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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung von N,N'-bis-(3-Picolyl)-4 -methoxy-isophthalamid der Formel
EMI1.1
dadurch gekennzeichnet, dass man zu einer Lösung von 4 -Methoxy-isophthalsäure-dichlorid in Tetrahydrofuran eine Lösung von 3-Aminomethylpyridin in Tetrahydrofuran zufügt und tropfenweise in diese Suspension eine Lösung von Triäthylamin in Tetrahydrofuran einträgt und sodann die erhaltene Mischung auf Rückflusstemperatur erhitzt, anschliessend unter vermindertem Druck den Überschuss an Tetrahydrofuran abdestilliert und den Rückstand mit einem Überschuss einer gesättigten, wässrigen Natriumhydrogencarbonat Lösung, bezogen auf die theoretische gebildete Menge an HCI, aufnimmt, abfiltriert und den Filterrückstand mit Was ser wäscht, aus Äthanol auskristallisiert und aus Benzol umkristallisiert.
2. Verfahren zur Herstellung von N,N'-bis-(3-Picolyl)-4 -methoxy-isophthalamid, dadurch gekennzeichnet, dass man tropfenweise zu einer Lösung von 3-Picolylamin in Tetrahydrofuran eine Lösung von 4-Methoxy-isophthalsäure-dichlorid in Tetrahydrofuran zusetzt und die so erhaltene Mischung unter Rühren auf Rückflusstemperatur erhitzt, bis die Reaktion vollständig ist, und schliesslich dieses Reaktionsgemisch in eine gesättigte, wässrige Natriumhydrogencarbonat- Lösung eingiesst, das kristalline Produkt, das sich aus der Mischung abscheidet, abfiltriert und dieses schliesslich aus Benzol umkristallisiert.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in einen Dreihalskolben 4,7 g (0,02 Mol) 4-Methoxy-isophthalsiiure-dichlorid, die in 50 ml Tetrahydrofuran gelöst sind, einträgt, und sodann eine Lösung von 4,75 g (0,044 Mol) 3-Aminomethylpyridin, die in 50 ml Tetrahydrofuran gelöst sind, zufügt und schliesslich tropfenweise zu der gebildeten Suspension im Kolben 4,44 g (0,044 Mol) Tri äthylamin, das in 50 ml Tetrahydrofuran gelöst ist, zufügt und anschliessend während 20 Stunden diese so erhaltene Mischung auf Rückflusstemperatur erhitzt und anschliessend unter vermindertem Druck das überschüssige Tetrahydrofuran abdestililert, und man schliesslich den Rückstand mit einer gesättigten, wässrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung aufnimmt,
filtriert und den Filterrückstand mit Wasser wäscht und schliesslich aus Äthanol kristallisiert und aus Benzol umkristallisiert.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man zu 19 g 3-Picolylamin, die in 50 ml Tetrahydro furan gelöst sind, tropfenweise 4,7 g (0,02 Mol) 4-Methoxy -isophthalsiiure-dichlorid, die in 50 ml Tetrahydrofuran gelöst sind, in den Reaktionskolben zufügt, und anschliessend auf Rückflusstemperatur erhitzt, während man die Mischung 16 Stunden lang rührt und sodann, sobald die Reaktion vollständig ist, die Reaktionsmischung in eine gesättigte, wässrige Natriumhydrogencarbonat-Lösung eingiesst und das kristalline Produkt, das sich beim Stehenlassen aus der Lösung abgeschieden hat, abfiltriert und dieses aus Benzol umkristallisiert.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von N,N'-bis-(3-Picolyl)-4-methoxy-isophthalamid, das als Inhibitor bei der Blutgerinnung verwendet werden kann. Die Verbindung verhindert die Aggregation von Blutplättchen.
