value, ss decreases. For example ss sere equal to one tenth of its maximum value when pH = pKa zt 1, and to one hundredth of its maximum value when pH = pKa i 2. In the case of a polyacid, the situation is similar, however the calculations are more complicated.
The value ss is proportional to CA and the curve ss = f (pH) has a maximum whose position depends on the pKa of the ionogen. Figures 1 (a) - (g) show examples of ss f (pH) curves of various acids (0. 05 M). These curves were established by calculation. The figures show that the ss values increase considerably when the pH is less than 2 or more than 12. This is due to the buffering capacity of the water solvent which is an ampholyte.
For this reason, it is generally difficult to determine the buffering capacity ss of a solute at extreme pH values and one is generally limited to the measurement of the buffering capacity of ionogenic solutions of medium concentration at the pH range situated approximately between 2 and 12. This buffering capacity is not only proportional to C, but also has an additive character when the solution is a mixture. The law B = f (pH) presents a certain similarity with the absorption spectrum for which the law of BEER-LAMBERT applies. The pH would correspond to the wavelength and P to the absorption.
Despite these characteristics, the use of ss = f (pH) curves for analytical purposes has been infrequent, one of the reasons for this being the absence of a simple and convenient technique.
allowing to measure the ss value of a solution. Naturally, it is possible to deduce the p value of the conventional curve representing the pH as a function of the volume of acid or base added, since '3 is the inverse of the slope of the titration curve. However, the work would be such that it is impossible to use this method for routine analyzes.
Modern calculators could facilitate this work, but this requires a lot of preparation and important equipment.
The author of the present invention had undertaken researches to obtain curves P = f (pH) with an equipment as simple as that used for automatic titrations and he succeeded. In the present description, the expression titration of the buffering capacity applies to the titration of a solution containing an ionogen with an acid or a strong base with simultaneous recording of a curve ss = f (pH).
One can imagine various methods for recording curves S = f (pH), the simplest in theory would consist in recording in the form of digital data the pH as a function of the volume of reagent added, then in calculating the curve p = f (pH) from this data. This method which is not very original in principle requires a lot of preparation and significant equipment, at least currently.
Instead of doing so, we have developed another method which makes it easy to obtain the curve P = f (pH).
This process consists in titrating the solution by adding strong acid or strong base with a constant flow rate the solution being stirred and in detecting the change in pH as a change in electrical signal; a differentiation circuit and an inversion circuit make it possible to obtain the inverse of the speed of change of the signal. This quantity dt / d pH, therefore proportional to p = dB / d pH when said flow is constant, is recorded as a function of pH.
The theoretical bases of the present invention are as follows:
When a weak acid solution (or a weak base in its protonic form) of concentration CA is titrated by a solution of a base of concentration CB, we can write:
Ca = [HA] + [A-] = CAV / (V + V) (1)
Cb = [M +] = CBV / (V + V) (2) [M + j + [H +] = [OH-J + [A-] (3)
EMI2. 1
The buffering capacity of the solution p i before titration is given by the following theoretical relation:
EMI2. 2
Thus, the quantity dt / d pH is proportional on the one hand to the initial buffering capacity p i and on the other hand to the volume of baoù Ca and Cb are the concentrations of the acid and the base added to the solution. V is the initial volume of the solution and v the base volume added.
From the preceding relations it follows that: [A-] = C, v / (V + v) + [H +] - [OH-] (4)
If we introduce the dissociation coefficient a = [A -] / ([HA] + [A-]) we obtain the following relation, in which nA and nB are the amounts of titrated acid and d3 base added in moles: = = nA + (V + v) ([OH] - [H +]) (5)
Since the dissociation coefficient is linked to the dissociation constant by the relation: Ka = [H +] a / (l-a) (6)
Equation 5 becomes:
EMI2. 3
By deriving from pH the relation (7) becomes:
EMI2. 4
Since the base is introduced at a constant speed r (cm3. sa1) and that nB = CBrt (9) where t is the time in seconds, we have:
EMI2. 5
get added.
The second term is only important at extreme pH values and can be overlooked when an adequate concentration of soda is used. If necessary, the second term can be eliminated to some extent by subtracting the results obtained in a blank test. As a consequence of the above, the pH can be used to obtain a curve p = f (pH), a curve which makes it possible to know the ionogens of a solution.
