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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Bestimmung der Konzentration an Heparin im Blut, dadurch gekennzeichnet, dass man normales menschliches Plasma äquilibriert und Serum, welches aus diesem Blut gewonnen wurde, zu einer standardisierten Thrombin Lösung zusetzt, das erhaltene Thrombin-Serum-Gemisch während einer Zeit, welche zu kurz ist, um eine wesentliche Reaktion zwischen Thrombin und irgendwelchen Fibrin-Abbauprodukten im Serum zu erlauben, inkubiert, eine Standard-Portion des derart inkubierten Thrombin-Serum-Gemisches zu dem genannten Plasma unter solchen Bedingungen zugesetzt, dass ein im wesentlichen gleichmässiges Thrombin-Serum-Plasma-Gemisch erzeugt wird, und die Gerinnungszeit davon beobachtet.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man verschiedene Mengen an Heparin zu Serumproben zusetzt, welche von gesunden Individuen entnommen wurden, bevor das Serum zur Thrombin-Lösung zugesetzt wird, wodurch die Gerinnungszeiten als Funktion des Heparin-Gehaltes des Serums bestimmt werden, was ermöglicht, den Heparin Gehalt des Blutes eines Patienten durch Messung der Gerinnungszeit des von diesem Patientenblut entnommenen Serums zu spezifizieren.
3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur bei der Äquilibrierung des Plasmas und bei der Inkubation des Thrombin-Serum-Gemisches 37 "C beträgt.
4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Thrombin-Lösung hergestellt wird durch Rekonstituierung von festem Thrombin und Verdünnung dieser Lösung, bis 0,1 ml der verdünnten Thrombin-Lösung beim Vermischen mit 0,2 ml frischem normalen Plasma bei 37 "C eine Gerinnungszeit von 12 Sekunden aufweist.
5. Verfahren nach Patenanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Serum durch normales Gerinnen und Zentrifugieren, gefolgt von einer Inkubation bei 37 "C während einer halben Stunde hergestellt wird.
6. Verfahren nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationszeit des Thrombin-Serum-Gemisches 2 Minuten beträgt.
Die Heparinisierung ist die bevorzugte Behandlung für eine Anzahl pathologischer Zustände. Im allgemeinen ist es kritisch, dass der Heparingehalt des Blutes innerhalb gewisser Grenzen gehalten wird, wobei diese Grenzen von einer Anzahl Variablen abhängt. Ein schwerwiegendes Problem bei der Heparintherapie beruht jedoch auf dem Fehlen einer raschen, empflindlichen Methode zur Bestimmung der Konzentration des Heparins im Blut. Diese Situation herrscht noch immer vor trotz der Tatsache, dass Heparin während über 30 Jahre als Anticoagulans verwendet wurde.
Gegenwärtig beruht die klassische Laboratoriumskontrolle auf der Messung der Gerinnungszeit des ganzen Blutes oder der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (APTT). Die Resultate werden üblicherweise eher als Gerinnungszeiten wie als He parineinheiten im zirkulierenden Blut ausgedrückt. Es ist je doch unverkennbar, dass die letztgenannte Menge kritisch ist und als Basis für den Entschluss dienen muss, wie die weitere
Heparintherapie erfolgen soll.
Wie ersichtlich, ist deshalb eine rasche, empfindliche und zuverlässige Methode zur Bestimmung der Heparinkonzentra tion höchst erwünscht.
Das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass man normales menschliches Plas ma äquilibriert und Serum, welches aus diesem Blut gewonnen wurde, zu einer standardisierten Thrombin-Lösung zusetzt, das erhaltene Thrombin-Serum-Gemisch während einer Zeit, welche zu kurz ist, um eine wesentliche Reaktion zwischen Thrombin und irgendwelchen Fibrin-Abbauprodukten im Serum zu erlauben, inkubiert, eine Standard-Portion des derart inkubierten Thrombin-Serum-Gemisches zu dem genannten Plasma unter solchen Bedingungen zugesetzt, dass ein im wesentlichen gleichmässiges Thrombin-Serum-Plasma-Gemisch erzeugt wird, und die Gerinnungszeit davon beobachtet.
