Verfahren und diagnostisches Mittel zum Nachweis von Urobilinogen-Körpern Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein verbesser tes Verfahren und ein verbessertes diagnostisches Mittel zum Nachweis von Urobilinogen-Körpern in Körperflüssig keiten, vorzugsweise in Urin.
Es ist bekannt, dass man Urobilinogen-Körper (Bilane), Indol, Sulfonamide, Porphobilinogen, Harnindiken und 5-Hy- droxy-indolessigsäure mit einer Lösung von p-Dimethylami- nobenzaldehyd in Salzsäure nachweisen kann. Dieser Nach weis ist in der Literatur als Ehrlichs Reaktion bekannt; er hat insbesonder in der medizinischen Diagnostik als Nach weis von vermehrten Urobilinogenen im Urin erhebliche Bedeutung gewonnen. Obwohl die Probe nicht sehr spezi fisch ist, gilt sie als Standardmehtode für die Diagnose von Leber- und Gallenerkrankungen.
Zur Vereinfachung des Tests ist bereits vorgeschlagen worden, Testtabletten herzustellen (Britische Patentschrift Nr. 779 921), in denen ausser p-Dimethylaminobenzaldehyd eine feste anorganische oder organische Säure enthalten ist (vergleiche auch US-Patentschrift Nr. 2 320 282 - Testtablet ten zum Nachweis von Sulfonamiden). Löst man solche Ta bletten in mehr oder weniger verdünntem Harn, so erhält man Farbreaktionen, die ungefähr denen der ursprünglichen Ehrlichschen Probe entsprechen; jedoch wird beispielsweise zur Auswertung der Farbreaktion mit Sulfonamiden der Ein satz einer blauen Hilfsfarbe (z. B. Methylenblau) empfohlen. Zur weiteren Vereinfachung der Ehrlichschen Probe hat man die Reaktion auch schon auf Testpapiere übertragen; vergleiche Fischl und Pinto, Clinica Chim. Acta 2, (1957), S. 527-533, sowie Franz.
Patentschrift<B>1</B>450 273, in welcher die von Fischl und Pinto benutzte Phosphorsäure durch Oxal säure ersetzt wird.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass be stimmte Derivate des p-Aminobenzaldehyds wesentlich emp findlichere und weniger störanfällige diagnostische Mittel zum Nachweis von Urobilinogen liefern, als sie bisher be kannt waren. Als Derivate des p-Aminobenzaldehyds kom men Substanzen in Frage, welche an der p-Aminogruppe eine verzweigte Alkylgruppe oder Substituenten tragen, die stark Elektronenabziehende Eigenschaften besitzen.
Insbesondere handelt es sich um Substanzen der Formel 1
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worin R, und R2 ein Halogenatom, eine Cyano-, Nitroso-, Carbalkoxy-, Carbamido-, Hydroxy-, Acyloxy-, Alkoxy-, eine offenkettige oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte, se kundäre oder tertiäre Aminogruppe bedeuten, oder worin R, und R2 zusammen auch eine Oxa-, Thia-, Sulfonyl-, Alkyl- thionium-, Imino-, Alkylimino-, gegebenenfalls substituierte Arylimino- oder eine niedere Dialkylimino-, Alkylenimino- oder Oxaalkyleniminogruppe bilden können, R2 auch den Rest einer sekundären Alkyl- oder Phenalkylgruppe bzw.
Cy- cloalkylgruppe bedeutet und einer der Reste R, und R2 auch ein Wasserstoffatom sein kann, R3 Wasserstoff oder eine AI- kylgruppe darstellt und n und m Zahlen von 0 bis 3 sind, verwendet.
Vorzugsweise verwendet man diese Substanzen zur Her stellung von Testpapieren, indem man sie zusammen mit einer starken, festen Säure auf einen saugfähigen Träger auf bringt. Ausserdem sind die Substanzen der Formel 1 zur Herstellung von Testfilmstreifen gemäss bekanntgemachter holländischer Patentanmeldung Nr. 67/15 828 und zum Nachweis von Urobilinogen in Lösungen geeignet.
Zur Herstellung der bevorzugten Ausführungsform der neuen diagnostischen Mittel werden saugfähige Träger, vor zugsweise Filterpapier, mit einer Lösung getränkt, die 0,001-1 % eines Aldehyds der Formel 1 und mindestens 3, vorzugsweise 15-30 % einer starken, festen Säure enthält. Als starke, feste Säuren werden vorzugsweise Sulfosalicyl- säure, p-Toluolsulfosäure, Kaliumbisulfat, Glutaminsäure-hy- drochlorid und insbesondere Oxalsäure verwendet.
Den Im prägnierlösungen können auch indifferente Zusätze wie Po- lyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Mischpolymere aus Poly- vinylpyrrolidon und Polyvinylacetat, Polyglykole usw. zuge fügt werden.
Als Lösungsmittel zum Tränken des saugfähigen Trägers kommen prinzipiell alle leichtflüchtigen Lösungsmittel in Frage, in denen sowohl die Aldehyde 1 als auch die Säuren ausreichend löslich sind. Vorzugsweise werden daher polare Lösungsmittel wie beispielsweise Methanol eingesetzt.
Nach dem Tränken werden die Filterpapiere getrocknet, zerschnitten und gewünschtenfalls an Kunststoff-Folien an gesiegelt, bzw. zwischen transparenten Kunststoff-Folien ein gesiegelt. Für den Fall, dass man als saugfähige Träger Stäb chen oder Streifen eingesetzt hat, sind sie unmittelbar nach dem Trocknen gebrauchsfertig.
Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens zum Nachweis von Urobilinogen bzw. Urobilinogen-Kör- pern, taucht man die neuen diagnostischen Mittel in die zu untersuchende Lösung ein und liest den Farbumschlag nach kurzer Zeit ab.
Im Gegensatz zu den bisherigen diagnostischen Mitteln zum Nachweis von Urobilinogen sind die neuen Teststreifen wesentlich empfindlicher und gestatten noch den Nachweis von ca. 0,4 mg lo Urobilinogen im Harn.
Überraschenderweise wird diese Farbreaktion durch die Anwesenheit von Harnstoff nicht mehr gestört; selbst eine 3%ige Harnstofflösung bewirkt bei den neuen Testpapieren praktisch keine Farbänderung, während Testpapiere, die p-Dimethylaminobenzaldehyd enthalten, sich hierbei intensiv gelb verfärben. Weiterhin war nicht vorauszusehen, dass die neuen diagnostischen Mittel weder durch Harnindikan noch durch Indol oder Sulfonamide bei üblicher Dosierung im Harn vorhanden sind, gestört werden. Dieser Befund ist be sonders überraschend, da man die neuen Substanzen, in 2-20%iger Salzsäure gelöst, sehr gut zum Nachweis von Indol in Lösungen benutzen kann. Zum Nachweis von Urobi- linogen bzw.
Urobilinogen-Körpern in Lösungen kann man selbstverständlich p-Dimethylaminobenzaldehyd durch die Substanzen der Formel 1 ersetzen und so den Gehalt pho tometrisch sehr exakt und störungsfrei in der Küvette be stimmen.
Ein besonderer Vorteil der Substanzen der Formel 1 mit verzweigten Alkylgruppen an der Aminogruppe besteht darin, dass sie gelegentlich im Normalharn vorkommende, bisher unbekannte Stoffwechselprodukte nicht mit anzeigen. Es ist weiterhin als überraschend zu bezeichnen, dass die stärker basischen Derivate des p-Aminobenzaldehyds mit einem verzweigten Substituenten R2 am Stickstoffatom nicht mit Harnstoff reagieren, obwohl nach den bisherigen Beobachtungen stärker basische Aldehyde auch stärker mit Harnstoff reagieren.
Das erfindungsgemässe diagnostische Mittel zum Nach weis von Urobilinogen-Körpern in Körperflüssigkeiten, vor zugsweise in Urin, bestehend aus einem saugfähigen Träger oder einem Film, einer starken festen Säure und einer oder mehreren Substanzen, welche mit Urobilinogen-Körpern einen Farbumschlag liefern, ist dadurch gekennzeichnet, dass es als den Farbumschlag liefernde Substanz(en) eine oder mehrere Substanzen der Formel 1
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enthält.
Das erfindungsgemässe Verfahren zum Nachweis von Urobilinogen-Körpern in Körperflüssigkeit auf einem saugfä higen Träger, einem Reagenzfilm oder in Lösung in Anwe senheit einer starken, festen bzw. auch flüssigen Säure mit Hilfe einer Substanz, die nach Art des Ehrlichschen Rea genz mit Urobilinogen-Körpern einen Farbumschlag liefert, ist dadurch gekennzeichnet, dass man als Farbindikatoren Substanzen der Formel 1 verwendet. In den nachfolgenden Beispielen sind das erfindungsge- mässe Verfahren und die erfindungsgemässen diagnosti schen Mittel näher erläutert, wobei durch Vergleichsversu che mit bisher bekannten diagnostischen Mitteln die Überle genheit gegenüber dem Stand der Technik nachgewiesen wird.
Beispiel 1 _ Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & Schüll) wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung getränkt:
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Nach dem Trocknen erhält man ein weisses Testpapier, welches mit normalem Harn eine schwache Rosafärbung er gibt und mit Urinen, die mehr als 0,4 mg % Urobilinogen- Körper enthalten, je nach Gehalt eine mehr oder weniger in tensive rosa bis violette Färbung zeigt. Urobilinogen-körper- freie Urine oder eine 3%ige wässrige Harnstofflösung füh ren zu keiner farblichen Veränderung des Testpapiers. Har- nindikan gibt keine Farbreaktion. Die Testpapiere können jeweils nach 1-2 Minuten abgelesen werden.
Beispiel 2 Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & Schüll) wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung getränkt:
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Nach dem Trocknen erhält man ein weisses Testpapier, welches die gleichen Eigenschaften besitzt wie das gemäss Beispiel 1 hergestellte Testpapier.
Beispiel 3 Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & Schüll) wird mit verschieden konzentrierten Lösungen von jeweils X Tei len p-N(N'-Methylpiperazino)-benzaldehyd (MPBA) bzw. p-Dimethylamino-benzaldehyd (DABA) und 20 Teilen Oxal säure in 100 Teilen Methanol wie im Beispiel 1 beschrieben, imprägniert. Die so erhaltenen Testpapiere sind nach dem Trocknen allesamt weiss. Die trockenen Testpapiere werden entweder in eine 3%ige Harnstofflösung oder in einen urobi- linogenfreien Urin eingetaucht.
Die dabei beobachteten Farbveränderungen sind in der nachfolgenden Tabelle zu sammengestellt:
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X <SEP> MPBA <SEP> DABA
<tb> 0,05 <SEP> Weiss <SEP> Gelb
<tb> 0,075 <SEP> Weiss <SEP> Gelb
<tb> 0,1 <SEP> Weiss <SEP> Gelb
<tb> 0,2 <SEP> Schwach <SEP> Stark
<tb> gelblich <SEP> Gelb Wie man hieraus deutlich sehen kann, ist das neue Test papier gegenüber dem bekannten praktisch unempfindlich gegen Harnstoff und reagiert somit empfindlicher und spezi fischer auf Urobilinogen-Körper, da die rosa Farbreaktion mit Urobilinogen durch die mehr oder weniger starke gelbe Farbreaktion mit Harnstoff nicht überdeckt wird.
