La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'esters actifs de peptides ou d'amino-acides.
Les esters actifs d'amino-acides ou de peptides, qui sont bien connus dans la chimie des peptides possèdent le caractère réactif d'agents d'acylation. Ces esters sont donc des composés utiles qu'on utilise dans le procédé appelé procédé d'esters actifs pour la synthèse des peptides. Ces esters sont particulièrement utiles pour la synthèse de polypeptides séquencés.
Des esters actifs ont été synthétisés directement en présence d'un carbodi-imide N,N'-disubstitués comme agents de
condensation. Cependant, la formation de dérivés d'urée
accompagne cette réaction connue, et la séparation de ces
dérivés d'urée du mélange réactionnel est généralement difficile, et par conséquent, on n'obtient pas facilement des esters peptides actifs purs. En outre, la reconversion de ces dérivés d'urée en dérivés de carbodi-imides pour une nouvelle utilisation est plutôt difficile.
On a maintenant trouvé que des isonitriles sont efficaces comme agents de condensation pour la production d'esters
actifs.
La réaction selon l'invention est conduite en faisant réagir un amino-acide ou un peptide N-protégé avec un composé
organique ayant une fonction hydroxyle active, en présence d'un isonitrile. On appelle désormais le composé organique précité ayant une fonction hydroxyle active composé hydroxy-actif .
Dans la réaction, des formamides N-substitués dérivant des isonitriles utilisés sont formés simultanément en tant que sousproduits.
Les peptides ou amino-acides de départ ne sont pas critiques. On peut utiliser n'importe quel groupe protecteur des fonctions amino courant dans la chimie des peptides pour les amino-acides ou peptides de départ. Les groupes protecteurs pour la fonction amino incluent, entre autre, les groupes carbobenzoxy, t-butyloxycarbonyle, phtalyle, formyle, tosyle et O-nitro-phénylsulfényle.
Si on utilise des peptides ou des amino-acides ayant encore d'autres groupes fonctionnels réactifs, de préférence on protège ces groupes fonctionnels additionnels de manière classique, aussi bien du point de vue de la pureté que du rendement en produit. De tels composés sont par exemple les amino-acides basiques comme la lysine et l'arginine, des amino-acides acides tels que les acides aspartique et glutamique, des amino-acides contenant un groupe thiol tel que la cystéine, et des peptides contenant les restes d'amino-acides précités.
On peut utiliser dans la présente invention n'importe quels
composés hydroxy-actifs connus dans la chimie des peptides sans limitation particulière. Ces composés hydroxy-actifs sont indiqués par exemple dans Journal of Synthetic Organic
Chemistry , Japan, 29, 27 (1971). Ils incluent le p-nitrophénol, les trichloro- et les tétrachlorophénols, le N-hydroxysuccinimide, le N-hydroxybenzotriazole et la N-hydroxypipéri
dine. Le rapport molaire entre un peptide ou un amino-acide
N-protégé par rapport molaire entre un peptide ou un aminoacide N-protégé par rapport au composé hydroxy-actif n'est pas critique, mais de préférence il est de 1:1 ou légèrement inférieur, par exemple 1: 2.
Les isonitriles utilisés dans la présente invention ne sont pas
critiques, et on peut utiliser n'importe quels isonitriles tels que des alcoyl-, allyl- et aralcoyl-isonitriles. En outre, des isonitriles ayant des groupes fonctionnels inertes tels que des groupes nitro ou halogéno et un fragment ester ne répriment pas cette réaction de condensation et ils sont efficaces de manière analogue comme agent de condensation. Des exemples d'isonitriles typiques incluent l'i-propylisonitrile, le n-butylisonitrile, le t-butylisonitrile, le phénylisonitrile et le benzylisonitrile. On utilise ces isonitriles de préférence en une quantité de 1 mole ou un excès modéré, par exemple de 1,5 à 2,0 moles par mole de peptide ou d'amino-acide N-protégé.
