CH650794A5

CH650794A5 - MICROORGANISMS CONTAINING HYDROPHILIC FOAM, METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF AND THE USE THEREOF FOR THE PRODUCTION OF L-AMINO ACIDS.

Info

Publication number: CH650794A5
Application number: CH5957/81A
Authority: CH
Inventors: Wayne Elliott Swann; Murray Campbell Fusee; Gary Jim Calton
Original assignee: Grace W R & Co
Priority date: 1980-09-17
Filing date: 1981-09-15
Publication date: 1985-08-15
Also published as: DE3134891A1; IT1136580B; IT8121236A0; AU547645B2; FR2490240B1; NL8102157A; JPS5754594A; SE8104943L; CA1178910A; AU7357881A; FR2490240A1

Description

Diese Erfindung betrifft einen hydrophilen Polyäther-Polyurethan-Schaum, ein Verfahren zur Herstellung desselben sowie die Verwendung dieses Schaumes zur Herstellung von L-Aminosäuren. This invention relates to a hydrophilic polyether polyurethane foam, a process for the production thereof and the use of this foam for the production of L-amino acids.

Es sind verschiedene Methoden bekannt für die Herstellung von L-Aminosäuren mittels enzymatischer Reaktionen an den geeigneten Substraten (d.h. Präkursoren). Various methods are known for the production of L-amino acids by means of enzymatic reactions on the suitable substrates (i.e. precursors).

Beispielsweise kann L-Alanin durch Kultivierung eines Mikroorganismus geschehen, welcher L-Asparaginsäurede-carboxylase zu bilden imstande ist. Die so vorbereitete Kultivierungsbrühe wird anschliessend mit L-Asparaginsäure versetzt (siehe JP veröffentlichte Patentanmeldung Nr. 7560/ 1971). Auf anderem Weg kann L-Alanin durch Extraktion von Asparaginsäuredecarboxylase aus Mikroorganismen und durch Umsetzen von L-Asparagaten mit den genannten extrahierten Enzymen gewonnen werden (siehe beispielsweise Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 67,1963). Auch die L-Asparaginsäure kann mittels ähnlicher Verfahren gewonnen werden, siehe dazu beispielsweise die US-Patent-schriften 2 927 057,2 971 890,3 198 712,3 214 345,3 310 475, 3 999 586,4 013 508,4 048 018; die GB-Patentschrift 880 234 und die CA-Patentschrift 697 310. Die US-Patentschrift 3 214 345 verwendet dabei E. coli-Zellen, um aus Ammoni-umfumarat L-Asparaginsäure zu erhalten. All diesen genannten Verfahren ist jedoch gemeinsam, dass das erhaltene Produkt, d.h. die L-Aminosäuren, unausweichlich mit den Enzymen, mit Mikrobenzellen, mit Bestandteilen aus der Kultivierungsbrühe und/oder anderen Medien bzw. Proteinen kontaminiert sind. Zur Herstellung der reinen L-Asparaginsäure muss daher das Rohprodukt in einem weiteren Verfahrensschritt von den genannten Verunreinigungen getrennt werden. Oft ist es auch nötig, nach Abschluss der Reaktion die Reaktionslösung zum Sieden zu bringen oder stark anzusäuern, um die Enzyme oder Mikroorganismen zwecks Abfiltrierung auszufällen. In all den Fällen können also die Enzyme oder die Mikroorganismen nur einmal verwendet werden und müssen nach der Umsetzung weggeworfen werden. For example, L-alanine can be made by culturing a microorganism capable of producing L-aspartic acid decarboxylase. The cultivation broth thus prepared is then mixed with L-aspartic acid (see JP published patent application No. 7560/1971). L-alanine can be obtained in another way by extracting aspartic acid decarboxylase from microorganisms and by reacting L-asparagates with the extracted enzymes mentioned (see for example Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 67, 1963). L-aspartic acid can also be obtained by means of similar processes, see, for example, US Pat. Nos. 2,927,057.2,971,890,3,198,712,3,214,345,3 310,475, 3,999,586.4,013,508.4 048 018; British Patent 880,234 and CA Patent 697,310. US Patent 3,214,345 uses E. coli cells to obtain L-aspartic acid from ammonium fumarate. However, all of these processes have in common that the product obtained, i.e. the L-amino acids are inevitably contaminated with the enzymes, with microbial cells, with components from the cultivation broth and / or other media or proteins. To produce the pure L-aspartic acid, the crude product must therefore be separated from the impurities mentioned in a further process step. After the reaction has ended, it is often also necessary to bring the reaction solution to the boil or to acidify it strongly in order to precipitate the enzymes or microorganisms for filtering. In all cases, the enzymes or microorganisms can only be used once and must be thrown away after the reaction.

Um die genannten Nachteile zu überwinden, ist die Immobilisierung mittels Einkapselung von Mikroorganismen in polymeren Trägern vorgeschlagen worden. Beispielsweise schlägt die US-Patentschrift 3 898 128 vor, die Mikroorganismen in semipermeablen Polyacrylamidmembranen einzuschliessen. Die US-Patentschrift 3 458 400 andererseits lehrt die enzymatische Umsetzung von L-Asparaginsäure zu L-Alanin unter Verwendung von Pseudomonas dacunhae oder Achromobacter pestifer, als Quellen für die Asparaginsäuredecarboxylase. Die veröffentlichte JP-Patentanmeldung Nr. 6870/1970 beschreibt die Bindung von Aspartase an einen Anionen austauschenden Polysaccharidadsorbenten. In der JP-Patentanmeldung Nr. 17 587/1970 werden Poly-acrylate verwendet, um Aspartase produzierende Mikroorganismen einzuschliessen. Diese eingeschlossenen Mikroorganismen werden dann für die Herstellung von L-Asparagin-säure verwendet. Hinsichtlich dieser Einkapselungsme-thoden sind noch zu erwähnen die US-Patentschriften 3 649 457,3 791 926 und 3 898 128. Die Verwendung von Car-rageenan als Trägerstoff wird durch Sato in Biochimica et Biophysica Acta, 570, Seiten 179-186, beschrieben. Die russischen Patentanmeldungen SU 423 976 und SU 451 483 beschreiben die Immobilisierung von E. coli-Zellen in Poly-acrylamid-Gelen und die Herstellung von L-Asparaginsäure aus Ammoniumfumarat. In order to overcome the disadvantages mentioned, immobilization by means of encapsulating microorganisms in polymeric carriers has been proposed. For example, U.S. Patent 3,898,128 suggests encapsulating the microorganisms in semi-permeable polyacrylamide membranes. U.S. Patent 3,458,400, on the other hand, teaches the enzymatic conversion of L-aspartic acid to L-alanine using Pseudomonas dacunhae or Achromobacter pestifer as sources of aspartic acid decarboxylase. JP published patent application No. 6870/1970 describes the binding of aspartase to an anion-exchanging polysaccharide adsorbent. In JP patent application No. 17 587/1970, poly-acrylates are used to include aspartase-producing microorganisms. These trapped microorganisms are then used for the production of L-aspartic acid. With regard to these encapsulation methods, US Pat. Nos. 3,649,457,3791,926 and 3,898,128 are also worth mentioning. The use of carageenan as a carrier is described by Sato in Biochimica et Biophysica Acta, 570, pages 179-186 . Russian patent applications SU 423 976 and SU 451 483 describe the immobilization of E. coli cells in polyacrylamide gels and the production of L-aspartic acid from ammonium fumarate.

Die Einkapselung von Mikroorganismen in hydrophilen Polyurethanschäumen ist auch schon vorgeschlagen worden. Siehe dazu die US-Patentanmeldung 3 905 923 (Klug) und die US-Patentanmeldung, Serial No. 362 488 vom 21. Mai 1973 (Erfinder Louis L. Wood et al) mit dem Titel: «Herstellung und Verwendung von an Polyurethan gebundenen Enzymen». Die Bindung von Enzymen an Polyurethan wird auch im US-Patent Nr. 3 672 955 (Erfinder Stanley) beschrieben, speziell in Kolonne 5, Zeilen 27 bis 35. Hydrophile Polymere sind auch als Träger für andere chemische Verbindungen verwendet worden, inklusive Bacteriostaten und Fungiciden. Siehe dazu unter anderem das US-Patent Nr. 3 975 350 (Erfinder Hudgin). Es ist auch bekannt, Bakte-rienzellen in hydrophoben Polyurethanen zu immobilisieren, siehe dazu Beispiel 4 der GB-Patentschrift 953 414. Die Immobilisierung einer grossen Zahl von Enzymen in hydro2 Encapsulation of microorganisms in hydrophilic polyurethane foams has also been proposed. See U.S. Patent 3,905,923 (Klug) and U.S. Patent Application Serial No. 362,488 of May 21, 1973 (inventor Louis L. Wood et al) with the title: "Production and use of enzymes bound to polyurethane". The binding of enzymes to polyurethane is also described in U.S. Patent No. 3,672,955 (inventor Stanley), especially in column 5, lines 27 to 35. Hydrophilic polymers have also been used as carriers for other chemical compounds, including bacteriostats and fungicides . See, inter alia, U.S. Patent No. 3,975,350 (inventor Hudgin). It is also known to immobilize bacterial cells in hydrophobic polyurethanes, see example 4 of GB patent specification 953 414. The immobilization of a large number of enzymes in hydro2

s s

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

philen Polyurethanen wird auch in der US-Patentanmeldung Nr. 849 999 (Erfinder Hartdegen et al) vom 9. November 1977 mit dem Titel «Immobilisiertes, biologisches Material» beschrieben. Philic polyurethanes are also described in US Patent Application No. 849,999 (invented by Hartdegen et al) dated November 9, 1977 with the title “Immobilized Biological Material”.

