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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung eines Umwandlungsproduktes einer enzymatischen Reaktion aus einem Substrat mittels einer Anlage, bestehend im wesentlichen aus einem Reaktionskessel (1), einem Ultrafilter (3), einer Umwälzpumpe (2) und einem Behälter ( 10), das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein extrazelluläres Enzym zusammen mit dem Substrat einem Filtrationskreislauf unterworfen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren im Gegenstrom (Fig. 2) durchgeführt wird.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Umsatz über die Enzymaktivität und den Substratzufluss aus dem Vorratsbehälter (8) gesteuert wird.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzymaktivität über die Enzymmenge im Reaktorkessel (1) gesteuert wird.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzymaktivität durch Zugabe von Frischenzym und Ablass von verbrauchtem Enzym gesteuert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym auf einem Träger dem Reaktorkessel (1) zugeführt wird.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung eines Umwandlungsproduktes einer enzymati schen Reaktion unter Verwendung extrazellulärer Enzyme.
Es sind zahlreiche Verfahren zur Herstellung von Produkten bekannt, die durch trägergebundene Enzyme hergestellt werden können.
Die Schwierigkeiten der Regenerierung von wasserunlöslichen. trägergebundenen Enzymen führte zur Prüfung des Einsatzes des Ultrafilters bei der Enzymherstellung. Bei der Herstellung von proteolytischen Enzymen wurden dadurch höhere Enzymaktivitäten in der Fermenterbrühe erreicht [E.S.K. Chian et al., Process Biochem. 4 (9), 47(1 969)j. Die Ultrafiltration mit trägergebundenen Enzymen wird am Beispiel des Chymotrypsin von S.P. O'Neill et al., Biotech. & BR< Bioeng., 13,319(1971) beschrieben.
Keine der genannten Veröffentlichungen beschreibt ein Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung von Umwandlungsprodukten mittels Enzymen.
Die Zugabe von reinem Enzym zu einem Substrat kann wegen der hohen Kosten nur in kleinen Mengen erfolgen. Da die Reaktionsgeschwindigkeit proportional der Enzymkonzentration ist, ist die Reaktionszeit relativ lang. Ausserdem muss das Umwandlungsprodukt vom Enzym, Nebenprodukten und Verunreinigungen in einem aufwendigen Verfahren abgetrennt werden.
Bei Verwendung von fixierten Enzymen ist das Füllen und Entleeren der Kolonnen umständlich, auch lässt sich der Prozess schwer automatisieren. Die Überwachung der Kolonnen ist schwierig und die Umschaltung von einer Kolonne auf eine andere umständlich.
Es wurde nun gefunden, dass dieser Enzymierungsprozess in Zirkulation ausgeführt werden kann, und zwar so, dass in einem Reaktionskessel, welcher mit einem Ultrafilter verbunden ist, eine hohe Konzentration an Enzym aufrechterhalten wird, wobei das Reaktionsprodukt dauernd entfernt, das Enzym im Reaktionskessel zurückgehalten und das zu reagierende Ausgangsprodukt dauernd zugeführt wird. Auf diese Weise wird es möglich, eine sehr hohe Umwandlungsrate aufrechtzuerhalten, unter gleichzeitiger Zurückhaltung des Enzyms.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein kontinuierliches Verfahren zur industriellen Herstellung von Umwandlungsprodukten aus einem Substrat durch eine enzymatische Reaktion mittels extrazellulären Enzymen zu schaffen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss mit einemVerfah- ren gemäss Patentanspruch 1 gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass in extrazelluläres Enzym zusammen mit einem Substrat einem Filtrationskreislauf unterworfen wird.
Die Erfindung wird anhand der Zeichnungen näher erläutert.
Fig. 1 stellt das erfindungsgemässe Verfahren dar,
Fig. 2 gibt eine erweiterte Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens als Gegenstromanlage wieder.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird in einer Anlage gemäss Fig. 1 durchgeführt. Diese Anlage besteht im wesentlichen aus einem Reaktionskessel 1 mit Rührwerk 15 und einem Ultrafilter 3. Der Abfluss im unteren Teil des Reaktionskessels 1 führt mittels einer Rohrleitung 22, in welcher eine Pumpe 2 vorgesehen ist, in den unteren Teil des Ultrafilters 3. Ein Rohr 6 verbindet den oberen Teil des Ultrafilters 3 und des Reaktors 1. Das Ultrafilter 3 ist mit einem Abflussrohr 4 für das Filtrat versehen, an dessen Ende eine Probeentnahmevorrichtung mit einem Analysengerät 11 angebracht ist. Ein Behälter 5 dient zur Aufnahme des Filtrates. Der Enzymaustritt des Behälters 10 ist über ein Steuerventil 14 über eine Leitung 16 mit dem Reaktor 1 verbunden.
Das zu enzymierende Produkt wird aus einem Vorratstank 8 über ein Rohr
17 und eine Dosierpumpe 7 dem Reaktionskessel 1 kontinuierlich zugeführt.
