CH650677A5

CH650677A5 - AGAINST DIABETES MELLITUS ACTIVE PHARMACEUTICAL AGENT.

Info

Publication number: CH650677A5
Application number: CH5008/82A
Authority: CH
Inventors: Ronald Eugene Chance; Bruce Hill Frank; John Allison Galloway
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1981-08-27
Filing date: 1982-08-23
Publication date: 1985-08-15
Also published as: NL8203316A; SE8204871L; IT8223019A0; ZW17382A1; JPS5846023A; IL66610A0; ZA826157B; IE53829B1; PH18716A; BE894186A; DE3232036A1; AU8759582A; HU193522B; IE822062L; FR2511866B1; LU84358A1; MY8700757A; IL66610A; FR2511866A1; GB2104380B

Description

Aufgabe der Erfindung ist nun die Bereitstellung eines pharmazeutischen Mittels, durch das sich die natürliche hormonale Homöostase in einem diabetischen Zustand besser angenähert erreichen und aufrechterhalten lässt als durch Verabreichung von Insulin. The object of the invention is now to provide a pharmaceutical agent by means of which the natural hormonal homeostasis in a diabetic state can be better approximated and maintained than by administration of insulin.

Diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäss gelöst durch ein pharmazeutisches Mittel aus einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger und einem Wirkstoff, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es als Wirkstoff Human-Proinsulin enthält. This object is now achieved according to the invention by a pharmaceutical agent consisting of a pharmaceutically acceptable carrier and an active ingredient, which is characterized in that it contains human proinsulin as the active ingredient.

Die Verabreichung von Human-Proinsulin unter Verwendung eines erfindungsgemässen Mittels ergibt eine natürliche Verwertung von Glucose und eine bessere Steuerung des Blutzuckers, so dass die oben beschriebenen nachteiligen Diabeteskomplikationen gemildert werden. The administration of human proinsulin using an agent according to the invention results in a natural utilization of glucose and better control of the blood sugar, so that the disadvantageous diabetes complications described above are alleviated.

Human-Proinsulin ist über eine Reihe verschiedener Wege zugänglich, beispielsweise durch organische Synthese, Isolierung aus der Bauchspeicheldrüse von Menschen und seit neuem auch durch Rekombinations-DNA-Methodologie. Human proinsulin is accessible in a number of different ways, for example by organic synthesis, isolation from the human pancreas and, more recently, by recombinant DNA methodology.

Die bevorzugte Herstellung von Proinsulin unter Anwendung der Rekombinations-DNA-Methodologie erfordert die Bildung einer Sequenz einer DNA-Codierung für die Aminosäuresequenz von Human-Proinsulin, was sich entweder durch Isolierung, Konstruktion oder eine Kombination aus beidem erreichen lässt. Die Human-Proinsulin-DNA wird dann in Lesephase in einen geeigneten Clonierungs- und Expressionsträger eingesetzt. Der Träger dient zur Transformierung eines geeigneten Mikroorganismus, und der hierbei erhaltene transformierte Mikroorganismus wird dann Fermentationsbedingungen unterzogen, die (a) zur Bildung weiterer Kopien des proinsulingenhaltigen Vektors und (b) zur Expression von Proinsulin oder einem Proinsulinvorläufer führen. The preferred production of proinsulin using recombinant DNA methodology requires the formation of a sequence of DNA coding for the amino acid sequence of human proinsulin, which can be accomplished either by isolation, construction, or a combination of both. The human proinsulin DNA is then inserted into a suitable cloning and expression carrier in the reading phase. The carrier serves to transform a suitable microorganism, and the transformed microorganism obtained in this way is then subjected to fermentation conditions which (a) lead to the formation of further copies of the vector containing proinsulin and (b) to the expression of proinsulin or a proinsulin precursor.

Handelt es sich beim Expressionsprodukt um einen Proinsulinvorläufer, dann enthält ein solches Produkt im allgemeinen die Human-Proinsulinaminosäuresequenz, die an ihrer endständigen Aminogruppe an ein Bruchstück eines Proteins gebunden ist, das normalerweise bei der Gensequenz ausgedrückt wird, bei welcher das Proinsulin eingesetzt worden ist. Die Proinsulinaminosäuresequenz ist an das Proteinbruchstück über eine spezifisch spaltbare Stelle gebunden, bei der es sich normalerweise um Methionin handelt. Dieses Produkt wird gewöhnlich als verschmolzenes Genprodukt bezeichnet. When the expression product is a proinsulin precursor, such a product generally contains the human proinsulin amino acid sequence which is attached at its terminal amino group to a fragment of a protein which is normally expressed in the gene sequence in which the proinsulin has been used. The proinsulin amino acid sequence is linked to the protein fragment via a specifically cleavable site, which is usually methionine. This product is commonly referred to as a fused gene product.