On peut conduire la réaction sans un solvant en présence d'un excès d'isonitrile, et on peut aussi la conduire en solutions aqueuses. Cependant, on préfère conduire la réaction dans des solvants organiques, inertes. Ces solvants incluent des hydrocarbures halogénés tels que le chlorure de méthylène, le chloroforme, et le dichlorure d'éthylène; des éthers tels que l'éthyléther, le tétrahydrofuranne et le dioxanne; des esters tels que l'acétate d'éthyle; des nitriles tels que l'acétonitrile et le diméthylformamide.
Lorsqu'on emploie un solvant, on peut ajouter dans n'importe quel ordre les matières de départ au solvant.
La température et le temps réactionnels optimum dépendent du peptide ou de l'amino-acide, et du composé hydroxylé actif utilisé. On peut accélérer la réaction par chauffage, et en général elle est complète à 10oC à 800C pendant quelques heures jusqu'à 50 heures. Lorsqu'on utilise des peptides ou des amino-acides optiquement actifs, on conduit de préférence la réaction à une température en dessous de 70 C, en particulier comprise entre 40 et 65oC parce que la racémisation peut se produire aux températures trop élevées.
S'il est nécessaire d'isoler l'ester actif formé, on peut le faire par les procédés utilisés dans la chimie des peptides. Bien qu'on puisse obtenir un peptide par réaction de l'ester actif ainsi formé avec un amino-acide ou peptide à groupe carboxyle protégé, on peut obtenir le même peptide dans une seule étape sans isolation de l'ester actif, en ajoutant l'aminoacide ou le peptide à carboxyle protégé directement au mélange réactionnel.
Dans la réaction de la présente invention, il se trouve aussi des formamides N-substitués dérivant des isonitriles utilisés dans le mélange réactionnel. Cependant, les formamides Nsubstitués, notamment le formamide dérivé du N- ou de l'isopropylisonitrile, ou du t-butylisonitrile peuvent facilement être séparés du mélange réactionnel par distillation sous pression réduite. On peut ainsi obtenir les esters actifs avec une pureté très élevée. En outre, les formamides N-substitués isolés peuvent facilement être reconvertis en l'isonitrile correspondant par l'action d'agents de déshydratation tels que le phosgène et l'oxychlorure de phosphore.
Les exemples suivants illustrent l'invention. On a identifié le peptide ou l'ester actif obtenu dans chaque exemple par son point de fusion, ces spectres infrarouges et de raisonnance magnétique nucléaire, et des chromatogrammes sur couche mince.
Exemple I
On a dissous 4,18 g (20 mmoles) de N-carbobenzoxyglycine, 2,3 g (20 mmoles) de N-hydroxysuccinimide et 2,0 g (30 mmoles) d'isopropylisonitrile dans 70 ml d'acétate d'éthyle et on a chauffé la solution obtenue à 650C pendant 30 heures.
On a concentré le mélange réactionnel puis on a trituré le résidu avec de l'éther pour obtenir le produit désiré sous forme de poudre. On a filtré et lavé le poudre avec de l'éther de pétrole. On a réuni les eaux de lavage et les eaux mères et on les a refroidies. On a séparé par filtration les cristaux ayant précipité. En combinant la poudre filtrée et les cristaux précipités, on a obtenu 4,95 g de N-hydroxysuccinimide-ester de N-carbobenzoxyglycine (rendement de 81 Sc). Après recristallisation dans un mélange de chlorure de méthylène et d'éther de pétrole on a obtenu des cristaux qui fondaient à 110-1120C.
Analyse élémentaire: Cl4Hz406N2
C H N
trouvé 54,90% 4,61 iC 9,15%
calculé 55,01% 4,66% 8,80%
Exemples 2 à 4
On a synthétisé le N-hydroxysuccinimide ester du N-carbobenzoxy-amino-acide indiqué dans la liste du tableau I comme dans l'exemple 1. On a utilisé la même quantité de chaque réactif et de solvant que dans l'exemple 1. Les conditions réactionnelles utilisées et le rendement sont indiqués dans le tableau I.