Zur Automatisierung des Verfahrens sind folgende Elemente notwendig. Eine Analysenvorrichtung 11, ein Regler 12, eine Analysenvorrichtung mit Steuerventil 9, ein Regler 13 und ein Steuerventil 14.
Die Funktionsweise wird nachfolgend beschrieben:
Während des Betriebes befindet sich das zu reagierende Produkt aus dem Tank 8 im Reaktionskessel 1, zusammen mit dem Enzym aus dem Behälters 10. Die Pumpe 2 zirkuliert die Lösung durch den Ultrafilter 3, der mit einer semipermeablen Membran versehen ist, die das Enzym und grössere Moleküle zurückzuhalten vermag. Über die Leitung 4 verlässt das Filtrat mit dem enzymierten Produkt den Ultrafilter und wird in dem Behälter 5 aufgefangen. Durch das Rohr 6 zirkuliert die Enzymlösung zurück in den Reaktor 1. Das zu enzymierende Produkt wird aus dem Behälter 8 über die Dosierpumpe 7 kontinuierlich in den Reaktor 1 gepumpt. Das verbrauchte Enzym kann entweder von Zeit zu Zeit vollständig oder teilweise über das Ventil 9 aus dem Reaktor 1 abgelassen werden.
Frisches Enzym wird dem Reaktor 1 über die Leitung 16 aus dem Behälter 10 zudosiert, und zwar in Abhängigkeit von der Aktivität, die über die Mess- und Steuervorrichtung 13 gemessen und den Zufluss über das Ventil 14 steuert. Die Zufuhr des Rohproduktes aus dem Behälter 8 wird nach der Analyse der Vorrichtung 11 über den Regler 12 mittels der Pumpe 7 ger gelt. Die Zufuhr und Ablass des Enzyms aus dem Reaktor 1 oder in diesen wird nach Analyse der Vorrichtung 9 über den Regler 13 und das Ventil 14 gesteuert.
Mit Hilfe des erfindungsgemässenVerfahrens ist es möglich, die Enzymkonzentration im Reaktor 1 konstant zu halten, ebenso die Zusammensetzung des Endproduktes. Auf diese Weise ist eine raschere und kontinuierliche Enzymierung möglich. Das verbrauchte Enzym, welches über die Leitung 18 in den Auffangtrichter 19 abläuft, kann je nach dem Produkt für eine Vorreaktion im Kessel 8 oder in einem separaten Kessel verwendet werden.
Fig. 2 zeigt das erfindungsgemässeVerfahren mittels einer Batterie Reaktionskessel 1 und Ultrafiltereinheiten 3 im Gegenstromverfahren.
Aus Behälter 8 wird frisches Rohprodukt über die Dosier
vorrichtung 7 dem ersten Reaktionskessel 1 zugeführt. Das weitgehend erschöpfte Enzym wird aus dem Reaktionskessel 1' über die Pumpe 21 dem Reaktionskessel 1 zugeführt. Die Mischung im Reaktionskessel 1 wird mittels der Pumpe 2 im Kreislauf über das Ultrafilter 3 und die Leitung 6 zirkuliert.
Das Filtrat aus dem Ultrafilter 3 fliesst über die Leitung 4 in den Reaktionskessel 1'.
Frisches Enzym wird dem Reaktionskessel 1" über die Leitung 20 zugeführt und kann dank der hohen Aktivität eine vollständigere Umwandlung des Filtrates, das aus Ultrafilter 3' über die Leitung 4' dem Reaktionskessel 1" zugeführt wird, bewirken.
Das Filtrat aus dem Ultrafilter 3" wird über die Leitung 4" und die Analyseneinrichtung 11 dem Lagertank 5 zugeführt, von wo es weiterverarbeitet werden kann.
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PATENT CLAIMS
1. A method for producing a conversion product of an enzymatic reaction from a substrate by means of a system consisting essentially of a reaction vessel (1), an ultrafilter (3), a circulation pump (2) and a container (10), which is characterized in that that an extracellular enzyme is subjected to a filtration cycle together with the substrate.
2. The method according to claim 1, characterized in that the method is carried out in countercurrent (Fig. 2).
3. The method according to claims 1 and 2, characterized in that the conversion is controlled via the enzyme activity and the substrate inflow from the storage container (8).
4. The method according to claims 1 to 3, characterized in that the enzyme activity is controlled via the amount of enzyme in the reactor vessel (1).
5. The method according to claims 1 to 4, characterized in that the enzyme activity is controlled by adding fresh enzyme and draining spent enzyme.
6. The method according to claim 1, characterized in that the enzyme is supplied to the reactor vessel (1) on a support.
The invention relates to a process for the continuous production of a conversion product of an enzymatic reaction using extracellular enzymes.
Numerous processes are known for producing products that can be produced by carrier-bound enzymes.
