CH633560A5 - METHOD FOR THE PRESERVATION OF IMMOBILIZED PROTEIN. - Google Patents
METHOD FOR THE PRESERVATION OF IMMOBILIZED PROTEIN. Download PDFInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Gebiet der Festphasenbiochemie, insbesondere auf ein Verfahren zur Konservierung von immobilisierten Eiweisstoffen in der Festphasenbiochemie werden die Fragen behandelt, die mit der Ausnutzung funktioneller Eigenschaften der Eiweisstoffe unter Bedingungen der heterogenen Systeme durch Überführung der Eiweisstoffe in den unlöslichen Zustand, hauptsächlich auf Kosten der Bildung von beständigen Bindungen mit unlöslichen (festen) Trägern verbunden sind. Die Immobilisierung (die Überführung in den unlöslichen Zustand) der Eiweisstoffe ermöglicht, diese als heterogene Katalysatoren (die Fermentingenieurie), biospezifische Sorptionsmittel, (die Affinationschromatographie) und für die immunoche-mische Analyse (immobilisierte Antikörper und Antigene) zu verwenden. Für die praktische Anwendung der immobilisierten Proteine spielt eine, wichtige Rolle die Frage deren Aufbewahrung und des Transports ohne wesentlichen Verlust an Aktivität vom Zeitpunkt der Herstellung bis zum Zeitpunkt der Verwendung. The present invention relates to a field of solid-phase biochemistry, in particular to a method for the preservation of immobilized proteins in solid-phase biochemistry, the questions which are related to the utilization of functional properties of the proteins under conditions of the heterogeneous systems by converting the proteins into the insoluble state, mainly associated with insoluble (solid) carriers at the expense of the formation of stable bonds. The immobilization (the conversion into the insoluble state) of the proteins enables them to be used as heterogeneous catalysts (the fermentation engineering), biospecific sorbents, (the affection chromatography) and for the immunochemical analysis (immobilized antibodies and antigens). For the practical application of the immobilized proteins, the question of their storage and transport plays an important role without a substantial loss of activity from the time of production to the time of use.
Das Verfahren zur Konservierung kann bei der Herstellung der Präparate von immobilisierten Fermenten, Inhibitoren, Immunoglobulinen, zur Bereitstellung der Affina-tionssorptionsmittel, der Präparate für eine schnelle und bequeme biochemische Analyse eine breite Verwendung finden und kann deswegen in der chemischen, medizinischen, mikrobiologischen Industrie sowie in der medizinischen und Laborpraxis benutzt werden. The method for preservation can be widely used in the preparation of the preparations of immobilized fermenters, inhibitors, immunoglobulins, for the preparation of the affinity sorbents, the preparations for quick and convenient biochemical analysis and can therefore be used in the chemical, medical, microbiological industry and be used in medical and laboratory practice.
Es ist bekannt und wird in der Industrie- und Laborpraxis die lyophile Trocknung der Eiweisstoffe breit angewandt, die es ermöglicht, in den meisten Fällen die nativen Eigenschaften und die funktionelle Aktivität der Eiweisstoffe voll zu erhalten. Wenn bei der lyophilen Trocknung die Aktivität teilweise oder vollständig eingebüsst wird, werden Verfahren zur Stabilisierung durch Zugabe in die Lösung vor der Trocknung verschiedener inerter fester löslicher Füllmittel vorgeschlagen (siehe, beispielsweise die US-Patentschrift 3.133.001 (1964), Klasse 195-69). It is known and widely used in industrial and laboratory practice, the lyophilic drying of the proteins, which makes it possible in most cases to fully preserve the native properties and the functional activity of the proteins. If some or all of the activity in lyophilic drying is lost, methods of stabilization by addition to the solution prior to drying various inert solid soluble fillers are suggested (see, for example, U.S. Patent 3,133,001 (1964), Class 195-69 ).