Tableau I
Exemple - N-carbobenzoxy- Isonitrile Solvant Temp. Temps Rendement p.f. Rotation spécifique
No amino-acide réaction- réaction- (%) (Oc) - [a]?E )5 (o)
nelle (0C) nel (h) 2 N-carbobenzoxy- N-propyl- chlorure de 40 . 42 41 95- 87 -55 (C = 2,
L-proline isonitrile méthylène dioxanne) 3 N-carbobenzoxy- t-butyl- chloroforme 70 20 55 114-115 -24,8 (C = 2,
L-valine isonitrile dioxanne) 4 N-carbobenzoxy- benzyl- acétate 70 30 73 135-137 - 17,1 (C = 2,
L-phénylalanine isonitrile d'éthyle dioxanne)
Exemple S
On a dissous 6,0 g (20 mmoles) de N-carbobenzoxy-Lphénylalanine, 3,3 g (24 mmoles) de p-nitrophénol et 1,6 g (24 mmoles) d'isopropylisonitrile dans 50 ml d'acétate d'éthyle.
On a chauffé la solution obtenue à 60OC pendant 40 heures.
Après avoir concentré le mélange réactionnel, on a dissous le résidu dans l'méthanol et on a gardé la solution obtenue dans un réfrigérateur. On a séparé par filtration les cristaux précipités. On a lavé les cristaux avec de l'éther de pétrole et on les a séchés. On a obtenu 4,5 g de p-nitrophénylester de N-carbo benzoxy-L-phénylalanine (rendement de 53%). Ils fondaient à 125,5-1270C et avaient un indice de rotation spécifique: [G]25 = - 8,00 (C= 2,2 dans le chloroforme).
Analyse élémentaire: C23H20N2O6
C H N trouvé 65,89% 4,83% 6,82%
calculé 65,70% 4,80% 6,66%
Exemples 6 à 9
On a synthétisé le p-nitrophénylester du peptide ou de l'amino-acîde N-protégé indiqué dans la liste du tableau II comme dans l'exemple 5, en utilisant l'isopropylisonitrile. On a utilisé la même quantité de chaque réactif et de solvant que dans l'exemple 5. Les conditions réactionnelles utilisées et le rendement sont indiqués dans le tableau II.
Tableau II
Exemple Amino-acide ou peptide Solvant Temp. Temps Rendement No N-protégé réactionnelle réactionnel (%)
( C) (h) 6 N-carbobenzoxy- acétate 65 24 63
S-benzyl-L- d'éthyle
cystéine 7 N-t-butyloxy- chlorure de 40 30 52
carbonyl-L- méthylène
alanine 8 N-formyl-L- dioxanne 70 28 48
phénylalanine 9 N-carbobenzoxy- acétate 65 24 56
L-phénylalanyl- d'éthyle
glycine
Exemple 10
On a dissous 5,02 g (20 mmoles) de N-carbobenzoxy-L.
valine, 5,61 g (20 mmoles) de pentachlorophénol et 2,0 g (30 mmoles) de n-propylisonitrile dans 70 ml d'acétate d'éthyle, et on a chauffé la solution obtenue à 65oC pendant 24 heures
On a gardé le mélange réactionnel dans un réfrigérateur et on a séparé par filtration les cristaux précipités. On a concentré les eaux mères, et on a recristallisé le résidu obtenu dans un mélange d'éther de pétrole et d'acétate d'éthyle pour obtenir une nouvelle quantité de cristaux. Ces deux jets de cristaux représentaient 8,05 g de pentachlorophénylester de N.
carbobenzoxy-L-valine (rendement de 81%). Après recristalli sation dans le méthanol on a obtenu 6,8 g de cristaux (rendement de 68 %) qui fondaient à 142,5-143,50C et qui avaient un indice de rotation spécifique: [a]D5 = -20,2 (C = 0,49 dans le chloroforme).