There is another method for determining the ionogens of a solution by means of a curve p = f (pH). It consists in titrating with a strong base, the amount added A v being such that the pH increases by a certain value At pH, for example 0.1. An electrical signal proportional to A v is then obtained, which makes it possible to calculate A VIA pH and record this value as a function of the pH. In this method, equations (1) to (8) continue to apply. Then, since nB = CBV:
EMI3. 1
Therefore:
EMI3. 2
Although A v and A pH are finite values, if they are sufficiently small, a completely correct curve ss is obtained. However, if these values are too low, fluctuations may arise, leading to errors.
They should be chosen experimentally so as to be as small as possible.
The curves p = f (pH) are plotted at the same time as the titration is carried out, and this by means of appropriate electronic equipment.
It is to be expected that the method of characterizing ionogens which is the subject of the present invention will find numerous industrial and scientific applications. Modes of implementing the invention will be described in the text with the aid of the appended drawing figures:
FIG. 1 represents the calibrated curves ss = f (pH) of a certain number of acids,
FIG. 2 is a schematic representation of the apparatus according to the present invention making it possible to obtain curves p = f (pH),
FIG. 3 is a schematic representation of an apparatus making it possible to obtain curves P = f (pH) by means of a calculator,
FIG. 4 represents curves ss = f (pH) calculated and obtained experimentally:
they are very close,
FIGS. 5 (a) and (b) show titration curves and ss f (pH) curves of salted Chinese cabbage juice after different fermentation times,
FIGS. 6 (a) and (b) represent titration curves for fermented Chinese cabbage juice and lactic acid,
Figures 7 to 19 show the curves B = f (pH) of various edible products: Figure 7 (a): green tea, (b): heated tea, (c): black tea, Figure 8 (a): vinegar, (b): acetic acid and Tris-C1H, figure 9: commercial drink based on amino acids, figure 10 (a): seasoning of chemical origin, (b): glutamic acid, figure 11 (a): sakejapanese, (b): wine, figure 12 (a): coffee, (b): instant coffee, figure 13: grapefruit juice, figure 14: lemon juice, figure 15:
orange juice, figure 16: apple juice, figure 17: grape juice, figure 18: pineapple juice, figure 19 (a): soy sauce, (b): curve calculated from the acid composition soy sauce amines.
FIG. 20 represents the curve ss = f (pH) of an aqueous extract of a compost originating from the fermentation of rice straw and FIGS. 21 (a), (b) and (c) represent the curves ss f ( pH) of urine.
In Figures 2 and 3, elements 1 to 6 represent a burette, a glass electrode, a reference electrode, an agitator, and an X-Y recorder.
As we have already indicated, ionogens are widely distributed in our environment. In particular, the majority of foods are mixtures containing organic acids, organic bases, friendly acids
born, proteins etc, on which the taste, the nutritional value depends,
commercial value, etc.
The process provides a curve whose profile depends on the
ionogens present in the sample. From this point of view, the
process constitutes a new means of identification. A
advantage of the process is that it does not require, as is the
case in the majority of conventional chemical analyzes
pre-treatment that may cause loss of substance
ionogenic. Although it is possible to use the process for
qualitative and quantitative analyzes by measuring the posi
tion and the height of the peaks, the purpose of this process is rather to
characterize a mixture of ionogens in a medium
complex.
We can when determining the buffering capacity
add a strong acid or strong base to a sample of the
solution so that the pH is in the region to
from which we plan to record the curves
p = f (pH). Thus, it is possible to save the curves
p = f (pH) in the range from 2 to 12.
An example of equipment for recording curves
B = f (pH) according to the principles stated above will be maintained
nant described in detail.
According to the operating diagram shown on the
Figure 2, the potential difference between the glass electrode and
the reference electrode is amplified to supply a circuit
of differentiation. The signal at the output of this circuit is propor
tional to dE / dt. This signal is amplified and converted into a signal
proportional to dt / dE (i. e. inverse of dE / dt) by means of a divider - multiplier circuit. Since dE is pro
portable to dpH, dt / dE is proportional to dt / dpH. This
general feeds the Y input of an X-Y recorder, the X input is
connected to the pH meter. Recording of the curve P = f (pH)
begins when the burette is started. The
pH is on the abscissa and the buffering capacity on the ordinate.