Der nächstliegende Stand der Technik ist das am 30. Juni 1971 eingereichte, französische Patent Nr. 7123901. Dort werden ähnliche Verbindungen, die als Antikoagulans dienen und eine fibrinolytische Wirksamkeit besitzen, beschrieben.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man zu einer Lösung von 4-Methoxy-isophthalsäure-dichlorid in Tetrahydrofuran eine Lösung von 3-Aminomethylpyridin in Tetrahydrofuran zufügt und tropfenweise in diese Suspension eine Lösung von Triäthylamin in Tetrahydrofuran einträgt und sodann die erhaltene Mischung auf Rückflusstemperatur erhitzt, anschliessend unter vermindertem Druck den Überschuss an Tetrahydrofuran abdestilliert und den Rückstand mit einem Überschuss einer gesättigten, wässrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung, bezogen auf die theoretische gebildete Menge an HCl, aufnimmt, abfiltriert und den Filterrückstand mit Wasser wäscht, aus Äthanol auskristallisiert und aus Benzol umkristallisiert.
Ein anderes Verfahren zur Herstellung der genannten Verbindung wird ausgeführt, indem man tropfenweise zu einer Lösung von 3-Picolylamin in Tetrahydrofuran eine Lösung von 4-Methoxy-isophthalsäure-dichlorid in Tetrahydrofuran zusetzt und die so erhaltene Mischung unter Rühren auf Rückflusstemperatur erhitzt, bis die Reaktion vollständig ist und schliesslich dieses Reaktionsgemisch in eine gesättigte, wässrige Natriumhydrogencarbonat-Lösung eingiesst, das kristalline Produkt, das sich aus der Mischung abscheidet, abfiltriert und dieses schliesslich aus Benzol umkristal lisieI-t.
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Verbindung weist die folgende Formel auf
EMI1.2
Empirische Formel: C2lH2QN403
Molekulargewicht: 376,4.
Diese Verbindung ist weiss und wird gewöhnlich in Form eines stabilen, kristallinen Pulvers hergestellt, welches leicht aus Benzol kristallisierbar ist, wobei der Schmelzpunkt 1240C beträgt.
In der Folge sind zwei Beispiele für das erfindungsgemässe Herstellungsverfahren von Picolylamid der 4-Methoxyisophthalsäure aus 4-Methoxy-isophthalsäure angegeben.
Bei der Ausführung dieser Beispiele können beispielsweise folgende Mengen an Reaktanten eingesetzt werden: 4-Methoxy-isophthalsäure-dichlorid (Molekulargewicht 233,061) 0,02 Mol 4,7 g 3 -Aminomethylpyridin (Molekulargewicht 108,146) 0,044 Mol 4,75 g Triäthylamin (Molekulargewicht 101,19) 0,044 Mol 4,44 g
Beispiel 1
In einem 250 m fassenden Dreihalskolben, der mit einem Rührer, einem Rückflusskühler mit einem Silikagel-Trockenrohr und der mit einem Tropftrichter ausgestattet ist, werden 4,7 g (0,02 Mol) 4-Methoxy-isophthalsäure-dichlorid in 50 ml Tetrahydrofuran gelöst, und sodann werden 4,75 g (0,44 Mol) 3-Aminomethylpyridin (3-Picolylamin), die in 50 ml Tetrahydrofuran gelöst sind, zugegeben. Es wird bezüglich des Säurechlorides ein leichter Überschuss der Base angewandt.
Zu der Suspension, die sich im Kolben gebildet hat, werden 4,44 g (0,044 Mol) Triäthylamin, die in 50 ml Tetrahydrofuran gelöst sind, tropfenweise mittels des Tropftrichters zugesetzt. Nachdem die Zugabe beendet ist, wird die Mischung während 20 Stunden unter ständigem Rühren auf Rückflusstemperatur erhitzt. Anschliessend wird das überschüssige Tetrahydrofuran unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird mit einem Überschuss einer gesättigten, wässrigen Natriumhydrogencarbonatlösung aufgenommen und anschliessend filtriert man, und der so erhaltene Filterkuchen (feste Rückstände) wird mit Wasser gewaschen und schliesslich aus Äthanol auskristallisieren gelassen und aus Benzol umkristallisiert. Der Schmelzpunkt der Substanz beträgt 1240C.
Beispiel 2
In einen 250 ml Dreihalskolben, der mit einem Rührwerk, einem Rückflusskühler mit Silikagel-Trockenrohr und einem Tropftrichter ausgerüstet ist, werden 9,5 g 3-Picolylamin, die in 50 ml Tetrahydrofuran gelöst sind, eingebracht.