Analyse élémentaire: ClsHl604NCls
C H N Cl trouvé 45,77% 3,26% 2,68% 35,76% calculé 45,67% 3,23% 2,80% 35,48%
Exemples il à 14
On a synthétisé le pentachlorophénylester du N-carbobenzoxy-amino-acide indiqué dans la liste du tableau III comme dans l'exemple 10, en utilisant l'isonitrile indiqué dans la liste du tableau III. On a utilisé la même quantité de chaque réactif et de solvant que dans l'exemple 10. Les conditions réactionnelles utilisées et le rendement et les propriétés du produit sont résumés dans le tableau III.
Tableau III
Exemple N-carbobenzoxy- Isonitrile Solvant Temp. Temps Rendement p. f. Rotation spécifique
No amino-acide réaction- réaction- (%) ( C) [a]R (O)
nelle(OC) nel (h) 11 N-carbobenz- i-propyl- acétate temp. 51 75 153 -52,6 (C = 1,
oxy-L-phenyl- isonitrile d'éthyle ordinaire DMF*)
alanine 12 N-carbobenz- i-propyl- DMF 65 24 86 154-157 -52,0 (C = 1,
oxy-L-phényl- isonitrile DMF)
alanine 13 Na, N & n-propyl- acétate 65 24 90 154-156 -7,8 (C = 0,8,
di-carbobenz- isonitrile d'éthyle chloroforme)
oxy-L-lysine 14 N-carbobenz- t-butyl- acétate 50 28 43 183-186 -23,3 (C = 1,
oxy-L-sérine isonitrile d'éthyle- DMF)
DMF
* DMF = diméthylformamide
The present invention relates to a process for preparing active esters of peptides or amino acids.
Active esters of amino acids or peptides, which are well known in peptide chemistry, possess the reactive character of acylating agents. These esters are therefore useful compounds which are used in the process referred to as the active ester process for the synthesis of peptides. These esters are particularly useful for the synthesis of sequenced polypeptides.
Active esters have been synthesized directly in the presence of an N, N'-disubstituted carbodi-imide as
condensation. However, the formation of urea derivatives
accompanies this known reaction, and the separation of these
urea derivatives of the reaction mixture is generally difficult, and therefore, pure active peptide esters are not easily obtained. In addition, the conversion of these urea derivatives back to carbodiimide derivatives for further use is rather difficult.
It has now been found that isonitriles are effective as condensing agents for the production of esters.
active.
The reaction according to the invention is carried out by reacting an amino acid or an N-protected peptide with a compound
organic having an active hydroxyl function, in the presence of an isonitrile. The aforementioned organic compound having an active hydroxyl function is now called a hydroxy-active compound.
In the reaction, N-substituted formamides derived from the isonitriles used are formed simultaneously as by-products.
The starting peptides or amino acids are not critical. Any amino protecting group common in peptide chemistry can be used for the starting amino acids or peptides. Protecting groups for the amino function include, inter alia, carbobenzoxy, t-butyloxycarbonyl, phtalyl, formyl, tosyl and O-nitro-phenylsulfenyl groups.
If peptides or amino acids having still other reactive functional groups are used, these additional functional groups are preferably protected in a conventional manner, both from the point of view of purity and of product yield. Such compounds are, for example, basic amino acids such as lysine and arginine, amino acids such as aspartic and glutamic acids, amino acids containing a thiol group such as cysteine, and peptides containing the compounds. abovementioned amino acid residues.
Any of these can be used in the present invention.
hydroxy-active compounds known in peptide chemistry without particular limitation. These hydroxy-active compounds are indicated for example in Journal of Synthetic Organic
Chemistry, Japan, 29, 27 (1971). They include p-nitrophenol, trichloro- and tetrachlorophenols, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxybenzotriazole, and N-hydroxypiperi
dine. The molar ratio between a peptide or an amino acid
N-protected by the molar ratio of a peptide or an amino acid N-protected to the hydroxy-active compound is not critical, but preferably it is 1: 1 or slightly less, for example 1: 2.
The isonitriles used in the present invention are not
critical, and any isonitriles such as alkyl-, allyl- and aralkyl-isonitriles can be used. Further, isonitriles having inert functional groups such as nitro or halo groups and an ester moiety do not suppress this condensation reaction and are similarly effective as a condensing agent. Examples of typical isonitriles include i-propylisonitrile, n-butylisonitrile, t-butylisonitrile, phenylisonitrile, and benzylisonitrile. These isonitriles are preferably used in an amount of 1 mole or a moderate excess, for example 1.5 to 2.0 moles per mole of N-protected peptide or amino acid.