This apparatus can be made economically
and in a compact form from elements existing in
trade. However, it can have the following disadvantages
vants: taking into account the way the derivation by rap
time is carried out, the apparatus may not be suitable
in cases where the reaction time is long, for example with
certain suspensions or certain non-aqueous media. As well,
background noise can be significant if the titrating solution is not
not distributed evenly quickly in the solution
by changing the pH gradually.
However, the disadvantages listed above can
be significantly reduced or eliminated by various improvements
technical rations, for example by improving the
mixing the solution, decreasing the speed of introduction
of the reagent or finally by controlling the addition of reagent to the mo
yen from a calculator.
A function generator was used to verify that
the apparatus was operating normally. It was found that
relations (14) and (15) are satisfied, which allows to enter
record the curves p = f (pH) of samples of various concen
trations and volumes.
In addition, it is possible to give the curves an aspect
regular and remove background noise by recording and trans
forming the signal using a digital calculator at
instead of an analog circuit. Apparatus using this prin
cipe is shown schematically in Figure 3. The team
Titration ment is the same as that of figure 2.
In point (a) of figure 3, a selected quantity of solu
titrating (for example 10} is added using the
burette. After a period of time t (for example 1 s) which per
causes the solution to become homogeneous again, the signal from
pH meter is stored in digital form in memory 1. The next signal is stored in memory II.
The value
volume of titrating solution
(memory II) - (memory I) is then calculated and recorded in digital form in memory A. In the next phase, the third pH value is stored in memory II, while the second pH is transferred from memory II to memory I. The result of the calculation is saved in memory B. The operation is thus repeated. The values stored in memories A, B, etc., are converted into an electrical signal. This signal is sent to the Y input of the X-Y recorder. The electrical signal from the pH meter is sent to input X.
In the analog method the dt / d pH value is recorded, while in the digital method the dv / d pH value is recorded. The numerical method therefore makes it possible to plot the curves p = f (pH) when the system response is slow. It is also possible to round the shape of the curves by processing the data recorded in the memories A,
B,. . . Finally, the measurement range can be extended to extreme pH values by subtracting the ss values obtained in a blank test (i. e. without ionogen). It is preferable to subject the time t to the dv / d pH value so as not to unnecessarily lengthen the recording time. This does not present any particular technical difficulty.
However, it is inevitable that such equipment will become bulky and expensive.
The apparatuses which we have described are mainly intended for the measurement of buffering capacity. They may however have other applications. The measurement of the buffering capacity is based on the Henderson equation:
pH = pKa + log [salt]
[acid] and on the conversion of pH into electrical potential by means of the glass electrode. In the case of a redox system, where the measurement electrode consists of an inert material such as platinum, the potential is given by the equation:
RT [oxidized form]
E = EO + - Log
nF [reduced form
0.059 [oxidized form = EO + '9 Log
n [reduced form]
where n is the number of electrons. PH and redox potential
are given by similar relationships. In other words, it
is possible to define a redox buffer power as it has
been possible to define a pH buffering capacity.
It suits
therefore note that the apparatus can also be used for
investigations on complex redox systems, by
example on biological materials.
The present invention will be made more explicit by
concrete examples of use, examples which limit no one
the scope of the invention.
The apparatus used is that shown schematically
ment in figure 2.
pH meter used: HM-SA model, manufactured by Toa Elec
tric Wave Co. , Ltd.
Recorder used: model D8-CP, manufactured by Riken
Electronics.
The titration was carried out using 1.00 N sodium hydroxide solution introduced at a constant speed, close to 10 Ill / sec. The solution was stirred by means of a magnetic bar (rotating at approximately 1300 rpm) and it was kept in a water bath at 25 C.
FIG. 4 represents the curves ss = = f (pH (theoretical (i. e.
calculated) and measured from a known solution. The solution contained 0.053 M / L of Tris chloride (i. e. tri (hydroxymethyl) aminomethane) whose pKa is 8.06 and 0.053 M / L of acetic acid (pKa = 4.76). A small amount of hydrochloric acid was added to the solution so that the pH was less than 2, which gave the curve in the low pH region. Figure 4 shows that the two curves are quite similar.
