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PATENTANSPRÜCHE
1. Vorrichtung zur Messung von Konzentrationen von Stoffteilchen vermittels einer optischen, eine Lichtquelle, einen Lichtempfänger und ein Anzeigegerät enthaltenden Lichtmesseinrichtung, mit einem aus einer Indikatorsubstanz und einer die Indikatorsubstanz umschliessenden Membran bestehenden Indikatorraum (11; 21; 31; 41; 51; 81), der eine Optode bildet, dadurch gekennzeichnet, dass dem Indikatorraum (11; 21; 31; 41; 51; 81) ein mindestens ein Reagens enthaltender, durch eine Membran (14; 24) abgeschlossener Reaktionsraum (13; 23; 33; 43; 53; 73; 83) für die zu messenden Stoffteilchen (M) vorgeschaltet ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsrate für die zu messenden Teilchen (M) gering ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsrate für die zu messenden Teilchen (M) gross ist.
4. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Permeationswiderstand der den Reaktionsraum (13; 23; 33; 43; 53; 73; 83) abschliessenden Membran (14; 24) gross ist.
5. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Reagens im Reaktionsraum (13; 23; 33; 43; 53; 73; 83) gering ist.
6. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Permeationswiderstand der den Reaktionsraum (13; 23; 33; 43; 53; 73; 83) abschliessenden Membran (14; 24) gering ist.
7. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Reagens im Reaktionsraum (13; 23; 33; 43; 53; 73; 83) hoch ist.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich eine oder mehrere Kontrolloptoden (15; 25; 35; 55; 65; 75) enthält.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Optode bzw. Optoden Sicht öffnungen und/oder Permeationsöffnungen (37) aufweisen.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagens ein biologisches System ist.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Reaktions raum (13; 23; 33; 43; 53; 73; 83) als eine mit einer Membran (14; 24) abgedeckte Folie ausgebildet ist, an die das Reagens fixiert ist.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, da- durch gekennzeichnet, dass der Reaktionsraum (13; 23; 33; 43; 53; 73; 83) eine hydrophobe, das Reagens enthaltende Schicht ist.
13. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Indikatorraum (81) als Mikrooptode oder als Nanooptode ausgebildet ist (Fig. 8).
14. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die den Reaktionsraum (13; 23; 33; 43; 53; 73; 83) abschliessende Membran (14; 24) Mittel zum selektiven Transport von zu messenden Teilchen (M) aufweist.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Optode bzw. Optoden und der Reaktionsraum auf dem Ende eines Lichtleiters (68, 69; 78) angeordnet sind.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, da durch gekennzeichnet, dass im Reaktionsraum (13; 23; 33; 43;
53; 73; 83) wenigstens ein zusätzliches Reagens angeordnet ist, das mit wenigstens einer störenden Teilchenart reagiert, um diese aus dem Reaktionsraum zu entfernen.
17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass im Reaktionsraum (13; 23; 33; 43; 53; 73; 83) wenigstens ein zusätzliches Reagens angeordnet ist, das die Konzentration der zu messenden Teilchen im Re aktionsraum verändert.
18. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dem Reaktionsraum (23) wenigstens ein weiterer Re aktionsraum (22) vorgeschaltet ist (Fig. 2).
19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass optische Mittel (24) zwischen die Reaktionsräume (22, 23) geschaltet sind.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, da durch gekennzeichnet, dass die Optode bzw. Optoden und/ oder die Reaktionsräume (33) gefenstert sind.
21. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Reaktionsraum (60) ringförmig ist (Fig. 6).
22. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Reaktionsräume (73, 73', 73") ne beneinander angeordnet sind, um eine mehrflächige Reak tionsoptode zu bilden.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, da durch gekennzeichnet, dass der Reaktionsraum (43; 60; 73) die die Optode (41; 65; 75) teilweise überdeckt.
24. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, dass der Reaktionsraum (53) Zuleitungen (58, 59) aufweist.
25. Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeich net, dass Optoden oder Reaktionsräume als optische Mittel ausgebildet sind.
26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 25, da durch gekennzeichnet, dass der Reaktionsraum ein solches
Reagens oder solche Reagenzien enthält, dass die Reaktion kontinuierlich abläuft.
27. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeich net, dass weitere Mittel unterschiedlicher Selektivität zum
Transport von mehreren, an der Reaktion beteiligten
Teilchenarten vorgesehen sind.
28. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeich net dass die Folie und die die Folie abdeckende Membran ein stückig ausgebildet sind.
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Messung von
Konzentrationen von Stoffteilchen vermittels einer optischen, eine Lichtquelle, einen Lichtempfänger und ein Anzeigegerät enthaltenden Lichtmesseinrichtung, mit einem aus einer Indi katorsubstanz und einer die Indikatorsubstanz umschliessen den Membran bestehenden Indikatorraum, der eine Optode bildet.
Es ist bereits vorgeschlagen worden, Vorrichtungen dieser
Art mehrstufig wirkend auszubilden und mit den zu messen den Stoffteilchen reagierende Substanzen dem Indikatorraum beizugeben.
Die Aufgabe der Erfindung besteht nun darin, eine mög lichst weitgehende Trennung von Reagentien und Indikator zu verwirklichen, da damit besondere Vorteile erzielbar sind und weitere Anwendungen der Vorrichtung möglich werden.
Zur Lösung dieser Aufgabe wird nach der Erfindung dem
Indikatorraum ein mindestens ein Reagens enthaltender, durch eine Membran abgeschlossener Reaktionsraum für die zu messenden Stoffteilchen vorgeschaltet.
Dieser Reaktionsraum, der, wie der Indikatorraum selbst, das Reagens durch eine Membran gegen das Messobjekt ab sperrt, wobei die Membran durch Permeation von den zu messenden Teilchen überwunden wird, gestattet die Trennung von Messobjekt, Indikatorsubstanz, Reagens und Reaktions produkten.
Die erfindungsgemässe Vorrichtung lässt sich deshalb dort mit grossem Vorteil anwenden, wo eine bestimmte Teil chenart nicht direkt messbar ist, wo es aber Reaktionen gibt,
die aus den zu messenden Teilchen solche Teilchen erzeugen, die messbar sind. Wird ein solches Reaktionssystem im Reaktionsraum angeordnet, wird dort aus den zu messenden Teilchen die messbare Teilchenart entstehen.
Durch die Einschliessung des Reaktionssystems in den abgeschlossenen Reaktionsraum lassen sich jetzt eine grosse Anzahl von Reaktionen anwenden, die sonst nicht frei im Messobjekt auftreten dürfen, z.B. weil toxische oder katalytische Substanzen auftreten, die aber eine Replacierung der einen (zu messenden) durch die andere (messbare) Teilchenart gestatten.
Durch diese messtechnische Replacierung von einer Teilchenart durch eine andere werden in der Regel weder stoffliche Störungen noch Störungen auf die optische Messung ausgeübt, andererseits sind fast unbeschränkt viele Teilchenarten, selbst unter physiologischen Bedingungen, messtechnisch erfassbar geworden. Ein besonderer Vorteil besteht darin, dass nicht nur einmalige Messungen (im sogenannten Endstopp-Verfahren, bei dem die Reaktion bis zum Aufbruch des Reagens abläuft), sondern auch kontinuierliche Messungen im Fliessgleichgewicht möglich sind, weil das Reaktionssystem ohne Rücksicht auf das Messobjekt so ausgebildet werden kann.
Gerade die Stetigkeit der Messung erlaubt die Verwendung der Anordnung zur Prozessüberwachung, insbesondere auch dort, wo es bisher keine Methoden zur direkten Konzentrationsmessung gab. Beispielsweise ist die Überwachung der Alkoholerzeugung im industriellen Prozess oder die Überwachung von Glucose im biologischen Prozess bisher nicht direkt möglich gewesen.
