Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von höheren Monoalkanoylfluoresceinen der allgemeinen Formel
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worin n eine ganze Zahl von 8 bis einschliesslich 16 bedeutet,
Höhere Monoalkanoylfluoresceine haben vor kurzem in fluorometrischen Methoden zur quantitativen Bestimmung der Lipaseaktivität in Körperflüssigkeiten Verwendung gefunden.
Es ist jedoch schwierig, diese Verbindungen mit einer genügenden Reinheit und Ausbeute herzustellen und somit sie in kommerziellen Mengen zu einem vernünftigen Preis zur Verfügung zu stellen.
Erfindungsgemäss wurde ein Verfahren gefunden, welches höhere Monoalkanoylfluoresceine mit 1 > 18 Kohlenstoffatomen in dem Alkanoylrest in kommerziellen Mengen mit einer hohen Reinheit und einem vernünftigen Preis liefert. Weiter wurde gefunden, dass durch Umsetzung des entsprechenden höheren Alkanoylhalogenids Fluorescein unter weitgehend wasserfreien Bedingungen in einem geeigneten aprotischen organischen Lösungsmittel bei einer geeigneten Temperatur unter einer inerten Atmosphäre, das Reaktionsprodukt, d. h.
das höhere Monoalkanoylfluorescein ohne Verunreinigung mit höheren Dialkanoylfluoresceinen hergestellt wird. Es wurde gefunden, dass die Reaktion erfolgt, wenn die geeignete Mischung von selektiven Extraktionsmitteln in Kombination mit den geeigneten Reaktionsbedingungen zur Herstellung des Produktes verwendet werden.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel
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worin n eine ganze Zahl von 8 bis einschlisslich 16 bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man ein höheres Alkanoylhalogenid mit 8-18 Kohlenstoffatomen mit Fluorescein bei einer Temperatur zwischen 15 und 30oC unter wasserfreien Bedingungen in einer inerten Atmosphäre bis zur Vervollständigung der Reaktion reagieren lässt, wobei die Reaktion in einem aprotischen Lösungsmittel, worin die Reagenzien langsam miteinander in Kontakt gebracht werden, erfolgt, und das Reaktionsprodukt mittels einem adsorbierenden Filtermedium filtriert, mit einem Gemisch aus organischem Lösungsmittel und Äther eluiert und aus dem Eluat mittels Hexan kristallisiert wird.
Das Alkanoylhalogenid, welches im erfindungsgemässen Verfahren zur Bildung des Alkanoylrestes verwendet wird, ist ein höheres Alkanoylhalogenid mit 10-18 Kohlenstoffatomen.
Besonders bevorzugt wird das Decanoylhalogenid, weil das entsprechende Endprodukt. d. h. Monodecanoylfluorescein, zur Bestimmung der Lipaseaktivität besonders vorteilhaft ist.
Das Halogenid kann Jodid, Chlorid, Fluorid oder Bromid sein, wobei jedoch das Chlorid wegen seiner leichten Verfügbarkeit als Ausgangsmaterial bevorzugt wird. Aus diesen Gründen wird als Ausgangsmaterial Decanoylchlorid ganz besonders bevorzugt.
Bei Durchführung der Reaktion wird mit Vorzug ein Mol Alkanoylhalogenid pro Mol Fluorescein verwendet, da die Reaktion stöchiometrisch ist.
Die Reaktion wird vorzugsweise unter weitgehend wasserfreien Bedingungen durchgeführt, um Nebenreaktionen, welche durch die Anwesenheit von Wasser verursacht werden, zu vermeiden. Im Falle von nicht-wasserfreien Bedingungen werden die Ausbeuten erniedrigt.
Die Reaktion erfolgt mit Vorteil in einer inerten Atmosphäre, um die Bildung von Nebenprodukten zu verhindern und die Nebenreaktionen zu verringern. Zur Bildung von inerten Atmosphären eignen sich Argon und Stickstoff, wobei Stickstoff bevorzugt ist.