Eine derartige Methode lässt sich nach der vorliegenden Erfindung beispielsweise wie folgt durchführen:
Aus einer Blutprobe eines Patienten wird das Serum nach üblichen Gerinnungs- und Zentrifugierungsverfahren gewonnen, worauf das Serum vor Gebrauch während einer halben Stunde bei 37 "C inkubiert wird.
Menschliches Thrombin wird in Kochsalzlösung aufgelöst und mit isotonischer Kochsalzlösung solange verdünnt, bis 0,1 ml der verdünnten Thrombinlösung 0,2 ml frisches normales Plasma bei 37 "C in 12 Sekunden zum Gerinnen bringt.
Um einen Test durchzuführen, werden 0,2 ml frisches normales Plasma in ein Glasröhrchen eingeführt und in ein Wasserbad gestellt, um bei 37 "C äquilibiriert zu werden. 0,1 ml Testserum werden sodann zu 0,9 ml standardisiertes Thrombin zugesetzt, kräftig gemischt, in ein Wasserbad von 37 ,C gestellt und darin während genau 2 Minuten gehalten. Am Ende von 2 Minuten werden 0,1 ml des Thrombin-Serum-Gemisches unter solchen Bedingungen, dass eine vollständige Durchmischung der Lösungen stattfindet, zu dem Röhrchen zugesetzt, welches 0,2 ml Plasma enthält und bei 37 "C äquilibriert wurde. Unmittelbar vor oder unmittelbar nach Durchführung dieses Zusatzes wird das Röhrchen aus dem Bad entnommen. Die Gerinnungszeit wird sodann notiert.
Als Basis für die funktionelle Abhängigkeit zwischen der Gerinnungszeit und dem Heparingehalt wurde Serum von einer Anzahl normaler Individuen in vitro mit verschiedenen Mengen Heparin behandelt. Die Gerinnungszeiten wurden wie oben bestimmt. Die Gültigkeit der Resultate, welche durch die Kalibrierung in vitro abgeleitet wurden, wurde durch Heparinisierung von Patienten mit bekannten Mengen an Heparin, Berechnen der aufgrund des Körpergewichtes des Patienten zu erwartenden Heparinkonzentration und anschliessende Entnahme von Blutproben für die Tests nach der oben beschriebenen Methode nachgewiesen; hierbei wurden die Blutproben innerhalb einer genügend kurzen Zeit entnommen, so dass eine Herabsetzung der Konzentration des Heparins im Blut nicht zu erwarten war.
Die Übereinstimmung zwischen den Gerinnungszeiten der in vitro -Proben und denjenigen, welche von den frisch heparinisierten Patienten entnommen wurden, war befriedigend.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung wird diese im folgenden unter Bezugnahme auf die beiliegende Zeichnung näher beschrieben, in welcher eine Kurve der Gerinnungszeit in Abhängigkeit von der Heparinkonzentration im Blut, wenn die Gerinnungszeit gemäss der vorliegenden Erfindung gemessen wird, dargestellt ist.
Die Methode zur Bestimmung der Gerinnungszeit von Serum und damit der Konzentration von Heparin im Blut ist eine Modifikation der in der US-Patentschrift No. 3 853 710 beschriebenen Methode. Der Inhalt dieses Patentes gilt vollumfänglich als in die vorliegende Beschreibung aufgenommen. Zur Durchführung des Testes gemäss der vorliegenden Erfindung werden die Reagenzien wie folgt zubereitet:
Thrombin-Lösung
Ortliches Thrombin ist von der Firma Ortho Diagnostik un ter dem Namen Fibrindex erhältlich. Das Thrombin wird durch Auflösen in 1 ml Kochsalzlösung rekonstituiert und an schliessend durch Verdünnen mit isotonischer Kochsalzlösung, bis 0,1 ml der verdünnten Thrombin-Lösung 0,2 ml frisches normales Plasma bei 37 C in 12 Sekunden zum gerinnen bringt, standardisiert.
Plasma-Lösung
Eine Standard-Lagerlösung von Plasma wird zubereitet, indem 48 mg Warner-Lambert-Plasma zu 5 ml normaler Kochsalzlösung zugesetzt werden. Der Fibrinogengehalt dieses Plasmas bildet den aktiven Bestandteil.