Aufgrund der starken Störanfälligkeit biologischer Objekte durch Konzentrationsänderungen der in diesen wirkenden Stoffe ist die Vorrichtung nach der Erfindung insbesondere auch hier mit Vorteil anwendbar.
Da der Reaktionsraum immer zusammen mit mindestens der die Reaktion messenden Messoptode verwendet wird, ist es zweckmässig, diese Kombination als Reaktionsoptode zu bezeichnen.
Durch besondere Ausbildungen des Reaktionsraumes ist es möglich, unterschiedliche Messprobleme zu lösen. Hierbei kann die Vorrichtung an das jeweils vorliegende Messobjekt angepasst werden: Ist die Reaktionsrate für die zu messenden Teilchen im Reaktionsraum gering, dann wird das im Mess objekt etwa vorliegende Fliessgleichgewicht durch den Reaktionsraum nicht gestört, die Messung zeigt den jeweils aktuel len Zustand an, beispielsweise die aktuelle Sauerstoffkonzen tration.
Ist andererseits die Reaktionsrate für die zu messenden
Teilchen gross, dann entsteht eine deutliche Senke für die zu messenden Teilchen, so dass beispielsweise aus der Messung des Senkenprofils die Grösse des Teilchenstromes bestimmt werden kann.
Die Grösse der Reaktionsrate lässt sich leicht durch Wahl des jeweils optimalen Permeationswiderstandes (Membran dicke, Membranart) und der optimalen Konzentration des
Reagens auf ein gemessenes Gewebe oder sonstige Biosysteme einstellen. Ist beispielsweise der Permeationswiderstand der
Membran gering - bei dünnen oder grossporigen Membranen oder solchen mit grosser spezifischer Oberfläche - oder ist die
Konzentration des Reaktions gross oder aber beide Eigen schaften liegen vor, dann ist auch die Reaktionsrate gross.
Soll die Reaktionsrate klein sein, dann sind Membranen mit grossem Permeationswiderstand und Reagentien in kleinen
Konzentrationen zu wählen. Was im einzelnen von Vorteil ist, kannjeweils nur im Hinblick auf die Eigenschaften des
Messobjektes festgelegt werden. Die Ausführung ist dem
Fachmann wohlbekannt.
Vorzugsweise kann die Vorrichtung zusätzlich eine oder mehrere Kontrolloptoden enthalten. Häufig ist es nämlich von Interesse, wenn gleichzeitig die zu messenden Teilchen im Reaktionsraum bestimmt und weitere, für die Messung wichtige Parameter innerhalb oder ausserhalb des Reaktionsrau mes überwacht werden.
Beispielsweise ist häufig die Temperatur oder der Binnendruck oder die Konzentration der zu messenden oder anderer Teilchen für einen biologischen Ablauf von Bedeutung. Die Überwachung dieser Parameter durch Optoden ist deshalb sehr vorteilhaft, weil diese die störungsfreie optische Messung ermöglichen.
Um zu vermeiden, dass für diese optische Messung störende Abschattungen auftreten, oder dass der Permeationsstrom gestört wird, können die Optoden oder der Reaktionsraum Sichtöffnungen und/oder Permeationsöffnungen aufweisen.
Eine besonders starke Anwendungserweiterung ist möglich, wenn das Reagens ein biologisches System ist. Solche Systeme - beispielsweise Enzyme, Enzymketten, Zellextrakte, Zellpartikel, Zel!en, Viren, Bakterien, Pilze, Mikroorganismen oder Antikörper - haben häufig eine hohe Spezifität für Stoffteilchen oder andere chemische oder physikalische Parameter, so dass hierdurch eine hohe Messelektivität erreichbar ist. Die Präparation solcher Reaktionsoptoden kann ohne grosse Schwierigkeiten erfolgen.
Um die Messzeitkonstanten möglichst gering zu halten, kann der Reaktionsraum zweckmässig möglichst dünn gemacht werden, beispielsweise kann der Reaktionsraum als Folie ausgebildet sein, an die das Reagens fixiert ist. Methoden zur Fixierung sind in der Technik bekannt. Falls die Fixierung eines Reagens an eine Folie nicht möglich ist, können auch hydrophobe Schichten, die das Reagens festhalten, auf eine Optode aufgebracht werden. Die Optode dient dabei also als Träger für solche nicht eigenstabile Schichten.
In einer anderen Ausführungsform kann der Indikatorraum als Nano- oder Mikrooptode (Durchmesser < 10 llm) ausgebildet sein. Solche Kleinstoptoden lassen sich physikochemisch gut herstellen und können zur Lösung einer Reihe von Messproblemen herangezogen werden. Meist werden die Kleinstoptoden den Trägerflüssigkeiten - etwa Blut - oder dem Gewebe zugegeben und dort selbst auch ausgemessen.
Zweckmässig kann in diesem Fall der Reaktionsraum aus einer die Optode einschliessenden Membran bestehen, weil in flüssigkeitsgefüllten Reaktionsräumen mit eingeschlossenen Kleinstoptoden die Symmetrie nicht gut eingehalten werden kann, andererseits die Dicke des Reaktionsraumes das Signal mitbestimmt.
Für den Fall, dass im Reaktionsraum die Messung störende Teilchen bei einer der dort ablaufenden Reaktionen entstehen, können vorteilhaft weitere Reagentien im Reaktionsraum angeordnet werden, die solche störenden Teilchen aus dem Reaktionsraum entfernen. Solche Reagentien können chemischer oder physikalischer Art sein.
Andererseits können auch weitere Reagentien vorgesehen sein, die die Konzentration der zu messenden Teilchen im Reaktionsraum verändern. Dadurch kann das Signal der Lichtmesseinrichtung in Einzelfällen beträchtlich erhöht werden.
Dem Reaktionsraum können ferner noch zusätzliche Reaktionsräume vorgeschaltet sein. Dadurch wird es möglich, mehrstufige Reaktionen durchzuführen, bei denen die Reaktionspartner untereinander nicht kompatibel sind, die Reaktionsprodukte auf dem Permeationswege in die jeweils benachbarten Reaktionsräume aber eindringen und weiterreagieren können.
Sollen die Reaktionen selbst überwacht werden, können zweckmässig dort Thermoelemente, Messelektroden oder dergleichen oder auch Kontrolloptoden angeordnet sein und es können auch Filter zur optischen Signaltrennung zwischen Reaktionsräumen und/oder Optoden geschaltet sein.
Optoden oder Reaktionsräume können dazu zusätzlich gefenstert sein, so dass Licht verschiedener Wellenlänge zur Analyse der Optoden nebeneinander verwendet werden kann, und sie können selbst als optische Filter ausgebildet sein.
Besonders günstige Bauformen für Reaktionsräume sind ringförmige Anordnungen, mehrflächige Anordnungen, Anordnungen auf Lichtleitern, insbesondere auf aufgespaltenen Lichtleitern, wenn der Reaktionsraum und die Messoptode auf einem, eine Kontrolloptode auf einem zweiten Lichtleiterende angeordnet ist.
In den Zeichnungen, anhand derer Ausführungsbeispiele der Erfindung erläutert werden, zeigen:
Fig. 1 eine erste Ausführungsform der Vorrichtung nach der Erfindung und
Fig. 1A in grösserem Massstab einen Ausschnitt aus Fig. 1,
Fig. 2 eine mehrstufige Vorrichtung,
Fig. 3 einen Ausschnitt einer gefensterten Reaktionsoptode,
Fig. 4 eine freie Reaktionsoptode und
Fig. 4A eine graphische Darstellung von Konzentrationen, die mit Reaktionsoptoden gemäss Fig. 4 gemessen werden,
Fig. 5 eine Reaktionsoptode mit Zuleitungen,
Fig. 5A eine graphische Darstellung von Teilchenkonzentrationen in der Reaktionsoptode von Fig. 5, Fig. 5B graphisch ein Kennlinienfeld für die Reaktionsoptode von Fig. 5,
Fig. 6 Reaktionsoptoden auf Lichtleitern,
Fig. 7 eine mehrflächige Reaktionsoptode und
Fig. 8 eine Mikro- bzw. Nanooptode.
