Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung neuer Peptide der Formel I
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worin X für H-Ala, H-D-Ala, H-p-Ala, Propionyl oder Ac-Ala steht (wobei Ac eine Acylgruppe bedeutet), Y für Wasserstoff steht oder eine direkte Bindung zwischen den Schwefelatomen in Stellung 3 und 14 bedeutet und Z für die Reste -COOH, -COOR1 (wobei R1 eine niedere Alkylgruppe bedeutet),
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(wobei R2 und R3 unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe bedeuten) und -CH2OH steht, sowie Säureadditionssalze und Komplexe der neuen Peptide.
Steht Ac für eine Acylgruppe, so bedeutet dies vorzugsweise den Formyl-, Acetyl-, Benzol-, Palmitoyl- oder den Trifluoracetylrest. Falls R1, R2 oder R & eine niedere Alkylgruppe bedeutet, so enthält diese niedere Alkylgruppe 1 bis 5, vorzugsweise 1 bis 3 Kohlenstoffatome und stellt insbesondere Methyl dar.
Die Peptide der obigen Formel, worin X, Y und Z obige Bedeutung haben, seine Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe können nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden. Hierbei werden die Aminosäuren bzw. deren Derivate in der in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach Bildung kleinerer Peptideinheiten kondensiert, indem man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit geschützer terminaler Carboxylgruppe und freier a-Aminogruppe umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Aminogruppe und geschützer terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter a-Aminogruppe umsetzt,
wobei jeweils gleichzeitig die an der Reaktion nicht beteiligten freien funktionellen Gruppen geschützt werden, nach Beendigung der Kondensation die nicht mehr benötigten Schutzgruppe abspaltet, wobei man gegebenenfalls zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese nach an sich bekannten Methoden die Carboxylgruppe des endständigen Aminosäurerestes in Stellung 14 in eine -COORl- (wobei R1 eine niedere Alkylgruppe bedeutet), eine
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(wobei R2 und R3 unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe bedeuten) oder eine -CH2OH-Grup- pe überführt, gegebenenfalls nach Bildung der Teilsequenz 3 bis 14 die Mercaptogruppen in der Stellung 3 und 14 oxydiert und die so erhaltenen Peptide obiger Formel in ihre therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze oder Schwermetallkomplexe überführt.
Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Überführung in ein Säureazid, -anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid oder einen aktiverten Ester oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimids oder N,N'-Carbodiimidazols aktiviert werden.
AIs gebräuchlichste Methoden sind zu nennen die Car- bodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die Anhydridmethode, ferner die Merrifield-Methode.
An der Reaktion nicht beteiligte freie funktionelle Gruppen können beim Aufbau der erfindungsgemässen Peptide durch die von den Synthesen langkettiger Peptide her bekannten Schutzgruppen geschützt werden. Für die Blockierung der Carboxylgruppe wird vorzugsweise die tert.-Butyloxygruppe verwendet, doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die Äthoxy-, die tert.-Amyloxy-, die Amidoder die Benzyloxygruppe in Frage. Für die Blockierung einer Aminogruppe, insbesondere der e"-Aminogruppe des Lysinrestes, kann eine Carbo-tert.-alkoxygruppe, vorzugsweise die Carbo-tert.-butoxygruppe verwendet werden. Die Mercaptogruppen der Cysteinreste können z.K. durch Acylgruppen oder vorzugsweise durch gegebenenfalls substituierte Arylmethylgruppen wie Benzyl, p-Nitrobenzyl, Diphenylmethyl oder Trityl geschützt werden.
Die Umwandlung einer geschützten Mercapto- oder Aminogruppe in eine freie Gruppe sowie die Umwandlung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe im Laufe des Verfahrens zur Herstellung der erfindungsgemässen Peptide erfolgt nach an sich bekannten Methoden, durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln. Die Oxydation der Mercaptogruppe in den Stellungen 3 und 14 zu den S,S-Brücke erfolgt mittels Sauerstoff oder Kaliumferricyanid.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung der erfindungsgemässen Peptide können, sofern sie bisher nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Säureadditionssalze und Komplexe der neuen Peptide der Formel I.
Als Säureadditionssalze kommen solche mit organischen Säuren, polymeren Säuren und Salze mit anorganischen Säuren in Frage.
Unter Komplexen sind in ihrer Struktur noch nicht abgeklärte Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz anorganischer Salze, die sich von Metallen wie Calcium, Magnesium, Mangan, Aluminium, Cobalt und Zink ableiten (vor allem Halogenide, Phosphate, Pyrophosphate und Polyphosphate) und/oder beim Zusatz polymerer organischer Stoffe wie Polyoxygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Schwefelsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextran, Polyphenolen und Polyalkoholen zum Peptid der obigen Formel entstehen.
Die erfindungsgemäss hergestellten Peptide haben therapeutische Bedeutung für alle Indikationsgebiete, in welchen eine Hemmung der GH-Sekretion erwünscht ist. Im Vordergrund steht die Verwendung beim Diabetes Mellitus, die Behandlung der Acromegalie, der Angiopathie sowie der Einsatz dieser Verbindungen zu diagnostischen Zwecken.
Die Dosierung bei Säugetieren beträgt 0,5-500 Il,g/kg.
Beim Menschen liegt die Dosierung bei 1,0-1000 ,çg/kg.
Es wurde ferner gefunden, dass sich die Wirkungsdauer der neuen Peptide in Form von Injektionspräparaten um mehrere Stunden verlängern lässt, wenn ein neues Peptid obiger Formel in Form eines der angeführten Komplexe vorliegt.
Die erfindungsgemäss hergestellten Peptide können als Heilmittel, z.B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden: Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial.
Sie können auch in Form eines Depotpräparates verwendet werden.
Es-werden folgende Abkürzungen verwendet:
Ala = L-Alanyl
D-Ala = D-Alanyl ss-Ala - ss-Alanyl
Gly = Glycyl
Lys = L-Lysyl
Asn = L-Asparaginyl
Phe = L-Phenylalanyl
Trp = L-Tryptophanyl
Thr = L-Threonyl
Ser = L-Seryl
Cys = L-Cysteinyl
BOC = tert. -Butyloxycarbonyl
Cbo = Carbobenzoxy
MBzl = p-Methoxybenzyl
OMe = Methoxy
OCP = 2,4,5-Trichlorphenyloxy
In den nachfolgenden Beispielen, welche die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel 1
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0,7 g (BOC)Ala-Gly-Cys(MBzl )-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe -Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Ser-Cys(MBzl )-OBzl werden mit 3,3 ml Anisol und 3,5 g Indol versetzt. Zu dieser Mischung kondensiert man unter Trockeneiskühlung ca. 40 ml Fluorwasserstoff, anschliessend rührt man 1 Stunde bei 0 . Der Fluorwasserstoff wird im Vakuum entfernt, der Rückstand mit Essigester verrührt und filtriert. Man wäscht mit Essigester und Äther. Der Rückstand wird in wenig 5% Essigsäure gelöst und durch Chromatographie an Sephadex G 25 im System 0,01 m 2-Mercapto-Athanol in 5% Essigsäure gereinigt. Fraktionen, welche das gewünschte Produkt enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert.