Test-Serum
Das Testserum wird auf einer Blutprobe nach den üblichen Gerinnungs- und Zentrifugierungs-Verfahren hergestellt. Vor Gebrauch wird das Serum während einer halben Stunde bei 37 "C inkubiert.
Eichverfahren
Eine wässerige Heparin-Vorratslösung mit einer Antikoagulierungsaktivität von 5000 Einheiten pro ml wurde verwendet. Serum von 5 normalen Individuen wurde in vitro heparinisiert durch Vermischen von 1,0 ml aliquoten Teilen von Serum mit 0,1 ml Natriumheparin bei derartigen Konzentrationen, dass die Serumproben 0,5, bzw. 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 und 4,0 Einheiten Heparin enthielten. Die Serum-Heparin-Konzentrationen wurden nach Korrektur für Hematocrit berechnet.
Für jeden Test wurden 0,2 ml frisches, normales Plasma in ein Glasröhrchen pipettiert und in ein Wasserbad von 37 "C gestellt. In ein zweites Reagensglas wurden 0,9 ml standardisiertes Thrombin pipettiert. Aus den Serumproben wurden 0,1 ml zu dem Thrombinglas zugesetzt, der Inhalt gut gemischt und das Glas in ein Wasserbad von 37 C gestellt und während genau 2 Minuten darin belassen. Am Ende der 2 Minuten Inkubation wurden 0,1 ml des Thrombin-Serum-Gemisches unter gutem Vermischen in das Reagensglas zugesetzt, welches 0,2 ml Plasma enthielt, das zuvor bei 37 C äquilibriert worden war, wobei der Zusatz unter solchen Bedingungen erfolgte, dass ein gutes Vermischen sichergestellt war.
Praktisch zur selben Zeit wurde das Reagensglas, welches das Plasma enthielt, aus dem Wasserbad entfernt und eine Stoppuhr in Gang gesetzt. Die Gerinnungszeit wurde sodann registriert.
Um sicherzustellen, dass die mit den Serumproben, welche in vitro heparinisiert worden waren, durchgeführten Tests inbezug auf die von einem heparinisierten Patienten entnommenen Blutproben sinnvoll waren, wurden die Testresultate von den von einem heparinisierten Patienten entnommenen Proben verglichen mit den Heparin-Konzentrationen im zirkulierenden Blut des Patienten, wie sie auf der Basis der Menge an zugesetztem Heparin und der Menge an Serum, berechnet auf der Basis des Körpergewichtes, erwartet wurden. Es wird allgemein angenommen, dass das gesamte Serumvolumen in Milliliter 5% des Körpergewichtes in Gramm beträgt.
Dementsprechend kann der theoretische Anfangsgipfelpunkt der Serumheparin-Konzentration nach der folgenden Gleichung berechnet werden: Dosis (Einh./mi) = DOSiS an Heparin in Einheiten Serumheparin-Konzentration (Einh./ml) = K i hPt in Gramm x 0,05
Untersuchungen haben gezeigt, dass die Heparin-Konzentration des Blutes während einer Dauer von etwa einer halben Stunde nach der Injektion konstant bleibt. Die Untersuchungen des Serums von heparinisierten Patienten stimmten gut mit denjenigen Resultaten überein, welche bei der Untersuchung des Serums erhalten wurden, welches in vitro heparinisiert worden war.
Es ist zu bemerken, dass das von einem Patienten entnommene Serum während etwa 8 Stunden bei Zimmertemperatur stabil ist, so dass jeder Test für Heparin innerhalb dieser Zeitspanne durchgeführt werden sollte.
Um die Nützlichkeit des erfindungsgemässen Tests zu zeigen wurde auch der APTT-Test durchgeführt. Plasma für diesen Test wurde hergestellt aus mit Citrat behandeltem Blut (1 Teil 3,8 %iges Trinatriumcitrat auf 9 Teile Blut). Das Plasma wurde defibrinisiert durch Erhitzen während 5 Minuten auf 56 "C. Der Test wurde nach der Methode von Spector und Corn durchgeführt. Die Resultate der APTT-Tests sowie der nach der erfindungsgemässen Methode durchgeführten Tests, angegeben als AA, sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt.