Es ist selbstverständlich, dass die Empfindlichkeit und Ablesbarkeit der Urobilinogenfarbreaktion dadurch wesentlich beeinträch tigt wird. Beispiel 4 Filterpapier (23 S oder 2316 der Firma Schleicher & Schüll) wird mit methanolischen Lösungen getränkt, die in 100 Teilen Lösung A-Teile der folgenden Substanzen 1 und B-Teile Oxalsäure enthalten. Man erhält weisse Testpapiere.
Die beim Eintauchen dieser Testpapiere beobachteten Farbreaktionen werden nach 1-2 Minuten abgelesen und sind in der folgenden Tabelle 11 zusammengestellt:
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Substanz <SEP> f <SEP> A <SEP> B <SEP> Farbreaktion <SEP> mit
<tb> Urobilinogen-Normalurin <SEP> Urobilinogen freiem <SEP> Urin <SEP> haltigem
<tb> =3%ige <SEP> Harn- <SEP> Urin
<tb> stofflösung
<tb> [p-N-(N'-Dimethylpiperazini- <SEP> 0,1 <SEP> 20 <SEP> Weiss <SEP> Schwach <SEP> Rosarot
<tb> um)-benzaldehyd]jodid <SEP> Rosa
<tb> [p-N-(N'-Cyclopentamethylen- <SEP> 0,2 <SEP> 20 <SEP> Weiss <SEP> Schwach <SEP> Rosarot
<tb> piperazinium)-benzaldehyd] <SEP> Rosa
<tb> jodid
<tb> p-N-[N'-Cyclo(3-oxapenta- <SEP> 0,2 <SEP> 20 <SEP> Weiss <SEP> Schwach <SEP> Rosarot
<tb> methylen-)piperazinium]- <SEP> Rosa
<tb> benzaldehyd-jodid
<tb> p-Bis(carbäthoxyäthyl)- <SEP> 0,
1 <SEP> 20 <SEP> Gelblich <SEP> Gelbrosa <SEP> Rot
<tb> amino-benzaldehyd
<tb> p-Bis(carbamidoäthyl)- <SEP> 0,1 <SEP> 20 <SEP> Geblich <SEP> Gelbrosa <SEP> Rot
<tb> amino-benzaldehyd
<tb> p-Bis(y-brompropyl)- <SEP> 0,0520 <SEP> Schwach <SEP> Schwach <SEP> Rosarot
<tb> amino-benzaldehyd <SEP> Gelblich <SEP> Rosa
<tb> p-Bis(y-cyanopropyl)- <SEP> 0,0520 <SEP> Schwach <SEP> Schwach <SEP> Rosarot
<tb> amino-benzaldehyd <SEP> Gelblich <SEP> Rosa
<tb> p-Bis(y-dimethylamino- <SEP> 0,0520 <SEP> Schwach <SEP> Schwach <SEP> Rosarot
<tb> propyl)-amino-benzaldehyd <SEP> Gelblich <SEP> Rosa
<tb> [p-Bis(γ
-trimethyl-ammonio- <SEP> 0,0520 <SEP> Weiss <SEP> Schwach <SEP> Rosarot
<tb> propyl)amino-benzaldehyd] <SEP> Rosa
<tb> dichlorid
<tb> p-N-Diäthylaminoäthyl- <SEP> 0,0525 <SEP> Schwach <SEP> Schwach <SEP> Purpur
<tb> N-methylamino-benz- <SEP> Gelblich <SEP> Rosa
<tb> aldehyd
<tb> p-N-Dimethylaminoäthyl- <SEP> 0,0525 <SEP> Schwach <SEP> Schwach <SEP> Purpur
<tb> N-methylaminobenz- <SEP> Gelblich <SEP> Rosa
<tb> aldehyd
<tb> p-N-Diisopropylamino- <SEP> 0,0525 <SEP> Schwach <SEP> Schwach <SEP> Purpur
<tb> äthyl-N-methylamino- <SEP> Gelblich <SEP> Rosa
<tb> benzaldehyd
<tb> p-N-Diäthylaminoäthyl- <SEP> 0,0525 <SEP> Schwach <SEP> Schwach <SEP> Purpur
<tb> N-äthylamino-benzal- <SEP> Gelblich <SEP> Rosa
<tb> dehyd
<tb> p-(1-Methyl-1,5-diaza- <SEP> 0,0525 <SEP> Schwach <SEP> Schwach <SEP> Rosarot
<tb> cyclooctyl-5)
benz- <SEP> Gelblich <SEP> Rosa
<tb> aldehyd
<tb> p-N-Cyanoäthyl-N- <SEP> 0,0525 <SEP> Gelblich <SEP> Schwach <SEP> Purpur
<tb> methyl-aminobenz- <SEP> Rosa
<tb> aldehyd
<tb> p-N-Cyanoäthyl-N-äthyl- <SEP> 0,0525 <SEP> Gelblich <SEP> Gelblich <SEP> Purpur
<tb> aminobenzaldehyd <SEP> Rosa
<tb> p-N-y-Dimethylamino- <SEP> 0,0525 <SEP> Gelb <SEP> Gelbrosa <SEP> Purpur
<tb> propyl-N-methyl aminobenzaldehyd
<tb> p-N-Bissulfoäthyl- <SEP> 0,0525 <SEP> Gelblich <SEP> Schwach <SEP> Rosarot
<tb> aminobenzaldehyd <SEP> Rosa
<tb> p-N-Diäthyl-amino- <SEP> 0,0525 <SEP> Gelblich <SEP> Schwach <SEP> Purpur
<tb> äthyl-N-isopropyl- <SEP> Rosa
<tb> aminobenzaldehyd
<tb> p-N-Cyanoäthylamino- <SEP> 0,0120 <SEP> Weiss <SEP> Schwach <SEP> Rosarot
<tb> benzaldehyd <SEP> Rosa
<tb> p-N-Diäthylamino- <SEP> 0,
0520 <SEP> Schwach <SEP> Schwach <SEP> Rosarot
<tb> äthyl-aminobenz- <SEP> Gelblich <SEP> Rosa
<tb> <U>aldehyd</U> Beispiel 5 Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & Schüll) wird mit einer Lösung von 0,05 g p-N-(N'-Methylpiperazino)-benz- aldehyd (MPBA) bzw. p-Dimethyl-aminobenzaldehyd (DABA) und 20 g Oxalsäure in 100 ml Methanol imprägniert und getrocknet. Die trockenen Papiere werden in wässrige Lösungen besonders häufig applizierter Sulfonamide ge taucht und nach 1-2 Minuten abgelesen.