Weitere, einschlägige Referenzen umfassen Sonomoto et al [Agric. Biol. Chem., 44 (5), S. 1119 bis 1126,1980]. Diese Arbeit beschreibt die Umsetzung von Steroiden mittels Bakterienzellen, die in Polyurethan immobilisiert sind. Das Polyurethan ist dabei aus einem Urethanpräpolymeren hergestellt worden. Fukui et al in Biochimie, 1980,62, S. 381 bis 386, beschreiben die Verwendung von in photo abgebundenen Präpolymeren immobilisierten Enzymen und von Enzymen in Urethanpräpolymeren zur Herstellung von L-Aminosäuren. Auch die Immobilisierung von Bakterienzellen unter Verwendung von Urethan-Präpolymeren ist bekannt. Bei der letzten Gordon Research Conference vom 11. bis 15. August 1980 wurde die Immobilisierung von ganzen Zellen (d.h. von mittels genetischer Manipulation erhaltenen E. coli-Zellen, welche grosse Mengen von Penicil-linamidase enthalten). Die Zellen werden dabei in Urethan-Präpolymeren eingeschlossen. Im Versuchsstadium sind noch Biotransformationssysteme zur Herstellung von L-Serin und L-Tryptophan. Other relevant references include Sonomoto et al [Agric. Biol. Chem., 44 (5), pp. 1119 to 1126, 1980]. This work describes the implementation of steroids using bacterial cells that are immobilized in polyurethane. The polyurethane was made from a urethane prepolymer. Fukui et al in Biochimie, 1980, 62, pp. 381 to 386 describe the use of enzymes immobilized in photo-bound prepolymers and of enzymes in urethane prepolymers for the production of L-amino acids. The immobilization of bacterial cells using urethane prepolymers is also known. At the last Gordon Research Conference from August 11 to 15, 1980, the immobilization of whole cells (i.e. of E. coli cells obtained by genetic manipulation, which contain large amounts of penicil linamidase). The cells are enclosed in urethane prepolymers. Biotransformation systems for the production of L-serine and L-tryptophan are still in the experimental stage.

Die hier beschriebene Erfindung umfasst einen hydrophilen Polyäther-Polyurethan-Schaum, in dem mindestens 50 Mol.% der Alkylenoxideinheiten in den Polyätherseg-menten des Polyurethans Äthylenoxid sind. Dieser Schaum hat in sich immobilisiert einen Mikroorganismus, der L-Aminosäuren zu produzieren erlaubt. Der Ausdruck «die L-Aminosäure-Produktion erlaubende Mikroorganismen» steht für alle diejenigen Mikroorganismen, welche, bei Kontakt mit dem geeigneten Substrat, dasselbe zu einer L-Aminosäure umsetzen. Die Erfindung umfasst sowohl die Organismen, wo die Umsetzung intracellulär mittels Enzymen und/oder auch die Fälle, wo die Umsetzung extracellulär abläuft. Ein spezifisches Beispiel für die Anwendung des erfindungsge-mässen Schaumes ist die Umsetzung von L-Asparaginsäure zu L-Alanin. The invention described here comprises a hydrophilic polyether-polyurethane foam in which at least 50 mol% of the alkylene oxide units in the polyether segments of the polyurethane are ethylene oxide. This foam has an immobilized microorganism that allows it to produce L-amino acids. The expression “L-amino acid production-permitting microorganisms” stands for all those microorganisms which, when in contact with the appropriate substrate, convert the same to an L-amino acid. The invention encompasses both the organisms where the implementation intracellularly by means of enzymes and / or the cases where the implementation takes place extracellularly. A specific example of the use of the foam according to the invention is the conversion of L-aspartic acid to L-alanine.

Der erfindungsgemässe Schaum ist im vorangehenden Patentanspruch 1, die erfindungsgemässen Verfahren zur Herstellung des Schaumes sowie die Verwendung des Schaumes sind in den vorangehenden Patentansprüchen 7 und 10 charakterisiert. The foam according to the invention is characterized in the preceding claim 1, the inventive methods for producing the foam and the use of the foam are characterized in the preceding claims 7 and 10.

Bevorzugterweise enthalten die Polyäthersegmente des Schaumes mindestens 90 Mol.% Äthylenoxideinheiten. Je nach der zugesetzten Menge von Vernetzungsmittel wird der Schaum entweder steif oder flexibel sein. Bezogen auf das Trockengewicht des eingesetzten Mikroorganismus beträgt das Gewichtsverhältnis von Polyurethan-Polymer zum Mikroorganismus im Schaum 1:10 bis 10:1, bevorzugterweise liegt dieses Verhältnis zwischen 2:1 und 4:1. Vor der Zugabe der Kultivierungsbrühe zum Präpolymeren kann das Trok-kengewicht des Mikroorganismus in der Kultur durch Eindampfen der Kultivierungsbrühe zur Trockne berechnet werden. Dieses Eindampfen kann bei einer geeigneten Tem- The polyether segments of the foam preferably contain at least 90 mol% of ethylene oxide units. Depending on the amount of crosslinking agent added, the foam will be either stiff or flexible. Based on the dry weight of the microorganism used, the weight ratio of polyurethane polymer to microorganism in the foam is 1:10 to 10: 1, preferably this ratio is between 2: 1 and 4: 1. Before adding the culture broth to the prepolymer, the dry weight of the microorganism in the culture can be calculated by evaporating the culture broth to dryness. This evaporation can be carried out at a suitable temperature.

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peratur, beispielsweise 50°, und unter reduziertem Druck geschehen. Nach der Zugabe einer solchen Kulturbrühe zum Präpolymeren werden 10 bis 90 Gew.% (bevorzugterweise 50 bis 90 Gew.%) des Mikroorganismus im Schaum immobi-s lisiert vorliegen. temperature, for example 50 °, and done under reduced pressure. After the addition of such a culture broth to the prepolymer, 10 to 90% by weight (preferably 50 to 90% by weight) of the microorganism will be immobilized in the foam.

Der frisch zubereitete Schaum zeigt einen gewissen Auswascheffekt bezüglich der Zellen. Dieser liegt im allgemeinen unter 15 Gew.%, bezogen auf die zugesetzte Organismuskultur. Normalerweise liegt dieser Auswaschgrad ein wenig io höher, wenn der Beladungsgrad des Schaumes mit Mikroorganismus erhöht wird. Ebenso wird dieser Auswaschgrad erhöht, wenn bei der Herstellung der Mischung Klumpenbildung eintritt, d.h., wenn ungenügend vermischt wird. Unter dem Ausdruck «immobilisieren» wird verstanden, dass die 15 Mikroorganismen so im Schaum zurückbehalten werden, The freshly prepared foam shows a certain washout effect with regard to the cells. This is generally below 15% by weight, based on the organism culture added. Normally this degree of washing out is a little higher if the degree of loading of the foam with microorganism is increased. This degree of washout is also increased if lumps form during the preparation of the mixture, i.e. if there is insufficient mixing. The term “immobilize” means that the 15 microorganisms are retained in the foam in such a way

dass sie bei Kontakt mit Wasser oder wässrigen Medien praktisch nicht ausgewaschen werden. Es wird angenommen, dass die Mikroorganismen im Schaum eingekapselt und so immobilisiert werden. Es ist auch wahrscheinlich, dass während 20 des Schäumungsvorganges eigentliche chemische Bindungen zwischen den Isocyanatgruppen des Präpolymeren und Oberflächengruppen des Mikroorganismus, beispielsweise Aminogruppen, ausgebildet werden. that they are practically not washed out in contact with water or aqueous media. It is assumed that the microorganisms are encapsulated in the foam and thus immobilized. It is also likely that actual chemical bonds between the isocyanate groups of the prepolymer and surface groups of the microorganism, for example amino groups, are formed during the foaming process.