Tabelle Veränderungen in vitro erzeugt durch Heparin im Serum von normalen Individuen
Anzahl Heparin- APTT AA Standard- Antithrom
Proben Einhei- (Sekunden) (Sekunden) Abweichung bin-III (%) ten / ml . von AA
5 0,5 118 17 0,2 94 (87-147) (17-18)*
1,0 250+ 23 1,2 N.C.
(271- > 300 (21-24)
1,5 > 300 31 2,4 N.C.
(29-34)
2,0 > 300 41 3,1 N.C.
(38-45)
2,5 > 300 61 4,6 N.C.
(57-68)
3,0 > 300 84 5,9 N.C.
(77-84)
3,5 > 300 117 7,3 N.C.
(112-127)
4,0 > 300 167 9,6 N.C.
(151-182) * Bereiche in Klammern.
N.C. = Keine Veränderung.
Die Konzentration an Antithrombin-III wurde in jeder der Proben durch die Immunobestimmungsmethode gemäss Fagerhof und Abildgaard gemessen.
Die Figur zeigt die experimentellen Resultate, erhalten für die in vitro heparinisierten Serumproben, wobei die Heparin Konzentration in Einh./ml gegen den Logarithmus der Gerinnungszeit in Sekunden aufgetragen sind. Erstaunlicherweise besteht eine lineare Abhängigkeit zwischen dem Logarithmus der Gerinnungszeit und der Heparin-Konzentration über einen Bereich von 0 bis 4,0 Einheiten pro ml.
Den Faktoren, welche die Gerinnungszeit-Resultate, welche als Mass für die Antithrombin-Konzentration betrachtet werden, stören könnten, wurde Beachtung geschenkt. Ein Faktor, welcher bereits erwähnt wurde, ist die Zeit der Probeentnahme in Beziehung zur Heparin-Dosierung. Der Antithrombin-Versuch folgt nahe der exponentiellen Fallkurve von Heparin nach einem Plateau, welches während 30 bis 45 Minuten nach Injektion des Heparins andauert. Demzufolge ist es bei der Eichung des Verfahrens notwendig, dass die Blutproben nicht später als 30 Minuten nach Injektion des Heparins entnommen werden.
Der zweite Faktor besteht in der Gegenwart vonantikoagulie- renden Fibrinabbauprodukten (FDP) X und Y im Blut. Aus diesem Grunde wird die Inkubationszeit kurz gehalten, nämlich 2 Minuten, im Gegensatz zum Verfahren, welches im eingangs erwähnten Patent beschrieben ist, welches eine Inkubationszeit von 15 Minuten bei 37 "C vorschreibt. Das Verfahren in dem genannten Patent ist jedoch spezifisch auf die Bestimmung der Konzentration von Fibrin-Abbauprodukten im Blut gerichtet.
Die Inkubationszeit von 2 Minuten gemäss der vorliegenden Erfindung dient lediglich dazu, die Probe auf die gewünschte Temperatur für die Reaktion mit dem Plasma zu bringen, wobei, wenn überhaupt, nur eine geringe Reaktion mit den FDP während der 2 Minuten Dauer eintreten kann.
Die Fragmente D und E sind nicht reaktionsfähig mit Thrombin, aber obwohl sie die Fibrinpolymerisation beeinträchtigen können, sind ihre Einwirkungen auf die Methode der vorliegenden Erfindung vernachlässigbar. Es wurde gefunden, dass Patienten mit Thromboembolie-Erkrankungen merklich herabgesetzte Werte aufweisen, wodurch die Befürchtungen einer Störung durch Fragmente X und Y bei der Heparin-Bestimmung bei solchen Patienten wegfällt, da diese Fragmente eine Verlängerung der Gerinnungszeit hervorrufen würden.
Die hauptsächlichen Vorteile des Antithrombin-Versuches oder AA-Tests gemäss der vorliegenden Erfindung gegenüber dem APIT-Test sind doppelter Art. Erstens bleibt das Verhältnis zwischen den AA und der Heparin-Konzentration bis auf etwa 4 Einheiten Heparin pro Milliliter linear. Die Heparin Konzentration kann ausserdem in Heparin-Einheit pro Milliliter des Serums oder Plasmas ausgedrückt werden anstelle der unbestimmten Gerinnungszeitangaben. Der zweite Vorteil besteht darin, dass Unterschiede in Gerinnungszeiten bis zu so hohen Spiegeln wie 4,0 Einh./ml mit Hilfe der vorliegenden Erfindung bestimmt werden können, während mit dem APTT Test die Resultate, wie aus der Tabelle ersichtlich, mit über 300 Sekunden bezeichnet werden müssen. Mit anderen Worten, der APTT-Test bricht zusammen, sobald die Heparin-Konzentration eine Höhe von 1,5 Einh./ml erreicht.