Man erhält die Titelverbindung
Smp. 216 ; [z]D20 = 340 (c = 1 in 0,5 n Essigsäure).
Das als Ausgangsmaterial verwendete (BOC)Ala-Gly -Cys (MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-Lys(Cbo);Thr-Phe-Thr- -Ser-Cys(MBzl)-OBzl wird wie folgt hergestellt: a) Cbo-Asn-Phe-Phe-OMe
85 g Cbo-Phe-Phe-OMe werden in 850 ml HBr/CHsCOOH 4-n gelöst und nach einer Stunde auf ca. 2/3 eingeengt. Man fällt mit 3 Liter Äther und nutscht ab.
Man erhält H-Phe-Phe-OMe HBr.
Smp. 196 ; 1D20 = + 8,1 in Dimethylsulfoxyd (c= 1).
40 g H-Phe-Phe-OMe HBr werden in 400 ml Dimethylformamid gelöst und mit 44 g Cbo-Asn-OCP und 16 ml Tri äthylamin versetzt. Nach 16 Stunden Stehen bei Raumtemperatur wird die Lösung im Vakuum eingedampft und der Rückstand in Isopropanol aufgekocht. Nach Abkühlen wird abgenutscht und mit Isopropanol und Methanol nachgewaschen. Man erhält Cbo-Asn-Phe-Phe-OMe.
Smp. 226 ; friju20 = -18,7 in Dimethylsulfoxyd (c = 1,10 > .
b) BOC-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe
77 g Cbo-Asn-Phe-Phe-OMe werden in 780 ml HBr/ CH3COOH 4-n gelöst und 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Einengen wird mit 3 Liter Äther gefällt und abgenutscht. Nach Trocknen erhält man H-Asn -Phe-Phe-OMe. HBr.
Smp. 195 ; [z1n20 = +4 in Dimethylsulfoxyd (c = 1).
51 g BOC-Lys(Cbo)-OH und 19 ml Triäthylamin werden in 500 ml Tetrahydrofuran gelöst und bei-10 mit 13 ml Chlorameisensäureäthylester versetzt. Nach 5 Minuten wird eine Lösung von 72 g H-Asn-Phe-Phe-OMe Hbr und 23 ml Triäthylamin in 800 ml Dimethylformamid zugetropft. Nach 6 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird eingedampft und mit Chloroform versetzt. Der Niederschlag wird abgenutscht, mit Chloroform und Äthanol nachgewaschen.
Man erhält BOC-Lys(Cbo)-Asn-Asn-Phe-OMe.
Smp. 187 ; [αD]20 = -22,4 in Dimethylsulfoxyd (c = 1,0).
c) BOC-Cys(MBzl)-Lys(Bbo)-Asn-Phe-Phe-OMe.
74 g BOC-Lys(Cbo)rAsn-Phe-Phe-OMe werden in 750 ml Trifluoressigsäure/Methylenchlorid (9 1) gelöst. Nach 1 Stunde wird eingeengt und mit Äther gefällt. Die ausgefallene Substanz wird abgenutscht und mit Äther nachgewaschen.
Man erhält H-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe als Trifluoracetat.
Smp. 2160; [aD]20 = -5,0 in Dimethylsulfoxyd (c = 1,0).
19 g H-Lys(Cbo-Asn-Phe-Phe-OMe Trifluoracetat und 15 g BOC-Cys(MBzl)-OMe werden in 150 ml Dimethylformamid und 6,5 ml Triäthylamin gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei Raumtemperatur wird eingeengt und mit Äther gefällt. Die Substanz wird mit Äther, Äthanol, Aceton nachgewaschen und getrocknet.
Man erhält BOC-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe -OMe.
Smp. 212 ; [aD]20 = -20,7 in Dimethylsulfoxyd (c= 1,0).
d) BOC-Cly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe.
22 g BOC-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe werden in 220 ml Trifluoressigsäure/Methylenchlorid (9 1) gelöst und eine Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen.
Nach Einengen wird mit Äther gefällt und abgenutscht.
Nach Trocknen erhält man H-Cys(MBz)l-Lys(Cbo)-Asn -Phe-Phe-OMe als Trifluoracetat.
Smp. 195 ; [i20D = -6,2 in Dimethylsulfoxyd (c= 1,0).
4,5 g BOC-Gly-OH und 3,6 ml Triäthylamin werden in 50 ml Tetrahydrofuran gelöst und bei 100 mit 2,5 ml Chlorameisensäureäthylester versetzt. Nach 10 Minuten tropft man eine Lösung von 24 g H-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe -OMe Trifluoracetat und 6,0 ml Triäthylamin in 250 ml Dimethylformamid zu. Nach 3 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand mehrmals mit Äther, Äthanol und Aceton nachgewaschen.
Man erhält BOC-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asu-Phe-Phe -OMe.
Smp. 11"; [a]D2o = - 17,0 in Dimethylsulfoxyd (c= 1,0).
e) Cbo-Ala-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe.
19 g BOC-Bly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe werden in 190 ml Trifluoressigsäure/Methylenchlorid (9:1) gelöst und eine Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen.
Nach Einengen im Vakuum wird mit Äther gefällt und abgenutscht.
Man erhält H-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe -OMe als Trifluoracetat.
Smp. 1910; [n2o = -5,3 in Dimethylsulfoxyd (c=1,0).
2,7 g Cbo-Ala-OH und 1,7 ml Triäthylamin werden in
30 ml Tetrahydrofuran gelöst und bei 100 mit 1,2 ml Chlorameisensäureäthylester versetzt. Nach 10 Minuten Rühren wird eine Lösung von 11 g H-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo) -Asn-Phe-Phe-OMe Trifluoracetat und 2,8 ml Triäthylamin zugetropft. Nach 6 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird eingeengt und mit Äther, Isopropanol und Methanol nachgewaschen.
Man erhält Cbo Ala-Gly(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe -Phe OMe.
Smp. 2190; [D20 = - 190 in Dimethylsulfoxyd.
f) Cbo-Ala-Gly-Cys(MBzl)Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-NHNH2
Man löst 12 g Cbo-Ala-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn -Phe-Phe-OMe in 120 ml Dimethylformamid auf und versetzt mit 3 ml Hydrazinhydrat. Nach 16 Stunden Stehen bei Raumtemperatur wird die Lösung eingeengt und mit Äther gefällt. Der Rückstand wird abgenutscht und mit Äthanol und Äther nachgewaschen.
Man erhält Cbo-Ala-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe- -Phe-NHNH2.
Smp. 2500; FlD20 = -20,6 in Dimethylsulfoxyd (c=1,0).
g) BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe.
17 g Cbo-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe werden in einem Gemisch von Methanol/Dimethylformamid gelöst, mit Palladiumkohle versetzt und bei Raumtemperatur unter Normaldruck hydriert. Man filtriert den Katalysator ab und dampft im Vakuum ein. Der erhaltene Rückstand, 10,7 g BOC-Lys (Cbo)-OH und 4,2 g Hydroxybenzotriazol, wird in 80 ml Dimethylformamid gelöst, auf -5 abgekühlt und versetzt mit 3,2 ml N-Methylmorphblin und einer Lösung von 6,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 30 ml Dimethylformamid.