Zu dieser Lösung werden 4,7 g (0,02 Mol) 4-Methoxy-isophthalsäure-dichlorid, die in 50 ml Tetrahydrofuran gelöst sind, tropfenweise mittels des Tropftrichters zugesetzt. Nachdem die Zugabe vollständig ist, wird die Mischung während 16 Stunden unter ständigem Rühren auf Rückflusstemperatur erhitzt. Am Ende der Reaktionszeit wird das im Kolben enthaltene Reaktionsgemisch in einen Überschuss einer gesättigten, wässrigen Natriumhydrogencarbonatlösung eingegossen.
Nach Ablauf einer gewissen Zeit fällt ein kristallines Produkt aus, welches nachher abfiltriert und schliesslich aus Benzol umkristallisiert wird. Der Schmelzpunkt der so erhaltenen Substanz beträgt 124"C.
Die Analyse ergab die folgenden Werte: Für C21H20N403: gefunden: C 67,19 H 6,14 N 14,68 berechnet: C 67,01 H 5,36 N 14,88
Es hat sich herausgestellt, dass N,N'-bis(3-Picolyl)-4-methoxy-isophthalamid eine deutliche Aktivität zur Verhinderung der Aggregatbildung bei Blutplättchen zeigt, und deshalb ist diese Substanz im pharmakologischen und therapeutischen Bereich nützlich. Die Aktivität der Substanz wurde in vitro und in vivo mittels des Born'schen Aggregometers getestet, wobei diese Vorrichtung die Bestimmung des Inhibierungsgrades bezüglich der Blutplättchen-Aggregation durchzuführen ermöglicht.
1. Aggregations-lnhibitou-Wirksamkeit in vitro :
Kaninchen, welchen während 12 Stunden keinerlei Nahrung, jedoch eine beliebige Menge Wasser zugeführt worden war, wurden mit 20% igem Äthylurethan, das intraperitonal in einer Dosierung von 0,6 mol/100 g Körpergewicht injiziert wurde, narkotisiert. Das Blut wird sodann über die Halsschlagader abgezogen und mit 3,8%igem Natriumcitrat in einem Verhältnis von 9 : 1 aufgenommen, und schliesslich wird während 15 Minuten bei 1000 U/min. zentrifugiert. Es wird ein Plasma erhalten, das mit Blutplättchen angereichert ist, das im folgenden als PRP bezeichnet wird.
Ein Teil dieses Plasmas wird während weiterer 10 Minuten bei 8000 U/min. zentrifugiert, wodurch man ein Plasma erhält, das bezüglich Blutplättchen abgereichert ist. Dieses Plasma wird im folgenden als PPP bezeichnet.
Das N,N'-bis(3-Picolyl)-4-methoxy-isophthalamid, welches in 1 N HC1-Lösung (oder in einer stöchiometrischen Fumarsäurelösung) gelöst und mit Phosphaten auf pH 7,4 gepuffert war, wurde in verschiedenen Konzentrationen zum PRP im Verhältnis von 0,1:1,0 des Plasmas zugesetzt und bei 37"C während 30 Minuten am Waserbad inkubiert. 1,0 ml des so behandelten PRP werden in ein Testgefäss des Born'schen Aggregometers eingebracht. Die Nullpunktsbestimmung wird mittels des PPP-Serums ausgeführt. Sodann wird die Aggregation der Blutplättchen durch Zugabe von 10-2 molarem ADP-Dinatriumsalz bewirkt.
Die Aktivität der nach dem er tindungsgemässen Verfahren hergestellten Verbindung wird aus der Inhibitorwirkung gegenüber der Aggregationskurve, wie sie mit dem gleichen Plasma des Kontrollversuches (inkubiert bei 370C am Wasserbad während 30 Minuten nach Zugabe von 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung pro ml Plasma) erhalten wurde. Der Wert des Kontrollversuches wird gleich 100 gesetzt.
