Es sind bereits Verfahren bekannt, mit denen biologische Substanzen, insbesondere infektiöse Mikroorganismen und/ oder deren Antigene, inaktiviert werden können. Man hat bisher entweder chemische oder physikalische Methoden angewandt. Allen bekannten Verfahren ist jedoch gemeinsam, dass die biologischen Substanzen in flüssigem Zustand inaktiviert werden. Die chemischen Methoden haben den Nachteil, dass beim Versetzen mit der inaktivierten Substanz der Behälter geöffnet werden muss und dabei das biologische Material durch Pilze und Bakterien verunreinigt werden kann.
Meist gestatten zugesetzte Chemikalien nicht die Inaktivierung einwandfrei abzubrechen und auch erwünschte Eigenschaften, wie die Antigenität bei Viren und Bakterien zur Herstellung von Vaccinen, werden in Mitleidenschaft gezogen. Aus dem gleichen Grunde wird auch die Lagerfähigkeit solcher Substanzen eingeschränkt. Aber gerade die Haltbarkeit spielt bei biologischem Material eine grosse Rolle, so auf dem Transport und in tropischen Ländern, wo höhere Temperaturen unvermeidlich und nicht zu umgehen sind. Deshalb wird bei den betreffenden Präparaten Kühlschranklagerung vorgeschrieben. Man hat sich auch dadurch geholfen, dass man zum Beispiel im Falle der Verwendung von Formaldehyd als Inaktivierungsmittel zum Binden des nicht umgesetzten Formaldehyds Bisulfit zugesetzt hat, wobei der Behälter wiederum geöffnet werden muss.
Als ein Nachteil hat sich auch erwiesen, dass zugesetzte Chemikalien, zum Beispiel Phenol, Unverträglichkeiten bei der Anwendung am Menschen und am Tier hervorgerufen haben.
Auch die physikalischen Methoden weisen Nachteile auf.
So müssen beispielsweise Suspensionen, die die genannten biologischen Substanzen enthalten, zur Inaktivierung UV Strahlen in besonderen Vorrichtungen in einem gleichmässig dicken Film ausgesetzt werden. Dabei bilden sich unter Umständen Peroxide, die die Inaktivierung eine unerwünscht lange Zeit fortsetzen können.
Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur Inaktivierung von infektiösen Mikroorganismen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine die infektiösen Mikroorganismen enthaltende wässrige Suspension mit einem Stabilisator versetzt, gefriertrocknet und die erhaltene Trockensubstanz 15 Minuten bis 12 Wochen auf 30 bis 110 C er hitzt, wobei eine chemische Inaktivierung stattfindet, indem die Nucleinsäurebestandteile der Mikroorganismen chemisch verändert werden.
Gegenstand der Erfindung ist weiter die Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Inaktivierung von infektiösen Viren oder Bakterien.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist neuartig, da bisher noch keine Methode bekannt war, infektiöse Mikroorganismen in Trockenform durch Einwirkung von Wärme zu inaktivieren. Wie bereits weiter oben ausgeführt, wurde nach den bekannten Verfahrensweisen stets in flüssiger Phase entweder mit Hilfe von geeigneten chemischen Mitteln oder physikalisch, beispielsweise mit UV-Strahlen, inaktiviert. Gegen die Inaktivierung des genannten biologischen Materials durch Wärmeeinwirkung bestand ein Vorurteil, denn frühere Versuche hatten gezeigt, dass die Inaktivierung in flüssiger Phase im allgemeinen zur Denaturierung des Materials und dadurch zur Beeinträchtigung erwünschter biologischer Eigenschaften oder gar zu deren Beseitigung führte.
Demgegenüber war es überratschend dass die erfindungsgemässe Inaktivierung durch Wärmeeinwirkung auf das trockene biologische Material nicht zur Denaturierung führte.
Während bei den bekannten Verfahrensweisen grösstenteils chemische Substanzen, z. B. Phenol, Formaldehyd, o. a.
als Inaktivierungsmittel verwendet wurden, werden erfindungsgemäss keine derartigen chemischen Mittel zugesetzt, so dass Nebenerscheinungen, wie Unverträglichkeiten, die auf der Anwesenheit der Inaktivierungsmittel beruhen, bei der medizinischen Anwendung nicht auftreten. Das erfindungsgemässe Verfahren hat weiter den Vorteil, dass die Gefahr einer bakteriellen Verunreinigung der Mikroorganismen während des Inaktivierungsvorganges nicht besteht, da die Inaktivierung im geschlossenen Gefäss durchgeführt werden kann.
Um die Inaktivierung abzubrechen, ist es lediglich erforderlich, das zu behandelnde Material auf tiefere Temperatur, beispielsweise Raumtemperatur, abzukühlen. Ein weiterer technischer Vorteil liegt darin, dass die aus erfindungsgemäss inaktiviertem Material hergestellten Präparate eine bessere Wirksamkeit als die bekannten Präparate aufweisen und dass sie Temperaturbelastungen ausgesetzt werden können, bei denen Vaccinen des Standes der Technik inaktiviert werden.
Zur Herstellung einer Vaccine aus den erfindungsgemäss inaktivierten Mikroorganismen kann man so vorgehen, dass man das Trockenpräparat einfach mit destilliertem Wasser, gegebenenfalls unter Zusatz eines geeigneten Puffers, z. B.
Phosphatlösung, die auch ein Adjuvans, z. B. Aluminiumhy droxid, enthalten kann, bis zu der gewünschten Konzentra tion auffüllt. Mit dem so erhaltenen Impfstoff lassen sich, je nach Ausgangsmaterial, in bekannter Weise Immunisie rungen gegen verschiedene Infektionskrankheiten durchführen.