In Fig. list eine Messoptode 11 auf einer Glasplatte 10 angeordnet und von einem Reaktionsraum 13 überdeckt und abgeschlossen. Ausserhalb des Reaktionsraumes ist eine Kontrolloptode 15 angeordnet. Ein Teilchenstrom M von zu messenden Teilchen tritt aus dem Messobjekt MO durch die Membran 14 des Reaktionsraumes 13 in den Reaktionsraum ein, reagiert dort, und das Reaktionsprodukt tritt über die rückwärtige Membran des Reaktionsraumes durch die Membran der Optode 11 in den Indikatorraum ein und ändert die optischen Eigenschaften der Indikatorsubstanz, wobei diese änderung durch einen Lichtstrahl L der (nicht gezeichneten) Lichtmesseinrichtung gemessen wird.
Der Betrieb der Vorrichtung, die sich auf alle permeationsfähigen Teilchenarten anwenden lässt, bei denen durch Reaktionen charakteristische Teilchenarten entstehen oder verschwinden, wird in einem ersten Beispiel anhand des Systems Glucose-Glucoseoxydase erläutert.
Für Glucose selbst gibt es zur Zeit keinen optischen Indikator, der eine direkte optische Konzentrationsmessung ermöglicht. Da Glucose aber mit Sauerstoff umgesetzt werden kann, ist die Bestimmung der Glucosekonzentration über die Messung der Sauerstoffkonzentration möglich. Die Glucose wird also für die Messung durch Sauerstoff replaciert. Sauerstoff selbst kann mit Fluoreszenzoptoden bestimmt werden.
Mit der Glucoseoxydase GOD und dem Koenzym FAD ergeben sich die folgenden Reaktionsgleichungen:
EMI3.1
<tb> Glucose <SEP> + <SEP> FAD <SEP> GOD <SEP> Gluconsäure-8-Lacton <SEP> + <SEP> FADH2 <SEP>
<tb> 02+FADH2 <SEP> <SEP> <SEP> FAD+H202
<tb> Glucose <SEP> + <SEP> O2 <SEP> GOD <SEP> Gluconsäure-6-Lacton <SEP> + <SEP> H202
<tb> H202 <SEP> se <SEP> Catalake <SEP> H2O <SEP> + <SEP> 112 <SEP> 2 <SEP>
<tb>
Zu Fig. 1A, einer Vergrösserung im Ausschnitt aus Fig. 1, ergibt sich dabei die folgende Zuordnung:
:
M = Strom der zu messenden Teilchen
P = sämtliche Reaktionspartner
G= von der 02-Optode 11 gemessene Teilchen
Der Teilchenstrom der zu messenden Teilchen M kommt zur Reaktion P mit dem im Reaktionsraum 13 angeordneten Reagens R, bestehend aus GOD + FAD + FADH2 + H202 und Catalase. Der Sauerstoff G wird gemessen und ist - gegenüber der Sauerstoffkonzentration im Messobjekt MO um 1/202 pro Glucosemolekül verringert.
Das Messobjekt MO ist also, da alle Reaktionspartner ohnehin bei der Glucoseveratmung entstehen würden, hinsichtlich der Teilchenarten ungestört, jedoch ist eine charakte ristische Menge Sauerstoff am Ort des Reaktionsraumes 13 verbraucht, was durch die Optode 11 verlustlos bestimmbar ist. Damit ist eine kontinuierliche, verlustlose Messung unter physiologischen Bedingungen möglich.
Voraussetzung dieser Messung ist die Kenntnis der Sauerstoffkonzentration im Messobjekt MO, die durch die Kontrolloptode 15 gemessen wird: Wie die Gleichungen zeigen, ist die Sauerstoffdifferenz ein Mass für die verbrauchte Glucose.
Messtechnisch wird ein möglichst grosser Gradient im Reaktionsraum 13 angestrebt. Die Intensitätsgleichungen für dieses System lauten wie folgt:
Für die Fluoreszenzlichtanalyse von Sauerstoff mit beispielsweise Pyrenbuttersäure als Indikator (nach VAU GHAN und WEBER) gilt nach STERN und VOLMER
EMI3.2
mit 1o' = rel. Fluoreszenzintensität ohne Sauerstoff
I' = rel. Fluoreszenzintensität bei der jeweiligen Sauerstoffkonzentration [02] = Sauerstoffkonzentration
K' = Faktor, proportional der Quenchkonstante
Daraus lässt sich die Sauerstoffkonzentration bestimmen zu
EMI3.3
Diese Gleichungen gelten für die Kontrolloptode 15.
Für die Reaktionsoptode mit dem Reaktionssystem P gilt:
EMI3.4
wobei K die Quenchkonstante für die Messoptode 11 und K* eine Reaktionskonstante für das stoffliche Reaktionssystem darstellen.
Damit ergibt sich
EMI3.5
<tb> <SEP> I <SEP> I <SEP> + <SEP> 1+ <SEP> IxKt <SEP> ]- <SEP> K* <SEP> [Glucose]
<tb> Daraus entsteht für die Glucosekonzentration:
EMI4.1
<tb> - <SEP> [Glucosej <SEP> = <SEP> f-0-1-K <SEP> 3 <SEP> /K*
<tb> 1 <SEP> I'K'
<tb> <SEP> (Io'I') <SEP> Io
<tb> [Glucose] <SEP> = <SEP> f <SEP> 1 <SEP> +K <SEP> lxK' <SEP> -I <SEP> } <SEP> /K* <SEP> (1)
<tb>
Dabei entsprechen die gestrichenen Grössen der Optode 15, die ungestrichenen Grössen der Optode 11, die mit Stern versehene Grösse dem Reaktionssystem im Reaktionsraum.
Die Konstanten K, K', K* sind experimentell bestimmbar.
Als Reagentien können nicht nur anorganische oder organische, wie in dem oben beschriebenen Beispiele, verwendet werden, sondern der Reaktionsraum kann auch mit biologischen Systemen gefüllt sein. Solche Systeme, wie beispielsweise lebende Zellen, Zellpartikel, Pilze, Bakterien, Viren, Antikörper und dergleichen, haben meist eine hohe Reaktionsselektivität, nehmen also aus einem Partikelgemisch nur eine bestimmte Art heraus, ohne andere Partikelarten anzugreifen.
Dadurch kann auch ohne vorausgegangene Präparation, vor allem aber in lebendem Gewebe unter physiologischen Bedingungen, gemessen werden.
Eine weitere Erhöhung der Selektivität lässt sich durch mit Carriern versehene Membranen erreichen. Solche Membranen weisen einen für eine bestimmte Teilchenart geeigneten Carrier - beispielsweise Valinomycin zum Transport von K+-Ionen - auf. Dadurch kann die den Reaktionsraum abschliessende Membran für andere Teilchen als die zu messenden, hier K+-Ionen, sehr viel weniger durchlässig gemacht werden, und eine hohe Selektivität des Reaktionsraumes für K+-Ionen ist die Folge.
Sind mehrere Teilchenarten zum Ablauf einer Reaktion erforderlich, wie beispielsweise bei der Umsetzung von Glucose die Glucose und der Sauerstoff, kann es von Vorteil sein, wenn selektive Durchlässigkeiten erzeugt werden, die für jedes der Teilchen für sich spezifisch sind. Dazu können jeweils in bekannter Weise der Vernetzungsgrad der Membransubstanz, deren Löslichkeit für die betreffende Teilchenart, die Porengrösse der Membran und die Aufladung der Membranporen durch elektrische Ladungen an das zu transportierende Teilchen angepasst werden. Die Porengrösse der Membran ist durch mechanische Streckung oder chemische Ätzung veränderbar.