2. Aggregations-It' l'ibitor-A ktiviüitsbesllninuizg in vivo :
Kaninchen, welchen während der letzten 12 Stunden keinerlei Nahrung ausser einer beliebigen Menge Wasser verabreicht wurde, werden mit 20% igem Methylurethan narkotisiert, welches intraperitonal in einer Dosis von 0,6 mit 100 g Körpergewicht injiziert wird. Das Blut wird aus der Halsschlagader entfernt, und zwar vor (im Kontrollversuch) und nach einer Stunde und 30 Minuten, bezogen auf die intraperitonale Injektion von N,N'-bis(3-Picolyl)-4-methoxy-isophthalamid, wobei die Dosierung der aktiven Substanz 25, 50, 100 bzw. 200 mg/kg Körpergewicht betrug. Die Blutproben werden mit 3,8%iger Natriumcitratlösung im Verhältnis von 9: 1 aufgenommen, und sodann zentrifugiert man bei 1000 U/min. während 15 Minuten.
Die Agregations-lnhibitor-Aktivität wird mittels der bereits für das in vitro -Verfahren beschriebenen Testmethode ermittelt, und zwar direkt an den verschiedenen behandelten Plasmaproben unmittelbar nach ihrer Zentrifugation. Die Bestätigung der in vivo -lnhibitor Wirkung der erfindungsgemäss hergestellten Verbindung gegenüber der Blutplättchen-Aggregation wurde dadurch erhalten, dass man die Verbindung intramuskulär Zwergschweinen einspritzte, und zwar in einer Dosierung von 20 mg/kg Körpergewicht als auch durch orale Behandlung von menschlichen Freiwilligen mit einer Dosis von 12 mg/kg Körpergewicht, wobei die gleiche Bestimmungsmethode der Inhibitorwirkung wie oben angewandt wurde.
Resultate:
Aufgrund der Versuche über den in vitro -Inhibitoreffekt von N,N'-bis(3-Picolyl)-4-methoxy-isophthalamid bei Kaninchen-Plasma wurde die Konzentration, die eine 50%ige Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation (IC") mittels der Probit-Analyse ermittelt. Es hat sich herausgestellt, dass die molare Konzentration der Verbindung, die eine 50%ige Aggregations-Inhibierung der Blutplättchen bewirkt, 5,2 10-4 M (IC5" in vitro ) beträgt.
Die Auswirkung der Aggregations-Inhibitor-Tests in vivo bei intraperitonal behandelten Kaninchen zeigte, dass die Dosis, welche ine 50%ige Inhibierung der Aggregation von Blutplättchen bewirkt, 108,2 mg/kg (IC,0 in vivo ) beträgt.
Bei Zwergschweinen erreichte die Aktivität der Verbindung ein Maximum von 64,50% in der vierten Stunde nach der Injektion, während die Zeitgrenze, bei welcher die Wirkung der Verbindung verschwand, bei 72 Stunden lag.
Bei Menschen wurde eine maximale Wirkung von 70,11% gefunden, und zwar 8 Stunden nach Verabreichung, während die Zeitlimite, innerhalb der die beobachtete Wirkung verschwand, auch in diesem Fall 72 Stunden betrug.
Die akute Toxizität der Verbindung wurde bestimmt, indem man intraperitonal bestimmte Mengen dieser Verbindung weissen männlichen Schweizer-Mäusen verabreichte.
Die Led30 (FL 95%)-Tests wurden gemäss der Verfahrensweise von Litchfield und Wilcoxon (I. Pharm. exp. Ther., 96, 99/1949) ausgeführt. Eine Tabelle, die die Resultate der Vergleichstests zusammenfasst, ist unten aufgeführt, wobei die erfindungsgemäss erhaltene Verbindung als G-137 bezeichnet wird.
G-137 Aspirin Heparin Fluphenamin- säure Inhibition der Plättchen-Aggregation in vitro 5,2 10-4M 9,04 10-3M 3,2 10-3M Antikoagulative Aktivität (Rekalzifikationszeit) 4,8 10-3M - 0,398 U.I./ml Fibrinolytische Aktivität in vitro 8,7 10-3M - 5,7 10-3M Antiinflammatorische Aktivität (Oedem durch Carogenin) inaktiv 74,5 mg/kg - 10,8 mg/kg DL50 1205 mg/kg 495 mg/kg - 235 mg/kg
Aufgrund dieser Resultate, und wenn man die sehr verminderte Toxizität in Betracht zieht, kann erwartet werden, dass diese Verbindung entsprechend ihrer Anwendbarkeit als Therapeutikum Verwendung finden wird, und zwar in Form von oral oder parenteral verabreichbaren Formulierungen, zwar für alle jene Anwendungsfälle, bei welchen es erwünscht ist,
die Tendenz zur spontanen Aggregation der Blutplättchen zu vermindern, z.B. bei Thrombo- und Fibrinophilia.