Das Lösungsmittel, in welchem die Reaktion durchgeführt wird, ist ein aprotisches organisches Lösungsmittel. Als Lösungsmittel eignen sich Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxyd (DMSO) oder Hexamethylphosphorsäure-triamid (HMPT), wobei Dimethylformamid bevorzugt wird. Die Menge an Lösungsmittel, welche in der Reaktion verwendet wird, ist wichtig, da die Ausbeuten an Monoalkanoylfluorescein davon abhängen. Erfindungsgemäss wird es bevorzugt, 830 Volumen Lösungsmittel pro Volumen Fluorescein zu verwenden, wobei 10-15 Volumen besonders bevorzugt werden.
Im Falle von DMF als Lösungsmittel und Monodecanoylfluorescein als Endprodukt werden 10 Volumen besonders bevorzugt.
Die Temperatur ist kritisch und liegt zwischen 15-300C, wobei die Raumtemperatur, d. h. 20-25 C, bevorzugt wird.
Höhere Temperaturen haben unerwünschte Nebenreaktionen zur Folge, wobei grössere Mengen an Dialkanoylfluorescein gebildet werden.
Das für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignete selektive aromatische Lösungsmittel soll Fluorescein nicht lösen und dagegen Monoalkanoylfluoresceine lösen. Geeignete Lösungsmittel sind Benzol und Toluol, wobei Benzol bevorzugt ist.
Das adsorbierende Filtermedium muss so gewählt werden, dass die Endprodukte darauf adsorbieren und die Verunreinigungen in dem Filtrat, welches entfernt wird, zurück bleiben.
Geeignete adsorbierende Filtermedia sind Aluminiumoxyd und Silicagel, wobei Silicagel für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bevorzugt wird. Ein besonders geeignetes Silicagel ist Silicagel 7734 (Merck), ein Produkt mit einer Teilchengrösse von 0,05 bis 0,2 mm.
Das Produkt wird von dem Silicagel durch Elution mit einem Lösungsmittelsystem, welches die höheren Alkanoylfluoresceine selektiv löst, entfernt. Solche Lösungsmittelsysteme sind Gemische von 2-15 Volumen eines aromatischen Lösungsmittels mit einem Volumen Diäthyläther. Vorzugsweise beträgt das Volumenverhältnis des aromatischen Lösungsmittels zum Diäthyläther 4:1. Bevorzugte aromatische Lösungsmittel sind Benzol oder Toluol.
Um das Endprodukt von dem Eluat zu trennen, wird ein Lösungsmittel, welches das Endprodukt nicht löst, verwendet.
Als ein solches Lösungsmittel wird mit Vorzug Hexan verwendet.
Vor der Filtrierung durch das adsorbierende Filtermedium wird das gelöste Endprodukt mit einem alkalischen Material behandelt, um jede Menge an nicht-umgesetzter Säure zu neutralisieren. Ein geeignetes alkalisches Mittel ist Natriumbicarbonat. Andere Alkalimetallbicarbonate können jedoch ebenfalls verwendet werden.
Weiter wurde gefunden, dass, wenn man die höheren Alkanoylhalogenide dem Fluorescein langsam zugibt, die Tendenz zur Bildung von Nebenreaktionen und von Dialkanoylprodukten vermindert wird. Unter langsam versteht man 46 ml Alkanoylhalogenid pro Stunde, gelöst in ungefähr 4050 ml Lösungsmittel.
Die Reaktion wird fortgesetzt, bis sie vollständig ist. In der Regel wird die Reaktion über Nacht durchgeführt, jedoch kann die Dauer der Reaktion kürzer oder länger sein. In der Regel ist die Dauer der Reaktion 2-12 Stunden.
Die folgenden Beispiele dienen zur Illustration der Erfindung. Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.
Beispiel 1
25,0 g (0,075 Mol) Fluorescein und 490 ml Dimethylformamid werden einem 1 Liter 3-Halskolben, welcher mit einem Rührer, einem Herschberg-Tropftrichter und einer Stickstoffatmosphäre versehen ist, zugegeben. Eine Mischung von 13,6 g Decanoylchlorid (0,071 Mol) in 50 ml Dimethylformamid wird während einer Periode von 10 Stunden dem 3 Halskolben durch den Tropftrichter unter ständigem Rühren bei Raumtemperatur zugegeben, wobei eine vollständige Lösung nach und nach bewerkstelligt wird. Anschliessend wird das Dimethylformamid bei vermindertem Druck (0,5 mm) entfernt, 400 ml Benzol zugegeben, die erhaltene Mischung während 20 Minuten gerührt, filtriert und mit 2 x 40 ml Benzol gewaschen. Der erhaltene Presskuchen enthält Fluorescein.