Reaktionssysteme wie das oben beschriebene aus Glucose-Glucoseoxydase können als einstufig bezeichnet werden.
Ein anderes einstufiges System ist die Messung von CO2 durch Protonen nach der folgenden Gleichung: H20 + CO2 [H2CO3] 2 [H+] + [HCO3-]
Hier würde sich für Fig. 1A die folgende Zuordnung ergeben: M = CO2 P=H2C03, H3+, HCO3 G= H+, von H+-Optode 11 gemessen
In einem weiteren einstufigen Reaktionssystem zur Messung von Alkohol kann Alkohol durch Sauerstoff replaciert werden. Unter Verwendung von Alkoholdehydrogenase ergibt sich.
EMI4.2
<tb>
CH3-CH2-OH <SEP> + <SEP> NAD <SEP> Alkoholdehydrogenase <SEP> CH3-C <SEP> Z <SEP> +NADH2
<tb> NADH2 <SEP> + <SEP> 2 <SEP> NADH-Oxydase <SEP> ? <SEP> NAD <SEP> + <SEP> H202
<tb> <SEP> Catalase <SEP> H20 <SEP> +1/202
<tb> H202
<tb>
Es besteht also zu Fig. 1A die Zuordnung M=C2H5OH
P= C2H5OH, NAD, C2H40, NADH2, Alkoholdehydrogenase, NADH-Oxydase, H202, 02, Catalase
G = 02, von 02-Optode 11 gemessen und es wird ein um 1/202 pro Glucosemolekül verringerter Sauerstoffstrom gemessen.
Diese Reaktion käme nach einiger Zeit zum Stillstand, weil der entstehende Aldehyd die Alkoholdehydrogenase angreift. Die Konzentrationsbestimmung könnte also nur aus der Steigung der Intensitätsfunktion bestimmt werden (was als Endstopp -Verfahren bekannt ist). Soll jedoch im Fliessgleichgewicht (steady state) gemessen werden, kann durch Zugabe von Aldehyddehydrogenase eine zur Transformation parallele Reaktion nach der folgenden Gleichung eingeleitet werden:
EMI4.3
<tb> <SEP> / <SEP> <SEP> + <SEP> 1/2 <SEP> 02 <SEP> Aldehyddehydrogenase <SEP> t
<tb> CH3-C <SEP> +/202 <SEP> CH3-C <SEP> ·
<tb> <SEP> (NAD) <SEP> OH
<tb> Die Essigsäure diffundiert in das Messobjekt zurück. Ausserdem wird die Konzentration von 02 verringert, und dadurch steigt das Messignal.
Für den Fall, dass das Messignal sehr schwach ist, kann die Konzentration im Reaktionsraum dadurch erhöht werden, dass dort Substanzen mit erhöhter Löslichkeit für die zu messenden Teilchen angeordnet sind. Soll beispielsweise eine schwache Sauerstoffkonzentration gemessen werden, kann der Reaktionsraum mit Fluorocarbonen gefüllt sein, die die Konzentration um bis zu zwei Grössenordnungen im Reaktionsraum gegenüber dem Messobjekt erhöhen können. Auch Öi Öl hat eine höhere Löslichkeit für Sauerstoff als Wasser und kann deshalb entsprechend verwendet werden.
Es sind jedoch nicht nur parallel laufende Reaktionen im gleichen Reaktionsraum - im Beispiel zur Entfernung störender Teilchen eingesetzt - verwendbar, sondern auch seriell ablaufende Reaktionen. Dazu müssen mehrere Reaktionsräume hintereinandergeschaltet und durch permeierbare Membranen getrennt werden. Dadurch können Wechselwirkungen der Reagentien oder Störungen der Teilchen vermieden werden.
In Fig. 2, einem vergrösserten Ausschnitt einer Anordnung mit hintereinandergeschalteten Reaktionsräumen 22, 23, die durch Membranen 26,24,27 abgeschlossen bzw. voneinander getrennt sind, tritt ein Strom von zu messenden Teilchen M in den ersten Reaktionsraum 22 ein. Zusammen mit einem Reagens oder Reagentiensystem R' läuft eine Reaktion P' ab, aus der eine Teilchenart G' abgespalten wird, die nach Permeation der Membran 24 in den Reaktionsraum 23 gelangt. Hier tritt sie mit dem Reagens R zu einer Reaktion P zusammen, aus der eine Teilchenart G entsteht, die durch die Optode 21 gemessen wird.
Ein Beispiel für ein solches System ist die Umwandlung von Plasmacholesterin unter Sauerstoffverbrauch:
EMI5.1
<tb> Fettsäure <SEP> Cholesterinesterase <SEP> Cholesterin <SEP> +
<tb> cholesterinester <SEP> > <SEP> Fettsäure
<tb> Cholesterin <SEP> + <SEP> FAD <SEP> Cholesterinoxydase <SEP> Ox.
<SEP> Cholesterin
<tb> <SEP> > <SEP> + <SEP> FADH2 <SEP>
<tb> FADH2 <SEP> + <SEP> 02 <SEP> Cholesterinoxydase <SEP> FAD <SEP> + <SEP> H202
<tb> H202 <SEP> Catalase <SEP> H2O+ <SEP> 1/202 <SEP>
<tb>
Als Zuordnung ergibt sich also zu Fig. 2:
M = Plasmacholesterin (= Fettsäurecholesterinester)
P' = Fettsäurecholesterinester, Cholesterin, Cholesterinesterase, Fettsäure
G' = freies Cholesterin = = Cholesterinesterase
R = Cholesterinoxydase
P = Cholesterin, FAD, FADH2, 2, H202, Catalase, oxydiertes Cholesterin
G = Sauerstoff, von O2-Optode gemessen, um 1/202 gegenüber dem Messobjekt verringert.
Es können jedoch auch noch weitere Reaktionsräume zu einer Kolonne zusammengeschaltet werden, wenn die Replacierung von einem zu messenden Teilchen durch ein messbares Teilchen dies erfordert.
Ein dreistufiges System nach dem folgenden Beispiel gestattet die Umwandlung von Stärke als zu messende Teilchenart in Sauerstoff als messbare Teilchenart:
EMI5.2
<tb> Stärke <SEP> a-Amylase <SEP> Dextrin
<tb> Dextrin <SEP> Glucoamylase <SEP> Glucose
<tb> Glucose <SEP> Glucoseoxydase <SEP> Gluconsäure
<tb>
Auch hierbei ergibt sich ein Sauerstoffverbrauch von l/2 02 pro Molekül entstehender Glucose, der durch die Messoptode und die zugeordnete Kontrolloptode bestimmt wird.
Als Zuordnung zu Fig. 2 ergibt sich in verkürzter Form: M = Stärke
R' = a-Amylase
G' = Dextrin
R = Glucoamylase
G = Glucose
Daraus ergibt sich im - nicht gezeichneten - dritten Reaktionsraum mit Glucoseoxydase als Reagens ein Sauerstoffverbrauch, der wiederum mit einer 02-Optode entsprechend Fig.
1A gemessen werden kann.
Wenn die verschiedenen Reaktionsräume mit verschiedenfarbigen Indikatoren überwacht werden, können anstelle der Membranen 24,27... optische Mittel, wie Filter, Spiegel und gegebenenfalls weitere Kontrolloptoden 25 vorgesehen sein. Werden dabei reflektierende Schichten verwendet, ist es von Vorteil, wenn die Optoden oder die Reaktionsräume ge fenstert sind.