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PATENT CLAIMS
1. A process for the preparation of N, N'-bis (3-picolyl) -4-methoxy-isophthalamide of the formula
EMI1.1
characterized in that a solution of 3-aminomethylpyridine in tetrahydrofuran is added to a solution of 4-methoxy-isophthalic acid dichloride in tetrahydrofuran and a solution of triethylamine in tetrahydrofuran is added dropwise to this suspension and the resulting mixture is then heated to reflux temperature, then below The excess of tetrahydrofuran is distilled off under reduced pressure and the residue is taken up with an excess of a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, based on the theoretical amount of HCl formed, filtered off and the filter residue is washed with water, crystallized from ethanol and recrystallized from benzene.
2. Process for the preparation of N, N'-bis- (3-picolyl) -4-methoxy-isophthalamide, characterized in that a solution of 4-methoxy-isophthalic acid dichloride is added dropwise to a solution of 3-picolylamine in tetrahydrofuran in tetrahydrofuran is added and the resulting mixture is heated to reflux temperature with stirring until the reaction is complete, and finally this reaction mixture is poured into a saturated, aqueous sodium hydrogen carbonate solution, the crystalline product that separates out of the mixture is filtered off and this is finally eliminated Benzene recrystallized.
3. The method according to claim 1, characterized in that 4.7 g (0.02 mol) of 4-methoxy-isophthalic acid dichloride, which are dissolved in 50 ml of tetrahydrofuran, are introduced into a three-necked flask, and then a solution of 4, 75 g (0.044 mol) of 3-aminomethylpyridine, which are dissolved in 50 ml of tetrahydrofuran, are added and then 4.44 g (0.044 mol) of triethylamine, which is dissolved in 50 ml of tetrahydrofuran, are added dropwise to the suspension formed in the flask, and then added This mixture thus obtained is heated to reflux temperature for 20 hours and then the excess tetrahydrofuran is distilled off under reduced pressure, and the residue is finally taken up in a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution,
filtered and the filter residue was washed with water and finally crystallized from ethanol and recrystallized from benzene.
4. The method according to claim 2, characterized in that to 19 g of 3-picolylamine, which are dissolved in 50 ml of tetrahydrofuran, dropwise 4.7 g (0.02 mol) of 4-methoxy-isophthalic acid dichloride, which in 50 ml of tetrahydrofuran are dissolved, added to the reaction flask, and then heated to reflux temperature while stirring the mixture for 16 hours and then, as soon as the reaction is complete, the reaction mixture is poured into a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and the crystalline product that precipitated from the solution when left to stand, filtered off and recrystallized from benzene.
The present invention relates to a process for the preparation of N, N'-bis (3-picolyl) -4-methoxy-isophthalamide, which can be used as an inhibitor in blood clotting. The compound prevents the aggregation of platelets.
The closest prior art is French patent no. 7123901, filed on June 30, 1971. There, similar compounds that serve as anticoagulants and have fibrinolytic activity are described.
The process according to the invention is characterized in that a solution of 3-aminomethylpyridine in tetrahydrofuran is added to a solution of 4-methoxy-isophthalic acid dichloride in tetrahydrofuran and a solution of triethylamine in tetrahydrofuran is added dropwise to this suspension and the resulting mixture is then brought to reflux temperature heated, then the excess tetrahydrofuran was distilled off under reduced pressure and the residue was taken up with an excess of a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, based on the theoretical amount of HCl formed, filtered off and the filter residue was washed with water, crystallized from ethanol and from benzene recrystallized.