Man rührt über Nacht bei Raumtemperatur, ausgefallener Dicyclohexylhamstoff wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird in Essigester gelöst und gewaschen mit 5% Natriumbicarbonat und Wasser. Die Essigesterphase wird über Natriumsulfat getrocknet und anschliessend eingeengt. Das ausgefallene Produkt wird abfiltriert und mit Essigester/Äther gewaschen.
Man erhählt BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe.
Smp. 1300; [αD]D20 = -7 in Dimethylformamid.
h) BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-NHNH
Man löst 7 g BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe in einem Gemisch von Dimethylformamid und Methanol, gibt 8 ml Hydrazinhydrat zu und lässt über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Das Reaktionsgemisch wird mit Wasser versetzt, gut verrührt, ausgefallenes Produkt abfiltriert, der Rückstand mit Wasser gewaschen und getrocknet.
Man erhält BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-NHNH2.
Smp; 1980; EX]D20 = -5 in Dimethylformamid.
i) BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-OBzl
2,3 g BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-NHNH2 werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst, auf 200 abgekühlt, mit 1,8 ml 5,5 N Salzsäure in Äther, dann 0,33 ml tert.-Butylnitrit versetzt und 5 minuten bei -15 gerührt. Nach Zugabe von 1,45 ml Triäthylamin bei 200 filtriert man ausgefallenes Triäthylamin-Hydrochlorid ab und vereinigt das Filtrat mit einer kalten Lösung von 1,86 g H-Cys(MBzl) -OBzl in 6 ml Dimethylformamid. Man lässt über Nacht bei 0 stehen, verrührt darauf das Reaktionsgemisch mit 500 ml Äther und filtriert das ausgefallene Material ab. Der Rückstand wird in einem Gemisch von Methanol/Dimethylformamid gelöst und anschliessend unter Rühren mit Wasser versetzt.
Ausgefallenes Produkt wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe -Tbr-Ser-Cys(MBzo)-OBzl.
Smp. 169 ; [r1,20 = 160 in Dimethylforniamid.
j) BOC-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-OBzl
2,3 g BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Lys(MBzl)-OBzl werden in einem Gemisch von 10 ml Methylenchlorid und 6 ml Trifluoressigsäure gelöst und 25 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschliessend wird H-Lys(Cbo > - -Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-OBzl Trifluoracetat mit Äther gefällt, abfiltriert und gut mit Äther ausgewaschen. Der Rückstand wird in 7 ml Dimethylformamid gelöst, mit 1,5 g BOC-Trp-OCP und mit 0,3 ml Triäthylamin versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Produkt wird mit Äther-Essigester (1:1) ausgefällt und filtriert.
Man trocknet und erhält die Titelverbindung.
Smp. 1670; [α]D20 = - 17,50 in Dimethylformamid.
k) Cbo-Ala-Gly(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys (Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-OBzl.
1,32 g BOC-Trp-Lys(Cbo)-Trp-Phe-Thr-Ser(MBzl).
-OBzl werden gelöst in 15 ml Methylenchlorid und versetzt mit 1,1 mi Anisol, 1,2 g Indol und zuletzt mit rs ml Trifluoressigsäure. Man lässt 40 Minuten bei Raumtemperatur stehen und fällt anschliessend mit Äther. Nach filtrieren, waschen mit Äther und trocknen erhält man H-Trp-Lys(Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl )-OBzl.
1,2 g Cbo-Ala-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe -NHNH2 werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst, auf -20 abgekühlt und mit 0,64 ml 5,5 N Salzsäure in Äther, dann 0,12 ml tert.-Butylnitrit versetzt und 5 Minuten bei -15 gerührt. Man gibt 0,5 ml Triäthylamin zu, filtriert ausgefallenes Triäthylamin-Hydrochlorid ab und vereinigt das Filtrat mit einer kalten Lösung von 1,3 g H-Trp-Lys(Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-OBzl Trifluoracetat in 5 ml Dimethylformamid. Man lässt über Nacht bei 0 stehen, verrührt mit 150 ml Methanol, filtriert, wäscht den Rückstand mit Methanol und Essigester, trocknet und erhält die Titelverbindung.
Smp. 245 ; [α]D20 = 170 in Dimethylformamid.
Beispiel 2
EMI3.1
Man löst 1,0 g der Titelverbindung nach Beispiel 1 in 6000 ml Wasser und stellt den pH mit 4-n Ammoniumhydroxyd-Lösung auf pH 7,7. Man versetzt mit ca. 120 ml 0,02 molaren Kaliumferricyanid-Lösüng und lässt 45 Mi- nuten bei 20 Rühren. Der pH der Lösung wird mit 50% Essigsäure auf ca. pH 5 gestellt und durch eine Säule von 200 ml Bio-Rad AG 3/X4 gelassen. Die Lösung wird auf 500 ml eingeengt und von unlöslichen Produkten durch Zentrifugation getrennt. Die klare wässrige Phase wird lyophilisiert und mittels Sephadex G-25 in verdünnter 2%iger Essigsäure chromatographiert. Die chromatographisch einheitliche Fraktionen werden vereinigt und nach Einengen lyophilisiert.
Man erhält die reine Titelverbindung.
Smp. 220 ; [aln20 = -29 , c=0,5 ACOH 0,1 n (c = 1,0).
Aminosäureanalyse gefunden:
Ala1,0,Asn1,0, 1/2 Cys1,8,Gly0,9, Lys2,0,Phe3,0, Ser0,9, Thr0,9, Trp0,9.
Beispiel 3
EMI4.1
Analog zu Beispiel 1 a bis k baut man Cbo-D-Ala-Gly -Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe- -Thr-Ser-Cys(MBzl)-OBzl auf, wobei in der Zwischenstufe e Cbo-D-Ala-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe, Smp. 219-220 ; [am20 = -16,4, c = 1,0 in Dimethylformamid eingesetzt wird und behandelt anschliessend wie in Beispiel 1 angegeben mit flüssigem Fluorwasserstoff. Man erhält die Titelverbindung vom Smp. 225 (Zers.); [α]D20 = -27 in ACOH 0,1-n (c = 1,0).
Beispiel 4
EMI4.2
Nach Oxydation der in Beispiel 3 erhaltenen Titelverbindung mittels Kaliumferricyanid, Behandlung mit Bio-Rad AG 3X/4 und anschliessende Chromatographie mit Sephadex G-25 (verdünnte Essigsäure) erhält man die Titelverbindung.
Smp. 2450 (Zers.); [a]n20 = 310, c = 1,0 in ACOH 0,1 n.
Aminosäureanalyse gefunden:
Ala1,0,Asn1,0, 1/2 Cys1,8, Gly1,0, Lys2,2, Phe3,1, Ser0,9, Thr1,8, Trp0,9.