Die Farbverände- rungen sind in der nachfolgenden Tabelle 111 zusammenge stellt:
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Tabelle <SEP> III
<tb> Sulfonamid <SEP> 10 <SEP> mg <SEP> % <SEP> 25 <SEP> mg <SEP> % <SEP> 50 <SEP> mg <SEP> /o
<tb> Test- <SEP> Sulfametin <SEP> Weiss <SEP> Weiss <SEP> Schwach <SEP> Gelblich
<tb> papier <SEP> Sulfafurazol <SEP> Weiss <SEP> Weiss <SEP> Schwach <SEP> Gelblich
<tb> mit <SEP> Sulfaphenazol <SEP> Weiss <SEP> Weiss <SEP> Weiss
<tb> MPBA <SEP> Sulfamoxolum <SEP> Weiss <SEP> Schwach <SEP> Gelblich
<tb> <U>Gelblich</U>
<tb> Test- <SEP> Sulfametin <SEP> Gelblich <SEP> Gelb <SEP> Stark <SEP> Gelb
<tb> papier <SEP> Sulfafurazol <SEP> Gelb <SEP> Stark <SEP> Gelb <SEP> Sehr <SEP> Stark <SEP> Gelb
<tb> mit <SEP> Sulfaphenazol <SEP> Weiss <SEP> Schwach <SEP> Rosa <SEP> Schwach <SEP>
Rosa
<tb> DABA <SEP> Sulfamoxolum <SEP> Gelb <SEP> Stark <SEP> Gelb <SEP> Sehr <SEP> Stark <SEP> Gelb
<tb> Sulfametin <SEP> = <SEP> N1-(5-Methoxy-2-pyrimidiny)-sulfanilamid
<tb> Sulfafurazol <SEP> = <SEP> NI-(3,4-Dimethyl-5-isoxazolyl)-sulfanilamid
<tb> Sulfaphenzazol <SEP> = <SEP> N1-(1-Phenyl-5-pyrazolyl)-sulfanilamid
<tb> Sulfamoxolum <SEP> = <SEP> NI-(4,5-Dimethyl-2-oxazolyl)-sulfanilamid Wie man obiger Tabelle entnehmen kann, wird die Farb- reaktion auf Urobilinogen bei den erfindungsgemässen Test streifen durch Sulfonamidkonzentrationen bis zu 50 mg praktisch nicht gestört. Höhere Konzentrationen kommen nur kurzfristig nach einer Stosstherapie vor und sind des halb dem Beobachter meist bekannt.
Beispiel 6 Zur Herstellung eines Reagenzfilmes zum Nachweis von Urobilinogen wird eine Mischung aus folgenden Bestandtei len bereitet:
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Auf eine weisse Polyvinylchlorid-Folie wird eine 300 p, dicke Schicht der obigen Mischung aufgetragen und an- schliessend mit Warmluft getrocknet, wobei ein wasserunlös licher Film entsteht. Wird dieser mit einem Tropfen urobili- nogenhaltigem Urin benetzt, so entsteht nach 1-2 Minuten eine rote Färbung, die sich nach dem Abwischen des Urins noch verstärkt. Mit urobilinogenfreiem Urin wird keine Fär bung beobachtet.
Beispiel 7 25 ml Harn werden mit 12 ml Eisessig angesäuert und mit 40 ml Äther extrahiert. Der Extrakt wird zweimal mit je 20 ml Wasser gewaschen und mit Äther wieder auf 40 ml aufgefüllt. Man nimmt 20 ml hiervon, versetzt mit 0,5 ml einer Lösung von 1 g p-N-Morpholino-benzaldehyd in 5 ml konzentrierter Salzsäure und schüttelt kräftig durch. Danach gibt man 6 ml halbgesättigte Natriumacetatlösung zu und schüttelt erneut, wobei sich der rote Farbstoff in der wässri- gen Phase ansammelt. Nach der Abtrennung wird der Äther nochmals mit 2 ml Wasser gewaschen. Die vereinigten wäss- rigen Auszüge werden auf 20 ml aufgefüllt, bei 557 nm im Photometer gemessen und mittels einer vorher aufgestellten Eichkurve ausgewertet.
Beispiel 8 Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & Schüll) wird mit einer Lösung von 0,5 Teilen p-Bis(diäthylaminoäthyl)- aminobenzaldehyd-bis-hydrogenoxalat, 30 Teilen Malein- säure und 0,5 Teilen Polyäthylenglykol 1000 in 100 Teilen Methanol imprägniert. Das Papier reagiert mit urobilinogen- haltigen Urinen rosa bis rot. Papiere mit gleichen analyti schen Eigenschaften aber günstigerem Verhalten beim Um rollen und Schneiden erhält man bei Verwendung von 5 Tei len Polyäthylenglykol 6000 bzw. 20 000.