Die erhaltene Proinsulinaminosäuresequenz wird vom verschmolzenen Genprodukt mittels Cyanogenbromid abgespalten, worauf man die Cysteinsulfhydrylreste der Proinsulinaminosäuresequenz durch übliche Umwandlung in die entsprechenden S-Sulfonate stabilisiert. The proinsulin amino acid sequence obtained is cleaved from the fused gene product by means of cyanogen bromide, whereupon the cysteine sulfhydryl residues of the proinsulin amino acid sequence are stabilized by customary conversion into the corresponding S-sulfonates.

Das erhaltene Proinsulin-S-sulfonat wird dann gereinigt, und im Anschluss daran überführt man das gereinigte Proin-sulin-S-sulfonat in Proinsulin, indem man die drei erforderlichen Disulfidbindungen an den geeigneten Stellen bildet. Hierauf wird das so gewonnene Proinsulin einer Reinigung unterzogen. The proinsulin S-sulfonate obtained is then purified, and then the purified proinsulin S-sulfonate is converted to proinsulin by forming the three required disulfide bonds at the appropriate sites. The proinsulin obtained in this way is then subjected to purification.

Das erfindungsgemässe Mittel zeichnet sich, wie bereits erwähnt, vor allem dadurch aus, dass sich mit ihm eine natürliche hormonale Homöostase besser erreichen lässt, so dass hierdurch die bekannten Komplikationen von Diabetes unterbunden, wesentlich vermindert oder verzögert werden können. Bestimmten Diabetikern lässt sich Insulin durch subkutane Injektion nicht wirksam verabreichen, da an der Injektionsstelle Proteasen zugegen sind, die das Insulin rasch zerstören, bevor es vom Blutstrom absorbiert und an die Empfängerstellen transportiert werden kann. Diesen Diabe- As already mentioned, the agent according to the invention is characterized above all by the fact that it can be used to achieve natural hormonal homeostasis better, so that the known complications of diabetes can thereby be prevented, significantly reduced or delayed. Certain diabetics cannot be effectively administered insulin by subcutaneous injection, as proteases are present at the injection site that destroy the insulin quickly before it can be absorbed by the bloodstream and transported to the recipient sites. This diabetic

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tikern muss Insulin durch intravenöse Injektion gegeben werden, wenn sie überhaupt mit Insulin behandelt werden können. Die Hierzu erforderlichen wiederholten intravenösen Injektionen sind infolge der damit verbundenen Schädigung der Venen des Empfängers und der hierdurch verursachten Infektionen unerwünscht. Überraschenderweise wurde demgegenüber nun gefunden, dass Human-Proinsulin von diesen Insulin abbauenden Proteasen nicht abgebaut wird, so dass sich dieses durch subkutane Injektion verabreichen lässt. Seine Stabilität und die hierdurch bedingte gute Verfügbarkeit tragen zur Erzielung einer natürlichen hormonalen Homöostase bei. Engineers must be given insulin by intravenous injection if they can be treated with insulin at all. The repeated intravenous injections required for this are undesirable due to the associated damage to the recipient's veins and the infections caused thereby. In contrast, it has now surprisingly been found that human proinsulin is not degraded by these insulin-degrading proteases, so that it can be administered by subcutaneous injection. Its stability and the resulting good availability contribute to the achievement of a natural hormonal homeostasis.

Neuere Untersuchungen (Diabetes 31, Suppl. 2,126A (1982)) haben ferner zu der Erkenntnis geführt, dass Human-Proinsulin in Zielgewebe, beispielsweise in Fettzellen, eingebaut wird. Seine besondere intrazelluläre Wirkung auf molekularem Massstab ist zwar bis jetzt noch unbekannt, doch wird hierdurch die Erkenntnis weiter gestützt, dass Hu-man-Proinsulin eine aktive Rolle bei der Erzielung einer natürlichen hormonalen Homöostase spielt und hierfür notwendig ist. Recent studies (Diabetes 31, Suppl. 2,126A (1982)) have also led to the finding that human proinsulin is incorporated into target tissue, for example in fat cells. Its special intracellular effect on a molecular scale is still unknown, but this further supports the knowledge that Hu-man proinsulin plays an active role in achieving natural hormonal homeostasis and is necessary for this.