Beispiel 5
EMI4.3
Analog Beispiel 1 a bis k baut man Cbo-Ala-Gly-Cys (MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr -Ser-Cys(MBzl)-NH2 auf, wobei in der Zwischenstufe BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(MBzl)-NH2, Smp. 205 ; [am20 = 14,80, c = 1 (Dimethylformamid) eingesetzt wird. Anschliessend behandelt man wie in Beispiel 1 angegeben mit flüssigem Fluorwasserstoff. Man erhält die Titel verbindung vom Smp. 218 (Zers.); [α]D20 = 210, c = 1,0 in ACOH 0,1 n.
Beispiel 6
EMI4.4
Nach Oxydation der in Beispiel 4 erhaltenen Titelverbindung mit Kaliumferricyanid und Chromatographie an Sephadex G-25 erhält man die Titelverbindung vom Smp. 251"; [α]D20 = -32 , c = 1,0 in ACOH 0,1 n Aminosäureanalyse gefunden:
Ala1,0, Asn1,0, 1/2 Cys1,8, gly0,9, Lys2,2, Phe3,0, Ser0,9, Thr0,9, Trp0,8.
Beispiel 7
EMI4.5
Analog Beispiel 1 a bis k baut man Cbo-ss-Ala-Gly-Cys- (MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr -Ser-Cys(MBzl)-OBzl auf und behandelt anschliessend wie in Beispiel 1 angegeben mit flüssigem Fluorwasserstoff. Man erhält die Titelverbindung vom Smp. 229-230 (Zers.); [α]D20 = -380,c = 1,0 in ACOH 0,1 n.
Beispiel 8
EMI4.6
Nach Oxydation der in Beispiel 7 erhaltenen Titelverbindung mittels Kaliumferricyanid und anschliessen der Aufarbeitung wie in Beispiel 2 angegeben, erhält man die Titelverbindung vom Smp. 2360 (Zers.); [α]D20 = 240, c= 1,0 in ACOH 0,1 n.
Aminosäureanalyse gefunden: ss-Ala0,9, Asn0,9, 1/2 Cys1,8, Gly1,0, Lys2,0, Phe3,0, Ser0,9, Thr0,8, Trp0,9.
Beispiel 9
EMI5.1
Analog Beispiel 1 a bis k baut man Cbo-Ala-Gly-Cys {MBzl)-Lys(Cbo),-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-
EMI5.2
auf, wobei in der Zwischenstufe j
EMI5.3
eingesetzt wird. Anschliessend behandelt man wie in Beispiel 1 angegeben mit flüssigem Fluorwasserstoff. Man erhält die Titelverbindung.
Smp. 238 (Zers.); [α]D20 = 370, c = 1,0 in ACOH 0,1 n.
Beispiel 10
EMI5.4
Nach Oxydation der in Beispiel 9 erhaltenen Titelverbindung mittels Kaliumferricyanid und anschliessender Aufarbeitung wie in Beispiel 2 angegeben, erhält man die Titelverbindung.
Smp. 230 (Zers) [α]D20 = -19 , c = 1,0 n ACOH 0,1 n.
Aminosäureanalyse gefunden:
Ala0,9, Asn0,9, 1/2 Cys0,9, Gly1,0, Lys2,2, Phe3,0, Ser0,9, Thr0,8, Trp0,8.
Beispiel 11
EMI5.5
Analog Beispiel 1 a bis k baut man Cbo-D-Ala-Gly -Cys(MBzl)-Lys(Cbo) -Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Cbo)-Thr-Phe- -Thr-Ser-Cys(MBzl)-NH2 auf, wobei in der Zwischenstufe e Cbo-D-Ala-Gly-Cys(MBzl)-Lys(Cbo)-Asn-Phe-Phe-OMe und in der Zwischenstufe j BOC-Lys(Cbo)-Thr-Phe-Thr-Ser -Cys(MBz1)-NH2 eingesetzt wird. Anschliessend behandelt man wie in Beispiel 1 angegeben mit flüssigem Fluorwasserstoff. Man erhält die Titelverbindung vom Smp. 210 (Zers.); [oC1D20 = 400 in 1% Essigsäure, 0,1 n.
Beispiel 12
EMI5.6
Nach Oxydation der in Beispiel 10 erhaltenen Titelverbindung mit Kaliumferricyanid und anschliessender Aufarbeitung wie in Beispiel 2 angegeben, erhält man die Titelverbindung vom Smp. 228 (Zers.); [α]D20 = -24 , c=1,0 in ACOH 0,1 n.
Aminosäureanalyse gefunden:
Ala0,9, Asn1,0, 1/2 Cys1,8, Gly0,9, Lys2,0, Phe2,0, Ser0,9, Thr0,8, Trp0,9.
Analog Beispiel 1 wurden auch noch folgende Polypeptide hergestellt:
Beispiel 13
EMI5.7
Beispiel 14
EMI5.8
Smp. 2050 (Zers.); [α]D20 = -33 in 1% Essigsäure.
Beispiel 15
EMI5.9
Smp. 230 (Zers.); [a]D20 = -36 in 1% Essigsäure. Beispiel 16
EMI6.1
Smp. 220 (Zers.); [a01,]D20 = -42 in 1% Essigsäure.
Beispiel 17
EMI6.2
Smp. 2050 (Zers.); Ea1,20 = -35" in 1% Essigsäure.
Beispiel 18
EMI6.3
Smp. 2120C (Zers. > ; [al29 = -25 in 1% Essigsäure.
Beispiel 19
Man löst 100 bis 200 mg H-D-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn -Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH in 50 ml Wasser, gibt 630 mg Zink(2)chlorid, 300 mg Phenol und 230 mg Natriumchlorid zu, stellt, den pH-Wert auf 5 bis 8 mit verdünnter Natronlauge ein und füllt mit dest. Wasser auf 100 ml auf.
Beispiel 20
Man verfährt wie in Beispiel 19, gibt aber anstatt 630 mg Zink(2)chlorid, 460 mg Calciumchlorid oder 580 mg Manganchlorid oder 440 mg Magnesiumchlorid dazu.
Beispiel 21
Man verfährt wie in Beispiel 19, fügt jedoch noch 2Q0 mg NaH2PO4 . H2O hinzu.
Beispiel 22
Man verfährt wie in Beispiel 19, fügt jedoch noch 200 mg NaH2PO4 . H2O und 230 mg Carboxymethylcellulose hinzu.
Beispiel 23
Man verfährt wie in Beispiel 19, fügt jedoch noch 200 bis 5000 mg Polyphloretinphosphat hinzu.