Now we will show by examples how the curves B = f (pH) can be used to judge the quality of food products and the like.
Aging process of Chinese cabbage preserved in brine
In this first example, we examine the evolution of the components and the taste of a vegetable preserved in brine as a function of the evolution of the curves p = f (pH) determined according to the process of the present invention. We also examine the differences between this method and the conventional pH and acidity methods currently used for quality control and compare the respective advantages.
500 g of Chinese cabbage were cut into 7 mm diameter strips and mixed with 20 g of sodium chloride. The mixture was packed in a container intended for this use and purchased commercially. The container and its contents were then left at room temperature. The salt concentration was that used to marinate Chinese cabbage overnight. According to the literature, the changes that take place during the fermentation of a vegetable in a saline environment are complex. They can be summarized as follows: initially, aerobic bacteria (Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter, Escherichia coli and various Bacillus) grow. After a few days, these are
lactic acid producing bacteria (Leuc. mesenteroides, Sc. faecalis, Pediococcus) which are beginning to spread.
The growth of aerobic bacteria is slowed by the decrease
tion of the pH. It stops completely when a certain level
lactic acid is reached. Finally, the lactic flora
changes with the proliferation of L. plantarum or L. brevis
(see Shokuhim Biseibutsugaku (food microbiology
shut up) written by Yoshii, Kaneko and Yamaguchi, published by Gi
hodo in 1980). Naturally, acids other than acid
lactic acid can also form during fermentation:
this is how various fatty acids have been highlighted in
salted vegetables. (Takanami et al. , Bull. Foods Industry,
Japan, 25, 9 (1978)). When a vegetable is packed with salt,
water oozes.
The amount of liquid produced is approximati
equal to the amount of water that remains inside the
vegetable. 20 ml of liquid were taken after 3, 5, 6 and 8 days of fermentation and subjected to a power titration
tampon according to the method of the present invention. We have
also measured pH and titrated acidity.
The curves p = f (pH) obtained are represented on the
Figure 5 (b). They have the following characteristics:
(1) A region with a high buffering capacity at a pH close to
3.8
(2) A region with a high buffering capacity at a pH close to
9.5
(3) A region with a low buffering capacity at a neighboring pH
de7.
The buffering capacity in these three regions increases consi
declining over time.
The buffering capacity can be calculated from the curve obtained with the standard Tris - acetic acid solution. The value of ss is obtained in regions (1) and (2) after 8 days approximately 0.032. If it is assumed that the buffering capacity in each of these two regions is due to a single inogen, the amount of each of the two ionogens would be 0.056 M / L. If it is further admitted that the buffering capacity of region (1) is due to lactic acid, its concentration is approximately 0.5% (molecular weight of lactic acid, 90.1). On the other hand, no mention is made in the literature of a product which could be responsible for the buffering capacity in the region (2).
Given the location of this peak (pH 9.5), the compound which is at its origin could be (a) an amino acid (group
NH2), (b) a heterocyclic aromatic compound (group
OH), (c) a phenol, (d) a purine, (e) a saturated heterocyclic compound containing nitrogen, or (f) a long chain amine. Given the composition of the vegetable and its evolution during fermentation, it is the compound (a) which is most probably responsible for the peak at pH 9.5. Since the buffering capacity at pH 3 is not higher than at pH 9.5, it can be deduced therefrom that the carbocylic groups belong to organic acids are less numerous than those belong to amino acids. This type of information cannot be provided by conventional acidimetric measurements: longer and more complex methods such as separation by chromatography must be used.
Chromatography does not however make it possible to obtain an ionogen distribution profile such as that provided by the titeration of the buffering capacity. It should be noted that this information has never been obtained by a conventional method (i. e. pH measurement, acidimetry); it is the process of the present invention which has made it possible for the first time.
In addition, no mention is made in the literature of the compound having a moderate buffering effect in region (3) i. e. close to 7. It is possible that this compound is histidine or another imidazole derivative, or finally an ester of phosphoric acid.
The essential characteristic of the process of the present invention is that it makes it possible to see at a glance the distribution of the ionogens of a solution as a function of their pKa, although it is necessary to use chemical techniques to identify the compounds. responsible for the different peaks.