Beispiel 9 Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & Schüll) wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung getränkt:
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p-(Cyclohexylamino)-benzaldehyd <SEP> 0,05 <SEP> g
<tb> Oxalsäure <SEP> 20,0 <SEP> g
<tb> Methanol <SEP> ad <SEP> 100,0 <SEP> ml Nach dem Trocknen erhält man ein weisses Testpapier, welches mit Urinen, die Urobilinogen-Körper enthalten, je nach Gehalt eine mehr oder weniger intensive rosa- bis vio lette Färbung zeigt. Urobilinogen-körperarme Urine oder eine 3%ige wässrige Harnstofflösung führen zu keiner farbli chen Veränderung des Testpapieres. Harnindikan gibt keine Farbreaktion. Die Testpapiere können jeweils nach 1-2 Mi nuten abgelesen werden.
Beispiel 10 Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & Schüll) wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung getränkt:
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p-(sec.-Butylamino)-benzaldehyd <SEP> 0,05 <SEP> g
<tb> Kaliumbisulfat <SEP> 15,0 <SEP> g
<tb> Polyäthylenglykol <SEP> 5,0 <SEP> g
<tb> Wasser <SEP> ad <SEP> 100,0 <SEP> ml Nach dem Trocknen erhält man ein weisses Testpapier, welches die gleichen Eigenschaften besitzt wie das gemäss Beispiel 9 hergestellte Testpapier.
Beispiel 11 Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & Schüll) wird mit verschieden konzentrierten Lösungen von jeweils X Tei len p-(Isopropylamino)-benzaldehyd (iPABA), p-(n-Propylami- no)-benzaldehyd (nPABA) bzw. p-(Dimethylamino)-benzalde- hyd (DABA) und 20 Teilen Oxalsäure in 100 Teilen Metha nol wie im Beispiel 1 beschrieben, imprägniert. Die trocke nen Testpapiere werden in eine 3%ige Harnstofflösung ein getaucht.
Die dabei beobachteten Farbveränderungen sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt:
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X <SEP> iPABA <SEP> nPABA <SEP> DABA
<tb> 0,05 <SEP> Weiss <SEP> Gelblich <SEP> Gelb
<tb> 0,075 <SEP> Weiss <SEP> Gelblich <SEP> Gelb
<tb> 0,1 <SEP> Weiss <SEP> Gelb <SEP> Gelb
<tb> 0,15 <SEP> Schwach <SEP> Gelblich <SEP> Gelb <SEP> Stark <SEP> Gelb Wie man hieraus deutlich sehen kann, ist das erfindungs- gemässe Testpapier mit iPABA wesentlich unempfindlicher gegen Harnstoff und reagiert somit empfindlicher und spezi fischer auf Urobilinogen-Körper, da die rosa Farbreaktion
EMI0006.0003
Substanz <SEP> I <SEP> Reaktion <SEP> mit <SEP> Ubg.-haltigem
<tb> 3%iger <SEP> Harnstoff-Lösg.
<SEP> Urin
<tb> oder <SEP> Ubg.-armen <SEP> Urin
<tb> p-(Isopropylamino)-benzaldehyd <SEP> Weiss* <SEP> Rosarot
<tb> p-(Isopropylamino)-m-methyl benzaldehyd <SEP> Schwach <SEP> gelblich <SEP> Rosarot
<tb> p-(sec.-Butylamino)-benzaldehyd <SEP> Schwach <SEP> gelblich <SEP> Rosarot
<tb> p-(Pentyl-3-amino)-benzaldehyd <SEP> Gelblich <SEP> Rosarot
<tb> p-(2,4-Dimethylpentyl-3-amino) benzaldehyd <SEP> Gelb <SEP> Rot
<tb> p-(Cyclopentylamino)-benzaldehyd <SEP> Schwach <SEP> Gelblich <SEP> Rosa-Violett
<tb> p-(2-Methylcyclopentyl-amino) benzaldehyd <SEP> Gelblich <SEP> Rosa-Violett
<tb> p-(Cyclohexylamino)-benzaldehyd <SEP> Fast <SEP> Weiss* <SEP> Rosa-Violett
<tb> p-(Cyclohexylamino)-m-methyl benzaldehyd <SEP> Schwach <SEP> Gelblich <SEP> Rosa-Violett
<tb> p-(Cyclohexylamino)-m-isopropyl benzaldehyd <SEP> Gelblich <SEP> Rosa-Violett
<tb> p-(2-Methylcyclohexyl-amino)
benzaldehyd <SEP> Gelblich <SEP> Rosa-Violett
<tb> p-Menthylamino-benzaldehyd <SEP> Gelb <SEP> Orange
<tb> p-(1-Cyclohexylpropyl-2-amino) benzaldehyd <SEP> Gelblich <SEP> Rosarot
<tb> p-(Cyclododecylamino)-benzaldehyd <SEP> Schwach <SEP> Gelblich <SEP> Rosa
<tb> p-(Norbornyl-2-amino)-benzaldehyd <SEP> Gelb <SEP> Rosarot
<tb> p-(α-Methylbenzylamino)-benzaldehyd <SEP> Gelblich <SEP> Rosarot
<tb> p-(α
-Isopropylbenzylamino) benzaldehyd <SEP> Gelblich <SEP> Rosarot
<tb> p-(1-Phenylpropyl-2-amino) benzaldehyd <SEP> Gelblich <SEP> Rosarot
<tb> p-(Indanyl-2-amino)-benzaldehyd <SEP> Gelblich <SEP> Rosarot
<tb> p-(N-Diäthylaminoäthyl-N-iso propylamino)-benzaldehyd <SEP> Gelblich <SEP> Purpur
<tb> *) <SEP> Die <SEP> in <SEP> den <SEP> Urin <SEP> getauchten <SEP> Streifen <SEP> zeigen <SEP> eine <SEP> fahle <SEP> Gelbfärbung, <SEP> welche <SEP> durch
<tb> die <SEP> Eigenfarbe <SEP> des <SEP> Urins <SEP> bedingt <SEP> ist.