Beispiel 24
Man verfährt wie in Beispiel 19, gibt aber anstatt Zinkchlorid 100 bis 5000 mg Polyphloretinphosphat hinzu. Verfahren zur Herstellung neuer Peptide der Formel I
EMI6.4
worin X für H-Ala, H-D-Ala, H-.p-Ala, Propionyl oder Ac-Ala steht, wobei Ac eine Acylgruppe bedeutet, Y für Wasserstoff steht oder eine direkte Bindung zwischen den Schwefelatomen in Stellung 3 und 14 bedeutet und Z für die Reste -COOR1, wobei R, eine niedere Alkylgruppe be
EMI6.5
wobei R2 und R, unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe bedeuten, und -CH2OH steht, sowie Säureadditionssalze der neuen Peptide, dadurch gekennzeichnet, dass man die entsprechenden Aminosäuren bzw.
deren Derivate in der in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach Bildung kleinerer Peptideinheiten kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen intermediär durch geeignete Schutzgruppen gechützt werden, nach Beendigung der Kondensation die nicht mehr benötigten Schutzgruppen abspaltet und gegebenenfalls die so erhaltenen Peptide obiger Formel in ihre therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze überführt.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Carboxylgruppe des endständigen Aminosäurerestes in Stellung 14 in eine -COOR,-Gruppe überführt.
2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Carboxylgruppe des endständigen Aminosäurerestes in Stellung 14 in eine
EMI6.6
überführt.
3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Carboxylgruppe des endständigen Aminosäurerestes in Stellung 14 in eine CH.2OH-Gruppe überführt.
4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man nach Bildung der Teilsequenz 3 bis 14 die Mercaptogruppen in der Stellung 3 und 14 oxydiert.
5. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die erhaltenen Peptide der Formel I in ihre therapeutisch wirksamen Komplexe überführt.
Anmerkung des Eidg. Amtes für geistiges Eigentum:
Sollten Teile der Beschreibung mit der im Patentanspruch gegebenen Definition der Erfindung nicht in Einklang stehen, so sei daran erinnert, dass gemäss Art. 51 des Patentgesetzes der Patentanspruch für den sachlichen Geltungsbereich des Patentes massgebend ist.
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The invention relates to a process for the preparation of new peptides of the formula I.
EMI1.1
where X is H-Ala, HD-Ala, Hp-Ala, propionyl or Ac-Ala (where Ac is an acyl group), Y is hydrogen or a direct bond between the sulfur atoms in positions 3 and 14 and Z is for the Radicals -COOH, -COOR1 (where R1 denotes a lower alkyl group),
EMI1.2
(where R2 and R3 are independently hydrogen or a lower alkyl group) and -CH2OH, as well as acid addition salts and complexes of the new peptides.
If Ac stands for an acyl group, this preferably means the formyl, acetyl, benzene, palmitoyl or trifluoroacetyl radical. If R1, R2 or R & is a lower alkyl group, this lower alkyl group contains 1 to 5, preferably 1 to 3, carbon atoms and is in particular methyl.
The peptides of the above formula, wherein X, Y and Z have the above meaning, its acid addition salts and heavy metal complexes can be prepared by methods well known for the synthesis of compounds of this type. Here, the amino acids or their derivatives are condensed individually or after formation of smaller peptide units in the order specified in the above formula, by combining an amino acid or a peptide with a protected a-amino group and an activated terminal carboxyl group with an amino acid or a peptide with a protected terminal carboxyl group and free a-amino group, or by reacting an amino acid or a peptide with activated a-amino group and protected terminal carboxyl group with an amino acid or a peptide with free terminal carboxyl group and protected a-amino group,
where at the same time the free functional groups not involved in the reaction are protected, after the end of the condensation the protective group which is no longer required is split off, the carboxyl group of the terminal amino acid residue in position 14 being in a position at any point in the synthesis according to methods known per se -COORl- (where R1 represents a lower alkyl group), one
EMI1.3
(where R2 and R3 independently of one another denote hydrogen or a lower alkyl group) or a —CH2OH group, optionally oxidizing the mercapto groups in positions 3 and 14 after formation of part-sequence 3 to 14 and the peptides thus obtained having the above formula in their transferred therapeutically effective acid addition salts or heavy metal complexes.
The carboxyl group can be activated, for example, by conversion into an acid azide, anhydride, imidazolide, isoxazolide or an activated ester or by reaction using a carbodiimide or N, N'-carbodiimidazole.
The most common methods are the carbodiimide method, the azide method, the activated ester method and the anhydride method, and also the Merrifield method.
Free functional groups which are not involved in the reaction can be protected in the construction of the peptides according to the invention by the protective groups known from the synthesis of long-chain peptides. The tert-butyloxy group is preferably used to block the carboxyl group, but other protecting groups such as the methoxy, the ethoxy, the tert-amyloxy, the amide or the benzyloxy group can also be used. A carbo-tert-alkoxy group, preferably the carbo-tert-butoxy group, can be used to block an amino group, in particular the e "amino group of the lysine residue. The mercapto groups of the cysteine residues can, for example, be substituted by acyl groups or preferably by optionally substituted arylmethyl groups such as Benzyl, p-nitrobenzyl, diphenylmethyl or trityl are protected.
The conversion of a protected mercapto or amino group into a free group and the conversion of a functionally modified carboxyl group in the course of the process for the preparation of the peptides according to the invention is carried out by methods known per se, by treatment with hydrolyzing or reducing agents. The mercapto group in positions 3 and 14 is oxidized to the S, S bridge by means of oxygen or potassium ferricyanide.
The starting products for the production of the peptides according to the invention, if they were not previously known, can be obtained by the methods known for peptide chemistry, the amino acids being linked together individually or after prior formation of smaller peptide units.
The present invention also relates to acid addition salts and complexes of the new peptides of the formula I.
Suitable acid addition salts are those with organic acids, polymeric acids and salts with inorganic acids.
Complexes are to be understood in their structure as not yet clarified compounds which, when inorganic salts are added, are derived from metals such as calcium, magnesium, manganese, aluminum, cobalt and zinc (especially halides, phosphates, pyrophosphates and polyphosphates) and / or with the addition of polymeric organic substances such as polyoxygelatin, polyvinylpyrrolidone and carboxymethyl cellulose, also sulfuric acid or phosphoric acid esters of alginic acid, dextran, polyphenols and polyalcohols to the peptide of the above formula.
The peptides produced according to the invention are of therapeutic importance for all indication areas in which inhibition of GH secretion is desired. The focus is on the use in diabetes mellitus, the treatment of acromegaly, angiopathy and the use of these compounds for diagnostic purposes.
The dosage in mammals is 0.5-500 Il, g / kg.
In humans, the dosage is 1.0-1000, çg / kg.
It was also found that the duration of action of the new peptides in the form of injectables can be extended by several hours if a new peptide of the above formula is present in the form of one of the complexes mentioned.
The peptides produced according to the invention can be used as medicaments, e.g. find use in the form of pharmaceutical preparations: These contain the compounds mentioned in a mixture with an organic or inorganic carrier material suitable for parenteral administration.
They can also be used in the form of a depot preparation.