Was die immobilisierten Proteine anbetrifft, werden sie zur Zeit in Form von Suspensionen in Wasser und in wässrigen Lösungen aufbewahrt und transportiert, was bestimmte Unbequemlichkeiten schafft, die mit der Notwendigkeit, Tieftemperaturen in einem recht engen Bereich aufrechtzuerhalten, mit der Möglichkeit der mikrobiologischen Infizierung und mit einer begrenzten Aufbewahrungsfrist wegen der geringen Stabilität der Eiweisstoffe bei deren Aufbewahrung im feuchten Zustand verbunden sind. Am bequemsten ist das Verfahren zur Aufbewahrung in trockener (lyophil getrockneter) Form, weil die Haltbarkeit der Eiweisspräparate in diesem Fall von der Temperatur und der Aufbewahrungsfrist weniger abhängt. Bei der lyophilen Austrocknung büssen jedoch die am unlöslichen Träger immobilisierten Eiweiss-stoffe oft einen bedeutenden Teil ihrer nativen Eigenschaften und funktionellen Aktivität ein, dabei hängt der Grad des Aktivitätsverlustes hauptsächlich nicht von der Natur des Eiweisstoffes, sondern vom Charakter des zu benutzenden Trägers ab. So verliert beispielsweise Pepsin, das Ferment, welches bei der lyophilen Trocknung 100% Aktivität aufrechterhält, bei der lyophilen Trocknung nach der Immobilisierung am Silochrom bis 90% Aktivität (Ju.I. Krylowa, L. W. Koslow, W. K. Antonow, B. S. Gaina, E. N. Datunaschwili, N.M. Pawlenko (1976), Bioorganische Chemie 2,273-278). Somit stellt zur Zeit die Aufbewahrung und der Transport der immobilisierten Eiweisspräparate ein Problem dar. As for the immobilized proteins, they are currently being stored and transported in the form of suspensions in water and in aqueous solutions, which creates certain inconveniences associated with the need to maintain cryogenic temperatures in a fairly narrow range, with the possibility of microbiological infection and with a limited storage period due to the low stability of the proteins when stored in a moist state. The most convenient method of storage is in a dry (lyophilically dried) form, because the shelf life of the protein preparations in this case is less dependent on the temperature and the storage period. With lyophilic dehydration, however, the protein substances immobilized on the insoluble carrier often lose a significant part of their native properties and functional activity; the degree of loss of activity depends mainly not on the nature of the protein, but on the character of the carrier to be used. For example, pepsin, the ferment that maintains 100% activity in lyophilic drying, loses up to 90% activity in lyophilic drying after immobilization on the silochrome (Ju.I. Krylowa, LW Koslow, WK Antonow, BS Gaina, EN Datunaschwili, NM Pawlenko (1976), Bioorganic Chemistry 2,273-278). Thus, the storage and transportation of the immobilized protein preparations is currently a problem.
Der Erfindung wurde die Aufgabe zugrundegelegt, die in der Forschung nach einem neuen Verfahren zur Konservierung der immobilisierten Eiweisstoffe durch deren lyophile Austrocknung bestand, bei welcher die Aktivität der Präparate aufrechterhalten wird. The invention was based on the object which consisted in research into a new method for preserving the immobilized proteins by lyophilically drying them out, in which the activity of the preparations is maintained.
Die gestellte Aufgabe wurde durch ein Verfahren zur Konservierung der immobilisierten Eiweisstoffe durch lyophile Trocknung deren Suspensionen in Wasser oder in der Pufferlösung gelöst, das erfindungsgemäss dadurch gekennzeichnet wird, dass die lyophile Trocknung in Gegenwart eines inerten wasserlöslichen festen Füllmittels durchgeführt wird. The object was achieved by a method for preserving the immobilized proteins by lyophilic drying of their suspensions in water or in the buffer solution, which is characterized according to the invention in that the lyophilic drying is carried out in the presence of an inert water-soluble solid filler.
Das Gewichtsverhältnis des Füllmittels und des immobilisierten Eiweisstoffes wird in jedem konkreten Fall ausgewählt und hängt vom genommenen Füllmittel, Eiweisstoff und Träger ab, auf welchem der Eiweisstoff immobilisiert worden ist, und kann von 1:1 bis 20:1 betragen. The weight ratio of the filler and the immobilized protein is selected in each specific case and depends on the filler, protein and carrier used, on which the protein has been immobilized, and can be from 1: 1 to 20: 1.
Als inertes wasserlösliches festes Füllmittel können anorganische Salze, beispielsweise Natriumchlorid, Aminosäuren, beispielsweise Glyzin, Kohlenhydrate, beispielsweise Glukose, synthetische Polymere, beispielsweise Polyvinylpyrrolidon sowie beliebige andere Füllmittel, die wasserlöslich und gegenüber Eiweisstoff inert sein können, in Frage kommen. Inert water-soluble solid fillers that can be used are inorganic salts, for example sodium chloride, amino acids, for example glycine, carbohydrates, for example glucose, synthetic polymers, for example polyvinylpyrrolidone, and any other fillers that can be water-soluble and inert to protein.