Beispiel 13 Zur Herstellung einer filmartigen Reagenzschicht zum Nachweis von Urobilinogen wird eine Mischung aus folgen den Bestandteilen bereitet:
EMI0006.0004
p-(Cyclohexylamino)-benzaldehyd <SEP> 0,05 <SEP> g
<tb> kolloidale <SEP> Kieselsäure <SEP> ( Aerosil ) <SEP> 1,00 <SEP> g
<tb> Oxalsäure <SEP> 10,00 <SEP> g
<tb> Polyvinylbutyracetal <SEP> ( Mowital ) <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> Polyäthylenglykol <SEP> 6000 <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> Methanol <SEP> 30,0 <SEP> ml Auf eine weisse Polyvinylchlorid-Folie wird obige Mi schung ca. 1 mm dick aufgetragen und anschliessend mit Warmluft getrocknet, wobei eine wasserunlösliche Schicht entsteht.
Wird diese mit einem Tropfen urobilinogenhalti- gem Urin benetzt, so entsteht nach 1-2 Minuten eine rote mit Urobilinogen nicht durch die mehr oder weniger starke gelbe Farbreaktion mit Harnstoff überdeckt wird.
Beispiel 12 Filterpapier (23 S oder 2316 der Firma Schleicher & Schüll) wird mit methanolischen Lösungen getränkt, die in 100 Teilen Lösung 0,05 Teile der folgenden Substanz I und 20 Teile Oxalsäure enthalten. Man erhält weisse bis gelbli che Testpapiere.
Die beim Eintauchen dieser Testpapiere beobachteten Farbreaktionen werden nach 1-2 Minuten abgelesen und sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt: Färbung. Mit urobilinogenfreiem Urin wird keine Färbung beobachtet.
Beispiel 14 25 ml Harn werden mit 12 ml Eisessig angesäuert und mit 40 ml Äther extrahiert. Der Extrakt wird zweimal mit je 20 ml Wasser gewaschen und mit Äther wieder auf 40 ml aufgefüllt. Man nimmt 20 ml hiervon, versetzt mit 0,5 ml einer Lösung von 1 g p-(Cyclopentylamino)-benzaldehyd in 5 ml konzentrierter Salzsäure und schüttelt kräftig durch. Da nach gibt man 2,5 ml halbgesättigte Natriumacetatlösung und 3,5 ml Wasser zu und schüttelt erneut, wobei sich der rote Farbstoff in der wässrigen Phase ansammelt. Nach der Abtrennung wird der Äther nochmals mit 2 ml Wasser ge waschen. Die vereinigten wässrigen Auszüge werden auf 20 ml aufgefüllt, bei 557 nm im Photometer gemessen und mit tels einer vorher aufgestellten- Eichkurve ausgewertet.
Method and diagnostic agent for the detection of urobilinogen bodies The present invention relates to an improved method and an improved diagnostic agent for the detection of urobilinogen bodies in body fluids, preferably in urine.
It is known that urobilinogen bodies (bilanes), indole, sulfonamides, porphobilinogen, urine indicators and 5-hydroxy-indoleacetic acid can be detected with a solution of p-dimethylaminobenzaldehyde in hydrochloric acid. This evidence is known in the literature as Ehrlich's reaction; it has gained considerable importance, especially in medical diagnostics as evidence of increased urobilinogens in urine. Although the sample is not very specific, it is considered the standard method for diagnosing liver and biliary diseases.
To simplify the test, it has already been proposed to produce test tablets (British Patent No. 779 921) in which, in addition to p-dimethylaminobenzaldehyde, a solid inorganic or organic acid is contained (see also US Patent No. 2,320,282 - Test tablets for detection of sulfonamides). If you dissolve such tablets in more or less diluted urine, you get color reactions that roughly correspond to those of the original Ehrlich sample; however, the use of an auxiliary blue color (e.g. methylene blue) is recommended to evaluate the color reaction with sulfonamides, for example. To further simplify Ehrlich's sample, the reaction has already been transferred to test papers; compare Fischl and Pinto, Clinica Chim. Acta 2, (1957), pp. 527-533, and Franz.
Patent specification <B> 1 </B> 450 273, in which the phosphoric acid used by Fischl and Pinto is replaced by oxalic acid.
Surprisingly, it has now been found that certain derivatives of p-aminobenzaldehyde deliver significantly more sensitive and less susceptible to failure diagnostic agents for the detection of urobilinogen than they were previously known. Substances which can be used as derivatives of p-aminobenzaldehyde are those which have a branched alkyl group or substituents on the p-amino group which have strong electron-withdrawing properties.
In particular, they are substances of formula 1
EMI0001.0004
where R and R2 are a halogen atom, a cyano, nitroso, carbalkoxy, carbamido, hydroxy, acyloxy, alkoxy, an open-chain or cyclic, saturated or unsaturated, secondary or tertiary amino group, or where R, and R2 together can also form an oxa, thia, sulfonyl, alkylthionium, imino, alkylimino, optionally substituted arylimino or a lower dialkylimino, alkylenimino or oxaalkylenimino group, R2 also the radical of a secondary alkyl or phenalkyl group or
Cycloalkyl group and one of the radicals R and R2 can also be a hydrogen atom, R3 is hydrogen or an alkyl group and n and m are numbers from 0 to 3, are used.