The following abbreviations are used:
Ala = L-alanyl
D-Ala = D-Alanyl ss-Ala - ss-Alanyl
Gly = glycyl
Lys = L-lysyl
Asn = L-asparaginyl
Phe = L-phenylalanyl
Trp = L-tryptophanyl
Thr = L-threonyl
Ser = L-Seryl
Cys = L-cysteinyl
BOC = tert. -Butyloxycarbonyl
Cbo = carbobenzoxy
MBzl = p-methoxybenzyl
OMe = methoxy
OCP = 2,4,5-trichlorophenyloxy
In the following examples, which explain the implementation of the method but are not intended to restrict the scope of the invention in any way, all the temperatures are given in degrees Celsius.
example 1
EMI2.1
0.7 g (BOC) Ala-Gly-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe -Trp-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Ser-Cys (MBzl) -OBzl are added with 3, 3 ml of anisole and 3.5 g of indole are added. About 40 ml of hydrogen fluoride are condensed to this mixture with dry ice cooling, and the mixture is then stirred at 0 for 1 hour. The hydrogen fluoride is removed in vacuo, the residue is stirred with ethyl acetate and filtered. You wash with ethyl acetate and ether. The residue is dissolved in a little 5% acetic acid and purified by chromatography on Sephadex G 25 in the system 0.01 m 2-mercapto-ethanol in 5% acetic acid. Fractions containing the desired product are pooled and lyophilized.
The title compound is obtained
M.p. 216; [z] D20 = 340 (c = 1 in 0.5N acetic acid).
The (BOC) Ala-Gly -Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-Lys (Cbo); Thr-Phe-Thr- -Ser-Cys (MBzl) -OBzl used as the starting material becomes as follows prepared: a) Cbo-Asn-Phe-Phe-OMe
85 g of Cbo-Phe-Phe-OMe are dissolved in 850 ml of HBr / CHsCOOH 4-n and concentrated to about 2/3 after one hour. One falls with 3 liters of ether and sucks.
H-Phe-Phe-OMe HBr is obtained.
M.p. 196; 1D20 = + 8.1 in dimethyl sulfoxide (c = 1).
40 g of H-Phe-Phe-OMe HBr are dissolved in 400 ml of dimethylformamide and mixed with 44 g of Cbo-Asn-OCP and 16 ml of triethylamine. After standing at room temperature for 16 hours, the solution is evaporated in vacuo and the residue is boiled in isopropanol. After cooling, the product is filtered off with suction and washed with isopropanol and methanol. Cbo-Asn-Phe-Phe-OMe is obtained.
Mp 226; friju20 = -18.7 in dimethyl sulfoxide (c = 1.10>.
b) BOC-Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-OMe
77 g of Cbo-Asn-Phe-Phe-OMe are dissolved in 780 ml of HBr / CH3COOH 4-n and left to stand for 1 hour at room temperature. After concentration, it is precipitated with 3 liters of ether and suction filtered. After drying, H-Asn -Phe-Phe-OMe is obtained. HBr.
M.p. 195; [z1n20 = +4 in dimethyl sulfoxide (c = 1).
51 g of BOC-Lys (Cbo) -OH and 19 ml of triethylamine are dissolved in 500 ml of tetrahydrofuran and 13 ml of ethyl chloroformate are added at -10. After 5 minutes, a solution of 72 g of H-Asn-Phe-Phe-OMe Hbr and 23 ml of triethylamine in 800 ml of dimethylformamide is added dropwise. After stirring for 6 hours at room temperature, the mixture is evaporated and chloroform is added. The precipitate is filtered off, washed with chloroform and ethanol.
BOC-Lys (Cbo) -Asn-Asn-Phe-OMe is obtained.
M.p. 187; [αD] 20 = -22.4 in dimethyl sulfoxide (c = 1.0).
c) BOC-Cys (MBzl) -Lys (Bbo) -Asn-Phe-Phe-OMe.
74 g of BOC-Lys (Cbo) rAsn-Phe-Phe-OMe are dissolved in 750 ml of trifluoroacetic acid / methylene chloride (9 1). After 1 hour, the mixture is concentrated and precipitated with ether. The precipitated substance is filtered off and washed with ether.
H-Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-OMe is obtained as trifluoroacetate.
M.p. 2160; [aD] 20 = -5.0 in dimethyl sulfoxide (c = 1.0).
19 g of H-Lys (Cbo-Asn-Phe-Phe-OMe trifluoroacetate and 15 g of BOC-Cys (MBzl) -OMe are dissolved in 150 ml of dimethylformamide and 6.5 ml of triethylamine. After standing at room temperature for 16 hours, the mixture is concentrated and washed with The precipitate is washed with ether, ethanol, acetone and dried.
BOC-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe -OMe is obtained.
Mp 212; [aD] 20 = -20.7 in dimethyl sulfoxide (c = 1.0).
d) BOC-Cly-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-OMe.
22 g of BOC-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-OMe are dissolved in 220 ml of trifluoroacetic acid / methylene chloride (9 l) and left to stand for one hour at room temperature.
After concentration, it is precipitated with ether and suction filtered.
After drying, H-Cys (MBz) l-Lys (Cbo) -Asn -Phe-Phe-OMe is obtained as trifluoroacetate.
M.p. 195; [i20D = -6.2 in dimethyl sulfoxide (c = 1.0).
4.5 g of BOC-Gly-OH and 3.6 ml of triethylamine are dissolved in 50 ml of tetrahydrofuran and mixed at 100 with 2.5 ml of ethyl chloroformate. After 10 minutes, a solution of 24 g of H-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe -OMe trifluoroacetate and 6.0 ml of triethylamine in 250 ml of dimethylformamide are added dropwise. After 3 hours of stirring at room temperature, the mixture is evaporated in vacuo and the residue is washed several times with ether, ethanol and acetone.
BOC-Gly-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asu-Phe-Phe -OMe is obtained.
M.p. 11 "; [a] D2o = - 17.0 in dimethyl sulfoxide (c = 1.0).
e) Cbo-Ala-Gly-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-OMe.
19 g of BOC-Bly-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-OMe are dissolved in 190 ml of trifluoroacetic acid / methylene chloride (9: 1) and left to stand for one hour at room temperature.
After concentration in a vacuum, it is precipitated with ether and suction filtered.
H-Gly-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe -OMe is obtained as trifluoroacetate.
M.p. 1910; [n2o = -5.3 in dimethyl sulfoxide (c = 1.0).
2.7 g of Cbo-Ala-OH and 1.7 ml of triethylamine are in
30 ml of tetrahydrofuran dissolved and mixed with 100 with 1.2 ml of ethyl chloroformate. After stirring for 10 minutes, a solution of 11 g of H-Gly-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-OMe trifluoroacetate and 2.8 ml of triethylamine is added dropwise. After stirring for 6 hours at room temperature, the mixture is concentrated and washed with ether, isopropanol and methanol.
Cbo Ala-Gly (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe -Phe OMe is obtained.
M.p. 2190; [D20 = - 190 in dimethyl sulfoxide.
f) Cbo-Ala-Gly-Cys (MBzl) Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-NHNH2
Dissolve 12 g of Cbo-Ala-Gly-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn -Phe-Phe-OMe in 120 ml of dimethylformamide and add 3 ml of hydrazine hydrate. After standing at room temperature for 16 hours, the solution is concentrated and precipitated with ether. The residue is filtered off and washed with ethanol and ether.
Cbo-Ala-Gly-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe- -Phe-NHNH2 is obtained.
Mp 2500; FlD20 = -20.6 in dimethyl sulfoxide (c = 1.0).
g) BOC-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-OMe.