The reaction can be carried out without a solvent in the presence of excess isonitrile, and it can also be carried out in aqueous solutions. However, it is preferred to carry out the reaction in organic, inert solvents. These solvents include halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, and ethylene dichloride; ethers such as ethyl ether, tetrahydrofuran and dioxane; esters such as ethyl acetate; nitriles such as acetonitrile and dimethylformamide.
When a solvent is employed, the starting materials can be added to the solvent in any order.
The optimum reaction temperature and time depend on the peptide or amino acid, and the active hydroxy compound used. The reaction can be accelerated by heating, and in general it is complete at 10oC to 800C for a few hours up to 50 hours. When using optically active peptides or amino acids, the reaction is preferably carried out at a temperature below 70 ° C, in particular between 40 and 65 ° C because racemization can occur at excessively high temperatures.
If it is necessary to isolate the active ester formed, it can be done by the methods used in peptide chemistry. Although a peptide can be obtained by reacting the active ester thus formed with an amino acid or peptide having a protected carboxyl group, the same peptide can be obtained in a single step without isolation of the active ester, by adding 1 The amino acid or the protected carboxyl peptide directly to the reaction mixture.
In the reaction of the present invention, there are also N-substituted formamides derived from isonitriles used in the reaction mixture. However, the Nsubstituted formamides, in particular the formamide derived from N- or isopropylisonitrile, or t-butylisonitrile can easily be separated from the reaction mixture by distillation under reduced pressure. It is thus possible to obtain the active esters with a very high purity. In addition, the isolated N-substituted formamides can easily be reconverted to the corresponding isonitrile by the action of dehydrating agents such as phosgene and phosphorus oxychloride.
The following examples illustrate the invention. The peptide or active ester obtained in each example was identified by its melting point, these infrared and nuclear magnetic reasoning spectra, and thin layer chromatograms.
Example I
4.18 g (20 mmol) of N-carbobenzoxyglycine, 2.3 g (20 mmol) of N-hydroxysuccinimide and 2.0 g (30 mmol) of isopropylisonitrile were dissolved in 70 ml of ethyl acetate and the solution obtained was heated at 650C for 30 hours.
The reaction mixture was concentrated and then the residue was triturated with ether to obtain the desired product as a powder. The powder was filtered and washed with petroleum ether. The washings and the mother liquors were combined and cooled. The crystals which precipitated were filtered off. By combining the filtered powder and the precipitated crystals, 4.95 g of N-hydroxysuccinimide-ester of N-carbobenzoxyglycine was obtained (yield 81 Sc). After recrystallization from a mixture of methylene chloride and petroleum ether, crystals were obtained which melted at 110-1120C.
Elemental analysis: Cl4Hz406N2
C H N
found 54.90% 4.61 iC 9.15%
calculated 55.01% 4.66% 8.80%
Examples 2 to 4
The N-hydroxysuccinimide ester of the N-carbobenzoxy-amino acid listed in Table I was synthesized as in Example 1. The same amount of each reagent and solvent was used as in Example 1. reaction conditions used and the yield are shown in Table I.
Table I
Example - N-carbobenzoxy- Isonitrile Solvent Temp. Time Yield m.p. Specific rotation
No amino acid reaction- reaction- (%) (Oc) - [a]? E) 5 (o)
nelle (0C) nel (h) 2 N-carbobenzoxy- N-propyl-chloride 40. 42 41 95- 87 -55 (C = 2,
L-proline isonitrile methylene dioxane) 3 N-carbobenzoxy- t-butyl- chloroform 70 20 55 114-115 -24.8 (C = 2,
L-valine isonitrile dioxane) 4 N-carbobenzoxy- benzyl- acetate 70 30 73 135-137 - 17.1 (C = 2,
L-phenylalanine isonitrile ethyl dioxane)
Example S
6.0 g (20 mmol) of N-carbobenzoxy-Lphenylalanine, 3.3 g (24 mmol) of p-nitrophenol and 1.6 g (24 mmol) of isopropylisonitrile were dissolved in 50 ml of acetate. ethyl.