With regard to the relationship between the taste and the profile of the curves ss = f (pH), it can be seen that after 3 to 5 days, the cabbage has a pleasant fresh taste. Then its acidity increases, and the taste deteriorates. This means that the taste is optimum when the values of ss in the region (1) and (2) are between 0.01 and 0.02. The P = f (pH) curves could also be used to easily detect the appearance of abnormal fermentations.
When we simply follow the evolution of the pH as a function of time, we see that it drops rapidly during the first 3 to 5 days, then it changes relatively little. This pH is represented in Figure 5 (b) by solid circles. We could deduce that the production of organic acids ceases after a few days. It is to this conclusion that some authors have arrived. In fact, it is erotic. In reality, the ss = f (pH) curves show that the quantity of ionogens (and in particular acids) continues to increase, even after 8 days. The fact that the pH is kept constant is due to the simultaneous production of acidic and basic compounds.
The measurement of acidity is usually done by adding a base to the solution until a certain pH is reached and by measuring the base volume thus added. This widely used method is called quantitative determination of organic acids (see for example the Treatise on Food Chemistry and Nutrition edited by Obara and published by Kenpakusha in 1980). This method of determination
organic acids does not account for the actual amount
lactic acid present. So that the result of the assay is in
according to the amount of acid present, it is necessary that:
(1) all organic acids are present in the form of free acids, and
(2) that the dissociation of these acids into ions is complete at the indicator turning pH.
These two conditions are satisfied, for example when lactic acid alone is present in the solution. The neutralization curve in Figure 6 (b) shows that the two indicators mentioned in this figure can be used to determine the point of neutralization. On the other hand, the neutralization curves obtained with the fermented liquid (see Figures 5 (a) and 6 (a)) show that the two conditions stated above are not satisfied. A small amount of hydrochloric acid had been added to the samples, the neutralization curves of which are shown in Figure 5 (a) and 6 (a) so that these curves start at a lower pH. The curve ss = f (pH) shows that an ionogen is present (probably a carboxylated compound) whose pKa is approximately 3.5.
However, after 8 days, the pH of the solution is 4.1: approximately 60% of the carboxylated compound is therefore already neutralized. In addition, if the acidity is measured using the mixed indicator, the turn becomes imprecise because of the buffering capacity of the solution in the region close to pH 7. If phenolphthalein is used as an indicator, the turn remains equally imprecise, and in addition approximately half of the ionogen with a pKa of 9.5 will be included in the result of the assay. Under these conditions, the determination of organic acids by alkalimetry does not have much meaning.
On the other hand, examination of the curve B = f (pH) provides the following information: the solution contains two main ionogens, the respective pKa of which are approximately 3.5 and 9.5; the amount of each of these two ionogens can be estimated at approximately 0.056 M after 8 days; a third ionogen is present in small quantities and its pKa is approximately 7. Therefore, the method of the present invention provides a set of information which cannot be obtained by conventional methods. Although it is necessary to use chemical methods to identify the different ionogens, this invention has the great advantage of making it possible to determine the distribution of ionogens in complex mixtures such as for example food products, with a technique as easy to implement. work than a titration.
The results obtained with other food products are briefly discussed below.
The titration was carried out using 1 N sodium hydroxide added at the rate of 2 x 9.74 L I / sec. The Eref value was 1.0 V.
Eref represents the signal at the input X of the divider whose signal at the output can be modified according to the change in pH.
Green tea of intermediate quality (fig. 7 (a))
The tea was extracted with 20 volumes of hot water pH 6.0.
Test sample 20 ml HCl 1 N 1.5 ml
The curve obtained probably corresponds to a mixture of amino acids. However, a certain amount of amino acids could have been added to the tea before packaging.
Toasted tea (heated) (fig. 7 (b))
The tea was extracted with 10 volumes of hot water of pH 5.43.
20 ml test portion
HCI 1 N 1.0 ml
The amount of amino acids in toasted tea is significantly lower than that found in green tea.
Black tea
The sachet (10 g) came from the company Lipton. The tea was extracted with 20 volumes of hot water.
20 ml test portion
HCI 1N i mi
The curve obtained shows an amino acid profile similar to that observed with roasted tea. However, the proportion of -COOH groups compared to -NH2 groups is different.
Vinegar (fig. 8 (a))
Summit fermentation vinegar with an acidity of 4.2% and a pH of 2.75.