17 g of Cbo-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe are dissolved in a mixture of methanol / dimethylformamide, mixed with palladium-carbon and hydrogenated at room temperature under normal pressure. The catalyst is filtered off and evaporated in vacuo. The residue obtained, 10.7 g of BOC-Lys (Cbo) -OH and 4.2 g of hydroxybenzotriazole, is dissolved in 80 ml of dimethylformamide, cooled to -5 and mixed with 3.2 ml of N-methylmorphbline and a solution of 6. 1 g dicyclohexylcarbodiimide in 30 ml dimethylformamide.
The mixture is stirred overnight at room temperature, precipitated dicyclohexyl urea is filtered off and the filtrate is evaporated. The residue is dissolved in ethyl acetate and washed with 5% sodium bicarbonate and water. The ethyl acetate phase is dried over sodium sulfate and then concentrated. The precipitated product is filtered off and washed with ethyl acetate / ether.
BOC-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-OMe is chosen.
Mp 1300; [αD] D20 = -7 in dimethylformamide.
h) BOC-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-NHNH
7 g of BOC-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-OMe are dissolved in a mixture of dimethylformamide and methanol, 8 ml of hydrazine hydrate are added and the mixture is left to stand at room temperature overnight. The reaction mixture is mixed with water, stirred well, the precipitated product is filtered off, the residue is washed with water and dried.
BOC-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-NHNH2 is obtained.
Mp; 1980; EX] D20 = -5 in dimethylformamide.
i) BOC-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-Cys (MBzl) -OBzl
2.3 g BOC-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-NHNH2 are dissolved in 20 ml dimethylformamide, cooled to 200, with 1.8 ml 5.5 N hydrochloric acid in ether, then 0.33 ml tert .-Butyl nitrite were added and the mixture was stirred at -15 for 5 minutes. After adding 1.45 ml of triethylamine at 200, the precipitated triethylamine hydrochloride is filtered off and the filtrate is combined with a cold solution of 1.86 g of H-Cys (MBzl) -OBzl in 6 ml of dimethylformamide. The mixture is left to stand at 0 overnight, the reaction mixture is stirred with 500 ml of ether and the precipitated material is filtered off. The residue is dissolved in a mixture of methanol / dimethylformamide and water is then added with stirring.
Precipitated product is filtered off, washed with water and dried. BOC-Lys (Cbo) -Thr-Phe -Tbr-Ser-Cys (MBzo) -OBzl is obtained.
Mp 169; [r1.20 = 160 in dimethylforniamide.
j) BOC-Trp-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-Cys (MBzl) -OBzl
2.3 g of BOC-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-Lys (MBzl) -OBzl are dissolved in a mixture of 10 ml methylene chloride and 6 ml trifluoroacetic acid and left to stand for 25 minutes at room temperature. H-Lys (Cbo> - -Thr-Phe-Thr-Ser-Cys (MBzl) -OBzl trifluoroacetate is precipitated with ether, filtered off and washed well with ether. The residue is dissolved in 7 ml of dimethylformamide at 1.5 g BOC-Trp-OCP and mixed with 0.3 ml triethylamine and left overnight at room temperature The product is precipitated with ether-ethyl acetate (1: 1) and filtered.
It is dried and the title compound is obtained.
Mp 1670; [α] D20 = - 17.50 in dimethylformamide.
k) Cbo-Ala-Gly (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-Trp-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-Cys (MBzl) -OBzl.
1.32 g BOC-Trp-Lys (Cbo) -Trp-Phe-Thr-Ser (MBzl).
-OBzl are dissolved in 15 ml methylene chloride and mixed with 1.1 ml anisole, 1.2 g indole and finally with rs ml trifluoroacetic acid. Allow to stand for 40 minutes at room temperature and then fall with ether. After filtering, washing with ether and drying, H-Trp-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-Cys (MBzl) -OBzl is obtained.
1.2 g of Cbo-Ala-Gly-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe -NHNH2 are dissolved in 20 ml of dimethylformamide, cooled to -20 and mixed with 0.64 ml of 5.5 N hydrochloric acid in Ether, then 0.12 ml of tert-butyl nitrite were added and the mixture was stirred at -15 for 5 minutes. 0.5 ml of triethylamine is added, the precipitated triethylamine hydrochloride is filtered off and the filtrate is combined with a cold solution of 1.3 g of H-Trp-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-Cys (MBzl) - OBzl trifluoroacetate in 5 ml dimethylformamide. The mixture is left to stand at 0 overnight, stirred with 150 ml of methanol, filtered, the residue is washed with methanol and ethyl acetate, dried and the title compound is obtained.
Mp 245; [α] D20 = 170 in dimethylformamide.
Example 2
EMI3.1
1.0 g of the title compound according to Example 1 is dissolved in 6000 ml of water and the pH is adjusted to pH 7.7 with 4N ammonium hydroxide solution. About 120 ml of 0.02 molar potassium ferricyanide solution are added and the mixture is left for 45 minutes with 20 stirring. The pH of the solution is adjusted to about pH 5 with 50% acetic acid and passed through a column of 200 ml Bio-Rad AG 3 / X4. The solution is concentrated to 500 ml and separated from insoluble products by centrifugation. The clear aqueous phase is lyophilized and chromatographed using Sephadex G-25 in dilute 2% acetic acid. The chromatographically uniform fractions are combined and lyophilized after concentration.
The pure title compound is obtained.
Mp 220; [aln20 = -29, c = 0.5 ACOH 0.1 n (c = 1.0).
Amino acid analysis found:
Ala1.0, Asn1.0, 1/2 Cys1.8, Gly0.9, Lys2.0, Phe3.0, Ser0.9, Thr0.9, Trp0.9.
Example 3
EMI4.1
Analogously to Example 1 a to k, Cbo-D-Ala-Gly-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-Trp-Lys (Cbo) -Thr-Phe- -Thr-Ser-Cys is built (MBzl) -OBzl, in the intermediate stage e Cbo-D-Ala-Gly-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-OMe, mp. 219-220; [am20 = -16.4, c = 1.0 is used in dimethylformamide and then treated as indicated in Example 1 with liquid hydrogen fluoride. The title compound of mp 225 (decomp.) Is obtained; [α] D20 = -27 in ACOH 0.1-n (c = 1.0).
Example 4
EMI4.2
After oxidation of the title compound obtained in Example 3 using potassium ferricyanide, treatment with Bio-Rad AG 3X / 4 and subsequent chromatography with Sephadex G-25 (dilute acetic acid), the title compound is obtained.
Mp 2450 (dec.); [a] n20 = 310, c = 1.0 in ACOH 0.1 n.
Amino acid analysis found:
Ala1.0, Asn1.0, 1/2 Cys1.8, Gly1.0, Lys2.2, Phe3.1, Ser0.9, Thr1.8, Trp0.9.
Example 5
EMI4.3
Analogously to Example 1 a to k, Cbo-Ala-Gly-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-Trp-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr -Ser-Cys (MBzl) - NH2, whereby in the intermediate BOC-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-Cys (MBzl) -NH2, mp. 205; [am20 = 14.80, c = 1 (dimethylformamide) is used. Then treated as in Example 1 with liquid hydrogen fluoride. The title combination of mp 218 (decomp.) Is obtained; [α] D20 = 210, c = 1.0 in ACOH 0.1 n.