The resulting solution was heated at 60OC for 40 hours.
After concentrating the reaction mixture, the residue was dissolved in methanol and the resulting solution kept in a refrigerator. The precipitated crystals were filtered off. The crystals were washed with petroleum ether and dried. 4.5 g of N-carbobenzoxy-L-phenylalanine p-nitrophenyl ester were obtained (yield 53%). They melted at 125.5-1270C and had a specific rotation index: [G] 25 = - 8.00 (C = 2.2 in chloroform).
Elemental analysis: C23H20N2O6
C H N found 65.89% 4.83% 6.82%
calculated 65.70% 4.80% 6.66%
Examples 6 to 9
The p-nitrophenyl ester of the N-protected peptide or amino acid listed in Table II was synthesized as in Example 5, using isopropylisonitrile. The same amount of each reagent and solvent was used as in Example 5. The reaction conditions used and the yield are shown in Table II.
Table II
Example Amino acid or peptide Solvent Temp. Reaction reaction time No N-protected reaction (%)
(C) (h) 6 N-carbobenzoxyacetate 65 24 63
S-benzyl-L- ethyl
cysteine 7 N-t-butyloxy- chloride 40 30 52
carbonyl-L- methylene
alanine 8 N-formyl-L- dioxane 70 28 48
phenylalanine 9 N-carbobenzoxy-acetate 65 24 56
L-phenylalanyl- ethyl
wisteria
Example 10
5.02 g (20 mmol) of N-carbobenzoxy-L was dissolved.
valine, 5.61 g (20 mmol) of pentachlorophenol and 2.0 g (30 mmol) of n-propylisonitrile in 70 ml of ethyl acetate, and the resulting solution was heated at 65oC for 24 hours
The reaction mixture was kept in a refrigerator and the precipitated crystals were filtered off. The mother liquors were concentrated, and the obtained residue was recrystallized from a mixture of petroleum ether and ethyl acetate to obtain a new quantity of crystals. These two crystal jets represented 8.05 g of N pentachlorophenyl ester.
carbobenzoxy-L-valine (81% yield). After recrystallization from methanol, 6.8 g of crystals were obtained (68% yield) which melted at 142.5-143.50C and which had a specific rotation index: [a] D5 = -20.2 ( C = 0.49 in chloroform).
Elemental analysis: ClsHl604NCls
C H N Cl found 45.77% 3.26% 2.68% 35.76% calculated 45.67% 3.23% 2.80% 35.48%
Examples 11 to 14
The pentachlorophenyl ester of the N-carbobenzoxy-amino acid listed in Table III was synthesized as in Example 10, using the isonitrile shown in the list in Table III. The same amount of each reagent and solvent was used as in Example 10. The reaction conditions used and the yield and properties of the product are summarized in Table III.
Table III
Example N-carbobenzoxy- Isonitrile Solvent Temp. Time Yield p. f. Specific rotation
No amino acid reaction- reaction- (%) (C) [a] R (O)
nelle (OC) nel (h) 11 N-carbobenz- i-propyl- acetate temp. 51 75 153 -52.6 (C = 1,
ordinary ethyl oxy-L-phenyl-isonitrile DMF *)
alanine 12 N-carbobenz- i-propyl- DMF 65 24 86 154-157 -52.0 (C = 1,
oxy-L-phenyl- isonitrile DMF)
alanine 13 Na, N & n-propyl- acetate 65 24 90 154-156 -7.8 (C = 0.8,
ethyl chloroform di-carbobenz- isonitrile)
oxy-L-lysine 14 N-carbobenz- t-butyl- acetate 50 28 43 183-186 -23.3 (C = 1,
ethyl-oxy-L-serine isonitrile - DMF)
DMF
* DMF = dimethylformamide