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s s
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Der auf Aerosil (pulverartiges Silikagel) immobilisierte Eiweisstoff, beispielsweise Schweinepepsin, wird in Wasser suspendiert, das die Lösung von Polyäthylenglykol (Mol. Masse 3000) in derselben Gewichtsmenge wie das Eiweiss-präparat enthält, eingefroren und lyophil getrocknet. Das getrocknete Präparat wird in 0,01 Mol Azetatpuffer bei einem pH-Wert von 4,5 suspendiert, das Füllmittel wird durch die aufeinanderfolgenden Auswaschungen mit der Pufferlösung unter Abtrennung des Eiweisspräparats durchs Zentrifu-gieren entfernt. Man nimmt die Einwaage des feuchten Präparats des immobilisierten Ferments und bestimmt dessen Aktivität nach der Hämoglobinhydrolyse. Man bestimmt auch die Aktivität des Ausgangspräparats des immobilisierten Pepsins und die Aktivität des ohne Zugabe des Füllmittels (Polyäthylenglykol) lyophil getrockneten Präparats. The protein, for example pork pepsin, immobilized on Aerosil (powdery silica gel) is suspended in water, which contains the solution of polyethylene glycol (mol. Mass 3000) in the same amount by weight as the protein preparation, frozen and dried lyophilically. The dried preparation is suspended in 0.01 mol of acetate buffer at a pH of 4.5, the filler is removed by centrifuging the successive washes out with the buffer solution while separating the protein preparation. Weigh out the wet preparation of the immobilized ferment and determine its activity after hemoglobin hydrolysis. The activity of the starting preparation of the immobilized pepsin and the activity of the preparation lyophilized without addition of the filler (polyethylene glycol) are also determined.
Die Aktivität des Ausgangspräparats wird für 100% gehalten, dann beträgt die Aktivität des ohne Füllstoff lyophil getrockneten Präparats 9% und die Aktivität des in Gegenwart von Polyäthylenglykol lyophil getrockneten Präparats - 78%. Dadurch wird es möglich, das gegebene Verfahren zur lyophilen Trocknung, trockene Fermentpräparate zu erhalten, deren Aktivität um das 8,7fache höher ist. The activity of the starting preparation is kept at 100%, then the activity of the preparation lyophilically dried without filler is 9% and the activity of the preparation lyophilically dried in the presence of polyethylene glycol - 78%. This makes it possible to obtain the given process for lyophilic drying, dry ferment preparations, the activity of which is 8.7 times higher.
Die Erfindung gestattet, die Verluste an Aktivität und nativen Eigenschaften der immobilisierten Eiweisstoffe bei deren lyophilen Trocknung zu vermeiden und diese Präparate in der für eine längere Aufbewahrung und den Transport bequemen Form zu erhalten. Recht bequeme Träger für die Immobilisierung der Eiweisstoffe stellen anorganische Träger, insbesondere Kieselerden (Silikagele, Glas) dar. Bei der lyophilen Trocknung verlieren jedoch die auf solchen Trägern immobilisierten Eiweisstoffe ihre nativen Eigenschaften und funktionelle Aktivität fast vollständig. Im Zusammenhang damit werden diese Träger zur Herstellung der Präparate, die der Aufbewahrung unterliegen, nicht verwendet, und die darauf immobilisierten Eiweisspräparate werden industriemässig für den Verkauf nicht hergestellt, sondern unmittelbar vor dem Gebrauch bereitgestellt. Die Verwendung der Erfindung gestattet, die auf anorganischen Trägern immobilisierten Industriemuster der Eiweisspräparate herzustellen, welche in der bequemen Form - in der lyophil getrockneten Form - aufbewahrt werden können. The invention makes it possible to avoid the loss of activity and native properties of the immobilized proteins during their lyophilic drying and to obtain these preparations in the form which is convenient for longer storage and transportation. Inorganic carriers, in particular silica (silica gels, glass), are very convenient carriers for the immobilization of the proteins. However, during lyophilic drying, the proteins immobilized on such carriers lose their native properties and functional activity almost completely. In connection with this, these carriers are not used for the production of the preparations which are subject to storage, and the protein preparations immobilized thereon are not industrially produced for sale, but are provided immediately before use. The use of the invention makes it possible to produce the industrial samples of the protein preparations which are immobilized on inorganic carriers and which can be stored in the convenient form - in the lyophilically dried form.
Zum besseren Verständnis der Erfindung werden folgende Beispiele angeführt. The following examples are given for a better understanding of the invention.