These substances are preferably used to produce test papers by placing them on an absorbent support together with a strong, solid acid. In addition, the substances of formula 1 are suitable for the production of test film strips according to the known Dutch patent application No. 67/15 828 and for the detection of urobilinogen in solutions.
To prepare the preferred embodiment of the new diagnostic agents, absorbent carriers, preferably filter paper, are impregnated with a solution containing 0.001-1% of an aldehyde of the formula 1 and at least 3, preferably 15-30%, of a strong, solid acid. The strong, solid acids used are preferably sulfosalicylic acid, p-toluenesulfonic acid, potassium bisulfate, glutamic acid hydrochloride and, in particular, oxalic acid.
Indifferent additives such as polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, copolymers of polyvinylpyrrolidone and polyvinyl acetate, polyglycols, etc. can also be added to the impregnating solutions.
In principle, all volatile solvents in which both the aldehydes 1 and the acids are sufficiently soluble are suitable as solvents for impregnating the absorbent carrier. Polar solvents such as, for example, methanol are therefore preferably used.
After soaking, the filter papers are dried, cut and, if desired, sealed to plastic foils or sealed between transparent plastic foils. In the event that sticks or strips have been used as absorbent carriers, they are ready for use immediately after drying.
To carry out the method according to the invention for the detection of urobilinogen or urobilinogen bodies, the new diagnostic agent is immersed in the solution to be examined and the color change is read off after a short time.
In contrast to the previous diagnostic means for the detection of urobilinogen, the new test strips are much more sensitive and still allow the detection of approx. 0.4 mg lo urobilinogen in the urine.
Surprisingly, this color reaction is no longer disturbed by the presence of urea; Even a 3% urea solution causes practically no color change in the new test papers, while test papers that contain p-dimethylaminobenzaldehyde turn an intense yellow. Furthermore, it was not foreseeable that the new diagnostic agents would not be disturbed by urine indican nor by indole or sulfonamides at the usual dosage in the urine. This finding is particularly surprising because the new substances, dissolved in 2-20% hydrochloric acid, can be used very well for the detection of indole in solutions. For the detection of urobilinogen or
Urobilinogen bodies in solutions can of course be replaced by p-dimethylaminobenzaldehyde with the substances of formula 1 and the content in the cuvette be determined photometrically very precisely and without interference.
A particular advantage of the substances of the formula 1 with branched alkyl groups on the amino group is that they do not show any previously unknown metabolic products that occur in normal urine. It can also be described as surprising that the more basic derivatives of p-aminobenzaldehyde with a branched substituent R2 on the nitrogen atom do not react with urea, although, according to previous observations, more strongly basic aldehydes also react more strongly with urea.
The diagnostic agent according to the invention for the detection of urobilinogen bodies in body fluids, preferably in urine, consisting of an absorbent carrier or a film, a strong solid acid and one or more substances which provide a color change with urobilinogen bodies is characterized that there is one or more substances of formula 1 as the substance (s) providing the color change
EMI0002.0004
contains.
The inventive method for the detection of urobilinogen bodies in body fluid on a suction capable carrier, a reagent film or in solution in the presence of a strong, solid or liquid acid with the aid of a substance that is like Ehrlich's reagent with urobilinogen bodies supplies a color change, is characterized in that substances of formula 1 are used as color indicators. In the following examples, the method according to the invention and the diagnostic agents according to the invention are explained in more detail, the superiority over the prior art being demonstrated by comparative tests with previously known diagnostic agents.
Example 1 Filter paper (2316 from Schleicher & Schüll) is impregnated with a solution of the following composition:
EMI0002.0007
After drying, a white test paper is obtained which, with normal urine, gives a faint pink color and with urines containing more than 0.4 mg% urobilinogen body, depending on the content, shows a more or less intense pink to purple color. Urobilinogen-free urine or a 3% aqueous urea solution do not change the color of the test paper. Urinary indicator gives no color reaction. The test papers can be read after 1-2 minutes.
Example 2 Filter paper (2316 from Schleicher & Schüll) is impregnated with a solution of the following composition:
EMI0002.0014
After drying, a white test paper is obtained which has the same properties as the test paper produced according to Example 1.
Example 3 Filter paper (2316 from Schleicher & Schüll) is mixed with differently concentrated solutions of X parts each of pN (N'-methylpiperazino) benzaldehyde (MPBA) or p-dimethylaminobenzaldehyde (DABA) and 20 parts of oxalic acid in 100 Parts of methanol as described in Example 1, impregnated. The test papers obtained in this way are all white after drying. The dry test papers are either immersed in a 3% urea solution or in urine-free urine.
The color changes observed are compiled in the following table:
EMI0002.0017
X <SEP> MPBA <SEP> DABA
<tb> 0.05 <SEP> white <SEP> yellow
<tb> 0.075 <SEP> white <SEP> yellow
<tb> 0.1 <SEP> white <SEP> yellow
<tb> 0.2 <SEP> weak <SEP> strong
<tb> yellowish <SEP> yellow As you can clearly see from this, the new test paper is practically insensitive to urea compared to the known test paper and therefore reacts more sensitively and specifically to urobilinogen bodies, as the pink color reaction with urobilinogen is more or less strong yellow color reaction with urea is not covered.