Die kombinierten Benzolfiltrate werden mit 2 x 80 ml einer 0,1 N Natriumbicarbonatlösung und 60 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, anschliessend mit Calciumsulfat behandelt und über 120 g Silicagel, welches in einer 600 ml Sinter-Glas-Säule enthalten ist, filtriert. Das Silicagel wird mit 4 X 100 ml einer Benzoläthermischung (4:1 v/v) gewaschen, wobei jede Waschflüssigkeit separat gehalten wird. Die Menge an Rohprodukt in diesen Waschflüssigkeiten sind die folgenden: Benzol-Äther 1-0,5 g; Benzol-Äther 2-7,95 g; Benzol Äther 3-11,20 G; Benzol-Äther 4-2,65 g. Die Rückstände werden kombiniert und durch Lösung von 95 ml kochendem Benzol und anschliessender (nach Beendigung des Erwärmens) Zugabe von 240 ml Hexan kristallisiert.
Die Mischung wird kontinuierlich gerührt, während der Abkühlung auf Raumtemperatur beimpft und dann über Nacht in einen Kühlschrank gestellt. Die Kristalle werden filtriert, mit einer Mischung von Benzol und Hexan (2:5 v/v) gewaschen und bei vermindertem Druck bei 50 C getrocknet. Man erhält 12,0 g Monodecanoylfluorescein vom Schmelzpunkt 89-9Oo.
Beispiel 2
25,0 g (0,075 Mol) Fluorescein und 490 ml Dunethylform- amid werden einem 1 Liter 3-Halskolben, welcher mit einem Rührer, einem Herschberg-Tropftrichter und einer Stickstoffatmosphäre versehen ist, zugegeben. Eine Mischung von 13,6 g Decanoylchlorid (0,071 Mol) in 50 ml Dimethylformamid wird während einer Periode von 10 Stunden dem 3-Halskolben durch den Tropftrichter unter ständigem Rühren bei Raumtemperatur zugegeben, wobei eine vollständige Lösung nach und nach bewerkstelligt wird. Anschliessend wird das Dimethylformamid bei vermindertem Druck (0,5 mm) entfernt, 400 ml Benzol zugegeben, die erhaltene Mischung während 20 Minuten gerührt, filtriert und mit 2 x 40 ml Benzol gewaschen.
Der erhaltene Presskuchen enthält Fluorescein. Die kombinierten Benzolfiltrate werden mit 2 x 80 ml 0,1 N Natriumbicarbonatlösung und 60 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, anschliessend mit Calciumsulfat behandelt und über 120 g Silicagel, welches in einer 600 ml Sinterglas Säule enthalten ist, filtriert. Das Silicagel wird mit 5 x 100 ml Benzol-Äther (4:1 v/v) gewaschen. Die Menge an Rohprodukt in den kombinierten Waschflüssigkeiten ist 31,3 g. Die Rückstände werden kombiniert und durch Lösung in 135 ml kochendem Benzol und anschliessender (nach Beendigung des Erwärmens) Zugabe von 340 ml Hexan kristallisiert. Die Mischung wird kontinuierlich gerührt, während der Abkühlung auf Raumtemperatur beimpft und über Nacht in einen Kühlschrank gestellt.
Die Kristalle werden filtriert, mit einer Mischung von Benzol-Hexan (2:5 v/v) gewaschen und bei vermindertem Druck bei 50C getrocknet. Man erhält 18,0 g Monodecanoylfluorescein vom Schmelzpunkt 89-9Oo.
The present invention relates to a process for the preparation of higher monoalkanoyl fluoresceins of the general formula
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where n is an integer from 8 to 16 inclusive,
Higher monoalkanoyl fluoresceins have recently found use in fluorometric methods for the quantitative determination of lipase activity in body fluids.