Beispiel 1 example 1
Man suspendiert 20 mg des auf Aerosil immobilisierten Schweinepepsins in 1 ml Wasser, das 200 mg Glyzin enthält. Man trocknet das Gemisch lyophil. Vor dem Gebrauch suspendiert man das Präparat in 0,01 Mol Azetatpuffer beim pH-Wert von 4,5 und entfernt das Füllmittel durch die aufeinanderfolgenden Auswaschungen mit derselben Pufferlösung unter Abtrennung des Eiweisspräparats durchs Zentri-fugieren. Man entnimmt die Einwaage des feuchten Präparats des immobilisierten Ferments und bestimmt dessen Aktivität nach der Hämoglobinhydrolyse. Die Aktivität beträgt 16%, bezogen auf die Aktivität des Ausgangspräparats bis zur lyophilen Trocknung. Die lyophile Trocknung ohne Füllmittel ergibt ein Präparat mit einer Aktivität von 9%, bezogen auf den Ausgangs wert. 20 mg of porcine pepsin immobilized on Aerosil are suspended in 1 ml of water containing 200 mg of glycine. The mixture is dried lyophilically. Before use, the preparation is suspended in 0.01 mol of acetate buffer at a pH of 4.5 and the filler is removed by successive washes with the same buffer solution while separating the protein preparation by centrifugation. The weight of the moist preparation of the immobilized ferment is taken and its activity after hemoglobin hydrolysis is determined. The activity is 16%, based on the activity of the starting preparation until lyophilic drying. The lyophilic drying without filler gives a preparation with an activity of 9%, based on the initial value.
Beispiel 2 Example 2
Die Konservierung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 400 mg Glyzin hinzugesetzt. Die Aktivität des Präparats beträgt 25%. The preservation is carried out as in Example 1, except that 400 mg of glycine are added as fillers. The activity of the preparation is 25%.
Beispiel 3 Example 3
Die Konservierung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 200 mg Glyzylglyzin hinzugesetzt. The preservation is carried out as in Example 1, except that 200 mg of glycylglycine are added as fillers.
Die Aktivität des Präparats beträgt 20%. The activity of the preparation is 20%.
Beispiel 4 Example 4
Die Konservierung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 20 g Ochsenserumalbumin hinzugesetzt. Die Aktivität des Präparats beträgt 63%. The preservation is carried out as in Example 1, except that 20 g of ox serum albumin are added as filler. The activity of the preparation is 63%.
Beispiel 5 Example 5
Die Konservierung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 20 mg Glukose hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 50%. The preservation is carried out as in Example 1, except that 20 mg of glucose are added as filler. The activity is 50%.
Beispiel 6 Example 6
Die Konservierung wird wie in Beispiel 5 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 200 Glukose hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 53%. The preservation is carried out as in Example 5, except that 200 glucose are added as fillers. The activity is 53%.
Beispiel 7 Example 7
Die Konservierung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 20 mg Saccharose hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 44%. The preservation is carried out as in Example 1, except that 20 mg of sucrose are added as filler. The activity is 44%.
Beispiel 8 Example 8
Die Konservierung wird wie in Beispiel 7 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 400 mg Saccharose hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 83%. The preservation is carried out as in Example 7, except that 400 mg of sucrose are added as filler. The activity is 83%.
Beispiel 9 Example 9
Die Konservierung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 20 mg Poly vinylpyrrolidon (mit der Mol. Masse von 25000) hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 67%. The preservation is carried out as in Example 1, except that 20 mg of polyvinylpyrrolidone (with a molecular weight of 25,000) are added as fillers. The activity is 67%.
Beispiel 10 Example 10
Die Konservierung wird wie in Beispiel 9 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 200 mg Polyvinylpyrrolidon hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 75%. The preservation is carried out as in Example 9, except that 200 mg of polyvinylpyrrolidone are added as filler. The activity is 75%.
Beispiel 11 Example 11
Die Konservierung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 20 mg Dextran (mit der Mol. Masse von 50000) hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 25%. The preservation is carried out as in Example 1, except that 20 mg of dextran (with a mol. Mass of 50,000) are added as fillers. The activity is 25%.
Beispiel 12 Example 12
Die Konservierung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 20 mg Polyäthylenglykol (mit der Mol. Masse von 3000) hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 78%. The preservation is carried out as in Example 1, except that 20 mg of polyethylene glycol (with a molecular weight of 3000) are added as fillers. The activity is 78%.
Beispiel 13 Example 13
Die Konservierung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 20 mg Natriumchlorid hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 21%. The preservation is carried out as in Example 1, except that 20 mg of sodium chloride are added as filler. The activity is 21%.
Beispiel 14 Example 14
Die Konservierung wird wie in Beispiel 13 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 200 mg Natriumchlorid hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 31%. The preservation is carried out as in Example 13, except that 200 mg of sodium chloride are added as filler. The activity is 31%.