In Diabetes 31, Suppl. 2,135A (1982) werden Untersuchungen beschrieben, die zeigen, dass die Human-Insulinre-zeptorbindung durch die Anwesenheit von Human-Proinsulin verbessert wird. Auch durch diese Ergebnisse wird die Erkenntnis wiederum weiter gestützt, dass die Verfügbarkeit und Anwesenheit von Human-Proinsulin zu einer Verbesserung oder Wiederherstellung der natürlichen hormonalen Homöostase führt. In Diabetes 31, Suppl. 2,135A (1982), studies are described which show that the human insulin receptor binding is improved by the presence of human proinsulin. These results also support the knowledge that the availability and presence of human proinsulin leads to an improvement or restoration of natural hormonal homeostasis.

Die zur Aufrechterhaltung einer natürlichen hormonalen Homöostase oder zur Erzielung eines Zustands, der der natürlichen hormonalen Homöostase beim Diabetiker stärker angenähert ist, erforderliche Menge an erfindunsgemässem Mittel ist natürlich abhängig von der Schwere des diabetischen Zustands. Die zu verabreichende Menge hängt auch vom jeweiligen Verabreichungsweg ab. Letztendlich ist die Menge an zu verabreichendem Mittel und die Häufigkeit einer solchen Verabreichung der Entscheidung des jeweiligen Arztes überlassen. Da 1 mg Human-Proinsulin eine Aktivität von etwa 3,5 Einheiten Human-Insulin ergibt, wird im allgemeinen ein Dosierungsbereich an Proinsulin gewählt, der für etwa 0,02 bis etwa 5 Einheiten an Human-Insulin pro kg Körpergewicht und pro Tag sorgt und der vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 1 Einheit an Human-Insulin pro kg Körpergewicht und pro Tag ergibt. The amount of agent according to the invention required to maintain natural hormonal homeostasis or to achieve a state which is more closely approximated to natural hormonal homeostasis in the diabetic is of course dependent on the severity of the diabetic state. The amount to be administered also depends on the respective route of administration. Ultimately, the amount of agent to be administered and the frequency of such administration is up to the decision of the particular doctor. Since 1 mg of human proinsulin gives an activity of about 3.5 units of human insulin, a dosage range of proinsulin is generally selected which provides about 0.02 to about 5 units of human insulin per kg of body weight and per day and which preferably gives about 0.1 to about 1 unit of human insulin per kg body weight and per day.

Das erfmdungsgemässe Mittel kann parenteral verabreicht werden, beispielsweise subkutan, intramuskulär oder intravenös. Das Mittel enthält den Wirkstoff, nämlich Human-Proinsulin, zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger hierfür und gegebenenfalls auch noch zusammen mit anderen therapeutischen Bestandteilen. Die Gesamtmenge an im erfindungsgemässen Mittel vorhandenem Wirkstoff macht bevorzugt etwa 99,99 bis etwa 0,01 Gew.-% aus. Der vorhandene Träger muss mit den anderen Bestandteilen des Mittels verträglich sein und darf natürlich auch zu keiner Beeinträchtigung des Patienten führen. The agent according to the invention can be administered parenterally, for example subcutaneously, intramuscularly or intravenously. The agent contains the active ingredient, namely human proinsulin, together with a pharmaceutically acceptable carrier therefor and, if appropriate, also together with other therapeutic constituents. The total amount of active ingredient present in the composition according to the invention preferably makes up about 99.99 to about 0.01% by weight. The existing carrier must be compatible with the other components of the agent and, of course, must not impair the patient.

Erfmdungsgemässe Mittel, die sich für die parenterale Verabreichung eignen, sind am besten sterile wässrige Lösungen und/oder Suspensionen der pharmazeutisch wirksamen Bestandteile, und diese Lösungen oder Suspenionen sind vorzugsweise mit dem Blut des Empfangers isotonisch gemacht, was sich im allgemeinen unter Verwendung von Natriumchlorid, Glycerin, Clucose, Mannit, Sorbit und ähnlichen bekannten Mitteln erreichen lässt. Zusätzlich können die Mittel auch noch irgendeine Anzahl von Hilfsstoffen enthalten, wie Puffer, Konservierungsmittel, Dispergierungs-mittel, Mittel zur Förderung eines raschen Wirkungsbeginns, Mittel zur Förderung einer verlängerten Wirkungs650 677 Agents according to the invention which are suitable for parenteral administration are best sterile aqueous solutions and / or suspensions of the pharmaceutically active ingredients, and these solutions or suspensions are preferably made isotonic with the blood of the recipient, which is generally done using sodium chloride, Glycerin, clucose, mannitol, sorbitol and similar known agents can be achieved. In addition, the agents can also contain any number of auxiliaries, such as buffers, preservatives, dispersants, agents for promoting a quick onset of action, agents for promoting a prolonged action650 677