Die Schäume werden durch Zumischung einer Kultivie-25 rungsbrühe von die L-Aminosäure-Produktion erlaubenden Mikroorganismen direkt mit einem Urethan-Präpolymeren in Anwesenheit von genügend Wasser erhalten. Das Wasser kann natürlich dasjenige der Kultivierungsbrühe sein. Daher ist es normalerweise von Vorteil, wenn diese Brühen 10 bis 90 30 Gew.% Wasser enthalten. Das Wasser wird das Präpolymer schäumen, wobei zugleich der Mikroorganismus im Schaum immobilisiert wird. Um die Immobilisierung optimal zu gestalten, sollte der pH der wässrigen Kultur zwischen 4 und 11 liegen, bevorzugterweise ist er jedoch höher als 7. Wäh-35 rend der Immobilisierung liegt das Gewichtsverhältnis von Präpolymer zu Wasser normalerweise zwischen 2:1 und 1:2, bevorzugterweise zwischen 3:2 und 2:3. Das Wasser wird, wie gesagt, durch die Kultivierungsbrühe beigesteuert; es kann jedoch auch zusätzlich Wasser während der Vermischung 40 zugegeben werden. The foams are obtained directly by admixing a culture broth from microorganisms which allow L-amino acid production with a urethane prepolymer in the presence of sufficient water. The water can of course be that of the cultivation broth. Therefore, it is usually advantageous if these broths contain 10 to 90 30% by weight of water. The water will foam the prepolymer, at the same time immobilizing the microorganism in the foam. In order to optimize the immobilization, the pH of the aqueous culture should be between 4 and 11, but is preferably higher than 7. During the immobilization, the weight ratio of prepolymer to water is normally between 2: 1 and 1: 2, preferably between 3: 2 and 2: 3. As mentioned, the water is contributed by the cultivation broth; however, additional water may also be added during mixing 40.

Nach der Zumischung der wässrigen Phase verläuft die Schäumungsreaktion, die normalerweise in 5 bis 10 Minuten abgeschlossen ist. Darauf wird der Schaum gehärtet und liegt dann, d.h. nach weiteren 5 bis 10 Minuten, in der 45 gewünschten steifen oder flexiblen Form vor. Bei sehr grossen Massen können diese Zeitangaben natürlich höher sein. After the aqueous phase has been mixed in, the foaming reaction proceeds, which is normally completed in 5 to 10 minutes. The foam is then cured and then lies, i.e. after another 5 to 10 minutes, in the 45 desired rigid or flexible form. With very large masses, these times can of course be higher.

Die L-Aminosäuren, welche mittels den erfindungsgemässen Schäumen hergestellt werden können, zusammen mit so den entsprechenden immobilisierten Mikroorganismen und den Substraten, sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt. Der Ausdruck «korrespondierende Substrate» bezeichnet chemische Verbindungen, welche durch den immobilisierten Mikroorganismus fermentiert und so zur 55 gesuchten L-Aminosäure umgesetzt werden. The L-amino acids, which can be produced by means of the foams according to the invention, together with the corresponding immobilized microorganisms and the substrates, are summarized in the following table. The term “corresponding substrates” denotes chemical compounds that are fermented by the immobilized microorganism and thus converted to the 55 L-amino acid sought.

Tabelle table

L-Aminosäure L-amino acid

Mikroorganismus Microorganism

Substrat Substrate

L-Alanin L-Alanin L-Histidin L-Histidin L-alanine L-alanine L-histidine L-histidine

Pseudomonas dacunhae (ATCC 21 197) Pseudomonas dacunhae (ATCC 21 197)

Alcaligenes faecalis (ATCC 25 094) Alcaligenes faecalis (ATCC 25 094)

Brevibacterium thiogenitalis (ATCC 19 240) Brevibacterium thiogenitalis (ATCC 19 240)

Corynebacterium glutamicum (ATCC 21 604 und ATCC 21 607) Corynebacterium glutamicum (ATCC 21 604 and ATCC 21 607)

L-Asparaginsäure L-Asparaginsäure Imidazol-Piruvinsäure Glucose L-Aspartic Acid L-Aspartic Acid Imidazole-Piruvic Acid Glucose

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Tabelle (Fortsetzung) Table (continued)

L-Aminosäure L-amino acid

Mikroorganismus Microorganism

Substrat Substrate

L-Histidin L-histidine

L-Isoleucin L-isoleucine

L-Leucin L-leucine

L-Serin L-serine

L-Theonin L-Theonine

L-Prolin L-proline

L-Arginin L-arginine

L-Tryptophan L-tryptophan

L-Phenylalamin L-phenylalamine

L-Tyrosin L-tyrosine

L-Lysin L-lysine

1) Brevibacterium flavum 1) Brevibacterium flavum

2) Glutaminsäure erzeugende Stämme (z.B. Cornebacterium oder Brevibacterium, 2) Strains producing glutamic acid (e.g. Cornebacterium or Brevibacterium,

spez. Brevibacterium flavum, ATCC 14 067) spec. Brevibacterium flavum, ATCC 14 067)

Serratia marcescens (ATCC 21740) Serratia marcescens (ATCC 21740)

Serratia marcescens (ATCC 21 741) Serratia marcescens (ATCC 21 741)

Serratia marcescens (ATCC 21810) Serratia marcescens (ATCC 21810)

Mikrobacterium species (ATCC 21 376) Mikrobacterium species (ATCC 21 376)

Norcardiabutanica(ATCC21 197) Norcardiabutanica (ATCC21 197)

Corynebacterium glycinophilum (ATCC 21 341) Corynebacterium glycinophilum (ATCC 21 341)

Brevibacterium flavum (ATCC 21 269) Brevibacterium flavum (ATCC 21 269)

Corynebacterium acetoacidophilum (ATCC 21 270) Corynebacterium acetoacidophilum (ATCC 21 270)

E. coli (ATCC 13 070) E. coli (ATCC 13 070)

Cornebacterium glutamicum (ATCC 19 223) Microbacterium ammoniaphilum (ATCC 15 354) Brevibacterium ammomiagenes (ATCC 13 746) Bacillus subtalis (ATCC 21 742) Cornebacterium glutamicum (ATCC 19 223) Microbacterium ammoniaphilum (ATCC 15 354) Brevibacterium ammomiagenes (ATCC 13 746) Bacillus subtalis (ATCC 21 742)

Brevibacterium flavum (ATCC 21 742) Corynebacterium glutamicum (ATCC 21 659) Brevibacterium thiogenitalis (ATCC 19 240) Proteuo rettgerii (Ajinomoto) (AJ 2770) Brevibacterium flavum (ATCC 21 742) Corynebacterium glutamicum (ATCC 21 659) Brevibacterium thiogenitalis (ATCC 19 240) Proteuo rettgerii (Ajinomoto) (AJ 2770)

E. coli (ATCC 27 553) E. coli (ATCC 27 553)

E. coli (ATCC 8724) E. coli (ATCC 8724)

Brevibacterium thiogenitalis (ATCC 19 240) Rhodosporidium toruloides (ATCC 10 788) Brevibacterium thiogenitalis (ATCC 19 240) Erwinia herbicola (ATCC 21 434) Brevibacterium thiogenitalis (ATCC 19 240) Rhodosporidium toruloides (ATCC 10 788) Brevibacterium thiogenitalis (ATCC 19 240) Erwinia herbicola (ATCC 21 434)

Erwinia herbicola (ATCC 21433) Erwinia herbicola (ATCC 21433)

Brevibacterium flavum (ATCC 21127-21 129) Corynebacterium glutamicum (ATCC 13 826) Corynebacterium glutamicum (ATCC 13 827) Bacillus megaterium (ATCC 21 209) Brevibacterium flavum (ATCC 21127-21 129) Corynebacterium glutamicum (ATCC 13 826) Corynebacterium glutamicum (ATCC 13 827) Bacillus megaterium (ATCC 21 209)

1) Glucose 1) glucose

2) Histidinol 2) histidinol

Glucose Glucose Glucose Glucose glucose glucose

Hydroxybuttersäure a-Keto-ß-methyl-n-valerionsäure a-Keto-isocapronsäure Glucose Hydroxybutyric acid a-keto-ß-methyl-n-valerionic acid a-keto-isocaproic acid glucose

Glycin, Formaldehyd Glycine, formaldehyde

Glucose glucose

Indolpyruvinsäure Indole pyruvic acid

Indol + Pyruvinsäure (oder Serin) Indole + pyruvic acid (or serine)

Phenylpyruvinsäure trans-Zimtsäure Phenylpyruvic acid trans-cinnamic acid

Hydroxyphenylpyruvinsäure Hydroxyphenylpyruvic acid

Phenol + Pyruvinsäure Phenol + pyruvic acid

Phenol + Pyrivinsäure Phenol + pyrivic acid

Glucose glucose

All die oben aufgeführten Mikroorganismen sind von den angegebenen Sammelstellen für Mikroorganismen erhältlich. Es ist hier jedoch daraufhinzuweisen, dass der erfindungsge-mässe Schaum sich nicht auf die oben aufgelisteten Mikroorganismen beschränkt. All of the microorganisms listed above are available from the specified collection points for microorganisms. However, it should be pointed out here that the foam according to the invention is not limited to the microorganisms listed above.