Example 6
EMI4.4
After oxidation of the title compound obtained in Example 4 with potassium ferricyanide and chromatography on Sephadex G-25, the title compound of mp 251 "is obtained; [α] D20 = -32, c = 1.0 found in ACOH 0.1 n amino acid analysis:
Ala1.0, Asn1.0, 1/2 Cys1.8, gly0.9, Lys2.2, Phe3.0, Ser0.9, Thr0.9, Trp0.8.
Example 7
EMI4.5
Analogously to Example 1 a to k, Cbo-ss-Ala-Gly-Cys- (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-Trp-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-Ser-Cys ( MBzl) -OBzl and then treated as indicated in Example 1 with liquid hydrogen fluoride. The title compound of mp 229-230 (dec.) Is obtained; [α] D20 = -380, c = 1.0 in ACOH 0.1 n.
Example 8
EMI4.6
After oxidation of the title compound obtained in Example 7 using potassium ferricyanide and then working up as indicated in Example 2, the title compound of mp. 2360 (dec.) Is obtained; [α] D20 = 240, c = 1.0 in ACOH 0.1 n.
Amino acid analysis found: ss-Ala 0.9, Asn 0.9, 1/2 Cys 1.8, Gly 1.0, Lys 2.0, Phe 3.0, Ser 0.9, Thr 0.8, Trp 0.9.
Example 9
EMI5.1
Analogously to Example 1 a to k, Cbo-Ala-Gly-Cys {MBzl) -Lys (Cbo), Asn-Phe-Phe-Trp-Lys (Cbo) -Thr-Phe-Thr-
EMI5.2
on, in the intermediate stage j
EMI5.3
is used. Then treated as in Example 1 with liquid hydrogen fluoride. The title compound is obtained.
M.p. 238 (dec.); [α] D20 = 370, c = 1.0 in ACOH 0.1 n.
Example 10
EMI5.4
After oxidation of the title compound obtained in Example 9 by means of potassium ferricyanide and subsequent work-up as indicated in Example 2, the title compound is obtained.
Mp 230 (dec) [α] D20 = -19, c = 1.0 n ACOH 0.1 n.
Amino acid analysis found:
Ala 0.9, Asn 0.9, 1/2 Cys 0.9, Gly 1.0, Lys 2.2, Phe 3.0, Ser 0.9, Thr 0.8, Trp 0.8.
Example 11
EMI5.5
Analogously to Example 1 a to k, Cbo-D-Ala-Gly-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-Trp-Lys (Cbo) -Thr-Phe- -Thr-Ser-Cys ( MBzl) -NH2, in the intermediate stage e Cbo-D-Ala-Gly-Cys (MBzl) -Lys (Cbo) -Asn-Phe-Phe-OMe and in the intermediate stage j BOC-Lys (Cbo) -Thr- Phe-Thr-Ser-Cys (MBz1) -NH2 is used. Then treated as in Example 1 with liquid hydrogen fluoride. The title compound of mp 210 (dec.) Is obtained; [oC1D20 = 400 in 1% acetic acid, 0.1 n.
Example 12
EMI5.6
After oxidation of the title compound obtained in Example 10 with potassium ferricyanide and subsequent working up as indicated in Example 2, the title compound of mp 228 (decomp.) Is obtained; [α] D20 = -24, c = 1.0 in ACOH 0.1 n.
Amino acid analysis found:
Ala 0.9, Asn 1.0, 1/2 Cys 1.8, Gly 0.9, Lys 2.0, Phe 2.0, Ser 0.9, Thr 0.8, Trp 0.9.
The following polypeptides were also prepared analogously to Example 1:
Example 13
EMI5.7
Example 14
EMI5.8
M.p. 2050 (dec.); [α] D20 = -33 in 1% acetic acid.
Example 15
EMI5.9
Mp 230 (dec.); [a] D20 = -36 in 1% acetic acid. Example 16
EMI6.1
Mp 220 (dec.); [a01,] D20 = -42 in 1% acetic acid.
Example 17
EMI6.2
M.p. 2050 (dec.); Ea1.20 = -35 "in 1% acetic acid.
Example 18
EMI6.3
Mp 2120C (dec.>; [Al29 = -25 in 1% acetic acid.
Example 19
100 to 200 mg of HD-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn -Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH are dissolved in 50 ml of water, and 630 mg of zinc (2) chloride are added , 300 mg of phenol and 230 mg of sodium chloride, adjust the pH to 5 to 8 with dilute sodium hydroxide solution and fill with dist. Water to 100 ml.
Example 20
The procedure is as in Example 19, but instead of 630 mg of zinc (2) chloride, 460 mg of calcium chloride or 580 mg of manganese chloride or 440 mg of magnesium chloride.
Example 21
The procedure is as in Example 19, but 2Q0 mg of NaH2PO4 are added. H2O added.
Example 22
The procedure is as in Example 19, but 200 mg of NaH2PO4 are added. H2O and 230 mg carboxymethyl cellulose added.
Example 23
The procedure is as in Example 19, but 200 to 5000 mg of polyphloretin phosphate are added.
Example 24
The procedure is as in Example 19, but 100 to 5000 mg of polyphloretin phosphate are added instead of zinc chloride. Process for the preparation of new peptides of formula I.
EMI6.4
where X is H-Ala, HD-Ala, H-.p-Ala, propionyl or Ac-Ala, where Ac is an acyl group, Y is hydrogen or a direct bond between the sulfur atoms in positions 3 and 14 and Z is for the radicals -COOR1, where R is a lower alkyl group
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where R2 and R, independently of one another, denote hydrogen or a lower alkyl group, and -CH2OH, and acid addition salts of the new peptides, characterized in that the corresponding amino acids or
the derivatives of which are condensed individually or after the formation of smaller peptide units in the order specified in the above formula, free functional groups not participating in the reaction being temporarily protected by suitable protective groups, and after the condensation has ended, the protective groups which are no longer required are split off and, if appropriate, the peptides thus obtained converted the above formula into their therapeutically effective acid addition salts.
SUB-CLAIMS
1. The method according to claim, characterized in that at any point in the synthesis, the carboxyl group of the terminal amino acid residue in position 14 is converted into a -COOR, group.
2. The method according to claim, characterized in that at any point in the synthesis of the carboxyl group of the terminal amino acid residue in position 14 in a
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transferred.
3. The method according to claim, characterized in that the carboxyl group of the terminal amino acid residue in position 14 is converted into a CH.2OH group at any point in the synthesis.
4. The method according to claim, characterized in that after formation of the partial sequence 3 to 14, the mercapto groups in the position 3 and 14 are oxidized.
5. The method according to claim, characterized in that the peptides of formula I obtained are converted into their therapeutically active complexes.
Federal Intellectual Property Office note:
Should parts of the description not be in accordance with the definition of the invention given in the patent claim, it should be remembered that according to Art. 51 of the Patent Act the patent claim is decisive for the factual scope of the patent.
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