However, it is difficult to prepare these compounds with sufficient purity and yield to make them available in commercial quantities at a reasonable price.
According to the invention, a process has been found which provides higher monoalkanoyl fluoresceins with 1> 18 carbon atoms in the alkanoyl radical in commercial quantities with a high degree of purity and at a reasonable price. It has further been found that by reacting the corresponding higher alkanoyl halide fluorescein under substantially anhydrous conditions in a suitable aprotic organic solvent at a suitable temperature under an inert atmosphere, the reaction product, i.e. H.
the higher monoalkanoyl fluorescein is produced without contamination with higher dialkanoyl fluoresceins. It has been found that the reaction occurs when the appropriate mixture of selective extractants in combination with the appropriate reaction conditions are used to produce the product.
More specifically, the present invention relates to a process for the preparation of compounds of the general formula
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where n is an integer from 8 to 16 inclusive, characterized in that a higher alkanoyl halide with 8-18 carbon atoms is allowed to react with fluorescein at a temperature between 15 and 30 ° C under anhydrous conditions in an inert atmosphere until the reaction is complete, with the reaction is carried out in an aprotic solvent, in which the reagents are slowly brought into contact with one another, and the reaction product is filtered using an adsorbent filter medium, eluted with a mixture of organic solvent and ether and crystallized from the eluate using hexane.
The alkanoyl halide which is used in the process according to the invention to form the alkanoyl radical is a higher alkanoyl halide having 10-18 carbon atoms.
The decanoyl halide is particularly preferred because the corresponding end product. d. H. Monodecanoyl fluorescein, is particularly advantageous for determining lipase activity.
The halide can be iodide, chloride, fluoride or bromide, but the chloride is preferred as a starting material because of its ready availability. For these reasons, decanoyl chloride is particularly preferred as the starting material.
In carrying out the reaction, it is preferred to use one mole of alkanoyl halide per mole of fluorescein since the reaction is stoichiometric.
The reaction is preferably carried out under substantially anhydrous conditions in order to avoid side reactions which are caused by the presence of water. In the case of non-anhydrous conditions, the yields are reduced.
The reaction is advantageously carried out in an inert atmosphere in order to prevent the formation of by-products and to reduce the side reactions. Argon and nitrogen are suitable for forming inert atmospheres, with nitrogen being preferred.
The solvent in which the reaction is carried out is an aprotic organic solvent. Suitable solvents are dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO) or hexamethylphosphoric acid triamide (HMPT), with dimethylformamide being preferred. The amount of solvent used in the reaction is important as the yields of monoalkanoyl fluorescein depend on it. According to the invention it is preferred to use 830 volumes of solvent per volume of fluorescein, with 10-15 volumes being particularly preferred.
In the case of DMF as the solvent and monodecanoyl fluorescein as the end product, 10 volumes are particularly preferred.
The temperature is critical and lies between 15-300C, the room temperature, i.e. H. 20-25 C, is preferred.
Higher temperatures result in undesirable side reactions, with larger amounts of dialkanoyl fluorescein being formed.
The selective aromatic solvent suitable for the purposes of the present invention should not dissolve fluorescein and instead dissolve monoalkanoylfluoresceins. Suitable solvents are benzene and toluene, benzene being preferred.
The adsorbing filter medium must be chosen in such a way that the end products adsorb on it and the impurities remain in the filtrate which is removed.
Suitable adsorbent filter media are alumina and silica gel, with silica gel being preferred for purposes of the present invention. A particularly suitable silica gel is Silicagel 7734 (Merck), a product with a particle size of 0.05 to 0.2 mm.
The product is removed from the silica gel by elution with a solvent system which selectively dissolves the higher alkanoyl fluoresceins. Such solvent systems are mixtures of 2-15 volumes of an aromatic solvent with one volume of diethyl ether. The volume ratio of the aromatic solvent to the diethyl ether is preferably 4: 1. Preferred aromatic solvents are benzene or toluene.
In order to separate the end product from the eluate, a solvent which does not dissolve the end product is used.