Um die gewünschten L-Aminosäuren zu erhalten, wird der den immobilisierten Mikroorganismus enthaltende Schaum mit der wässrigen Substratlösung in Kontakt gebracht. Die Mischung wird dann bei Temperaturen zwischen 15 und In order to obtain the desired L-amino acids, the foam containing the immobilized microorganism is brought into contact with the aqueous substrate solution. The mixture is then at temperatures between 15 and

60 60°C unter Rühren inkubiert, bis die Umsetzung abgeschlossen ist. Anschliessend wird der Schaum abgetrennt und kann bei tiefen Temperaturen gelagert werden, wobei er für weitere Umsetzungen dieser Art zur Verfügung steht. Die Aminosäuren werden mittels konventioneller Methoden 6s gewonnen. Die enzymatische Reaktion kann andererseits auch so ausgeführt werden, dass eine Kolonne mit dem mikroorganismushaltigen Schaum gefüllt wird und das Substrat durch die Kolonne gegeben wird. Diese Ausführungs 60 60 ° C incubated with stirring until the reaction is complete. The foam is then separated off and can be stored at low temperatures, and is available for further reactions of this type. The amino acids are obtained using conventional 6s methods. On the other hand, the enzymatic reaction can also be carried out by filling a column with the microorganism-containing foam and passing the substrate through the column. This execution

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form stellt ein kontinuierliches Verfahren dar. Der Schaum wird beispielsweise dabei so in eine Kolonne gepackt, dass das Substrat mit genügend hoher Geschwindigkeit noch durchmessen kann. Das Substrat mit einem pH von 3 bis 11 wird bei einer Temperatur zwischen 15 bis 60°C durch die Kolonne geleitet. Als Ausfluss wird eine wässrige Lösung erhalten, welche die gesuchte L-Aminosäure enthält. Die Lösung kann auch rezirkuliert werden. form is a continuous process. For example, the foam is packed into a column so that the substrate can still measure at a sufficiently high speed. The substrate with a pH of 3 to 11 is passed through the column at a temperature between 15 to 60 ° C. As an outflow, an aqueous solution is obtained which contains the sought L-amino acid. The solution can also be recirculated.

Die Urethan-Präpolymere, die für die Herstellung der erfindungsgemässen Schäume geeignet sind, werden mittels Umsetzung von Polyoxyalkylen-Polyolen mit einem Über-schuss von Polyisocyanaten, beispielsweise Toluoldiiso-cyanat, erhalten. Vor der Umsetzung sollten die Polyole ein mittleres Zahlen-Molekulargewicht von 200 bis 20 000, bevorzugterweise ein solches von 600 bis 6000 aufweisen. Die Hydroxylfunktionalität der Polyole und die entsprechende Isocyanatfunktionalität nach der Umsetzung soll zwischen 2 und 8 liegen. Wenn Präpolymere eingesetzt werden, die eine Isocyanat-Funktionalität von ungefähr 2 haben, besteht der resultierende Schaum im wesentlichen aus linearen Molekülen und zeigt ungenügende Zugfestigkeit, verglichen mit quervernetzten Produkten. Demgemäss werden Hydroxyl-funktionalitäten von mehr als 2 pro Molekül verlangt. Dies kann dadurch geschehen, dass Mischungen von Diolen und Triolen oder von Polyolen mit noch höherer Funktionalität eingesetzt werden. Auch Triole oder Polyole mit höheren Funktionalitäten können alleine mit Di- oder Polyisocyanaten umgesetzt werden. Beispiele von geeigneten Polyolen zur Umsetzung mit den genannten Polyisocyanaten umfassen: The urethane prepolymers which are suitable for the production of the foams according to the invention are obtained by reacting polyoxyalkylene polyols with an excess of polyisocyanates, for example toluenediisocyanate. Before the reaction, the polyols should have an average number molecular weight of 200 to 20,000, preferably 600 to 6,000. The hydroxyl functionality of the polyols and the corresponding isocyanate functionality after the reaction should be between 2 and 8. If prepolymers are used which have an isocyanate functionality of approximately 2, the resulting foam consists essentially of linear molecules and exhibits insufficient tensile strength compared to cross-linked products. Accordingly, hydroxyl functionalities of more than 2 per molecule are required. This can be done by using mixtures of diols and triols or of polyols with even higher functionality. Triols or polyols with higher functionalities can also be reacted with di- or polyisocyanates alone. Examples of suitable polyols for reaction with the polyisocyanates mentioned include:

A) im wesentlichen lineare Polyole, die beispielsweise durch Reaktion von Äthylenoxid mit Äthylenglykol als Initiator erhalten werden. Auch Mischungen von Äthylenoxid mit anderen Alkylenoxiden können dabei eingesetzt werden, wobei jedoch der Molprozent von Äthylenoxideinheiten mindestens 50 betragen muss. Wenn die linearen Polyäther Mischungen von Äthylenoxid mit beispielsweise Propylenoxid sind, können die Polymere anschliessend als Random- oder Block-Copolymere vorliegen, und die endständigen Einheiten können entweder Oxyäthylen oder Oxy-propylen sein. Eine zweite Klasse von Polyolen B) umfassen diejenigen, welche eine Hydroxyfunktionalität von 3 und mehr aufweisen. Solche Polyole werden normalerweise durch Umsetzung von Alkylenoxiden mit polyfunktionalen Initiatoren wie Trimethylolpropan, Pentaerythritol erhalten. Um Polyole der Klasse B) zu bilden, können als Alkylenoxide Äthylenoxid oder Mischungen von Äthylenoxid mit anderen Alkylenoxiden verwendet werden. Weitere für die Herstellung der erfindungsgemässen Schäume geeignete Polyole (Gruppe C) sind lineare oder verzweigte, polyfunktionale Polyole wie in A) und B) definiert, wobei die beiden mit einem Initiator oder Quervernetzungsmittel miteinander umgesetzt werden. Ein spezifisches Beispiel aus der Gruppe C) ist eine Mischung von Polyäthylenglykol (Molekulargewicht ungefähr 1000) mit Trimethylolpropan, Trimethylol-äthan oder Glycerin. Diese Mischung kann anschliessend in einem Überschuss von Polyisocyanat umgesetzt werden, um ein Präpolymer zu erhalten, welches in dieser Erfindung günstigerweise eingesetzt werden kann. Andererseits können lineare oder verzweigtkettige Polyole (beispielsweise Polyäthylenglykol) separat mit überschüssigem Polyisocyanat umgesetzt werden. Der Initiator, d.h. das Trimethylolpropan, kann auch separat mit dem Polyisocyanat umgesetzt werden. Dann können die beiden Reaktionsprodukte kombiniert werden und bilden dann zusammen das gesuchte Präpolymere. A) essentially linear polyols obtained, for example, by reacting ethylene oxide with ethylene glycol as the initiator. Mixtures of ethylene oxide with other alkylene oxides can also be used, but the mole percent of ethylene oxide units must be at least 50. If the linear polyethers are mixtures of ethylene oxide with, for example, propylene oxide, the polymers can then be present as random or block copolymers, and the terminal units can be either oxyethylene or oxypropylene. A second class of polyols B) include those which have a hydroxy functionality of 3 and more. Such polyols are normally obtained by reacting alkylene oxides with polyfunctional initiators such as trimethylolpropane, pentaerythritol. In order to form class B) polyols, ethylene oxide or mixtures of ethylene oxide with other alkylene oxides can be used as alkylene oxides. Further polyols (group C) suitable for the production of the foams according to the invention are linear or branched, polyfunctional polyols as defined in A) and B), the two being reacted with one another using an initiator or crosslinking agent. A specific example from group C) is a mixture of polyethylene glycol (molecular weight approximately 1000) with trimethylolpropane, trimethylolethane or glycerin. This mixture can then be reacted in an excess of polyisocyanate to obtain a prepolymer which can be used favorably in this invention. On the other hand, linear or branched-chain polyols (for example polyethylene glycol) can be reacted separately with excess polyisocyanate. The initiator, i.e. the trimethylolpropane can also be reacted separately with the polyisocyanate. Then the two reaction products can be combined and then together form the desired prepolymer.

Geeignete Polyisocyanate und Initiatoren werden beispielsweise in der US-Patentschrift 3 903 232 beschrieben. Suitable polyisocyanates and initiators are described, for example, in US Pat. No. 3,903,232.

Diese Patentschrift wird hiermit als Referenz in diese Erfindungsbeschreibung aufgenommen. Die Initiatoren sind normalerweise wasserlösliche oder wasserdispergierbare, quervernetzende Mittel; sie sind ebenfalls in der genannten US-Patentschrift beschrieben. This patent is hereby incorporated by reference into this description of the invention. The initiators are normally water-soluble or water-dispersible, cross-linking agents; they are also described in the aforementioned US patent.