Gemäss Pitney ist die Antithrombin-Aktivität die Basis für die antikoagulierende Wirkung des Heparins. Die Beteiligung eines Heparin-Antithrombin-III (Heparin-Cofaktor) -Komplexes in der antikoagulierenden Heparin-Wirkung ist gut dokumentiert. Rosenberg zeigte kürzlich, dass die Thrombin-Inhibition durch Antithrombin-III mit der Bildung einer starken kovalenten Bindung mit der aktiven Stelle des Serin-Restes an der leichten Untereinheitskette von Thrombin durch Antithrombin in Beziehung steht. Er zeigt ferner, dass der Zusatz von Heparin zu diesem Thrombin-Antithrombin-Reaktionsgemisch die Einwirkungsgeschwindigkeit dramatisch beschleunigt. Auf ähnliche Weise ist es wahrscheinlich, dass Heparin-Antithrombin andere Serin-Proteasen inhibitieren, einschliesslich Plasmin und aktivierte Faktoren XI, IX und X.
Im Licht von Rosenberg's Beobachtungen ist eine wesentliche Frage, wieviel Heparin mit Antithrombin-III zu jeder gegebenen Zeit komplex gebunden wird. Aus den Resultaten von der Tabelle ist klar ersichtlich, dass die heparinisierten Individuen mit deutlichen Erhöhungen der Heparin-Konzentration keine Erhöhung des Antithrombin-III aufwiesen. Die erhöhte Heparinwirkung kann daher der Heparin-Komponente des Heparin-Antithrombin-III-Komplexes zugeschrieben werden. Es scheint daher, dass bei heparinisierten Individuen AA ein quantitatives Mass der an Antithrombin-III gebundenen Heparin Moleküle darstellt.
APIT sind empfindliche Indikatoren für kleine Mengen an zirkulierendem Heparin, gemäss Marder übersteigen jedoch therapeutische Dosen an Heparin im allgemeinen die messbaren Grenzen des Testes. Dieser Schluss wird durch die in der Tabelle zusammengestellten Resultate bekräftigt. In der Marder-Modifikation von APIT wird das Plasma verdünnt, um die Heparin-Konzentration auf einen messbaren Bereich herabzusetzen.
Bei der Anwendung des vorliegenden Testes, nämlich AA, kann im Gegensatz hierzu das unverdünnte Serum verwendet werden, und ausserdem besteht ein lineares Verhältnis zwischen dem Logarithmus der Antithrombin-Gerinnungszeit und der Heparin-Konzentration zwischen 0 und 4,0 Einheiten pro Milliliter.
Es ist zu beachten, dass die Konzentrationen der verschiedenen eingesetzten Reagenzien wie auch die Temperatur und die Inkubationszeiten in einem beträchtlichen Bereich variiert werden können, falls erwünscht. Es ist lediglich notwendig, die Gerinnungszeiten nach der Methode der Heparinisierung in vitro zu bestimmen, wie oben erwähnt. Eine derartige Bestimmung liegt innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmannes. Die Temperatur von 37 "C ist für die Inkubation festgelegt worden aufgrund der Tatsache, dass die meisten biologischen Laboratorien Verfahren bei dieser Temperatur durchführen und dementsprechend ein derartiges Bad zur Verfügung haben. Die Erfindung ist also nicht auf die im vorstehenden erwähnten spezifischen Konzentrationen, Temperaturen und Zeitangaben eingeschränkt.
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PATENT CLAIMS
1. A method for determining the concentration of heparin in the blood, characterized in that normal human plasma is equilibrated and serum obtained from this blood is added to a standardized thrombin solution, the thrombin-serum mixture obtained during a time which is too short to allow a substantial reaction between thrombin and any fibrin degradation products in the serum, a standard portion of the thrombin-serum mixture thus incubated is added to the plasma mentioned under conditions such that an essentially uniform thrombin Serum-plasma mixture is generated, and the clotting time thereof is observed.