Another process for the preparation of the compound mentioned is carried out by adding dropwise a solution of 4-methoxy-isophthalic acid dichloride in tetrahydrofuran to a solution of 3-picolylamine in tetrahydrofuran and the mixture thus obtained is heated to reflux temperature with stirring until the reaction is complete and finally this reaction mixture is poured into a saturated, aqueous sodium hydrogen carbonate solution, the crystalline product that separates out of the mixture is filtered off and this is finally recrystallized from benzene.
The compound produced by the process of the present invention has the following formula
EMI1.2
Empirical formula: C2lH2QN403
Molecular weight: 376.4.
This compound is white and is usually produced in the form of a stable, crystalline powder, which can easily be crystallized from benzene, with a melting point of 1240C.
In the following, two examples are given for the production process according to the invention of picolylamide of 4-methoxyisophthalic acid from 4-methoxy-isophthalic acid.
When carrying out these examples, the following amounts of reactants can be used, for example: 4-methoxy-isophthalic acid dichloride (molecular weight 233.061) 0.02 mol 4.7 g 3-aminomethylpyridine (molecular weight 108.146) 0.044 mol 4.75 g triethylamine (molecular weight 101 , 19) 0.044 mole 4.44 g
example 1
4.7 g (0.02 mol) of 4-methoxyisophthalic acid dichloride are dissolved in 50 ml of tetrahydrofuran in a 250 m three-necked flask equipped with a stirrer, a reflux condenser with a silica gel drying tube and a dropping funnel , and then 4.75 g (0.44 mol) of 3-aminomethylpyridine (3-picolylamine) dissolved in 50 ml of tetrahydrofuran are added. A slight excess of the base is used with respect to the acid chloride.
4.44 g (0.044 mol) of triethylamine dissolved in 50 ml of tetrahydrofuran are added dropwise through the dropping funnel to the suspension which has formed in the flask. After the addition is complete, the mixture is heated to reflux temperature for 20 hours with constant stirring. The excess tetrahydrofuran is then distilled off under reduced pressure. The residue is taken up with an excess of a saturated, aqueous sodium hydrogen carbonate solution and then filtered, and the filter cake thus obtained (solid residues) is washed with water and finally left to crystallize from ethanol and recrystallized from benzene. The melting point of the substance is 1240C.
Example 2
9.5 g of 3-picolylamine dissolved in 50 ml of tetrahydrofuran are introduced into a 250 ml three-necked flask equipped with a stirrer, a reflux condenser with a silica gel drying tube and a dropping funnel.
4.7 g (0.02 mol) of 4-methoxy-isophthalic acid dichloride, which are dissolved in 50 ml of tetrahydrofuran, are added dropwise to this solution using the dropping funnel. After the addition is complete, the mixture is heated to reflux temperature for 16 hours with constant stirring. At the end of the reaction time, the reaction mixture contained in the flask is poured into an excess of a saturated, aqueous sodium hydrogen carbonate solution.
After a certain time, a crystalline product precipitates, which is then filtered off and finally recrystallized from benzene. The melting point of the substance obtained in this way is 124 "C.
The analysis gave the following values: For C21H20N403: found: C 67.19 H 6.14 N 14.68 calculated: C 67.01 H 5.36 N 14.88
It has been found that N, N'-bis (3-picolyl) -4-methoxy-isophthalamide shows a marked activity for preventing platelet aggregation, and therefore this substance is useful in pharmacological and therapeutic fields. The activity of the substance was tested in vitro and in vivo by means of the Born aggregometer, this device making it possible to determine the degree of inhibition with regard to platelet aggregation.
1. Aggregation inhibitou activity in vitro:
Rabbits which had not been fed any food for 12 hours but had been given an arbitrary amount of water were anesthetized with 20% ethyl urethane injected intraperitoneally at a dose of 0.6 mol / 100 g body weight. The blood is then withdrawn via the carotid artery and taken up with 3.8% sodium citrate in a ratio of 9: 1, and finally, for 15 minutes at 1000 rpm. centrifuged. A plasma is obtained which is enriched with blood platelets, which is hereinafter referred to as PRP.
A portion of this plasma is for a further 10 minutes at 8000 rpm. centrifuged to obtain a plasma depleted in platelets. This plasma is referred to below as PPP.