Herstellung von Präpolymer A Preparation of prepolymer A

Das Präpolymer A wird erhalten durch Zumischen einer zweimolaren, äquivalenten Menge von Polyäthylenglykol mit einem durchschnittlichen Zahlenmolekulargewicht von 1000 (PEG 1000) zu 0,66 molaren Äquivalenten von Trimethylolpropan (TMOP). Die Mischung wird bei 100 bis 110°C und bei einem Druck von 5 bis 15 Torr getrocknet, um das Wasser zu entfernen. Die erhaltene, getrocknete Mischung wird langsam, über eine Periode von ungefähr einer Stunde, in einen Behälter gegeben, welcher eine Menge von 5,7 molaren Äquivalenten von Toluoldiisocyanat (TDI) enthält. Die Zugabe geschieht unter Rühren. Die Temperatur wird auf 60°C gehalten und das Rühren nach der Zugabe des Poly-äthylenglykols 3 Stunden lang fortgesetzt. Dann wird eine weitere Menge von 0,92 molaren Äquivalenten von TDI zugegeben und nochmals eine Stunde lang gerührt. Die Temperatur wird dabei wiederum auf 60°C gehalten. Das End-Reaktionsgemisch enthält 5 Mol.% Überschuss von TDI. Alle Hydroxylgruppen sind mit Isocyanat abgesättigt, und eine gewisse Kettenverlängerung ist eingetreten wegen der Vernetzung der Polyole mit TDI. Prepolymer A is obtained by admixing a two-molar equivalent amount of polyethylene glycol with an average number molecular weight of 1000 (PEG 1000) to 0.66 molar equivalents of trimethylolpropane (TMOP). The mixture is dried at 100 to 110 ° C and at a pressure of 5 to 15 torr to remove the water. The resulting dried mixture is slowly placed over a period of approximately one hour in a container containing 5.7 molar equivalents of toluene diisocyanate (TDI). The addition is done with stirring. The temperature is maintained at 60 ° C and stirring is continued for 3 hours after the addition of the poly-ethylene glycol. A further amount of 0.92 molar equivalents of TDI is then added and stirring is continued for one hour. The temperature is again kept at 60 ° C. The final reaction mixture contains 5 mol% excess of TDI. All hydroxyl groups are saturated with isocyanate and some chain extension has occurred due to the crosslinking of the polyols with TDI.

Beispiel 1 example 1

Alcaligenes-faecalis-Zellen (ATCC 25 094) wurden zu 5 g Präpolymer A gegeben. Dabei wurden 8 g der im voraus gebildeten Kultur eingesetzt. Die eingesetzte Kultur enthielt 1 g Trockensubstanz an Zellen. Wegen des Wassers der zugesetzten Kultur wurde ein flexibler hydrophiler Polyurethan-Schaum erhalten, welcher in etwa 15 Minuten nach dem Schäumen ausgehärtet war. Die Zellen waren entweder in der Schaummasse eingekapselt oder auf der Oberfläche der Polyurethan-Schaummatrix gebunden. Alcaligenes faecalis cells (ATCC 25 094) were added to 5 g of prepolymer A. 8 g of the culture formed beforehand were used. The culture used contained 1 g of dry substance on cells. Because of the water of the added culture, a flexible hydrophilic polyurethane foam was obtained which was cured in about 15 minutes after foaming. The cells were either encapsulated in the foam mass or bound on the surface of the polyurethane foam matrix.

Beispiel 2 Example 2

Der Schaum aus Beispiel 1 wurde in eine Kolonne gegeben und oben und unten mit einem «Millipore»-Filter abgedeckt. Am Kopf der Kolonne wurden 50 g L-Asparaginsäure in einen Behälter gegeben. Der Behälter war in Kontakt mit der Kolonne. Anschliessend wurden 41 einer Lösung, enthaltend 40 ml NH4OH und 10 ml Tween 80 mit einem pH von 10 (mit 50%iger H3PO4), durch die L-Asparaginsäure auf die Kolonne gegeben. Die Lösungstemperatur war ungefähr 25°C und die Durchflussgeschwindigkeit ungefähr 0,67 ml pro Minute. Während der ersten 40 Stunden der Betriebsdauer trat aus der Kolonne eine Lösung mit ungefähr 0,9 mg/ml L-Alanin aus. Dies entspricht bei einer Umsetzung von ungefähr 0,60 mg/min. L-Alanin. Anschliessend wurde die Durchflussgeschwindigkeit auf 0,34 ml/min. erniedrigt, und die Umsetzungsrate betrug nun 1,62 mg/ml. Bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,17 ml/min. war die Umsetzungsgeschwindigkeit 2,66 mg/ml. The foam from Example 1 was placed in a column and covered at the top and bottom with a “Millipore” filter. At the top of the column, 50 g of L-aspartic acid were placed in a container. The container was in contact with the column. Then 41 of a solution containing 40 ml of NH4OH and 10 ml of Tween 80 with a pH of 10 (with 50% H3PO4) were added to the column through the L-aspartic acid. The solution temperature was approximately 25 ° C and the flow rate approximately 0.67 ml per minute. During the first 40 hours of operation, a solution with approximately 0.9 mg / ml L-alanine emerged from the column. This corresponds to a conversion of approximately 0.60 mg / min. L-alanine. The flow rate was then raised to 0.34 ml / min. decreased, and the conversion rate was now 1.62 mg / ml. At a flow rate of 0.17 ml / min. the rate of conversion was 2.66 mg / ml.

Der Gehalt an L-Alanin wurde auf einem Technicon Auto-Analyzer festgestellt. Eingesetzt wurde die L-Aminosäureoxi-dase, um das L-Anilin in die entsprechende a-Ketosäure, in NH3 und in H2O2 umzuwandeln. Anschliessend wurde das Peroxid mit 2,4-Dichlorphenol und mit 4-Aminoantipyren in Anwesenheit von Meerrettich-Peroxidase umgesetzt. Das erhaltene Reaktionsprodukt, ein Chinonimin-Farbstoff, wurde kolorimetrisch bei 505 nm abgelesen. The L-Alanine content was determined on a Technicon auto-analyzer. The L-amino acid oxi-dase was used to convert the L-aniline into the corresponding a-keto acid, in NH3 and in H2O2. The peroxide was then reacted with 2,4-dichlorophenol and with 4-aminoantipyrene in the presence of horseradish peroxidase. The reaction product obtained, a quinonimine dye, was read colorimetrically at 505 nm.

Beispiel 3 Example 3

Teilchenförmiger Schaum aus dem Beispiel 1 wurde in eine Particulate foam from Example 1 was converted into a

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

650 794 650 794

6 6

Doppeiwandkolonne gegeben, deren Aussenraum von Wasser durchflössen war. Die Temperatur konnte so auf verschiedene Stufen eingestellt und dort gehalten werden. Das Substrat lief wiederum mit einer Duchflussgeschwindigkeit von 0,67 ml/min. durch die Kolonne. Das Substrat bestand aus 500 ml entionisiertem Wasser, welches 10 ml konz. NH4OH, 2,5 ml Tween 80 und 53 g feste L-Asparaginsäure enthielt. Es lag bei Raumtemperatur vor. Beim Durchlauf durch die Kolonne wurde das Substrat auf 27°C erwärmt und anschliessend, d.h. vor der Rezirkulierung in den die feste L-Asparagin enthaltenden Behälter, auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Substrat wurde kontinuierlich aus dem Austrittsbehälter auf die Kolonne und dann in den Kühler zurück zur Aufgabe gepumpt. Das genannte Verfahren wurde bei Temperaturen von 37 und 50°C wiederholt. Die Umsetzung bei 27°C wurde 20 Stunden lang gefahren, diejenige bei 37°C 72 Stunden und die bei 50°C 24 Stunden lang. Die Umsetzungsgeschwindigkeiten zu L-Alanin, welches übrigens wie im Beispiel 2 analysiert wurde, waren bei 27°C: 112,5 mg/Stunde, bei 37°C: 334 mg/Stunde und bei 50°C: 0 mg/Stunde. Given double-wall column, the outer space of which was flooded with water. The temperature could be set to different levels and kept there. The substrate again ran at a flow rate of 0.67 ml / min. through the column. The substrate consisted of 500 ml of deionized water, which 10 ml of conc. NH4OH, 2.5 ml Tween 80 and 53 g solid L-aspartic acid contained. It was at room temperature. When passing through the column, the substrate was heated to 27 ° C and then, i.e. cooled to room temperature before recirculation to the container containing the solid L-asparagine. The substrate was continuously pumped from the exit container to the column and then back to the cooler in the cooler. The above procedure was repeated at temperatures of 37 and 50 ° C. The reaction at 27 ° C was run for 20 hours, that at 37 ° C for 72 hours and that at 50 ° C for 24 hours. The conversion rates to L-alanine, which was incidentally analyzed as in Example 2, were at 27 ° C.: 112.5 mg / hour, at 37 ° C.: 334 mg / hour and at 50 ° C.: 0 mg / hour.