Die derart hergestellten Vaccinen besitzen weiterhin ge genüber nach bekannten Verfahren erhaltenen Vaccinen den
Vorteil einer wesentlich verbesserten Haltbarkeit. Während nach den bisher beschriebenen Verfahren hergestellte Impf stoffe wegen ihrer Empfindlichkeit gegen höhere Tempera turen bei Temperaturen in der Nähe des Gefrierpunktes (0 bis 4" C) aufbewahrt und transportiert werden mussten, was beispielsweise unter tropischen Bedingungen mit einigem
Aufwand verbunden ist, weisen Vaccinen, hergestellt aus er findungsgemäss inaktivierten Mikroorganismen, eine sehr gute Lagerfähigkeit auch bei höheren Temperaturen, bei spielsweise 60 C, auch über längere Zeiträume auf.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird zweckmässiger weise so durchgeführt, dass man eine in bekannter Weise hergestellte wässrige Suspension der infektiösen Mikroorga nismen, z. B. Viren und Bakterien, mit einer stabilisierenden Substanz versetzt, anschliessend gefriertrocknet und das er haltene Trockenpräparat 15 Minuten bis 12 Wochen, vorzugsweise 60 Minuten bis 10 Wochen, auf eine Temperatur zwischen 30 bis 110 C, vorzugsweise 35 bis 100 C, erhitzt.
Als Stabilisatoren werden vorteilhafterweise bekannte Prä parate, beispielsweise ein nach der DT-PS 1118 792 herge stelltes Polymerisat aus abgebauter Gelatine angewendet, das unter der Bezeichnung Haemaccel im Handel ist, oder Molico$-Lösung, die aus Trockenmilchpulver hergestellt wird, ferner Saccarose-Glutamat-, Maltose-Glutamat oder Glucose Gelatine-Bouillon.
Die Dauer der Wärmeeinwirkung steht zu der Temperatur, bei der die Inaktivierung durchgeführt wird, in umge kehrtem Verhältnis, d. h. je höher die Inaktivierungstempe ratur ist, desto kürzer ist die Zeit, die zur vollständigen Inak tivierung notwendig ist. Beispielsweise dauert die Inaktivierung von Tollwutviren in Gegenwart von Haemaccel als Stabilisator bei 37 C 60 Tage, während sie bei 56" C nur
7 Tage in Anspruch nimmt. Als Viren und Bakterien, die erfindungsgemäss inaktiviert werden können, kommen beispielsweise Tollwut-, Schweinepest- und Pferdeinfluenzaviren und Rotlauf-Bakterien in Betracht.
Nach der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird mittels der üblichen Testmethoden geprüft, ob die Pathogenität beseitigt, die Antigenität dagegen erhalten geblieben ist. Zum Beispiel wird im Falle des Tollwutvirus die Unschädlichkeit durch intracerebrale Injektion an Mäusen und die antigene Wirksamkeit mittels des Habel-Tests bestimmt (WHO Monograph Series No. 23 140 [1966]).
Beispiel 1
20 g auf bekannte Weise aus Gehirn- und Rückenmark eines mit Tollwutvirus fixe infizierten Kaninchens gewonnene feuchte Substanz werden mit 180 ml einer 3,5 %gen Lösung eines polymeren Gelatinederivates, das unter der Bezeichnung Haemaccel (geschütztes Warenzeichen) im Handel ist, versetzt, im Homogenisator zu einer feinen Suspension verarbeitet, in Fläschchen zu 7 ml abgefüllt und gefriergetrocknet.
Der Virusgehalt der Trockensubstanz wird an 11-15 g schweren Mäusen durch intracerebrale (i.c.) Titration der in der ursprünglichen Konzentration (7 ml) gelösten Substanz bestimmt. Er beträgt 104,0LD50 pro 0,03 ml. Die Fläschchen werden zur Inaktivierung des Virenmaterlals anschliessend 7 Tage auf 56" C erwärmt. Durch die Wärmeeinwirkung tritt beim Trockengut makroskopisch keine Veränderung ein.
Nach 7 Tagen wird das Material mit Aqua. dest. bis zur ur sprünglichen Konzentration (7 ml) verdünnt und die Unschädlichkeit und Wirksamkeit an 11-15 g schweren Mäusen in folgender Weise getestet:
Unschädlichkeitsprüfung an a) Maus
20 Mäusen werden 0,03 ml des gelösten Materials intracerebral injiziert. Innerhalb einer Beobachtungszeit von 14 Tagen zeigen die Tiere keine Tollwut-Erscheinung. Das Virusmaterial ist somit inaktiviert. Das Ergebnis wurde in mehreren Wiederholungsversuchen bestätigt.
b) Hund
2 Hunde erhielten an 6 aufeinanderfolgenden Tagen 4 ml der Vaccine subcutan verabreicht. Während einer Beobachtungszeit von 21 Tagen wurden weder lokale noch allgemeine Reaktionen festgestellt.
c) Meerschweinchen
5 Meerschweinchen erhielten je 2 ml der Vaccine intraperitoneal verabreicht. Während einer Beobachtungszeit von 10 Tagen traten weder lokale noch allgemeine Reaktionen auf. 6 Meerschweinchen erhielten subcutan je 0,5 ml der zu prüfenden Vaccine. Während einer Beobachtungszeit von 10 Tagen wurden keine lokalen Reaktionen festgestellt.
d) Kaninchen
5 Kaninchen erhielten intracerebral je 0,3 ml der Vaccine.
Während einer Beobachtungszeit von 42 Tagen zeigten sich keine Reaktionen. Das Ergebnis wurde in einem Wiederholungsversuch unter denselben Bedingungen und mit derselben Tierzahl bestätigt.