Eine Anordnung dieser Art zeigt Fig. 3. Messlicht L einer ersten Farbe analysiert eine erste Optode 35, die mit Fenstern
37 zur Durchsicht und zum Kontakt der zu messenden Teilchen mit dem Reaktionsraum 33 versehen ist. Zweckmässig ist die Optode 35 auf der an den Reaktionsraum 33 angrenzenden Rückseite mit einer reflektierenden und die Permea tion hindernden Metallschicht versehen. Die Optode 35 ist also geeignet, den vorderen Raum, das Messobjekt, zu überwachen. Messlicht L' einer zweiten Farbe, die an eine zweite Optode 31 angepasst ist, durchstrahlt die Öffnungen 37 und den Reaktionsraum 33 und wird ebenfalls an einer metallischen Schicht auf der Rückseite der Optode 31 reflektiert.
Die Trennung der Lichtkomponenten bereitet keine Schwierigkeiten, so dass der Reaktionsraum, dass Messobjekt und bei Bedarf durch eine im Reaktionsraum 33 angeordnete weitere Kon trolloptode 35' die Temperatur oder andere Parameter überwachbar sind.
Zu Zwecken der Implantation können Anordnungen nach Fig. 4 Verwendung finden. Hier ist die Optode 41 nur teilweise vom Reaktionsraum 43 überdeckt. Der Teil 48 aus Reaktionsraum und Optode ist die Reaktionsoptode, der Teil 49 die Kontrolloptode.
Mit solchen freien Reaktions- und Kontrolloptoden können beispielsweise Diffusionsprofile nach Fig. 4A ausgemessen werden: Wird durch niedrige Konzentration in der Reaktionsoptode und hohen Permeationswiderstand der Membran die Reaktionsrate klein gehalten, kann an den Orten S1, S2 eines (ausgedehnten) Messobjektes MO die Konzentration von Teilchen optisch vermessen werden, ohne dass Störungen der Teilchenkonzentration auftreten. Ist am Ort S3 eine Reaktionsoptode mit hoher Reaktionsrate angeordnet, die mit einer Membran von geringem Permeationswiderstand und hoher Konzentration des Reagens versehen ist, dann stellt diese Reaktionsoptode eine merkliche Senke für die zu messenden Teilchen dar und es stellt sich ein bestimmtes Diffusionsprofil Cx ein, das somit ausgemessen und daraus beispielsweise die Grösse des Diffusionsstromes bestimmt werden kann.
Fig. 5 zeigt einen von Optoden 51 und 55 eingeschlossenen Reaktionsraum 53, der mit Zuleitungen 58, 59 versehen ist. Damit lassen sich entweder Enzymaktivitäten im Nullverfahren oder direkt bestimmen: Die Konzentration eines Stromes von zu messenden Teilchen wird unter den üblichen Diffusionsbedingungen über den Reaktionsraum hin abnehmen und bildet eine cosh-Funktion CK = f(S)y Fig. 5A, für kleine Konzentrationen etwa die Kurve A, für grosse Konzentrationen etwa die Kurve B. Die Optoden messen diese Konzentrationen entweder unmittelbar, und daraus lässt sich die Differenz AC der Konzentrationen direkt messen, oder die Konzentrationen des durchfliessenden Reagens wird solange ge ändert, bis beide Optoden eine vorbestimmte, etwa leicht messbare Differenz zeigen.
Damit lässt sich ein günstiger Arbeitspunkt im Kennlinienfeld, Fig. 5B, bestimmen, das aus der Gleichung (1) entsteht, wenn die Konzentration C des Reagens als Parameter verändert wird.
Sollen etwa Diffusionsprofile in Flüssigkeiten ausgemessen werden, ist es vorteilhaft, wenn die Reaktionsoptoden auf Lichtleiterenden angeordnet werden. In Fig. 6 ist ein Lichtleiter 67 in zwei Enden 68, 69 aufgespaIten. Eine kreisförmige Optode ist von einem ringförmigen Reaktionsraum überdeckt. Dadurch entsteht eine ringförmige Reaktionsoptode 60 mit einer kreisförmigen Kontrolloptode 65 oder eine ringförmige Kontrolloptode 65' mit einer kreisförmigen Reaktionsoptode 60'.
In Fig. 7 sind mehrere Reaktionsoptoden mehrflächig nebeneinander angeordnet. Ist 78 das Lichtleiterende und ist 75 die Kontrolloptode, kann durch Überdeckung mit Reaktionsräumen 73,73' und 73" eine mehrflächige Reaktionsoptode gebildet werden, mit der verschiedene Teilchenfraktionen überwachbar sind.
Wenn kleine Messzeitkonstanten erreicht werden sollen, werden zweckmässigerweise dünne Folien als Reaktionsräume vorgesehen, an die die Reagentien fixiert sind, und diese mit Membranen abgedeckt. Besonders kleine Einstellzeiten sind erreichbar, wenn der Reaktionsraum und die Folie einstückig ausgebildet sind. Dazu kann zum Beispiel die Folienoberfläche durch eine chemische Reaktion in eine membranartige Schicht umgewandelt und so der Reaktionsraum, die Folie, abgedichtet werden.
Mikrooptoden, beziehungsweise Nanooptoden, die mittels bekannter physikochemischer Verfahren herstellbar sind, erhalten durch Umschliessung einen Reaktionsraum. Sie bestehen, wie in Fig. 8 dargestellt, aus einem Indikatorraum 81 mit einer Indikatorsubstanz I, der von einem Reaktionsraum 83 umgeben und von einer Membran 84 umschlossen ist. Oft ist es zweckmässig, die Membran 87 des Indikatorraumes und die die Membran 84 des Reaktionsraumes zusammenfallen zu lassen und das Reagens in dieser Folie einzuschliessen. Der Zutritt erfolgt durch Permeation der zu messenden Teilchen in die Membran und der in der Membran entstandenen Teilchen in den Indikatorraum 81.
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PATENT CLAIMS
1. Device for measuring concentrations of substance particles by means of an optical light measuring device containing a light source, a light receiver and a display device, with an indicator space consisting of an indicator substance and a membrane enclosing the indicator substance (11; 21; 31; 41; 51; 81) , which forms an optode, characterized in that the indicator space (11; 21; 31; 41; 51; 81) has a reaction space (13; 23; 33; 43; 43) which contains at least one reagent and is closed off by a membrane (14; 24). 53; 73; 83) for the substance particles (M) to be measured.
2. Device according to claim 1, characterized in that the reaction rate for the particles to be measured (M) is low.
3. Device according to claim 1, characterized in that the reaction rate for the particles to be measured (M) is large.
4. The device according to claim 2, characterized in that the permeation resistance of the reaction chamber (13; 23; 33; 43; 53; 73; 83) closing membrane (14; 24) is large.
5. The device according to claim 2, characterized in that the concentration of the reagent in the reaction space (13; 23; 33; 43; 53; 73; 83) is low.
6. The device according to claim 3, characterized in that the permeation resistance of the membrane (14; 24) closing the reaction space (13; 23; 33; 43; 53; 73; 83) is low.
7. The device according to claim 3, characterized in that the concentration of the reagent in the reaction space (13; 23; 33; 43; 53; 73; 83) is high.
8. Device according to one of claims 1 to 7, characterized in that it additionally contains one or more control optodes (15; 25; 35; 55; 65; 75).
9. Device according to one of claims 1 to 8, characterized in that the optode or optodes have viewing openings and / or permeation openings (37).
10. Device according to one of claims 1 to 9, characterized in that the reagent is a biological system.
11. The device according to one of claims 1 to 10, characterized in that the reaction space (13; 23; 33; 43; 53; 73; 83) is designed as a with a membrane (14; 24) covered film to which the reagent is fixed.
12. Device according to one of claims 1 to 11, characterized in that the reaction space (13; 23; 33; 43; 53; 73; 83) is a hydrophobic layer containing the reagent.