Beispiel 4 Example 4

26 g Pseudomonas-dacunhae-Zellen (ATCC 21 192) wurden mit 20 g des Präpolymeren A gemischt, wonach die Mischung geschäumt wurde, alles wie im Beispiel 1. Der Schaum wurde in Würfel von ungefähr 1 cm3 Grösse geschnitten und in eine 100-cm3-Kolonne gepackt. Ein Substrat, welches ungefähr 0,5 molar in L-Asparaginsäure war, wurde auf die Kolonne gegeben. Der pH des Substrates betrug 5,3 (eingestellt mit H2SO4). Das Substrat enthielt zudem 10 mg/1 Pyridoxal-5-phosphatund 2,5 g/1 Tween 80. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 0,65 ml/min., was eine Umsetzung zu L-Analin (analysiert wie im Beispiel 2) von 14 bis 17 mg/ml ergaben. Das Substrat wurde nicht rezirkuliert, d.h., der Durchlauf geschah einmal. Nachdem 700 cm3 Substrat aufgefangen worden waren, wurde das L-Anilin daraus wie folgt isoliert: Die Lösung wurde auf 85°C erwärmt, ihr pH wurde auf 5,5 eingestellt, worauf die Lösung auf 15°C abgekühlt wurde. Dabei fielen sowohl die L-Asparaginsäure wie auch das L-Alanin aus. Der Feststoff wurde abgetrennt und in entionisiertem Wasser gelöst, wobei nur das L-Alanin in Lösung ging. Die L-Asparaginsäure wurde abgetrennt. Das Filtrat wurde nun unter Vakuum eingedampft, und man erhielt so das L-Anilin in kristalliner Form. Die Ausbeute an Rohprodukt war 151,4 g. 26 g of Pseudomonas dacunhae cells (ATCC 21 192) were mixed with 20 g of prepolymer A, after which the mixture was foamed, all as in Example 1. The foam was cut into cubes approximately 1 cm 3 in size and into a 100 cm 3 Column packed. A substrate which was about 0.5 molar in L-aspartic acid was placed on the column. The pH of the substrate was 5.3 (adjusted with H2SO4). The substrate also contained 10 mg / 1 pyridoxal-5-phosphate and 2.5 g / 1 Tween 80. The flow rate was 0.65 ml / min., Which was a conversion to L-analine (analyzed as in Example 2) from 14 to 17 mg / ml resulted. The substrate was not recirculated, i.e. the run happened once. After collecting 700 cm3 of substrate, the L-aniline was isolated therefrom as follows: the solution was heated to 85 ° C, its pH was adjusted to 5.5, and the solution was cooled to 15 ° C. Both the L-aspartic acid and the L-alanine failed. The solid was separated and dissolved in deionized water, leaving only the L-alanine in solution. The L-aspartic acid was separated. The filtrate was then evaporated in vacuo to give the L-aniline in crystalline form. The yield of the crude product was 151.4 g.

Beispiel 5 Example 5

Nach einer etwa 2wöchigen Dauer des Versuches wurde das Substrat des Beispiels 4 ausgetauscht gegen eine 1 molare Lösung von L-Asparaginsäure, welche zugleich 125 cm3 NH4OH/I enthielt. Der pH des neuen Substrates wurde durch Zugabe von 60%iger Schwefelsäure auf 5,3 eingestellt. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 0,65 ml/min. Die anfängliche Umsetzungsrate betrug etwa 14 mg/ml. Nach Substitution des Substrates mit einem Analogen, welches jedoch nur 0,05 mole L-Asparaginsäure pro Liter enthielt, verringerte sich der Umsetzungsgrad auf 4 bis 5 mg/ml. After the test had lasted about 2 weeks, the substrate of Example 4 was exchanged for a 1 molar solution of L-aspartic acid which also contained 125 cm 3 of NH 4 OH / I. The pH of the new substrate was adjusted to 5.3 by adding 60% sulfuric acid. The flow rate was 0.65 ml / min. The initial conversion rate was approximately 14 mg / ml. After substitution of the substrate with an analog, which however only contained 0.05 mole L-aspartic acid per liter, the degree of conversion decreased to 4 to 5 mg / ml.

Weitere Operationen wurden durchgeführt mit 1 molaren Substraten und ergaben Umsetzungsraten von 27 bis 32 mg/ml. Beim Rezirkulieren solcher Substrate wurden Konversionsraten von 45 bis 50 mg/ml erreicht. Durch Zugabe von Pyridoxal-5-phosphat (P-5-P) in einer Menge von 12,5 mg/1 wurde ein Umsetzungsgrad von 36 mg/ml erreicht. Weitere Operationen ohne das P-5-P, aber mit Umwälzung, führten zu Umsetzungsgraden von bis zu 45 mg/ml. Nachdem die Kolonne kontinuierlich etwa 45 Tage lang in Betrieb gewesen war, fiel der Umsetzungsgrad auf ungefähr 16 mg/ml. Es muss jedoch daraufhingewiesen werden, dass der grösste Teil der Operationszeit ohne P-5-P gefahren worden war. Bei Zugabe von 12,5 mg/ml P-5-Pzum Substrat erhöhte sich der Umsetzungsgrad wieder auf s 40 mg/ml. Durch Umwälzung desselben Substrates während 24 Tagen erhöhte sich der pH-Wert des Substrates auf ungefähr 8,72, was einer Umsetzungsrate von über 90% entspricht. Die erhaltene Lösung wurde nun auf ihren Gehalt an L-Alanin untersucht, und zwar mittels des automatisierten Analyseverfahrens, wie es im Beispiel 2 beschrieben ist. Es wurde festgestellt, dass 94% der vorgelegten L-Asparagin-säure zu L-Alanin umgesetzt worden waren. Further operations were carried out with 1 molar substrates and yielded conversion rates of 27 to 32 mg / ml. When such substrates were recirculated, conversion rates of 45 to 50 mg / ml were achieved. A degree of conversion of 36 mg / ml was achieved by adding pyridoxal-5-phosphate (P-5-P) in an amount of 12.5 mg / 1. Further operations without the P-5-P, but with circulation, led to degrees of conversion of up to 45 mg / ml. After the column was operated continuously for about 45 days, the degree of conversion fell to about 16 mg / ml. However, it must be pointed out that most of the operating time had been driven without P-5-P. When adding 12.5 mg / ml P-5-P to the substrate, the degree of conversion rose again to 40 mg / ml. By circulating the same substrate for 24 days, the pH of the substrate increased to approximately 8.72, which corresponds to a conversion rate of over 90%. The resulting solution was then examined for its content of L-alanine using the automated analysis method as described in Example 2. It was found that 94% of the L-aspartic acid presented had been converted to L-alanine.

15 Beispiel 6 15 Example 6

Zellen von E. coli (ATCC 11 303) wurden in einer phos-phathaltigen Pufferlösung bei pH 8,0 zentrifugiert, und zwar 30 Minuten lang bei 5000 Umdrehungen pro Minute. Die Zellmasse wurde dann abgekühlt und über Nacht getrocknet. 20 11 g dieser Zellmasse wurden nun mit 11 g Präpolymer A gemischt. Wegen der immer noch vorhandenen Wassermenge in der Zellmasse erhielt man einen flexiblen, hydrophilen Polyurethan-Schaum, welcher anschliessend 15 Minuten lang ausgehärtet wurde. Die Zellen waren nun entweder im 25 Schaum eingekapselt oder an der Schaummatrix gebunden. E. coli cells (ATCC 11 303) were centrifuged in a phosphate-containing buffer solution at pH 8.0 for 30 minutes at 5000 revolutions per minute. The cell mass was then cooled and dried overnight. 20 11 g of this cell mass were then mixed with 11 g prepolymer A. Due to the amount of water still present in the cell mass, a flexible, hydrophilic polyurethane foam was obtained, which was then cured for 15 minutes. The cells were either encapsulated in the foam or bound to the foam matrix.