Die obigen Unschädlichkeitsversuche ergaben, dass die Tollwut-Vaccine unschädlich und gut verträglich ist.
Wirksamkeit a) Maus
Die Wirksamkeit der Tollwutvaccine wird mit dem sogenannten Habel-Test bestimmt. Dazu werden 60 Mäuse 6mal mit 0,25 ml einer Suspension intraperitoneal (i.p.) immunisiert, die durch eine 1: 20fache Verdünnung eines Fläschcheninhaltes (7 ml) mit phosphatgepuffertem Aqua. dest. oder physiologischer Kochsalzlösung gewonnen wird, somit das Gehirn- und Rückenmarkmaterial 0,5 %ig enthält, und zwar am Montag, Mittwoch und Freitag zweier aufeinanderfolgender Wochen. 14 Tage nach der ersten Vaccination wird die Testinfektion vorgenommen. Dazu werden je 10 Mäuse mit 0,03 ml des virulenten Tollwut-Testvirus CVS 27 I b 2 (Challenge Virus Strain) in Verdünnungen von 1(r1 bis 10" i.c. infiziert.
Gleichzeitig werden je 10 unbehandelte Mäuse mit den Verdünnungen 10-5 bis 10-7 infiziert.
Von beiden Versuchsreihen werden nun nach Reed und Münch (vgl. Am. J. Hyg. 27, 493 [1938]) die 50%-Endpunkte ermittelt. Die Differenz beider Endpunkte ergibt die Schutz-LDso, das heisst diejenige Dosis, die 50% der Tiere gegen eine Infektion der angegebenen Höhe zu schützen vermag. Der Habel-Test gilt dann als bestanden, wenn die Differenz der beiden 50%-Endpunkte der vaccinierten Gruppe und der Kontrollgruppe, d. h. die Schutz-LDso einen Wert von 103,0 oder höher erreicht. Die aus erfindungsgemäss inaktiviertem Material hergestellte Vaccine ergab in mehreren Proben einen Titer von 104'0 bis 104'5 SChUtZ-LDso pro 0,03 ml.
i b) Hund
Die aus erfindungsgemäss inaktiviertem Material hergestellte Vaccine (A 12) wurde in einer Dosierung von 1 x 10 ml und 1 x 5 ml subcutan an Gruppen von je 2 Hunden, deren Seren vor Beginn des Versuches frei von virusneutralisierenden Antikörpern gegen Tollwut waren, verabreicht. Durch periodisch vorgenommene Blutentnahmen und Bestimmung der Antikörper im Serumneutralisationstest an der weissen
Maus wurde der Verlauf der Immunität durch Untersuchung der Mischseren der Hundegruppen über 52 Wochen verfolgt.
14 Tage nach der Immunisierung war mit Titern zwischen
1:12 bis 1:150 (50% neutralisierender Endpunkt der Serumverdünnung, d. h. diese Verdünnung neutralisiert 50% eines gleichen Volumes einer Virussuspension des infektiösen
Tollwutvirus) bereits das Maximum der Immunität erreicht, die dann über 50 Wochen langsam abfiel. Bei Versuchsende,
52 Wochen nach der Immunisierung, hatten die Seren der
Hundegruppen folgende Werte:
Hund Vaccination Serumtiter (50% Endpunkt)
Nr. 52 Wochen p.v.
6053 1 x 10 ml 12,3
6083
6190 lx5ml 1:7,2
6191
Diese Hunde sind immun gegen eine tödliche experimentelle Infektion mit Tollwut-Virus. (Amer. J. Vet. Res. 26, 24-30 [1965]).
Bei dem oben geschilderten Immunisierungsversuch am Hund wurde gleichzeitig mit der aus erfindungsgemäss inaktiviertem Material hergestellten Vaccine (Serumtiter am 50% Endpunkt 1: 12,3) eine gemäss dem Stand der Technik durch Inaktivierung mit Phenol nach Hempt hergestellte Tollwut Vaccine in einer Dosierung von 1 x 10 ml subcutan einer Gruppe von zwei Hunden verabreicht. 14 Tage nach der Vaccination wurden Serumtiter von 1:12 festgestellt, bei Versuchsende (52 Wochen p.v.) ein Serumtiter (50% Endpunkt) von 1:3. Auch dieser Versuch zeigt, dass die aus erfindungsgemäss inaktiviertem Material hergestellte Vaccine eine bessere Wirksamkeit besitzt als die bekannten Vaccinen.
Haltbarkeit
Die gemäss vorne hergestellte Vaccine wird 60 Tage bei 56" C gelagert und mit einer in bekannter Weise durch Inaktivierung mit Phenol erhaltenen Tollwut-Vaccine bei der niedrigeren Temperatur von 370 C verglichen.
Die Vaccine aus gemäss der Erfindung inaktiviertem Material weist auch nach 60 Tagen bei 56" C keinen Wirksamkeitsverlust auf, während die in bekannter Weise hergestellte Vaccine schon nach 15 Tagen bei der niedrigeren Temperatur von 37" C nur noch eine Wirksamkeit von 101,6 Schutz-LDso pro 0,03 ml zeigte.
Wie aus den Ergebnissen ersichtlich, übersteht die aus erfindungsgemäss inaktiviertem Material hergestellte Vaccine eine erheblich grössere Belastung durch Temperatureinwirkung, während die Antigenität der Vergleichsvaccine bei einer geringeren Belastung zerstört wird.
Versuch
Eine wie im Beispiel 1 angegeben hergestellte Vaccine aus Tollwutviren, die mit Haemaccel - und Molico -Lösung stabilisiert war, wurde dem Hebel-Test sowie der Haltbarkeitsprüfung unterworfen:
Die Ergebnisse unter Angabe der Versuchsbedingungen und Wirksamkeit sind in folgender Tabelle zusammengestellt. Zum Vergleich wurden zwei in bekannter Weise mit Phenol inaktivierte Vaccinen herangezogen.