2. The method according to claim 1, characterized in that different amounts of heparin are added to serum samples taken from healthy individuals before the serum is added to the thrombin solution, whereby the clotting times are determined as a function of the heparin content of the serum , which makes it possible to specify the heparin content of a patient's blood by measuring the clotting time of the serum drawn from this patient's blood.
3. The method according to claim 1, characterized in that the temperature during the equilibration of the plasma and during the incubation of the thrombin-serum mixture is 37 "C.
4. The method according to claim 1, characterized in that the thrombin solution is prepared by reconstituting solid thrombin and diluting this solution to 0.1 ml of the diluted thrombin solution when mixed with 0.2 ml of fresh normal plasma at 37 " C has a clotting time of 12 seconds.
5. The method according to claim 1, characterized in that the serum is produced by normal coagulation and centrifugation, followed by an incubation at 37 ° C. for half an hour.
6. The method according to claim 3, characterized in that the incubation time of the thrombin-serum mixture is 2 minutes.
Heparinization is the preferred treatment for a number of pathological conditions. In general, it is critical that the blood heparin content be kept within certain limits, which limits depend on a number of variables. However, a serious problem with heparin therapy is due to the lack of a rapid, sensitive method for determining the concentration of heparin in the blood. This situation still prevails despite the fact that heparin has been used as an anticoagulant for over 30 years.
Classic laboratory control is currently based on measuring the clotting time of the whole blood or the activated partial thromboplastin time (APTT). The results are usually expressed in terms of clotting times rather than heparin units in the circulating blood. However, it is unmistakable that the latter quantity is critical and must serve as the basis for the decision, like the rest
Heparin therapy should be done.
As can be seen, a quick, sensitive and reliable method for determining the heparin concentration is therefore highly desirable.
The method according to the present invention is characterized in that normal human plasma is equilibrated and serum obtained from this blood is added to a standardized thrombin solution, the thrombin-serum mixture obtained for a time which is too short In order to allow a substantial reaction between thrombin and any fibrin degradation products in the serum, a standard portion of the thrombin-serum mixture thus incubated was added to said plasma under conditions such that a substantially uniform thrombin-serum plasma -Mixture is generated, and the clotting time thereof is observed.
Such a method can be carried out according to the present invention, for example, as follows:
The serum is obtained from a patient's blood sample using conventional coagulation and centrifugation methods, and the serum is incubated at 37 ° C. for half an hour before use.
Human thrombin is dissolved in saline and diluted with isotonic saline until 0.1 ml of the diluted thrombin solution coagulates 0.2 ml of fresh normal plasma at 37 ° C. in 12 seconds.
To perform a test, 0.2 ml of fresh normal plasma is introduced into a glass tube and placed in a water bath to be equilibrated at 37 "C. 0.1 ml of test serum is then added to 0.9 ml of standardized thrombin, mixed vigorously , placed in a water bath at 37 ° C. and held therein for exactly 2 minutes. At the end of 2 minutes, 0.1 ml of the thrombin-serum mixture is added to the tube under such conditions that the solutions are completely mixed, which contains 0.2 ml plasma and was equilibrated at 37 "C. The tube is removed from the bath immediately before or immediately after this addition is made. The clotting time is then noted.
As a basis for the functional dependency between the clotting time and the heparin content, serum was treated with a number of normal individuals in vitro with different amounts of heparin. The clotting times were determined as above. The validity of the results, which were derived from the calibration in vitro, was demonstrated by heparinization of patients with known amounts of heparin, calculation of the heparin concentration to be expected on the basis of the patient's body weight and subsequent taking of blood samples for the tests according to the method described above; the blood samples were taken within a sufficiently short time so that a reduction in the concentration of heparin in the blood was not to be expected.
The agreement between the clotting times of the in vitro samples and those taken from the freshly heparinized patients was satisfactory.
For a better understanding of the present invention, this will be described in more detail below with reference to the accompanying drawing, in which a curve of the clotting time as a function of the heparin concentration in the blood when the clotting time is measured according to the present invention is shown.