Hexane is preferably used as such a solvent.
Prior to filtration through the adsorbent filter medium, the final dissolved product is treated with an alkaline material to neutralize any amount of unreacted acid. A suitable alkaline agent is sodium bicarbonate. However, other alkali metal bicarbonates can also be used.
It has also been found that if the higher alkanoyl halides are added slowly to the fluorescein, the tendency for side reactions and dialkanoyl products to form is reduced. Slow is understood to mean 46 ml of alkanoyl halide per hour, dissolved in approximately 4050 ml of solvent.
The reaction continues until it is complete. The reaction is usually carried out overnight, but the duration of the reaction can be shorter or longer. Usually the duration of the reaction is 2-12 hours.
The following examples serve to illustrate the invention. All temperatures are given in degrees Celsius.
example 1
25.0 g (0.075 mol) of fluorescein and 490 ml of dimethylformamide are added to a 1 liter, 3-necked flask equipped with a stirrer, a Herschberg dropping funnel and a nitrogen atmosphere. A mixture of 13.6 g of decanoyl chloride (0.071 mole) in 50 ml of dimethylformamide is added to the 3-necked flask through the dropping funnel over a period of 10 hours with constant stirring at room temperature, complete dissolution being achieved gradually. The dimethylformamide is then removed under reduced pressure (0.5 mm), 400 ml of benzene are added, the mixture obtained is stirred for 20 minutes, filtered and washed with 2 × 40 ml of benzene. The press cake obtained contains fluorescein.
The combined benzene filtrates are washed with 2 x 80 ml of a 0.1 N sodium bicarbonate solution and 60 ml of water, dried over sodium sulfate, then treated with calcium sulfate and filtered over 120 g of silica gel, which is contained in a 600 ml sintered glass column. The silica gel is washed with 4 x 100 ml of a benzene ether mixture (4: 1 v / v), each washing liquid being kept separate. The amount of crude product in these washing liquids are as follows: benzene-ether 1-0.5 g; Benzene ether 2-7.95 g; Benzene ether 3-11.20 G; Benzene ether 4-2.65 g. The residues are combined and crystallized by dissolving 95 ml of boiling benzene and then adding 240 ml of hexane (after the end of heating).
The mixture is stirred continuously, seeded while cooling to room temperature and then placed in a refrigerator overnight. The crystals are filtered, washed with a mixture of benzene and hexane (2: 5 v / v) and dried at 50 ° C. under reduced pressure. 12.0 g of monodecanoyl fluorescein with a melting point of 89-90 ° are obtained.
Example 2
25.0 g (0.075 mol) of fluorescein and 490 ml of dunethylformamide are added to a 1 liter 3-necked flask which is provided with a stirrer, a Herschberg dropping funnel and a nitrogen atmosphere. A mixture of 13.6 g of decanoyl chloride (0.071 mol) in 50 ml of dimethylformamide is added to the 3-necked flask through the dropping funnel over a period of 10 hours with constant stirring at room temperature, complete dissolution being achieved gradually. The dimethylformamide is then removed under reduced pressure (0.5 mm), 400 ml of benzene are added, the mixture obtained is stirred for 20 minutes, filtered and washed with 2 × 40 ml of benzene.
The press cake obtained contains fluorescein. The combined benzene filtrates are washed with 2 x 80 ml of 0.1 N sodium bicarbonate solution and 60 ml of water, dried over sodium sulfate, then treated with calcium sulfate and filtered over 120 g of silica gel, which is contained in a 600 ml sintered glass column. The silica gel is washed with 5 × 100 ml of benzene-ether (4: 1 v / v). The amount of crude product in the combined washing liquids is 31.3 g. The residues are combined and crystallized by dissolving them in 135 ml of boiling benzene and then adding 340 ml of hexane (after the end of heating). The mixture is stirred continuously, seeded while cooling to room temperature and placed in a refrigerator overnight.
The crystals are filtered, washed with a mixture of benzene-hexane (2: 5 v / v) and dried at 50 ° C. under reduced pressure. 18.0 g of monodecanoyl fluorescein with a melting point of 89-90 ° are obtained.