Vaccinezusammensetzung Art der Ergebnis der Wirksamkeitsprüfung und Stabilisatorlösung Inaktivierung im Habel-Test vor Temperatur- nach Temperatur
Belastung Belastung Tollwutviren in mit Phenol 3,7 30Tage + 20 g Kan. Geh. (z. Vergleich) 56 " C 180 ml Haemaccel -Lös. = 1,2 Tollwutviren in erfindungsgemäss 4,3 60 Tage + 20 g Kan. Geh. 56"C 180 ml Haemaccel -Lös. =3,8 Tollwutviren in mit Phenol 4,7 47 Tage + 20 g Kan. Geh. (z. Vergleich) 37"C 180 ml Molico -Lös. = 0,8 Tollwutviren in erfindungsgemäss 4,3 60 Tage + 20 g Kan.
Geh. 56"C 180 ml Molico -Lös. = 4,6
Die Versuchsergebnisse zeigen, dass die nach dem erfindungsgemässen Verfahren inaktivierte Tollwutviren enthaltende Vaccinen eine wesentlich höhere Belastung aushalten als Vaccinen, die nach bekannten Verfahren hergestellt worden sind.
Beispiel 2
Mit Proben des in Beispiel 1 angegebenen Materials wurden bei verschiedenen Temperaturen Inaktivierungsversuche ausgeführt und die folgenden Resultate erzielt:
Temperatur Inaktivierungsdauer 37" C 60 Tage 45"C 35 Tage 56 C 7 Tage
Mit weiteren Proben des gleichen Virusmaterials und Molico -Lösung (9%ig) wurden die folgenden Inaktivierungsversuche ausgeführt.
Temperatur Inaktivierungsdauer 37"C 70 Tage 45"C 35 Tage 56 C 7 Tage
Ferner wurde für verschiedene Stabilisatoren, aber bei gleicher Temperatur (56 C) die Inaktivierungsdauer bestimmt:
Stabilisatoren Temperatur Inaktivierungsdauer Haemaccel 56" C 7 Tage Molico 56 C 7 Tage
Saccharose (3,5%) 56" C 70 Tage + Na-Glutamat (0,1%)
Dieses Beispiel zeigt, dass bei dem erfindungsgemässen Verfahren die Inaktivierungsdauer für ein bestimmtes Virus abhängig ist von der Wahl des Stabilisators und der Temperatur.
Alle Proben wurden auf Unschädlichkeit, Wirksamkeit und Haltbarkeit geprüft. Das Virusmaterial war inaktiviert und im Habel-Test wirksam. Es wies nach einer 60 Tage langen Lagerung bei 56" C keine Wirksamkeitsverluste auf.
Beispiel 3
Wie im Beispiel 1 angegeben, wurden Tollwut-Viren Suspensionen mit verschiedenen Stabilisatoren versetzt und durch Erhitzen bei 98" C inaktiviert. Im einzelnen gibt folgende Tabelle die Versuchsergebnisse wieder: Zusammensetzung des zu Art der Inaktivierung Prüfung der Inaktivierung Ergebnis der Wirksamkeitsinaktivierenden Materials Temperatur Zeit an der Maus prüfung im Habel-Test i.c. Injektion
20 g Kaninchengehirn 980 C 60 Min. kein Tollwutvirus 4,7
80 ml physiol. NaCl-Lösung nachgewiesen 100 ml Sacch.-Glutamat-Lösung
20 g Kaninchengehirn 980 C 60 Min. kein Tollwutvirus 4,3
40 ml physiol.
NaCl-Lösung nachgewiesen
50 ml Sacch.-Glutamat-Lösung
90 ml Haemaccel -Lösung Zusammensetzung des zu Art der Inaktivierung Prüfung der Inaktivierung Ergebnis der Wirksamkeitsinaktivierenden Materials Temperatur Zeit an der Maus prüfung im Habel-Test i.c. Injektion
20 g Kaninchengehirn 98 C 60 Min. kein Tollwutvirus 3,4
40 ml physiol. NaCl-Lösung nachgewiesen
50 ml Sacch.-Glutamat-Lösung
90 ml Molico -Lösung Dieses Beispiel zeigt, dass auch extreme Temperaturen für die Inaktivierung benutzt werden können, ohne dass die Wirksamkeit des erfindungsgemäss zu inaktivierenden Materials beeinträchtigt wird. Die Inaktivierungsdauer wird dadurch erheblich verkürzt.
Versuch
Drei aus erfindungsgemäss inaktiviertem Material hergestellte Vaccinen
A 16 (inaktiviert 5 Tage bei +70 C)
A 17 (inaktiviert 3 Tage bei +70 C)
A 18 (inaktiviert 7 Tage bei +70 C) werden vergleichend mit zwei durch Inaktivierung mit Phenol nach Hempt hergestellten Tollwut-Vaccinen (B 3 und B 4) im Habel-Test geprüft.
Wie in Beispiel 1 dargelegt, wird im Habel-Test verlangt, dass eine 6malige Injektion von 0,25 ml der auf 0,5% Nervengewebeanteil verdünnten Vaccine gegen 1.000 LD50 (log 3) des Infektionsvirus schützt. Bei der Tollwutvaccine nach Hempt wird deshalb die 10%ige Nervengewebesuspension normalerweise im Verhältnis 1:20 verdünnt.