dauer oder andere bekannte Mittel. Typische Konservierungsmittel sind beispielsweise Phenol, m-Kresol oder Me-thyl-p-hydroxybenzoat. Beispiele für typische Puffer sind Natriumphosphat, Natriumacetat oder Natriumeitrat. duration or other known means. Typical preservatives are, for example, phenol, m-cresol or methyl p-hydroxybenzoate. Examples of typical buffers are sodium phosphate, sodium acetate or sodium citrate.

Ferner können auch entsprechende Mittel zur geeigneten Einstellung des pH-Werts vorhanden sein, beispielsweise Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, oder Basen, wie Natriumhydroxid. Der pH-Wert entsprechender wässriger Mittel liegt im allgemeinen zwischen etwa 2 und 8, vorzugsweise etwa 6,8 bis 8,0. Appropriate means for suitably adjusting the pH can also be present, for example acids such as hydrochloric acid or bases such as sodium hydroxide. The pH of corresponding aqueous agents is generally between about 2 and 8, preferably about 6.8 to 8.0.

Andere geeignete Zusätze sind beispielsweise zweiwertige Zinkionen, die, falls überhaupt vorhanden, im allgemeinen in einer Menge von etwa 0,2 bis 3 mg/100 Einheiten HumanProinsulin anwesend sind, ober Protaminsalze, beispielsweise in Form des Sulfats, die, falls überhaupt, im allgemeinen in einer Menge von etwa 0,5 bis 20 mg/100 Einheiten Humanproinsulin vorliegen. Other suitable additives are, for example, divalent zinc ions, which, if any, are generally present in an amount of about 0.2 to 3 mg / 100 units of human proinsulin, or protamine salts, for example in the form of the sulfate, which are generally, if at all present in an amount of about 0.5 to 20 mg / 100 units of human proinsulin.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert. The invention is explained in more detail below with the aid of examples.

Beispiel 1 example 1

Formulierung von neutralem regulärem Human-Proinsulin (40 Einheiten Human-Proinsulin pro ml) Formulation of neutral regular human proinsulin (40 units of human proinsulin per ml)

Zur Herstellung von 10 ml dieser Formulierung vermischt man Mix to make 10 ml of this formulation

Human-Proinsulin (3,5 E/mg) 114 mg (400 E) Human proinsulin (3.5 U / mg) 114 mg (400 U)

Phenol, destilliert 20 mg Phenol, 20 mg distilled

Glycerin 160 mg Glycerin 160 mg

Wasser und entweder 100%-ige Chlorwasserstoffsäure oder 10%-iges Natriumhydroxid in solcher Menge miteinander, dass sich eine Zusammensetzung mit einem Volumen von 10 ml und einem End-pH-Wert von 7,0 bis 7,8 ergibt. Water and either 100% hydrochloric acid or 10% sodium hydroxide together in such an amount that a composition with a volume of 10 ml and a final pH of 7.0 to 7.8 results.

Beispiel 2 Example 2

Formulierung von Protamin und Human-Zinkproinsulin (40 Einheiten Human-Proinsulin pro ml) Formulation of protamine and human zinc proinsulin (40 units of human proinsulin per ml)

Human-Proinsulin (3,5 E/mg) 114 mg (400 E) Phenol, destilliert 25 mg Human proinsulin (3.5 U / mg) 114 mg (400 U) phenol, distilled 25 mg

Zinkoxid 0,95 bis 3,8 mg Zinc oxide 0.95 to 3.8 mg

Glycerin 160 mg Glycerin 160 mg

Protaminsulfat 32 bis 64 mg Protamine sulfate 32 to 64 mg

Natriumphosphat, Kristalle 38 mg Sodium phosphate, crystals 38 mg

Wasser und entweder 10%-ige Chlorwasserstoffsäure oder 10%-iges Natriumhydroxid in solcher Menge miteinander, dass sich eine Zusammensetzung mit einem Volumen von 10 ml und einem End-pH-Wert von 7,1 bis 7,4 ergibt. Water and either 10% hydrochloric acid or 10% sodium hydroxide together in such an amount that a composition with a volume of 10 ml and a final pH of 7.1 to 7.4 results.