The N, N'-bis (3-picolyl) -4-methoxy-isophthalamide, which was dissolved in 1N HCl solution (or in a stoichiometric fumaric acid solution) and buffered to pH 7.4 with phosphates, was used in various concentrations PRP was added in a ratio of 0.1: 1.0 to the plasma and incubated at 37 ° C. for 30 minutes in a water bath. 1.0 ml of the PRP treated in this way was placed in a test vessel of the Born aggregometer. The zero point was determined using the The platelets are then aggregated by adding 10-2 molar ADP disodium salt.
The activity of the compound prepared according to the process according to the invention is determined from the inhibitory effect on the aggregation curve as obtained with the same plasma of the control experiment (incubated at 370C on a water bath for 30 minutes after adding 0.1 ml of physiological saline per ml of plasma) . The value of the control experiment is set equal to 100.
2. Aggregation-It'l'ibitor-A ktiviüitsbesllninuizg in vivo:
Rabbits which have not been given any food other than any amount of water during the last 12 hours are anesthetized with 20% methyl urethane, which is injected intraperitoneally at a dose of 0.6 with 100 g body weight. The blood is removed from the carotid artery before (in the control experiment) and after one hour and 30 minutes, based on the intraperitoneal injection of N, N'-bis (3-picolyl) -4-methoxy-isophthalamide, with the dosage the active substance was 25, 50, 100 and 200 mg / kg body weight, respectively. The blood samples are taken up with 3.8% sodium citrate solution in a ratio of 9: 1, and they are then centrifuged at 1000 rpm. for 15 minutes.
The aggregation inhibitor activity is determined by means of the test method already described for the in vitro method, specifically directly on the various treated plasma samples immediately after their centrifugation. Confirmation of the in vivo inhibitor effect of the compound prepared according to the invention against platelet aggregation was obtained by injecting the compound intramuscularly into miniature pigs, in a dosage of 20 mg / kg body weight and by oral treatment of human volunteers with a Dose of 12 mg / kg body weight, using the same method of determining the inhibitory effect as above.
Results:
On the basis of the tests on the in vitro inhibitor effect of N, N'-bis (3-picolyl) -4-methoxy-isophthalamide in rabbit plasma, the concentration which means a 50% inhibition of platelet aggregation (IC ") was determined It has been found that the molar concentration of the compound which causes a 50% inhibition of aggregation of the blood platelets is 5.2 10-4 M (IC5 "in vitro).
The effect of the in vivo aggregation inhibitor tests on intraperitoneally treated rabbits showed that the dose which produced a 50% inhibition of the aggregation of platelets was 108.2 mg / kg (IC, 0 in vivo).
In miniature pigs, the activity of the compound reached a maximum of 64.50% in the fourth hour after injection, while the time limit at which the effect of the compound disappeared was 72 hours.
In humans, a maximum effect of 70.11% was found 8 hours after administration, while the time limit within which the observed effect disappeared was also 72 hours in this case.
The acute toxicity of the compound was determined by intraperitoneally administered certain amounts of this compound to white male Swiss mice.
The Led30 (FL 95%) tests were carried out according to the procedure of Litchfield and Wilcoxon (I. Pharm. Exp. Ther., 96, 99/1949). A table summarizing the results of the comparative tests is shown below, and the compound obtained by the present invention is designated as G-137.
G-137 Aspirin Heparin Fluphenamic acid Inhibition of platelet aggregation in vitro 5.2 10-4M 9.04 10-3M 3.2 10-3M Anticoagulative activity (recalcification time) 4.8 10-3M - 0.398 UI / ml Fibrinolytic Activity in vitro 8.7 10-3M - 5.7 10-3M Anti-inflammatory activity (edema due to carogenin) inactive 74.5 mg / kg - 10.8 mg / kg DL50 1205 mg / kg 495 mg / kg - 235 mg / kg
On the basis of these results, and taking into account the very reduced toxicity, it can be expected that this compound will find use as a therapeutic agent according to its applicability, namely in the form of orally or parenterally administrable formulations, indeed for all those applications in which it is desirable
reduce the tendency for spontaneous aggregation of platelets, e.g. with thrombo- and fibrinophilia.