Vaccine Herstellung Vaccineverdünnung (%Nervengewebeanteil)
1 :20 (0,5%) 1 :40(0,25%) 1: 80 (0,125%)
A16 erfindungsgem. a 5,7 5,7 5,7 inakt. b 1,0 1,4 2,0 c 4,7 4,3 3,7
A 17 erfindungsgem. a 5,7 5,7 5,7 inakt. b 1,4 2,4 2,1 - c 4,3 3,3 3,6
A 18 erfindungsgem. a 6,1 6,1 6,1 inakt. b 1,0 1,0 1,6 c 5,1 5,1 4,5
B 3 Stand der Technik a 5,3 5,3 5,3 b 1,6 2,0 3,3 c 3,7 3,3 2,0
B 4 Stand der Technik a 5,7 5,7 nicht b 2,6 3,6 untersucht c 3,1 2,1 a = Log. des 50%gen Endpunktes der Kontrolltiere (LDso) b = Log. des 50 %igen Endpunktes der vaccinierten Tiere (LDso) c = Log. des Schutz-LDso (a-b)
Aus der Tabelle ist zu ersehen, dass die aus erfindungsgemäss inaktiviertem Material hergestellten Vaccinen in den Verdünnungen 1:20, 1:40 und sogar 1:
:80 den Habel-Test bestehen. Die nach dem Stand der Technik hergestellten Tollwutvaccinen nach Hempt erfüllten in der Verdünnung 1:20 den Habel-Test, in der Verdünnung 1:40 erfüllte nur noch eine Vaccine den Test und in der Verdünnung 1:80 auch diese nicht mehr. Die aus erfindungsgemäss inaktiviertem Material hergestellten Vaccinen sind soweit antigenwirksamer als nach dem Stand der Technik hergestellte.
Beispiel 4
5 Liter einer auf bekannte Weise hergestellten Erysipelothrixrhusiopatiae-Suspension wurden mit 2,5 1 einer aus 50 % Haemaccel und 50 % Saccharose-Glutamat-Lösung bestehenden Stabilisatorlösung gemischt und gefriergetrocknet.
Anschliessend wurde das Trockengut 32 Tage lang bei 70 C gehalten.
a) Nachweis der Inaktivierung
Zum Nachweis der Inaktivierung wurden die lebenden Keime gezählt. Am 30. Tage der Inaktivierung war kein Keimwachstum mehr zu beobachten.
b) Bestimmung der Wirksamkeit
Eine Vaccine wurde nach Auflösung der erfindungsgemäss hergestellten Trockensubstanz in 0,8 Ssiger Al(OH)3 Lösung analog den Vorschriften für die staatliche Prüfung von Rotlauf-Impfstoffen (Hellich -Störiko, Die deutsche Tierseuchengesetzgebung 1953, S. 623) durch Immunisierung von Mäusegruppen und nachfolgende Infektion mit einer standardisierten Keimzahl mit der Wirksamkeit der internationalen Rotlauf-Standard-Vaccine verglichen, deren Gehalt an Internationalen Einheiten (IE) bekannt ist. Mit Hilfe der Dreipunktmethode wurde der Gehalt an Internationalen Einheiten errechnet. Ein Rotlauf-Impfstoff, der den behördlich vorgeschriebenen Bedingungen genügt, muss bei einer Laufzeit von 2 Jahren mindestens 50 Internationale Einheiten pro 1 ml aufweisen.
Die aus erfindungsgemäss inaktiviertem Material hergestellte Vaccine zeigte bei der vergleichenden Prüfung mit der internationalen Rotlauf-Standard-Vaccine Rf2 einen Gehalt von 175 IE pro 1 ml. Das ist etwa das Dreifache der geforderten Anzahl an Internationalen Einheiten.
Das Beispiel zeigt, dass auch Bakterien nach dem erfindungsgemässen Verfahren inaktiviert werden können.
PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zur Inaktivierung von infektiösen Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine die infektiösen Mikroorganismen enthaltende wässrige Suspension mit einem Stabilisator versetzt, gefriertrocknet und die erhaltene Trockensubstanz 15 Minuten bis 12 Wochen auf 30 bis 110 C erhitzt, wobei eine chemische Inaktivierung stattfindet.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man die Trockensubstanz 60 Minuten bis 10 Wochen erhitzt.
2. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man die Trockensubstanz auf 35 bis 100" C erhitzt.
3. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man als Stabilisator ein Polymerisat aus abgebauter Gelatine verwendet.
4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Stabilisator eine Lösung aus Trockenmilchpulver verwendet.
5. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man als Stabilisator eine Saccharose-Glutamat Lösung, eine Maltose-Glutamat-Lösung oder Glukose-Gelatine-Bouillon verwendet.
PATENTANSPRUCH II
Anwendung des Verfahrens nach Patentanspruch I zur Inaktivierung von infektiösen Viren oder Bakterien.
Methods are already known with which biological substances, in particular infectious microorganisms and / or their antigens, can be inactivated. So far either chemical or physical methods have been used. However, what all known methods have in common is that the biological substances are inactivated in a liquid state. The chemical methods have the disadvantage that when the inactivated substance is added, the container has to be opened and the biological material can be contaminated by fungi and bacteria.
In most cases, added chemicals do not allow the inactivation to be terminated properly and desirable properties, such as antigenicity in viruses and bacteria for the production of vaccines, are also affected. For the same reason, the shelf life of such substances is also restricted. But it is precisely the durability that plays a major role in biological material, for example on transport and in tropical countries, where higher temperatures are inevitable and cannot be avoided. Therefore, refrigeration is required for the preparations in question. It was also helpful that, for example, in the case of using formaldehyde as an inactivating agent to bind the unreacted formaldehyde, bisulfite was added, and the container had to be opened again.
It has also proven to be a disadvantage that added chemicals, for example phenol, have caused incompatibilities when used on humans and animals.