The method for determining the clotting time of serum and thus the concentration of heparin in the blood is a modification of that described in US Pat. 3 853 710 method described. The content of this patent is considered to be fully included in the present description. To carry out the test according to the present invention, the reagents are prepared as follows:
Thrombin solution
Local thrombin is available from Ortho Diagnostik under the name Fibrindex. The thrombin is reconstituted by dissolving in 1 ml of saline and then standardized by diluting with isotonic saline until 0.1 ml of the diluted thrombin solution coagulates 0.2 ml of fresh normal plasma at 37 C in 12 seconds.
Plasma solution
A standard plasma storage solution is prepared by adding 48 mg of Warner Lambert plasma to 5 ml of normal saline. The fibrinogen content of this plasma forms the active ingredient.
Test serum
The test serum is prepared on a blood sample using the usual coagulation and centrifugation procedures. The serum is incubated at 37 ° C. for half an hour before use.
Calibration procedure
An aqueous heparin stock solution with an anticoagulant activity of 5000 units per ml was used. Serum from 5 normal individuals was heparinized in vitro by mixing 1.0 ml aliquots of serum with 0.1 ml sodium heparin at such concentrations that the serum samples were 0.5, 1.0, 1.5 and 2.0, respectively , 2.5, 3.0, 3.5 and 4.0 units of heparin. Serum heparin concentrations were calculated after correction for hematocrit.
For each test, 0.2 ml of fresh, normal plasma was pipetted into a glass tube and placed in a water bath at 37 ° C. 0.9 ml of standardized thrombin were pipetted into a second test tube. 0.1 ml of the serum samples became the thrombin glass added, the contents mixed well and the glass placed in a water bath at 37 ° C. and left in it for exactly 2 minutes At the end of the 2 minute incubation, 0.1 ml of the thrombin-serum mixture was added to the test tube with thorough mixing, which Contained 0.2 ml of plasma, which had previously been equilibrated at 37 C, the addition being carried out under such conditions that a good mixing was ensured.
At about the same time, the test tube containing the plasma was removed from the water bath and a stopwatch started. The clotting time was then registered.
In order to ensure that the tests performed on the serum samples which had been heparinized in vitro made sense in relation to the blood samples taken from a heparinized patient, the test results from the samples taken from a heparinized patient were compared with the heparin concentrations in the circulating blood of the patient as expected based on the amount of heparin added and the amount of serum calculated based on body weight. It is generally believed that the total volume in milliliters is 5% of the body weight in grams.
Accordingly, the theoretical starting peak of serum heparin concentration can be calculated according to the following equation: dose (unit / mi) = DOSiS of heparin in units of serum heparin concentration (unit / ml) = K i hPt in grams x 0.05
Studies have shown that the heparin concentration in the blood remains constant for about half an hour after the injection. The serum studies of heparinized patients were in good agreement with the results obtained from the examination of the serum which had been heparinized in vitro.
It should be noted that the serum taken from a patient is stable for about 8 hours at room temperature, so any test for heparin should be done within that time.
In order to show the usefulness of the test according to the invention, the APTT test was also carried out. Plasma for this test was made from citrated blood (1 part 3.8% trisodium citrate to 9 parts blood). The plasma was defibrinated by heating for 5 minutes to 56 ° C. The test was carried out according to the Spector and Corn method. The results of the APTT tests and the tests carried out according to the method according to the invention, indicated as AA, are shown in the table below compiled.
Table changes in vitro generated by heparin in the serum of normal individuals
Number of heparin APTT AA standard antithroma
Sample units (seconds) (seconds) deviation of bin-III (%) / ml. from AA
5 0.5 118 17 0.2 94 (87-147) (17-18) *
1.0 250+ 23 1.2 N.C.
(271-> 300 (21-24)
1.5> 300 31 2.4 N.C.
(29-34)
2.0> 300 41 3.1 N.C.
(38-45)
2.5> 300 61 4.6 N.C.
(57-68)
3.0> 300 84 5.9 N.C.
(77-84)
3.5> 300 117 7.3 N.C.
(112-127)
4.0> 300 167 9.6 N.C.
(151-182) * Areas in parentheses.
N.C. = No change.