Test sample (after 1/20 dilution) 2 ml HCl i N i mi
Water 18 ml
The curve obtained is identical to that of pure acetic acid (fig. 8 (b)).
Amino acid drink (fig. 9)
Algin Z is manufactured by Ajinomoto Co. , Inc. Its pH is 3.80. It contains: L-arginine, sodium L-aspartate, fructose, glucose, citric acid, D and L-malic acid, honey, vitamin C, niacin, caramel and perfume.
Test sample (after 1/4 dilution) 5 ml HCl i N imi
Water 15 mi
The peak located in the vicinity of pH 9 (it is due to the -NH2 groups) is lower than the peak located in the region of low pH. This is due to the presence of organic acids (citric, malic, ascorbic acid).
Chemical seasoning (fig. 10 (a))
Hondashi is manufactured by Ajinomoto Co. , Inc. A 2% solution was centrifuged. Its pH was 6.02.
Test sample 20 ml HUI 1N 2ml
The curve obtained is identical to that of 0.05 M glutamic acid (fig. 10 (b)) Sakejapanese (fig. 11 (a))
An Ozeki sake a cup from Ozeki Shuzo
K. K. has been reviewed. The product had a pH of 4.30.
A Test sample 20 ml HCliN i mi pH 1.60
B Test sample, after concentration of 100 ml to 20 ml 20 ml
HCllN 3 ml pH 1.45
The curve obtained corresponds to a mixture of amino acids.
Wine (fig. II (b))
Delica red wine from Suntory Limited. Its pH was 3.30.
Test sample 20 ml HCll N îml
The curve obtained is similar to that of tartaric acid.
The buffering capacity existing in the region of pH close to
it could be due to an acid - phenol or to an amine group.
Ground chock (fig. 12 (a))
The extract was prepared by percolation from 10 g of
finely ground coffee from Hills Brothers Med. and of
250 ml of hot water. The pH of the extract was 5.13.
20 ml test portion
HCllN 1.5ml
Instant coffee (fig. 12 (b))
We used MJB instant coffee at the concentration
2%. The pH of the reconstituted coffee was 5.00.
Test sample 20 ml Hui 1N i mi
Both products have a buffering capacity in the
neighboring region of pH 4, which could be due to the presence of a
or more organic acids. The product responsible for
buffering capacity in the neighboring region of pH 9 has not been
identified. It is possible that it is a phenolic product
or an amino compound.
Grapefruit juice (fig. 13)
We used grapefruit juice from
Florida and diluted 1/4. The pH of the diluted juice was 3.07.
5 ml test portion
HCl1N imi
Water 15 mi
We observe the presence of a peak from citri acid
than. Note also the existence of a buffer power in the
around pH 10.
The peak corresponding to citric acid is light
offset from its theoretical position (Fig. 1 (f)).
This is to be attributed to the strong ionic activity of citrate ions
tribasic and can be corrected by calculation.
Lemon juice (fig. 14)
Lemon juice (diluted 1/10) 2 mi
HCl1N imi
Water 17 ml
The observed peak is probably due to citric acid. The
peak near pH 10 has disappeared, but this may be due to the
dilution.
Orange juice (fig. 15)
Orange juice (diluted 1/3) 10 ml
HCl1N 2 ml
Water 18 ml
Acids other than citric acid appear to be pre
smells. There is again a peak in the pH region voi
sine of 10.
Apple juice (fig. 16)
We used pure apple juice from Ka
gomé Co. , Inc. Its pH was 3.76.
Test sample (after 2/3 dilution) 5 ml (A)
20 ml (B) Cl 1 N imi
Water 10 ml
It is clear that the main component is mali acid
than. Note also the presence of a compound having a strong
buffering capacity at a pH greater than 10. The same results have been obtained with drinks based on apple juice.
Grape juice (fig. 17)
We used pure grape juice from Ka
gome Co. , Inc. Its pH was 3.73.
Test sample (after 1/2 dilution) 10 ml
HC11N îmi
Water 10 ml
The curve corresponds to tartaric acid.
Pineapple juice (fig. 18)
Pineapple juice (pH 3.10) 10 ml HCllN imi
We used pure and freshly prepared pineapple juice. According to the literature, the two main organic acids are citric acid and malic acid. In the sample examined, the profile of citric acid appears more strongly than that of malic acid.