The physical methods also have disadvantages.
For example, suspensions that contain the biological substances mentioned must be exposed to UV rays in special devices in a film of uniform thickness for inactivation. Under certain circumstances, peroxides are formed which can continue the inactivation for an undesirably long time.
The invention now relates to a method for inactivating infectious microorganisms, which is characterized in that a stabilizer is added to an aqueous suspension containing the infectious microorganisms, freeze-dried and the dry substance obtained is heated to 30 to 110 C for 15 minutes to 12 weeks, chemical inactivation takes place by chemically changing the nucleic acid components of the microorganisms.
The invention also relates to the use of the method according to the invention for inactivating infectious viruses or bacteria.
The method according to the invention is novel, since no method was previously known for inactivating infectious microorganisms in dry form by the action of heat. As already stated above, according to the known procedures, inactivation was always carried out in the liquid phase either with the aid of suitable chemical agents or physically, for example with UV rays. There was a prejudice against the inactivation of the biological material mentioned by the action of heat, because earlier experiments had shown that inactivation in the liquid phase generally led to denaturation of the material and thus to impairment of desired biological properties or even to their elimination.
In contrast, it was surprising that the inactivation according to the invention through the action of heat on the dry biological material did not lead to denaturation.
While in the known procedures mostly chemical substances such. B. phenol, formaldehyde, o.
were used as inactivating agents, no such chemical agents are added according to the invention, so that side effects, such as incompatibilities, which are based on the presence of the inactivating agents, do not occur in medical use. The method according to the invention also has the advantage that there is no risk of bacterial contamination of the microorganisms during the inactivation process, since the inactivation can be carried out in a closed vessel.
In order to terminate the inactivation, it is only necessary to cool the material to be treated to a lower temperature, for example room temperature. Another technical advantage lies in the fact that the preparations made from the inactivated material according to the invention are more effective than the known preparations and that they can be exposed to thermal stresses in which vaccines of the prior art are inactivated.
To prepare a vaccine from the microorganisms inactivated according to the invention, the procedure can be that the dry preparation is simply washed with distilled water, optionally with the addition of a suitable buffer, e.g. B.
Phosphate solution, which is also an adjuvant, e.g. B. aluminum hydroxide, may contain up to the desired concentration fills. With the vaccine obtained in this way, depending on the starting material, immunizations against various infectious diseases can be carried out in a known manner.
The vaccines produced in this way also have the vaccines obtained by known methods compared to the
Advantage of a significantly improved shelf life. While vaccines produced by the methods described so far had to be stored and transported at temperatures near freezing (0 to 4 "C) because of their sensitivity to higher tempera tures, which for example under tropical conditions with some
Costly, vaccines produced from microorganisms inactivated according to the invention have a very good shelf life, even at higher temperatures, for example 60 ° C., even over long periods of time.
The inventive method is expediently carried out so that one prepared in a known manner aqueous suspension of the infectious microorganisms, z. B. Viruses and bacteria, mixed with a stabilizing substance, then freeze-dried and he kept dry preparation 15 minutes to 12 weeks, preferably 60 minutes to 10 weeks, heated to a temperature between 30 to 110 C, preferably 35 to 100 C.
As stabilizers, known preparations are advantageously used, for example a polymer made from degraded gelatin produced according to DT-PS 1118 792, which is commercially available under the name Haemaccel, or Molico $ solution, which is made from dry milk powder, and also sucrose glutamate -, maltose glutamate or glucose gelatine broth.
The duration of the exposure to heat is inversely related to the temperature at which the inactivation is carried out; H. the higher the inactivation temperature, the shorter the time that is necessary for complete inactivation. For example, the inactivation of rabies viruses in the presence of Haemaccel as a stabilizer takes 60 days at 37 C, while it only takes 60 days at 56 "C
Takes 7 days. Viruses and bacteria which can be inactivated according to the invention include, for example, rabies, swine fever and equine influenza viruses and ruddy bacteria.
After the method according to the invention has been carried out, the usual test methods are used to check whether the pathogenicity has been eliminated while the antigenicity has been retained. For example, in the case of the rabies virus, the harmlessness is determined by intracerebral injection in mice and the antigenic effectiveness is determined by means of the Habel test (WHO Monograph Series No. 23 140 [1966]).
example 1
20 g of moist substance obtained in a known manner from the brain and spinal cord of a rabbit infected with rabies virus are mixed with 180 ml of a 3.5% solution of a polymeric gelatin derivative which is commercially available under the name Haemaccel (registered trademark), in Homogenizer processed into a fine suspension, filled into 7 ml vials and freeze-dried.
The virus content of the dry substance is determined in mice weighing 11-15 g by intracerebral (i.c.) titration of the substance dissolved in the original concentration (7 ml). It is 104.0LD50 per 0.03 ml. In order to inactivate the viral material, the vials are then heated to 56 ° C. for 7 days. The effect of heat does not result in any macroscopic change in the dry material.
After 7 days the material is aqua. least. diluted up to the original concentration (7 ml) and tested the harmlessness and efficacy on 11-15 g mice as follows:
Harmlessness test on a) mouse
20 mice are injected intracerebrally with 0.03 ml of the solute. The animals did not show any signs of rabies within an observation period of 14 days. The virus material is thus inactivated. The result was confirmed in several repeated attempts.
b) dog
2 dogs received 4 ml of the vaccine subcutaneously on 6 consecutive days. Neither local nor general reactions were observed during an observation period of 21 days.
c) guinea pigs
5 guinea pigs each received 2 ml of the vaccine intraperitoneally. Neither local nor general reactions occurred during an observation period of 10 days. 6 guinea pigs each received 0.5 ml of the vaccine to be tested subcutaneously. No local reactions were found during an observation period of 10 days.
d) rabbits
5 rabbits each received 0.3 ml of the vaccine intracerebrally.