13. The apparatus according to claim 1, characterized in that the indicator space (81) is designed as a micro optode or as a nano optode (Fig. 8).
14. The apparatus according to claim 1, characterized in that the membrane (14; 24) which closes off the reaction space (13; 23; 33; 43; 53; 73; 83) has means for the selective transport of particles (M) to be measured.
15. Device according to one of claims 1 to 14, characterized in that the optode or optodes and the reaction space are arranged on the end of an optical fiber (68, 69; 78).
16. Device according to one of claims 1 to 15, characterized in that in the reaction chamber (13; 23; 33; 43;
53; 73; 83) at least one additional reagent is arranged, which reacts with at least one interfering particle type in order to remove it from the reaction space.
17. Device according to one of claims 1 to 16, characterized in that in the reaction space (13; 23; 33; 43; 53; 73; 83) is arranged at least one additional reagent which changes the concentration of the particles to be measured in the reaction space .
18. The apparatus according to claim 1, characterized in that the reaction space (23) is connected upstream of at least one further re action space (22) (Fig. 2).
19. The apparatus according to claim 18, characterized in that optical means (24) are connected between the reaction spaces (22, 23).
20. Device according to one of claims 1 to 19, characterized in that the optode or optodes and / or the reaction spaces (33) are windowed.
21. The apparatus according to claim 1, characterized in that the reaction space (60) is annular (Fig. 6).
22. The apparatus of claim 1 or 8, characterized in that a plurality of reaction spaces (73, 73 ', 73 ") are arranged next to each other to form a multi-surface reaction optode.
23. Device according to one of claims 1 to 22, characterized in that the reaction space (43; 60; 73) which partially covers the optode (41; 65; 75).
24. The device according to claim 1, characterized in that the reaction space (53) has feed lines (58, 59).
25. The device according to claim 19, characterized in that optodes or reaction spaces are designed as optical means.
26. Device according to one of claims 1 to 25, characterized in that the reaction space is such
Contains reagent or such reagents that the reaction proceeds continuously.
27. The apparatus according to claim 14, characterized in that further means of different selectivity for
Transport of several involved in the reaction
Particle types are provided.
28. The apparatus according to claim 11, characterized in that the film and the membrane covering the film are integrally formed.
The invention relates to a device for measuring
Concentrations of material particles by means of an optical light measuring device containing a light source, a light receiver and a display device, with an indicator space consisting of an indicator substance and an indicator substance enclosing the indicator substance and forming an optode.
Devices of this have already been proposed
Kind of multi-stage training and add to the indicator space with the substances reacting to the substance particles to be measured.
The object of the invention is now to achieve the greatest possible separation of reagents and indicator, since special advantages can be achieved and further applications of the device are possible.
To solve this problem according to the invention
Indicator space upstream of a reaction space containing at least one reagent and sealed off by a membrane for the substance particles to be measured.
This reaction space, which, like the indicator space itself, blocks the reagent from the test object through a membrane, the membrane being overcome by permeation from the particles to be measured, allows the measurement object, indicator substance, reagent and reaction products to be separated.
The device according to the invention can therefore be used with great advantage where a certain type of particle cannot be measured directly, but where there are reactions,
that generate particles from the particles to be measured that are measurable. If such a reaction system is arranged in the reaction space, the measurable particle type will arise from the particles to be measured.
By enclosing the reaction system in the closed reaction space, a large number of reactions can now be used, which should not otherwise occur freely in the test object, e.g. because toxic or catalytic substances occur, but which allow the one (to be measured) to be replaced by the other (measurable) type of particle.
As a result of this metrological replication from one type of particle to another, neither material disturbances nor disturbances are usually exerted on the optical measurement; on the other hand, an almost unlimited number of particle types, even under physiological conditions, have become measurable. A particular advantage is that not only one-time measurements (in the so-called end-stop method, in which the reaction proceeds until the reagent breaks open), but also continuous measurements in flow equilibrium are possible because the reaction system is designed in this way regardless of the measurement object can.
It is precisely the continuity of the measurement that allows the arrangement to be used for process monitoring, particularly where there have previously been no methods for direct concentration measurement. For example, the monitoring of alcohol production in the industrial process or the monitoring of glucose in the biological process has so far not been possible directly.
Because of the strong susceptibility to malfunction of biological objects due to changes in the concentration of the substances acting in them, the device according to the invention can also be used with particular advantage here.
Since the reaction space is always used together with at least the measuring optode measuring the reaction, it is expedient to call this combination the reaction optode.
Special training of the reaction space makes it possible to solve different measurement problems. Here, the device can be adapted to the respective measurement object: If the reaction rate for the particles to be measured in the reaction space is low, then the flow equilibrium present in the measurement object is not disturbed by the reaction space, the measurement shows the current state, for example the current oxygen concentration.
On the other hand, the response rate for those to be measured
Particles large, then there is a clear sink for the particles to be measured, so that the size of the particle stream can be determined, for example, from the measurement of the sink profile.
The size of the reaction rate can easily be selected by choosing the optimal permeation resistance (membrane thickness, membrane type) and the optimal concentration of the
Adjust reagent to a measured tissue or other biosystems. For example, is the permeation resistance
Small membrane - in the case of thin or large-pore membranes or those with a large specific surface area - or is that
If the concentration of the reaction is large or both properties are present, then the reaction rate is also large.
If the reaction rate is to be small, then membranes with a high permeation resistance and reagents are small
To choose concentrations. What is of particular advantage can only be seen in terms of the properties of the
Measurement object. The execution is that
Well known to those skilled in the art.
The device can preferably additionally contain one or more control optodes. It is often of interest if at the same time the particles to be measured are determined in the reaction space and other parameters important for the measurement are monitored inside or outside the reaction space.
For example, the temperature or the internal pressure or the concentration of the particles to be measured or other particles is often important for a biological process. The monitoring of these parameters by optodes is very advantageous because they enable interference-free optical measurement.
To avoid interfering shadowing for this optical measurement or that the permeation current is disturbed, the optodes or the reaction space can have viewing openings and / or permeation openings.
A particularly strong application extension is possible if the reagent is a biological system. Such systems - for example enzymes, enzyme chains, cell extracts, cell particles, cells, viruses, bacteria, fungi, microorganisms or antibodies - often have a high specificity for substance particles or other chemical or physical parameters, so that a high degree of measurement selectivity can be achieved. Such reaction optodes can be prepared without great difficulty.
In order to keep the measuring time constant as short as possible, the reaction space can expediently be made as thin as possible, for example the reaction space can be designed as a film to which the reagent is fixed. Fixation methods are known in the art. If it is not possible to fix a reagent to a film, hydrophobic layers that hold the reagent in place can also be applied to an optode. The optode thus serves as a carrier for such layers that are not inherently stable.
In another embodiment, the indicator space can be designed as a nano or micro optode (diameter <10 llm). Such small optodes are easy to manufacture physico-chemically and can be used to solve a number of measurement problems. The smallest optodes are usually added to the carrier fluids - such as blood - or to the tissue and are also measured there.
In this case, the reaction space can expediently consist of a membrane that encloses the optode, because in liquid-filled reaction spaces with enclosed small optodes, the symmetry cannot be well maintained, and on the other hand, the thickness of the reaction space also determines the signal.
In the event that the measurement-disturbing particles arise during one of the reactions taking place there, other reagents can advantageously be arranged in the reaction space, which remove such disturbing particles from the reaction space. Such reagents can be chemical or physical in nature.
On the other hand, other reagents can also be provided which change the concentration of the particles to be measured in the reaction space. As a result, the signal from the light measuring device can be increased considerably in individual cases.
Additional reaction spaces can also be connected upstream of the reaction space. This makes it possible to carry out multi-stage reactions in which the reactants are not compatible with one another, but the reaction products can penetrate into the respective adjacent reaction spaces and continue to react.