The concentration of antithrombin-III was measured in each of the samples by the immunoassay method according to Fagerhof and Abildgaard.
The figure shows the experimental results obtained for the in vitro heparinized serum samples, the heparin concentration in units / ml being plotted against the logarithm of the clotting time in seconds. Surprisingly, there is a linear relationship between the log of the clotting time and the heparin concentration over a range of 0 to 4.0 units per ml.
Attention has been paid to the factors that could interfere with the clotting time results, which are considered a measure of the antithrombin concentration. One factor that has already been mentioned is the time of sampling in relation to the heparin dosage. The antithrombin test follows close to the exponential fall curve of heparin after a plateau which lasts 30 to 45 minutes after the heparin injection. As a result, when calibrating the procedure, it is necessary that blood samples are taken no later than 30 minutes after the heparin injection.
The second factor is the presence of anticoagulant fibrin degradation products (FDP) X and Y in the blood. For this reason, the incubation time is kept short, namely 2 minutes, in contrast to the method which is described in the patent mentioned at the outset, which prescribes an incubation time of 15 minutes at 37 ° C. The method in the patent mentioned, however, is specific to the determination the concentration of fibrin breakdown products in the blood.
The incubation time of 2 minutes according to the present invention only serves to bring the sample to the desired temperature for reaction with the plasma, with little, if any, reaction with the FDP to occur during the 2 minute period.
Fragments D and E are not reactive with thrombin, but although they can interfere with fibrin polymerization, their effects on the method of the present invention are negligible. It has been found that patients with thromboembolic disorders have markedly reduced values, which eliminates the fear of interference from fragments X and Y in the determination of heparin in such patients, since these fragments would increase the clotting time.
The main advantages of the antithrombin test or AA test according to the present invention over the APIT test are twofold. First, the relationship between the AA and the heparin concentration remains linear down to about 4 units of heparin per milliliter. The heparin concentration can also be expressed in units of heparin per milliliter of serum or plasma instead of the indefinite clotting time information. The second advantage is that differences in clotting times up to levels as high as 4.0 units / ml can be determined with the aid of the present invention, while with the APTT test the results, as can be seen from the table, can be determined with over 300 seconds must be designated. In other words, the APTT test breaks down as soon as the heparin concentration reaches 1.5 units / ml.
According to Pitney, antithrombin activity is the basis for the anticoagulant effect of heparin. The involvement of a heparin-antithrombin-III (heparin cofactor) complex in the anticoagulant heparin effect is well documented. Rosenberg recently showed that thrombin inhibition by antithrombin-III is related to the formation of a strong covalent bond with the active site of the serine residue on the light subunit chain of thrombin by antithrombin. He also shows that the addition of heparin to this thrombin-antithrombin reaction mixture dramatically accelerates the rate of exposure. Similarly, heparin antithrombin is likely to inhibit other serine proteases, including plasmin and activated factors XI, IX and X.
In light of Rosenberg's observations, an essential question is how much heparin is complex-bound with antithrombin-III at any given time. The results from the table clearly show that the heparinized individuals with marked increases in the heparin concentration had no increase in antithrombin III. The increased heparin effect can therefore be attributed to the heparin component of the heparin-antithrombin III complex. It therefore appears that in heparinized individuals AA represents a quantitative measure of the heparin molecules bound to antithrombin III.
APIT are sensitive indicators of small amounts of circulating heparin, but according to Marder, therapeutic doses of heparin generally exceed the measurable limits of the test. This conclusion is confirmed by the results summarized in the table. In the APIT marten modification, the plasma is diluted in order to reduce the heparin concentration to a measurable range.
In contrast, when using the present test, namely AA, the undiluted serum can be used, and in addition there is a linear relationship between the logarithm of the antithrombin clotting time and the heparin concentration between 0 and 4.0 units per milliliter.
It should be noted that the concentrations of the various reagents used, as well as the temperature and incubation times, can be varied within a substantial range if desired. It is only necessary to determine the clotting times by the heparinization method in vitro, as mentioned above. Such a determination is within the skill of a person skilled in the art. The temperature of 37 "C has been set for incubation due to the fact that most biological laboratories carry out processes at this temperature and accordingly have such a bath available. The invention is therefore not limited to the specific concentrations, temperatures and Limited time.