The difficulty of regenerating water-insoluble. carrier-bound enzymes led to the testing of the use of the ultrafilter in enzyme production. As a result, higher enzyme activities in the fermenter broth were achieved in the production of proteolytic enzymes [E.S.K. Chian et al., Process Biochem. 4 (9), 47 (1 969) j. Ultrafiltration with carrier-bound enzymes is illustrated using the example of chymotrypsin from S.P. O'Neill et al., Biotech. & BR <Bioeng., 13,319 (1971).
None of the publications mentioned describes a process for the continuous production of conversion products using enzymes.
The addition of pure enzyme to a substrate can only be done in small quantities because of the high costs. Since the reaction rate is proportional to the enzyme concentration, the reaction time is relatively long. In addition, the conversion product must be separated from the enzyme, by-products and impurities in a complex process.
When using fixed enzymes, filling and emptying the columns is cumbersome, and the process is also difficult to automate. Monitoring the columns is difficult and switching from one column to another is cumbersome.
It has now been found that this enzymatic process can be carried out in circulation in such a way that a high concentration of enzyme is maintained in a reaction vessel which is connected to an ultrafilter, the reaction product being continuously removed, the enzyme being retained in the reaction vessel and the starting product to be reacted is fed continuously. In this way it becomes possible to maintain a very high conversion rate, while at the same time retaining the enzyme.
The object of the invention is to provide a continuous process for the industrial production of conversion products from a substrate by an enzymatic reaction using extracellular enzymes.
This object is achieved according to the invention by a method according to claim 1, which is characterized in that a filtration cycle is carried out in extracellular enzyme together with a substrate.
The invention is explained in more detail with reference to the drawings.
1 shows the method according to the invention,
2 shows an expanded version of the method according to the invention as a countercurrent system.
The method according to the invention is carried out in a system according to FIG. 1. This system essentially consists of a reaction vessel 1 with stirrer 15 and an ultrafilter 3. The outflow in the lower part of the reaction vessel 1 leads by means of a pipeline 22, in which a pump 2 is provided, into the lower part of the ultrafilter 3. A tube 6 connects the upper part of the ultrafilter 3 and the reactor 1. The ultrafilter 3 is provided with a drain pipe 4 for the filtrate, at the end of which a sampling device with an analysis device 11 is attached. A container 5 serves to hold the filtrate. The enzyme outlet of the container 10 is connected to the reactor 1 via a control valve 14 via a line 16.
The product to be enzymed is removed from a storage tank 8 via a pipe
17 and a metering pump 7 continuously fed to the reaction vessel 1.
The following elements are necessary to automate the process. An analysis device 11, a controller 12, an analysis device with control valve 9, a controller 13 and a control valve 14.
The mode of operation is described below:
During operation, the product to be reacted from the tank 8 is in the reaction vessel 1, together with the enzyme from the container 10. The pump 2 circulates the solution through the ultrafilter 3, which is provided with a semipermeable membrane which contains the enzyme and larger ones Able to retain molecules. The filtrate with the enzymed product leaves the ultrafilter via line 4 and is collected in the container 5. The enzyme solution circulates back into the reactor 1 through the pipe 6. The product to be enzymed is continuously pumped from the container 8 into the reactor 1 via the metering pump 7. The used enzyme can either be completely or partially discharged from the reactor 1 via the valve 9 from time to time.
Fresh enzyme is metered into the reactor 1 via the line 16 from the container 10, depending on the activity which is measured by the measuring and control device 13 and controls the inflow via the valve 14. The supply of the raw product from the container 8 is controlled after the analysis of the device 11 via the controller 12 by means of the pump 7. The supply and discharge of the enzyme from the reactor 1 or into this is carried out after the analysis of the device 9 via the controller 13 and the valve 14 controlled.
With the aid of the process according to the invention, it is possible to keep the enzyme concentration in the reactor 1 constant, as well as the composition of the end product. In this way, faster and continuous enzymes are possible. Depending on the product, the spent enzyme, which runs off via line 18 into the collecting funnel 19, can be used for a pre-reaction in the boiler 8 or in a separate boiler.
Fig. 2 shows the method according to the invention by means of a battery reaction vessel 1 and ultrafilter units 3 in the countercurrent method.
Container 8 becomes fresh raw product via the dosing
device 7 fed to the first reaction vessel 1. The largely exhausted enzyme is fed from the reaction vessel 1 'to the reaction vessel 1 via the pump 21. The mixture in the reaction vessel 1 is circulated by means of the pump 2 in a circuit via the ultrafilter 3 and the line 6.
The filtrate from the ultrafilter 3 flows via line 4 into the reaction vessel 1 '.
Fresh enzyme is fed to the reaction vessel 1 "via the line 20 and, owing to the high activity, can bring about a more complete conversion of the filtrate which is fed from the ultrafilter 3 'to the reaction vessel 1" via the line 4'.
The filtrate from the ultrafilter 3 "is fed via line 4" and the analysis device 11 to the storage tank 5, from where it can be processed further.