Soy sauce (fig. 19 (a) J
We used soy sauce made by Kikkoman Co. , Ltd. Its pH was 4.72. 2mi
Test sample
HC11N 2ml
Water 17 ml
Soy sauce contains a mixture of amino acids. The experimentally obtained curve should result from the superposition of the individual profiles of the amino acids present.
In fact, the experimental curve is identical to that calculated from the amino acid contents of the soy sauce and from the pKa of the 18 amino acids (see Composition of Japanese foods edited by the Company for the publication of medical, dental and pharmacological in 1976).
The p = f (pH) curves obtained on food products highlight not only the known components, but also probably important minor ionogens. The importance of the present invention will increase as the practical observations arising from its use accumulate.
It is expected that the present invention will find applications in the quality control of many products.
Furthermore, we know that the organic components of the soil are very important in agriculture. It is recommended to enrich the soil regularly with organic compounds and large quantities of compost are made for this purpose.
However, little progress has been made in the knowledge of so-called humic compounds, mainly because of the complexity of their structure and composition. It is very difficult to follow the formation of humus in the making of compost.
Humic acid is a dark colored polymeric material whose acidity comes mainly from the presence of carboxyl groups. Therefore, the present invention could be used for qualitative and quantitative analysis of humus. An example of analysis is shown in Figure 20. FIG. 20 represents the curve ss f (pH) obtained with an aqueous extract (pH = 8.60) of a highly decomposed rice straw compost. 40 g of compost were extracted by
100 ml of water and the insoluble particles were removed before analysis. As you would expect, the solution contains a mixture of ionogens. The curve obtained has a maximum in the pH region of 4 to 6 is in the region
from pH 9 to 11.
Although the use that can be made of this curve is not clear at the moment, this
will be possible later, by accumulating the experimental results on a large number of samples.
Use of the method for the examination of human urine
The composition of urine varies considerably depending on living conditions. Although much research and analysis is done on urine to make a diagnosis, it is virtually impossible to get an overall picture of the various components of urine. It would be too complicated to achieve. Most, if not all, of the organic components in urine are ionogens such as organic acids, amino acids, heterocyclic compounds, peptides, and proteins. The curve p = f (pH) will therefore be a reflection of the components present and their respective proportions.
Results from urine samples from three healthy adult men aged 40 to 60 are examined in detail
Subject A (fig. 21 (a))
Urine (pH 6.7) 10 ml HCllN îml
Subject B (fig. 21 (b))
Urine (pH 5.37) 10 ml HC1 0.5 ml
Subject C (fig. 21 (c))
Urine (pH 6.0) 10 ml
HCI 1.5 ml
When we compare the curves obtained with the urine of the three subjects, we note that they present notable differences. The curves obtained with the urine of subject A and B are similar, with slight differences in the relative height of the peaks located at pH 4.9, 6.3 to 6.7 and 9.3. It is likely that two of the peaks (4.9 and 6.3 to 6.7) are due to organic acids, the third (9.3) to ammonia or an organic amine.
The curves show that the urine of the three subjects is rich in ionogen, and in particular one of them, which has a pKa of 9.3.
The presence of ionogen (s) having a pKa of 2 to 3 is also noted; it is the urine of subject C which contains the most. We observe on curve C the presence of background noise at the peak located at pH 9.7. This background noise comes from the dissolution of small amounts of solid particles that were present in the urine. It is possible to calculate the molar concentration of the compounds corresponding to the different peaks from the values of ss. In the case of sample C, the compound having a pKa of 6.3 is present at the concentration of 0.06 M, while the compound having a pKa of 9.3 is present at the concentration of 0.12 M about.
The interpretation of the curves presented will be made easier in the future by the accumulation of experimental results on a large number of samples. The fact that the curves obtained with the urine of healthy subjects leading a similar lifestyle show significant differences, suggests that the process may find clinical applications.
It is also to be expected that the process of the present invention will find applications in other fields, such as research on proteins and peptides.
For a long time, the titration of proteins by acids or bases was a very effective investigative technique (see for example The electrical properties of proteins by Katsushige Hayashi, published by the publications service of the University of Tokyo in 1971) . It is to be expected that the determination of ss f (pH) curves for proteins will also become a very effective investigation technique.