If the reactions themselves are to be monitored, thermocouples, measuring electrodes or the like or control optodes can expediently be arranged there and filters for optical signal separation can also be connected between reaction spaces and / or optodes.
For this purpose, optodes or reaction spaces can additionally be windowed so that light of different wavelengths can be used next to one another for the analysis of the optodes, and they themselves can be designed as optical filters.
Particularly favorable designs for reaction spaces are ring-shaped arrangements, multi-surface arrangements, arrangements on light guides, in particular on split light guides, if the reaction space and the measuring optode are arranged on one and a control optode on a second light guide end.
The drawings, on the basis of which exemplary embodiments of the invention are explained, show:
Fig. 1 shows a first embodiment of the device according to the invention and
1A on a larger scale a section of FIG. 1,
2 shows a multi-stage device,
3 shows a section of a windowed reaction optode,
Fig. 4 is a free reaction optode and
4A is a graphical representation of concentrations which are measured with reaction optodes according to FIG. 4,
5 shows a reaction optode with feed lines,
5A shows a graphical representation of particle concentrations in the reaction optode of FIG. 5, FIG. 5B graphically shows a characteristic field for the reaction optode of FIG. 5,
6 reaction optodes on optical fibers,
7 shows a multi-surface reaction optode and
8 shows a micro or nano optode.
In FIG. 1 a measuring optode 11 is arranged on a glass plate 10 and covered and closed off by a reaction space 13. A control optode 15 is arranged outside the reaction space. A particle stream M of particles to be measured enters the reaction space from the measurement object MO through the membrane 14 of the reaction space 13, reacts there, and the reaction product enters the indicator space through the membrane of the optode 11 and changes the indicator space optical properties of the indicator substance, this change being measured by a light beam L from the light measuring device (not shown).
The operation of the device, which can be applied to all permeable particle types in which characteristic particle types arise or disappear through reactions, is explained in a first example using the glucose-glucose oxidase system.
There is currently no optical indicator for glucose itself that enables direct optical concentration measurement. However, since glucose can be reacted with oxygen, it is possible to determine the glucose concentration by measuring the oxygen concentration. The glucose is therefore replaced by oxygen for the measurement. Oxygen itself can be determined with fluorescence optodes.
The following reaction equations result with the glucose oxidase GOD and the coenzyme FAD:
EMI3.1
<tb> Glucose <SEP> + <SEP> FAD <SEP> GOD <SEP> Gluconic acid 8-lactone <SEP> + <SEP> FADH2 <SEP>
<tb> 02 + FADH2 <SEP> <SEP> <SEP> FAD + H202
<tb> Glucose <SEP> + <SEP> O2 <SEP> GOD <SEP> Gluconic acid 6-lactone <SEP> + <SEP> H202
<tb> H202 <SEP> se <SEP> Catalake <SEP> H2O <SEP> + <SEP> 112 <SEP> 2 <SEP>
<tb>
1A, an enlargement in the detail from FIG. 1, results in the following assignment:
:
M = current of the particles to be measured
P = all reactants
G = particles measured by the 02 optode 11
The particle stream of the particles M to be measured comes to the reaction P with the reagent R arranged in the reaction space 13, consisting of GOD + FAD + FADH2 + H202 and catalase. The oxygen G is measured and is - compared to the oxygen concentration in the measurement object MO reduced by 1/202 per glucose molecule.
The measurement object MO is undisturbed with regard to the particle types, since all reaction partners would arise in the course of the glucose respiration anyway, but a characteristic quantity of oxygen is consumed at the location of the reaction space 13, which can be determined without loss by the optode 11. This enables a continuous, lossless measurement under physiological conditions.
A prerequisite for this measurement is knowledge of the oxygen concentration in the measurement object MO, which is measured by the control optode 15: As the equations show, the oxygen difference is a measure of the glucose consumed.
In terms of measurement technology, the largest possible gradient in the reaction space 13 is aimed for. The intensity equations for this system are as follows:
For the fluorescent light analysis of oxygen with, for example, pyrenebutyric acid as an indicator (according to VAU GHAN and WEBER) applies according to STERN and VOLMER
EMI3.2
with 1o '= rel. Fluorescence intensity without oxygen
I '= rel. Fluorescence intensity at the respective oxygen concentration [02] = oxygen concentration
K '= factor, proportional to the quench constant
From this, the oxygen concentration can be determined
EMI3.3
These equations apply to the control optode 15.
The following applies to the reaction optode with the reaction system P:
EMI3.4
where K is the quench constant for the measuring optode 11 and K * is a reaction constant for the material reaction system.
This results in
EMI3.5
<tb> <SEP> I <SEP> I <SEP> + <SEP> 1+ <SEP> IxKt <SEP>] - <SEP> K * <SEP> [glucose]
<tb> This results in the following for the glucose concentration:
EMI4.1
<tb> - <SEP> [Glucosej <SEP> = <SEP> f-0-1-K <SEP> 3 <SEP> / K *
<tb> 1 <SEP> I'K '
<tb> <SEP> (Io'I ') <SEP> Io
<tb> [glucose] <SEP> = <SEP> f <SEP> 1 <SEP> + K <SEP> lxK '<SEP> -I <SEP>} <SEP> / K * <SEP> (1)
<tb>
The deleted sizes of the optode 15, the uncoated sizes of the optode 11 and the size with an asterisk correspond to the reaction system in the reaction space.
The constants K, K ', K * can be determined experimentally.
Not only inorganic or organic reagents can be used as reagents, as in the examples described above, but the reaction space can also be filled with biological systems. Such systems, such as living cells, cell particles, fungi, bacteria, viruses, antibodies and the like, usually have a high reaction selectivity, ie they only take out a certain type from a particle mixture without attacking other types of particles.
As a result, measurements can be carried out without previous preparation, but above all in living tissue under physiological conditions.
A further increase in selectivity can be achieved by using membranes provided with carriers. Such membranes have a carrier which is suitable for a specific particle type - for example valinomycin for the transport of K + ions. As a result, the membrane closing off the reaction space can be made much less permeable to particles other than those to be measured, here K + ions, and the result is a high selectivity of the reaction space for K + ions.
If several types of particles are required for a reaction to take place, for example in the reaction of glucose with glucose and oxygen, it can be advantageous to generate selective permeabilities which are specific for each of the particles. For this purpose, the degree of crosslinking of the membrane substance, its solubility for the particle type in question, the pore size of the membrane and the charge on the membrane pores can be adapted to the particle to be transported in a known manner. The pore size of the membrane can be changed by mechanical stretching or chemical etching.
Reaction systems such as the one described above from glucose-glucose oxidase can be referred to as one-stage.
Another one-stage system is the measurement of CO2 by protons according to the following equation: H20 + CO2 [H2CO3] 2 [H +] + [HCO3-]
1A, the following assignment would result: M = CO2 P = H2C03, H3 +, HCO3 G = H +, measured by H + -optode 11
In another one-step reaction system for measuring alcohol, alcohol can be replaced by oxygen. Using alcohol dehydrogenase results in
EMI4.2
<tb>
CH3-CH2-OH <SEP> + <SEP> NAD <SEP> alcohol dehydrogenase <SEP> CH3-C <SEP> Z <SEP> + NADH2
<tb> NADH2 <SEP> + <SEP> 2 <SEP> NADH oxidase <SEP>? <SEP> NAD <SEP> + <SEP> H202
<tb> <SEP> Catalase <SEP> H20 <SEP> +1/202
<tb> H202
<tb>
1A there is an assignment M = C2H5OH
P = C2H5OH, NAD, C2H40, NADH2, alcohol dehydrogenase, NADH oxidase, H202, 02, catalase
G = 02, measured by 02 optode 11 and an oxygen flow reduced by 1/202 per glucose molecule is measured.