Beispiel 3 Example 3

Formulierung aus Isophanprotamin und Human-Proinsulin (40 Einheiten Human-Proinsulin pro ml) Formulation of isophane protamine and human proinsulin (40 units of human proinsulin per ml)

Human-Proinsulin (3,5 E/mg) 114 mg (400 E) m-Kresol, destilliert 16 mg Human proinsulin (3.5 U / mg) 114 mg (400 U) m-cresol, distilled 16 mg

Phenol, destilliert 6,5 mg Phenol, distilled 6.5 mg

Glycerin 160 mg Glycerin 160 mg

Protaminsulfat 9,6 bis 19,2 mg Protamine sulfate 9.6 to 19.2 mg

Natriumphosphat, Kristalle 38 mg Sodium phosphate, crystals 38 mg

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Beispiel 4 Example 4

Formulierung aus Zink-Humanproinsulin (40 Einheiten Human-Proinsulin pro ml) Zinc human proinsulin formulation (40 units of human proinsulin per ml)

Natriumacetat, wasserfrei 16 mg Sodium acetate, anhydrous 16 mg

Natriumchlorid, Granulat 70 mg Sodium chloride, granules 70 mg

Methyl-p-hydroxybenzoat 10 mg Methyl p-hydroxybenzoate 10 mg

Zinkoxid 1 bis 8 mg Zinc oxide 1 to 8 mg

Wasser und entweder 10%-ige Chlorwasserstoffsäure oder 10%-iges Natriumhydroxid in solcher Menge miteinander, dass sich eine Zusammensetzung mit einem Volumen von 10 ml und einem End-pH-Wert von 7,2 bis 7,5 ergibt. Water and either 10% hydrochloric acid or 10% sodium hydroxide together in such an amount that a composition with a volume of 10 ml and a final pH of 7.2 to 7.5 results.

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Claims

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1. A pharmaceutical agent effective against diabetes mellitus consisting of a pharmaceutically acceptable carrier and an active ingredient, characterized in that it contains human proinsulin as the active ingredient.

2. Composition according to claim 1, characterized in that it contains divalent zinc ions.

2nd

PATENT CLAIMS

3. Composition according to claim 1, characterized in that it contains protamine salt.

Diabetes mellitus is a metabolic disorder which manifests itself in the fact that the body tissue can no longer oxidize carbohydrates to the normal extent. Its most important factor is a lack of insulin. For about 60 years, diabetics have been treated with certain amounts of insulin. The insulin required for this is isolated from the pancreas of animals, generally from cattle or pigs. Both bovine insulin and swine insulin differ in structure from insulin, which is produced by the human pancreas. Recently, recombinant DNA methodology has also made it possible to produce insulin that is identical to the insulin made by the human pancreas. The use of such an insulin enables the diabetic to imitate the natural system more closely than when using the other insulins.

Regardless of this, it has long been known that administering insulin to a diabetic alone is not sufficient to restore and / or maintain the normal metabolic state. While insulin clearly affects the metabolism of carbohydrates,

However, other disorders are associated with diabetes mellitus, which depend largely or entirely on the structure and function of the blood vessels. The deficiencies leading to these disorders can rarely be completely corrected by conventional treatment with insulin.

The vascular abnormalities associated with diabetes are often referred to as complications from diabetes. They generally consist of microangiopathic changes that damage the retina and kidney. Neuropathy is another complication of diabetes that may or may not be directly or indirectly related to the observed microangiopathic changes. Examples of specific manifestations of diabetes complications include (1) eye diseases including retinopathy, cataract formation, glaucoma and extraocular muscle paralysis, (2) oral diseases including gingivitis, increased tooth decay, periodontal diseases and increased resorption of the alveolar bone, (3 ) motor, sensory and autonomic neuropathy,

(4) disease of large blood vessels,

(5) microangiopathy,

(6) Diseases of the skin including Xanthoma diabeticorum, Necrobiosis lipoidica diabetico-rum, furunculosis, mycoses and itchy skin,

(7) Diseases of the kidneys including diabetic glomerulosclerosis, arteriolar nephrosclerosis and pyelonephiritis and

(8) Problems during pregnancy, including the increase in education of large children, stillbirths, miscarriages, newborn deaths and congenital defects.

Some and possibly all diabetic complications are a result of the lack of insulin alone, so the body can no longer maintain its natural hormonal balance.