Beispiel 15 Example 15
Die Konservierung wird wie in Beispiel 13 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 400 mg Natriumchlorid hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 35%. The preservation is carried out as in Example 13, except that 400 mg of sodium chloride are added as filler. The activity is 35%.
Beispiel 16 Example 16
20 mg des auf Diatomeenerde immobilisierten Huhnpepsins werden analog dem Beispiel 1 konserviert. Als Füllmittel verwendet man 20 mg Glyzin. Die Präparataktivität, bezogen s 20 mg of the chicken pepsin immobilized on diatomaceous earth are preserved analogously to Example 1. 20 mg glycine are used as fillers. The drug activity, related s
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auf das Hämoglobin, betrë-jt nach der lyophilen Trocknung mit dem Füllmittel 60%. C ig Aktivität des lyophil getrockneten Präparats ohne Füll räUel beträgt 50%. on hemoglobin, is 60% after lyophilic drying with the filler. C ig activity of the lyophilized preparation without filling is 50%.
Beispiel 17 Example 17
Die Konservierung wird wie in Beispiel 16 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 200 mg Glyzin hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 67%. The preservation is carried out as in Example 16, except that 200 mg of glycine are added as fillers. The activity is 67%.
Beispiel 18 Example 18
20 mg des auf Sphäron Ar A 1000 («Lachema», BRNO, die Tschechoslowakei) immobilisierten Protosubtilins werden in 1 ml 0,01 Mol Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 8,0 suspendiert, der 20 mg Glukose enthält. Weiter wird die Konservierung wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Präparataktivität nach Hämoglobin beträgt nach der lyophilen Trocknung 93%. Die Aktivität des ohne Füllmittel lyophil getrockneten Präparats beträgt 80%. 20 mg of the protosubtilin immobilized on spheron Ar A 1000 ("Lachema", BRNO, Czechoslovakia) are suspended in 1 ml of 0.01 mol of phosphate buffer at a pH of 8.0, which contains 20 mg of glucose. The preservation is then carried out as in Example 1. The preparation activity after hemoglobin after lyophilic drying is 93%. The activity of the preparation lyophilically dried without filler is 80%.
Beispiel 19 Example 19
Die Konservierung wird wie in Beispiel 18 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 20 mg Polyäthylenglykol (mit der Mol. Masse von 3000) hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 86%. The preservation is carried out as in Example 18, except that 20 mg of polyethylene glycol (with a molecular weight of 3000) are added as fillers. The activity is 86%.
Beispiel 20 Example 20
20 mg des auf Enzakryl AA («Koch-Light», England) immobilisierten Protosubtilins werden analog dem Beispiel 18 konserviert. Die Präparataktivität beträgt 100%. Die Akti s vität des ohne Füllmittel lyophil getrockneten Präparats beträgt 74%. 20 mg of the protosubtilin immobilized on Enzakryl AA ("Koch-Light", England) are preserved analogously to Example 18. The drug activity is 100%. The activity of the preparation lyophilically dried without filler is 74%.
Beispiel 21 Example 21
Die Konservierung wird wie in Beispiel 20 durchgeführt, io nur werden als Füllmittel 20 mg Polyäthylenglykol (mit der Mol. Masse von 3000) hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 93%. The preservation is carried out as in Example 20, except that 20 mg of polyethylene glycol (with a molecular weight of 3000) are added as fillers. The activity is 93%.
Beispiel 22 Example 22
is 20 mg des auf Aerosil immobilisierten Ovalbuminantise-rums des Kaninchesn werden in 0,01 Mol Tris-HCl-puffer, der 20 mg Polyäthylenglykol (Mol. Masse 3000) enthält, bei einem pH-Wert von 7,6 suspendiert, eingefroren und lyophil getrocknet. Vor dem Gebrauch wird das Präparat in dem-20 selben Puffer suspendiert und das Füllmittel wird durch die Auswaschungen entfernt. Man bestimmt die Aktivität nach der (125i) Ovalbuminbindun g im Vergleich zur Ausgangsaktivität. Die Aktivität beträgt 73%. Die Aktivität des ohne Füllmittel getrockneten Präparats beträgt 12%. is 20 mg of the rabbit ovalbuminant immobilized on Aerosil are suspended in 0.01 mol of Tris-HCl buffer containing 20 mg of polyethylene glycol (mol. mass 3000) at a pH of 7.6, frozen and lyophilized dried. Before use, the preparation is suspended in the same buffer and the filler is removed by the washings. The activity is determined according to the (125i) ovalbumin bond in comparison to the starting activity. The activity is 73%. The activity of the preparation dried without filler is 12%.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PL | Patent ceased |