Beispiel 7 Example 7

Der Schaum aus dem Beispiel 6 wurde abgekühlt und 30 anschliessend in kleine Stücke (ungefähr 1 cm3) geschnitten. Dann wurde eine Substratlösung zubereitet, und zwar nach folgendem Rezept: 11,6 g Fumarsäure und 20,3 mg Magnesiumchlorid • 6H2O wurden in 25%iger Ammoniaklösung gelöst, worauf, durch Zugabe von konzentriertem Ammo-35 niak, der pH der Lösung auf 8,5 eingestellt wurde. Nun wurde mit entionisiertem Wasser auf 100 cm3 aufgefüllt. Die Temperatur des Substrates wurde auf 37°C eingestellt. In das Substrat wurden nun 1,4 g des oben erwähnten Schaums gegeben. 30 Minuten später wurden Proben aus der Lösung 40 mittels Dünnschichtchromatographie untersucht. Es zeigte sich, dass in dieser Zeit sich relativ grosse Mengen an L-Asparaginsäure gebildet hatten. Eine weitere analytische Untersuchung ergab, dass 95% der Fumarsäure zu L-Asparaginsäure umgesetzt worden waren. The foam from Example 6 was cooled and then 30 cut into small pieces (approximately 1 cm 3). Then a substrate solution was prepared according to the following recipe: 11.6 g fumaric acid and 20.3 mg magnesium chloride • 6H2O were dissolved in 25% ammonia solution, whereupon, by adding concentrated ammonia-35 niac, the pH of the solution to 8 , 5 was set. Now it was made up to 100 cm 3 with deionized water. The temperature of the substrate was set at 37 ° C. 1.4 g of the foam mentioned above were then added to the substrate. Thirty minutes later, samples from solution 40 were examined by thin layer chromatography. It was shown that relatively large amounts of L-aspartic acid had formed during this time. Another analytical investigation showed that 95% of the fumaric acid had been converted to L-aspartic acid.

45 45

Beispiel 8 Example 8

Der Schaum in Teilchenform aus dem Beispiel 6 wurde in eine 75-cm3-Kolonne gegeben, welche einen Wassermantel 50 aufwies. Die Temperatur wurde in der Kolonne auf 37°C eingestellt, und das Substrat wurde mit verschiedenen Durchlaufgeschwindigkeiten durch die Kolonne gegeben. Die Zusammensetzung des Substrates war die folgende: 400 cm3 NH4OH, 1200 cm3 entionisiertes Wasser, 232 g Fumarsäure, ss 406 mg Magnesiumchlorid • 6H2O; das Ganze mit entionisiertem Wasser auf 21 gebracht. Der pH des Substrates betrug 9,0. Dieses Substrat wurde in 2 Volumen aufgeteilt. Das Flüssigkeitsvolumen in der Kolonne, d.h. der Teil, welcher nicht durch den Schaum besetzt war, betrug 31,25 cm3. 60 Ungefähr 3500 ml des obengenannten Substrates wurden mit einer konstanten Durchflussgeschwindigkeit von 0,6 ml/ min. bei pH 9,0 durch die Kolonne gegeben. Aus dem Aus-fluss wurden periodisch Proben genommen und mittels Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie auf Anwesenheit 65 von Fumarsäure untersucht. Die Umsetzungen in Prozenten zu L-Asparaginsäure, im Verhältnis zur Anzahl der Stunden des Umlaufs durch die Kolonne, ist in der folgenden Tabelle zusammengestellt: The foam in particle form from Example 6 was placed in a 75 cm 3 column which had a water jacket 50. The temperature in the column was adjusted to 37 ° C and the substrate was passed through the column at various flow rates. The composition of the substrate was as follows: 400 cm3 NH4OH, 1200 cm3 deionized water, 232 g fumaric acid, ss 406 mg magnesium chloride • 6H2O; brought the whole thing to 21 with deionized water. The pH of the substrate was 9.0. This substrate was divided into 2 volumes. The volume of liquid in the column, i.e. the part that was not occupied by the foam was 31.25 cm3. 60 Approximately 3500 ml of the above substrate was run at a constant flow rate of 0.6 ml / min. passed through the column at pH 9.0. Samples were taken periodically from the outflow and examined for the presence of fumaric acid by means of high pressure liquid chromatography. The conversion in percent to L-aspartic acid, in relation to the number of hours of circulation through the column, is shown in the following table:

10 10th

7 7

650794 650794

Stabilitätsuntersuchung bei 37°C Stability test at 37 ° C

Umsetzung von Fumarsäure zu L-Asparaginsäure Conversion of fumaric acid to L-aspartic acid

Zeiten (Std.) Times (hours)

% Umsetzung % Implementation

(bei Durchflussgeschwindigkeit von 0,6 cmVMin.) (at flow rate of 0.6 cmVMin.)

5 5

71 71

46 46

69 69

150 150

61 61

218 218

61 61

Beispiel 9 Example 9

Nachdem die Kolonne gemäss Beispiel 8 54 Stunden lang betrieben worden war, wurde die Durchflussgeschwindigkeit auf 0,28 cmVMinute eingestellt. Während der nachfolgenden Periode von 16 Stunden und 50 Minuten wurde ein Muster von 288 ml aufgefangen. Aus 250 ml dieses Musters wurde die L-Asparaginsäure bestimmt. Die tatsächliche Umsetzungsrate von Fumarsäure zu L-Asparaginsäure (basierend auf der direkteren Analyse von getrockneter L-Asparaginsäure mittels Gas-Flüssig-Chromatographie) betrug ungefähr 85%. After the column had been operated according to Example 8 for 54 hours, the flow rate was set to 0.28 cmV minute. A 288 ml sample was collected over the subsequent 16 hour and 50 minute period. The L-aspartic acid was determined from 250 ml of this sample. The actual conversion rate from fumaric acid to L-aspartic acid (based on the more direct analysis of dried L-aspartic acid using gas-liquid chromatography) was approximately 85%.

Beispiel 10 Example 10

Es wurden ungefähr 3500 ml eines Substrates, das mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,6 ml/min. durch die Kolonne von Beispiel 8 gegeben worden war, aufgefangen. Die Probe wurde auf 90°C erhitzt, und der pH-Wert der Lösung wurde auf 2,8 eingestellt, d.h. auf den isoelektrischen Punkt für L-Asparaginsäure. Die pH-Einstellung geschah mittels Zugabe von 200 ml 60%iger Schwefelsäure. Die angesäuerte Mischung wurde auf 15°C abgekühlt, wodurch die L-Asparaginsäure ausfiel. Diese wurde abfiltriert, getrocknet und, bei 30°C, mit einer 95%igen Mischung aus Äthanol und Wasser gewaschen. Die Fumarsäure, die sich nicht umgesetzt hatte, blieb im Äthanol gelöst und wurde abgetrennt. Eine Probe aus dem erhaltenen Pulver wurde analysiert, und es ergab sich ein Gehalt von 97% an L-Asparaginsäure. Dies entspricht einer Ausbeute von 89% an reiner L-Asparaginsäure. There was approximately 3500 ml of a substrate running at a flow rate of 0.6 ml / min. had been passed through the column of Example 8. The sample was heated to 90 ° C and the pH of the solution was adjusted to 2.8, i.e. to the isoelectric point for L-aspartic acid. The pH was adjusted by adding 200 ml of 60% sulfuric acid. The acidified mixture was cooled to 15 ° C, causing the L-aspartic acid to precipitate. This was filtered off, dried and, at 30 ° C., washed with a 95% mixture of ethanol and water. The fumaric acid that had not reacted remained dissolved in the ethanol and was separated off. A sample of the powder obtained was analyzed and found to be 97% L-aspartic acid. This corresponds to a yield of 89% of pure L-aspartic acid.

Beispiel 11 Example 11

Es wurde ein Schaum zubereitet wie im Beispiel 6.1 g dieses Schaumes wurde in einen Kolben gegeben, in dem zugleich 100 cm3 eines Substrates vorlagen, das 126 mg/ml Fumarsäure enthielt. Die Temperatur der Mischung betrug 37°C, und der pH lag bei 9,0. Die Umsetzung dauerte 15 Minuten lang. Das Vorgehen wurde dreimal wiederholt, A foam was prepared as in Example 6.1 g of this foam was placed in a flask in which 100 cm 3 of a substrate were present, which contained 126 mg / ml fumaric acid. The temperature of the mixture was 37 ° C and the pH was 9.0. The implementation took 15 minutes. The procedure was repeated three times,

wobei jedesmal ein frisches Substrat zugegeben wurde. Im ersten Ansatz betrug die Umsetzung zu L-Asparaginsäure ungefähr 57% und in den folgenden drei Ansätzen je etwa 35% (basierend auf der Analyse der nicht umgesetzten Fumarsäure). Die Differenz zwischen der ersten Umsetzung und den folgenden wird auf einen gewissen Aus wascheffekt des ersten Ansatzes zurückgeführt. a fresh substrate was added each time. In the first batch, the conversion to L-aspartic acid was approximately 57% and in the following three batches, approximately 35% each (based on the analysis of the unreacted fumaric acid). The difference between the first implementation and the following is attributed to a certain washout effect of the first approach.