There were no reactions during an observation period of 42 days. The result was confirmed in a repeated test under the same conditions and with the same number of animals.
The above harmlessness tests showed that the rabies vaccine is harmless and well tolerated.
Effectiveness a) mouse
The effectiveness of the rabies vaccine is determined with the so-called Habel test. For this purpose, 60 mice are immunized 6 times with 0.25 ml of a suspension intraperitoneally (i.p.), which is obtained by a 1:20 dilution of the contents of the vial (7 ml) with phosphate-buffered aqua. least. or physiological saline solution is obtained so that the brain and spinal cord material contains 0.5%, on Monday, Wednesday and Friday for two consecutive weeks. The test infection is carried out 14 days after the first vaccination. For this purpose, 10 mice each are infected with 0.03 ml of the virulent rabies test virus CVS 27 I b 2 (Challenge Virus Strain) in dilutions of 1 (r1 to 10 "i.c.).
At the same time, 10 untreated mice each are infected with the dilutions 10-5 to 10-7.
According to Reed and Münch (cf. Am. J. Hyg. 27, 493 [1938]), the 50% endpoints are determined from both test series. The difference between the two endpoints gives the protective LD50, that is to say the dose that is able to protect 50% of the animals against infection of the specified level. The Habel test is considered passed if the difference between the two 50% endpoints of the vaccinated group and the control group, i.e. H. the protective LDso reaches a value of 103.0 or higher. The vaccine produced from the inactivated material according to the invention gave a titer of 10 4 to 10 4 5 SChUtZ-LD 50 per 0.03 ml in several samples.
i b) dog
The vaccine (A 12) produced from inactivated material according to the invention was administered subcutaneously in a dosage of 1 × 10 ml and 1 × 5 ml to groups of 2 dogs each whose sera were free of virus-neutralizing antibodies against rabies before the start of the experiment. Periodically taking blood samples and determining the antibodies in the serum neutralization test on the white
The course of immunity was followed in mice by examining the mixed sera of the groups of dogs over 52 weeks.
14 days after immunization was with titers between
1:12 to 1: 150 (50% neutralizing endpoint of the serum dilution, i.e. this dilution neutralizes 50% of an equal volume of a virus suspension of the infectious
Rabies virus) already reached the maximum of immunity, which then slowly declined over 50 weeks. At the end of the experiment,
52 weeks after immunization, the sera had the
Dog groups have the following values:
Dog vaccination serum titer (50% endpoint)
No. 52 weeks p.v.
6053 1 x 10 ml 12.3
6083
6190 lx5ml 1: 7.2
6191
These dogs are immune to a deadly experimental infection with the rabies virus. (Amer. J. Vet. Res. 26, 24-30 [1965]).
In the immunization test on dogs described above, a rabies vaccine produced according to the prior art by inactivation with phenol according to Hempt was administered at a dose of 1 x 10 ml administered subcutaneously to a group of two dogs. 14 days after the vaccination, serum titers of 1:12 were determined, at the end of the experiment (52 weeks p.v.) a serum titre (50% end point) of 1: 3. This experiment also shows that the vaccine produced from the inactivated material according to the invention is more effective than the known vaccines.
durability
The vaccine prepared according to the above is stored for 60 days at 56.degree. C. and compared with a rabies vaccine obtained in a known manner by inactivation with phenol at the lower temperature of 370.degree.
The vaccine made from material inactivated according to the invention shows no loss of effectiveness even after 60 days at 56 "C, while the vaccine produced in a known manner after 15 days at the lower temperature of 37" C only has an effectiveness of 101.6 protective LD 50 per 0.03 ml showed.
As can be seen from the results, the vaccine produced from the inactivated material according to the invention withstands a considerably greater exposure to temperature, while the antigenicity of the comparison vaccine is destroyed at a lower exposure.
attempt
A vaccine produced from rabies viruses as indicated in Example 1, which was stabilized with Haemaccel and Molico solutions, was subjected to the lever test and the durability test:
The results, including the test conditions and effectiveness, are compiled in the following table. For comparison, two vaccines inactivated in a known manner with phenol were used.
Vaccine composition Type of result of the effectiveness test and stabilizer solution Inactivation in the Habel test before temperature - after temperature
Exposure exposure rabies virus in with phenol 3.7 30 days + 20 g can. Go (for comparison) 56 "C 180 ml Haemaccel solution = 1.2 rabies viruses in 4.3 60 days according to the invention + 20 g can. Go 56" C 180 ml Haemaccel solution. = 3.8 rabies viruses in 47 days with phenol + 20 g Kan. Go (for comparison) 37 "C 180 ml Molico solution = 0.8 rabies virus in 4.3 60 days + 20 g Kan.
Go 56 "C 180 ml Molico solution = 4.6
The test results show that the vaccines containing rabies viruses which have been inactivated by the method according to the invention can withstand a significantly higher exposure than vaccines which have been produced according to known methods.
Example 2
Inactivation tests were carried out at various temperatures with samples of the material specified in Example 1 and the following results were obtained:
Temperature inactivation duration 37 "C 60 days 45" C 35 days 56 C 7 days
The following inactivation experiments were carried out with further samples of the same virus material and Molico solution (9%).
Temperature inactivation duration 37 "C 70 days 45" C 35 days 56 C 7 days
The inactivation time was also determined for various stabilizers, but at the same temperature (56 C):
Stabilizers Temperature Inactivation time Haemaccel 56 "C 7 days Molico 56 C 7 days
Sucrose (3.5%) 56 "C 70 days + Na glutamate (0.1%)
This example shows that in the method according to the invention the inactivation time for a specific virus depends on the choice of stabilizer and the temperature.