This reaction would come to a standstill after a while because the aldehyde formed attacks the alcohol dehydrogenase. The concentration determination could therefore only be determined from the gradient of the intensity function (which is known as the end stop method). However, if measurements are to be carried out in steady state, the addition of aldehyde dehydrogenase can initiate a reaction parallel to the transformation according to the following equation:
EMI4.3
<tb> <SEP> / <SEP> <SEP> + <SEP> 1/2 <SEP> 02 <SEP> aldehyde dehydrogenase <SEP> t
<tb> CH3-C <SEP> + / 202 <SEP> CH3-C <SEP> ·
<tb> <SEP> (NAD) <SEP> OH
<tb> The acetic acid diffuses back into the measurement object. The concentration of 02 is also reduced, which increases the measurement signal.
In the event that the measurement signal is very weak, the concentration in the reaction space can be increased by arranging substances with increased solubility for the particles to be measured. If, for example, a weak oxygen concentration is to be measured, the reaction space can be filled with fluorocarbonene, which can increase the concentration in the reaction space by up to two orders of magnitude compared to the measurement object. Oil also has a higher solubility for oxygen than water and can therefore be used accordingly.
However, it is not only possible to use parallel reactions in the same reaction space - used in the example to remove interfering particles - but also serial reactions. For this purpose, several reaction rooms have to be connected in series and separated by permeable membranes. Interactions of the reagents or disturbances of the particles can thereby be avoided.
In FIG. 2, an enlarged section of an arrangement with reaction spaces 22, 23 connected in series, which are closed or separated from one another by membranes 26, 24, 27, a flow of particles M to be measured enters the first reaction space 22. Together with a reagent or reagent system R ', a reaction P' takes place, from which a particle type G 'is split off, which after permeation of the membrane 24 reaches the reaction space 23. Here it comes together with the reagent R to form a reaction P, from which a particle type G arises which is measured by the optode 21.
An example of such a system is the conversion of plasma cholesterol while consuming oxygen:
EMI5.1
<tb> fatty acid <SEP> cholesterol esterase <SEP> cholesterol <SEP> +
<tb> cholesterol ester <SEP>> <SEP> fatty acid
<tb> cholesterol <SEP> + <SEP> FAD <SEP> cholesterol oxidase <SEP> ox.
<SEP> cholesterol
<tb> <SEP>> <SEP> + <SEP> FADH2 <SEP>
<tb> FADH2 <SEP> + <SEP> 02 <SEP> cholesterol oxidase <SEP> FAD <SEP> + <SEP> H202
<tb> H202 <SEP> Catalase <SEP> H2O + <SEP> 1/202 <SEP>
<tb>
The assignment to Fig. 2 is:
M = plasma cholesterol (= fatty acid cholesterol ester)
P '= fatty acid cholesterol ester, cholesterol, cholesterol esterase, fatty acid
G '= free cholesterol = = cholesterol esterase
R = cholesterol oxidase
P = cholesterol, FAD, FADH2, 2, H202, catalase, oxidized cholesterol
G = oxygen, measured by O2 optode, reduced by 1/202 compared to the measurement object.
However, further reaction spaces can also be interconnected to form a column if the replication of a particle to be measured by a measurable particle requires this.
A three-stage system according to the following example allows the conversion of starch as the particle type to be measured into oxygen as the measurable particle type:
EMI5.2
<tb> Starch <SEP> a-amylase <SEP> dextrin
<tb> dextrin <SEP> glucoamylase <SEP> glucose
<tb> glucose <SEP> glucose oxidase <SEP> gluconic acid
<tb>
Here, too, there is an oxygen consumption of 1/220 glucose produced per molecule, which is determined by the measuring optode and the assigned control optode.
In an abbreviated form, the assignment to FIG. 2 is: M = strength
R '= a-amylase
G '= dextrin
R = glucoamylase
G = glucose
This results in an oxygen consumption in the third reaction space (not shown) with glucose oxidase as reagent, which in turn is used with an 02 optode according to FIG.
1A can be measured.
If the different reaction spaces are monitored with differently colored indicators, instead of the membranes 24, 27... Optical means, such as filters, mirrors and possibly further control optodes 25, can be provided. If reflective layers are used, it is advantageous if the optodes or the reaction spaces are windowed.
An arrangement of this type is shown in FIG. 3. Measuring light L of a first color analyzes a first optode 35, which has windows
37 is provided for viewing and for contacting the particles to be measured with the reaction space 33. The optode 35 is expediently provided on the rear side adjoining the reaction space 33 with a reflective and permeation-preventing metal layer. The optode 35 is therefore suitable for monitoring the front space, the measurement object. Measuring light L 'of a second color, which is matched to a second optode 31, shines through the openings 37 and the reaction space 33 and is also reflected on a metallic layer on the back of the optode 31.
The separation of the light components presents no difficulties, so that the reaction space, the measurement object and, if necessary, the temperature or other parameters can be monitored by a further control optode 35 ′ arranged in the reaction space 33.
Arrangements according to FIG. 4 can be used for the purposes of implantation. Here, the optode 41 is only partially covered by the reaction space 43. Part 48 of the reaction chamber and optode is the reaction optode, part 49 the control optode.
With such free reaction and control optodes, for example, diffusion profiles according to FIG. 4A can be measured: If the reaction rate is kept low due to low concentration in the reaction optode and high permeation resistance of the membrane, the concentration of Particles are measured optically without disturbing the particle concentration. If a reaction optode with a high reaction rate is arranged at location S3, which is provided with a membrane with low permeation resistance and high concentration of the reagent, then this reaction optode represents a noticeable sink for the particles to be measured and a specific diffusion profile Cx is established, that can thus be measured and the size of the diffusion current can be determined therefrom, for example.
5 shows a reaction space 53 enclosed by optodes 51 and 55, which is provided with supply lines 58, 59. Enzyme activities can either be determined using the zero method or directly: The concentration of a stream of particles to be measured will decrease under the usual diffusion conditions across the reaction space and form a cosh function CK = f (S) y Fig. 5A, for small concentrations approximately curve A, for large concentrations, curve B. The optodes either measure these concentrations directly, and from this the difference AC of the concentrations can be measured directly, or the concentration of the reagent flowing through is changed until both optodes have a predetermined, approximately show easily measurable difference.
This allows a favorable operating point in the characteristic field, FIG. 5B, to be determined, which arises from equation (1) when the concentration C of the reagent is changed as a parameter.
If, for example, diffusion profiles in liquids are to be measured, it is advantageous if the reaction optodes are arranged on light guide ends. 6, a light guide 67 is split into two ends 68, 69. A circular optode is covered by an annular reaction space. This creates an annular reaction optode 60 with a circular control optode 65 or an annular control optode 65 'with a circular reaction optode 60'.
In FIG. 7, a plurality of reaction optodes are arranged side by side over several surfaces. If 78 is the light guide end and 75 is the control optode, a multi-area reaction optode can be formed by covering it with reaction spaces 73, 73 'and 73 ", with which different particle fractions can be monitored.
If small measuring time constants are to be achieved, thin foils are expediently provided as reaction spaces to which the reagents are fixed and these are covered with membranes. Particularly short response times can be achieved if the reaction space and the film are formed in one piece. For this purpose, for example, the film surface can be converted into a membrane-like layer by a chemical reaction and the reaction space, the film, can thus be sealed.
Microoptodes, or nanooptodes, which can be produced by means of known physicochemical processes, are given a reaction space by enclosing them. As shown in FIG. 8, they consist of an indicator space 81 with an indicator substance I, which is surrounded by a reaction space 83 and is enclosed by a membrane 84. It is often expedient to let the membrane 87 of the indicator space and the membrane 84 of the reaction space coincide and to enclose the reagent in this film. Access takes place by permeation of the particles to be measured into the membrane and of the particles formed in the membrane into the indicator space 81.