Beispiel 12 Example 12

Eine Kolonne wurde vorbereitet und betrieben, wie dies im vorangehenden Beispiel 8 beschrieben ist ( 116 mg/cm3 Fumarsäure bei pH 9,04). Die Temperatur betrug jedoch im Gegensatz zum genannten Beispiel hier 50°C. Das Substrat wurde kontinuierlich durch die Kolonne rezirkuliert. Die Restgehalte an Fumarsäure wurden periodisch überprüft. Nach ungefähr 120 Stunden war die Umsetzung praktisch vollendet. Nach etwa 30 Stunden waren etwa noch 33% und nach 50 Stunden noch etwa 10% der Fumarsäure vorhanden. Die 50%ige Umsetzung ist ein extrapolierter Wert. A column was prepared and operated as described in Example 8 above (116 mg / cm3 fumaric acid at pH 9.04). In contrast to the example mentioned, the temperature here was 50 ° C. The substrate was continuously recirculated through the column. The residual fumaric acid levels were checked periodically. After about 120 hours the implementation was practically complete. About 33% of the fumaric acid was still present after about 30 hours and about 10% after 50 hours. The 50% conversion is an extrapolated value.

Beispiel 13 Example 13

5 g kultivierte Zellen von Brevibacterium thiogenitalis (AHV-resistent) wurden mit 5 g des Präpolymeren A vermischt, wobei das Präpolymer zusätzlich 2 Gew.% Pluronic L-62 enthielt. Die Mischung wurde geschäumt, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist. Der erhaltene Schaum wurde in Würfel von ungefähr 2 cm3 Volumen geschnitten. Abgewogene Portionen (entsprechend 0,42 g Zellen von Feuchtgewicht) wurden je zu 25 cm3 Substratlösungen gegeben. Die Zusammensetzung dieses Substrates war: 1,64 mM a-Keto-isokapronsäure, 1,70 mM L-Glutaminsäure, 5 x 10~5 M Pyri-doxal-5-phosphat; der pH der Lösung lag zwischen 8 und 9 und war mit 2 N NHtOH eingestellt worden. Die Umsetzungen verliefen nun unter konstantem Rühren mit einem Magnetrührstab und bei Raumtemperatur. Aus den Umsetzungslösungen wurden in festgelegten Intervallen Proben entnommen, anhand derer die Leucin-Produktion kontrolliert wurde. Typischerweise war der Schaum 8 Stunden im Tag in Kontakt mit dem Substrat und wurde über Nacht in einer 0,05 M K-Phosphatlösung bei 4 bis 10°C aufbewahrt. Der Zyklus wurde 4 Tage lang wiederholt. Der Gehalt an Leucin wurde semi-quantitativ mittels Dünnschichtchromatographie und quantitativ mittels Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie ausgeführt. Die Stabilität der Schaumzellen bei Raumtemperatur wurde bei zwei pH-Werten, nämlich bei 8,0 und 9,0, bestimmt. Bei pH 7,0 wurde festgestellt, dass der Schaum beschädigt wurde. 5 g of cultured cells from Brevibacterium thiogenitalis (AHV-resistant) were mixed with 5 g of prepolymer A, the prepolymer additionally containing 2% by weight of Pluronic L-62. The mixture was foamed as described in Example 1. The foam obtained was cut into cubes of approximately 2 cm 3 volume. Weighed portions (corresponding to 0.42 g wet weight cells) were added to 25 cm3 of substrate solutions. The composition of this substrate was: 1.64 mM a-keto-isocaproic acid, 1.70 mM L-glutamic acid, 5 x 10 -5 M pyridoxal-5-phosphate; the pH of the solution was between 8 and 9 and was adjusted with 2N NHtOH. The reactions were now carried out with constant stirring using a magnetic stir bar and at room temperature. Samples were taken from the reaction solutions at fixed intervals, on the basis of which the leucine production was checked. Typically, the foam was in contact with the substrate 8 hours a day and was stored overnight in a 0.05 M K-phosphate solution at 4 to 10 ° C. The cycle was repeated for 4 days. The leucine content was carried out semi-quantitatively by means of thin-layer chromatography and quantitatively by means of high-pressure liquid chromatography. The stability of the foam cells at room temperature was determined at two pH values, namely 8.0 and 9.0. At pH 7.0, the foam was found to be damaged.

Stabilitätsuntersuchungen bei pH 9,0 Umsetzung von a-Ketosäure zu Leucin Stability studies at pH 9.0 conversion of a-keto acid to leucine

Tage Stunden mM Leucin pro g gebundener Days hours mM leucine per g bound

(Zeitl. Zellen (Feuchtgewicht) (Time cells (wet weight)

Probenahme) Sampling)

1 1

4 4th

27,22 27.22

5 5

27,22 27.22

6 6

40,83 40.83

2 2nd

4 4th

31,76 31.76

6 6

45,36 45.36

7 7

45,36 45.36

3 3rd

27,22 27.22

4 4th

45,36 45.36

5 5

49,91 49.91

4 4th

45,36 45.36

Nach 72 Std. After 72 hours

6 6

72,13 72.13

Lagerung in einer Storage in one

19 19th

258,61 258.61

gepufferten Lösung buffered solution

22 22

285,85 285.85

bei 4 bis 10°C at 4 to 10 ° C

Die immobilisierten Zellen zeigten eine Transaminase-Aktivität über eine Dauer von 4 Tagen bei Raumtemperaturen. Die graduelle Zunahme der Umsetzung von a-Ketosäure zu Leucin wird auf eine spezielle Aktivierung zurückgeführt: Die immobilisierten Zellen könnten dabei einen gewissen Lysierungseffekt zeigen, wodurch die Diffusion des Substrates zu den aktiven Zentren der Transaminase erleichtert wird. Diese anscheinende Aktivierung war noch verstärkter in der Untersuchung bei pH 8,0. In den ersten zwei Tagen zeigte die Schaum/Zellen-Kombination eine eher kleine Aktivität. Am dritten Tag dagegen nahm diese Aktivität stark zu, wie dies aus den folgenden Daten hervorgeht: The immobilized cells showed transaminase activity over a period of 4 days at room temperature. The gradual increase in the conversion of a-keto acid to leucine is attributed to a special activation: The immobilized cells could show a certain lysing effect, which facilitates the diffusion of the substrate to the active centers of the transaminase. This apparent activation was even stronger in the study at pH 8.0. The foam / cell combination showed rather little activity in the first two days. On the third day, however, this activity increased significantly, as can be seen from the following data:

5 5

10 10th

15 15

10 10th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

650794 650794

Stabilitätsuntersuchungen bei pH 8,0 Umsetzung von a-Ketosäure zu Leucin Stability studies at pH 8.0 Conversion of a-keto acid to leucine

Tage Stunden mM Leucin pro g gebundener Days hours mM leucine per g bound

(Zeitl. Zellen (70 bis 85% (Time cells (70 to 85%

Probenahme) Feuchtigkeit) Sampling) humidity)

1 1

4-6 4-6

- -

2 2nd

4-6 4-6

- -

3 3rd

4 4th

186,01 186.01

5 5

245,02 245.02

6 6

249,50 249.50

4 4th

163,32 163.32

nach 72 Std. after 72 hours

5 5

294,88 294.88

Lagerung in einer Storage in one

6 6

267,64 267.64

gepufferten Lösung bei 4 bis 10°C buffered solution at 4 to 10 ° C

B B

Claims

650794 PATENT CLAIMS

1. Hydrophilic polyether-polyurethane foam, characterized in that at least 50 mol.% Of the alkylene oxide units of the polyurethane are ethylene oxide and that the foam contains a microorganism which induces and accelerates the L-amino acid production and is immobilized.

2. hydrophilic foam according to claim 1,

characterized in that at least 90 mol% of the alkylene oxide units of the polyurethane are ethylene oxide.

3. hydrophilic foam according to claim 1,

characterized in that it contains a culture of such a microorganism capable of producing the L-aspartic decarboxylase.

4. Hydrophilic foam according to claim 1, in rigid form.

5. Hydrophilic foam according to claim 1, in flexible form.

6. Hydrophilic foam according to claim 1,

characterized in that the weight ratio, on an anhydrous basis, of polyurethane polymer to the microorganism culture is between 10: 1 and 1:10.

7. A method for producing the hydrophilic foam according to claim 1, characterized in that a culture of a microorganism which allows L-amino acid production is admixed with a hydrophilic polyether urethane prepolymer in which at least 50 mol% of the alkylene oxide units in the polyether segments of the Prepolymers are ethylene oxide, with sufficient water being present when admixed to foam the prepolymer so that it encloses and immobilizes the microbial cells of the culture.

8. The method according to claim 7, characterized in that the water content of the admixed culture is between 10 and 90% by weight and that the pH of the admixture is greater than 7.

9. The method according to claim 7, characterized in that the weight ratio, based on dry weights, between the prepolymer and the admixed culture is between 10: 1 and 1:10.

10. Use of the hydrophilic foam according to claim 1 for the production of L-amino acids, characterized in that said foam is brought into contact with a suitable substrate, the substrate containing the components which the microorganism in the foam to form L-amino acids needs.

11. Use according to claim 10, characterized in that the substrate is a water-soluble solution with a pH of 3 to 11 and that the substrate has a temperature of 15 to 60 ° C.

12. Use according to claim 10, characterized in that it is carried out as a continuous or as a batch process.