All samples were tested for harmlessness, effectiveness and durability. The virus material was inactivated and effective in the Habel test. It showed no loss of effectiveness after storage for 60 days at 56 ° C.
Example 3
As indicated in Example 1, various stabilizers were added to rabies virus suspensions and inactivated by heating at 98 ° C. The following table shows the test results in detail: Composition of the type of inactivation Test of inactivation Result of the effectiveness inactivating material Temperature Time at the Mouse examination in the Habel test ic injection
20 g rabbit brain 980 C 60 min. No rabies virus 4.7
80 ml physiol. NaCl solution detected 100 ml saccharine glutamate solution
20 g rabbit brain 980 C 60 min. No rabies virus 4.3
40 ml physiol.
NaCl solution detected
50 ml sacch. Glutamate solution
90 ml Haemaccel solution Composition of the type of inactivation Test of inactivation Result of the effectiveness inactivating material Temperature Time on the mouse Test in the Habel test i.c. injection
20 g rabbit brain 98 C 60 min. No rabies virus 3,4
40 ml physiol. NaCl solution detected
50 ml sacch. Glutamate solution
90 ml Molico solution This example shows that extreme temperatures can also be used for the inactivation without the effectiveness of the material to be inactivated according to the invention being impaired. This significantly shortens the inactivation time.
attempt
Three vaccines produced from inactivated material according to the invention
A 16 (inactivated 5 days at +70 C)
A 17 (inactivated 3 days at +70 C)
A 18 (inactivated for 7 days at +70 C) are compared with two rabies vaccines (B 3 and B 4) produced by inactivation with phenol according to Hempt in the Habel test.
As shown in Example 1, the Habel test requires that a 6-time injection of 0.25 ml of the vaccine diluted to 0.5% nerve tissue content protect against 1,000 LD50 (log 3) of the infectious virus. In the rabies vaccine according to Hempt, the 10% nerve tissue suspension is therefore normally diluted in a ratio of 1:20.
Vaccine production Vaccine dilution (% nerve tissue content)
1:20 (0.5%) 1:40 (0.25%) 1:80 (0.125%)
A16 according to the invention a 5.7 5.7 5.7 inact. b 1.0 1.4 2.0 c 4.7 4.3 3.7
A 17 according to the invention. a 5.7 5.7 5.7 inact. b 1.4 2.4 2.1 - c 4.3 3.3 3.6
A 18 according to the invention. a 6.1 6.1 6.1 inact. b 1.0 1.0 1.6 c 5.1 5.1 4.5
B 3 prior art a 5.3 5.3 5.3 b 1.6 2.0 3.3 c 3.7 3.3 2.0
B 4 prior art a 5.7 5.7 not b 2.6 3.6 examined c 3.1 2.1 a = log. of the 50% gene end point of the control animals (LDso) b = log. of the 50% end point of the vaccinated animals (LDso) c = log. of the protection LDso (a-b)
The table shows that the vaccines produced from the inactivated material according to the invention in the dilutions 1:20, 1:40 and even 1:
: 80 Pass the Habel test. The rabies vaccines according to Hempt produced according to the prior art fulfilled the Habel test in the 1:20 dilution, only one vaccine fulfilled the test in the 1:40 dilution and this also no longer fulfilled the 1:80 dilution. The vaccines produced from inactivated material according to the invention are so far more antigenic than those produced according to the prior art.
Example 4
5 liters of an Erysipelothrixrhusiopatiae suspension prepared in a known manner were mixed with 2.5 1 of a stabilizer solution consisting of 50% Haemaccel and 50% sucrose-glutamate solution and freeze-dried.
The dry material was then kept at 70 ° C. for 32 days.
a) Proof of inactivation
The living germs were counted to prove inactivation. On the 30th day of inactivation, no further germ growth could be observed.
b) Determination of effectiveness
After dissolving the dry substance prepared according to the invention in 0.8 Ssiger Al (OH) 3 solution, a vaccine was prepared analogously to the regulations for the state testing of Rotlauf vaccines (Hellich-Störiko, Die deutsche Tierseuchengesetzgebung 1953, p Subsequent infection with a standardized bacterial count compared with the effectiveness of the international Rotlauf standard vaccine, the content of which is known in International Units (IU). The content of international units was calculated using the three-point method. A Rotlauf vaccine that meets the officially prescribed conditions must have at least 50 international units per 1 ml over a period of 2 years.
The vaccine produced from the inactivated material according to the invention showed a content of 175 IU per 1 ml in the comparative test with the international red run standard vaccine Rf2. This is about three times the required number of international units.
The example shows that bacteria can also be inactivated by the method according to the invention.
PATENT CLAIM 1
Process for inactivating infectious microorganisms, characterized in that a stabilizer is added to an aqueous suspension containing the infectious microorganisms, freeze-dried and the dry substance obtained is heated to 30 to 110 C for 15 minutes to 12 weeks, with chemical inactivation taking place.
SUBCLAIMS
1. The method according to claim I, characterized in that the dry substance is heated for 60 minutes to 10 weeks.
2. The method according to claim I, characterized in that the dry substance is heated to 35 to 100 "C.
3. The method according to claim I, characterized in that the stabilizer used is a polymer made from degraded gelatin.
4. The method according to claim 1, characterized in that a solution of dry milk powder is used as the stabilizer.
5. The method according to claim I, characterized in that the stabilizer used is a sucrose-glutamate solution, a maltose-glutamate solution or glucose-gelatin broth.
PATENT CLAIM II
Use of the method according to claim I for the inactivation of infectious viruses or bacteria.