It goes without saying that the sensitivity and readability of the urobilinogen color reaction will be significantly impaired. Example 4 Filter paper (23 S or 2316 from Schleicher & Schüll) is impregnated with methanolic solutions which, in 100 parts of solution, contain A parts of the following substances 1 and B parts oxalic acid. White test papers are obtained.
The color reactions observed when these test papers are immersed are read off after 1-2 minutes and are listed in Table 11 below:
EMI0003.0000
EMI0004.0000
Substance <SEP> f <SEP> A <SEP> B <SEP> Color reaction <SEP> with
<tb> Urobilinogen normal urine <SEP> Urobilinogen free <SEP> urine containing <SEP>
<tb> = 3% <SEP> urinary <SEP> urine
<tb> substance solution
<tb> [p-N- (N'-Dimethylpiperazini- <SEP> 0.1 <SEP> 20 <SEP> white <SEP> weak <SEP> pink-red
<tb> um) -benzaldehyd] iodide <SEP> pink
<tb> [p-N- (N'-Cyclopentamethylene- <SEP> 0.2 <SEP> 20 <SEP> white <SEP> weak <SEP> pink-red
<tb> piperazinium) -benzaldehyd] <SEP> pink
<tb> iodid
<tb> p-N- [N'-Cyclo (3-oxapenta- <SEP> 0.2 <SEP> 20 <SEP> white <SEP> weak <SEP> pink-red
<tb> methylen-) piperazinium] - <SEP> pink
<tb> benzaldehyde iodide
<tb> p-bis (carbäthoxyäthyl) - <SEP> 0,
1 <SEP> 20 <SEP> yellowish <SEP> yellow-pink <SEP> red
<tb> amino-benzaldehyde
<tb> p-bis (carbamidoethyl) - <SEP> 0.1 <SEP> 20 <SEP> yellowish <SEP> yellow pink <SEP> red
<tb> amino-benzaldehyde
<tb> p-bis (y-bromopropyl) - <SEP> 0.0520 <SEP> weak <SEP> weak <SEP> pink
<tb> amino-benzaldehyde <SEP> yellowish <SEP> pink
<tb> p-bis (y-cyanopropyl) - <SEP> 0.0520 <SEP> weak <SEP> weak <SEP> pink
<tb> amino-benzaldehyde <SEP> yellowish <SEP> pink
<tb> p-bis (y-dimethylamino- <SEP> 0.0520 <SEP> weak <SEP> weak <SEP> pink
<tb> propyl) -amino-benzaldehyde <SEP> yellowish <SEP> pink
<tb> [p-bis (?
-trimethyl-ammonio- <SEP> 0.0520 <SEP> white <SEP> weak <SEP> pink-red
<tb> propyl) amino-benzaldehyde] <SEP> pink
<tb> dichloride
<tb> p-N-diethylaminoethyl- <SEP> 0.0525 <SEP> weak <SEP> weak <SEP> purple
<tb> N-methylamino-benz- <SEP> yellowish <SEP> pink
<tb> aldehyde
<tb> p-N-dimethylaminoethyl- <SEP> 0.0525 <SEP> weak <SEP> weak <SEP> purple
<tb> N-methylaminobenz- <SEP> yellowish <SEP> pink
<tb> aldehyde
<tb> p-N-diisopropylamino- <SEP> 0.0525 <SEP> weak <SEP> weak <SEP> purple
<tb> ethyl-N-methylamino- <SEP> yellowish <SEP> pink
<tb> benzaldehyde
<tb> p-N-diethylaminoethyl- <SEP> 0.0525 <SEP> weak <SEP> weak <SEP> purple
<tb> N-ethylamino-benzal- <SEP> yellowish <SEP> pink
<tb> dehyd
<tb> p- (1-methyl-1,5-diaza- <SEP> 0.0525 <SEP> weak <SEP> weak <SEP> pink
<tb> cyclooctyl-5)
benz- <SEP> yellowish <SEP> pink
<tb> aldehyde
<tb> p-N-Cyanoäthyl-N- <SEP> 0.0525 <SEP> yellowish <SEP> weak <SEP> purple
<tb> methyl-aminobenz- <SEP> pink
<tb> aldehyde
<tb> p-N-cyanoethyl-N-ethyl- <SEP> 0.0525 <SEP> yellowish <SEP> yellowish <SEP> purple
<tb> aminobenzaldehyde <SEP> pink
<tb> p-N-y-dimethylamino- <SEP> 0.0525 <SEP> yellow <SEP> yellow pink <SEP> purple
<tb> propyl-N-methyl aminobenzaldehyde
<tb> p-N-Bissulfoäthyl- <SEP> 0.0525 <SEP> yellowish <SEP> weak <SEP> pink-red
<tb> aminobenzaldehyde <SEP> pink
<tb> p-N-diethyl-amino- <SEP> 0.0525 <SEP> yellowish <SEP> weak <SEP> purple
<tb> ethyl-N-isopropyl- <SEP> pink
<tb> aminobenzaldehyde
<tb> p-N-cyanoethylamino- <SEP> 0.0120 <SEP> white <SEP> weak <SEP> pink-red
<tb> benzaldehyde <SEP> pink
<tb> p-N-diethylamino- <SEP> 0,
0520 <SEP> weak <SEP> weak <SEP> rose red
<tb> ethyl-aminobenz- <SEP> yellowish <SEP> pink
<tb> <U> aldehyde </U> Example 5 filter paper (2316 from Schleicher & Schüll) is mixed with a solution of 0.05 g of pN- (N'-methylpiperazino) -benz- aldehyde (MPBA) or p- Dimethyl aminobenzaldehyde (DABA) and 20 g of oxalic acid impregnated in 100 ml of methanol and dried. The dry papers are immersed in aqueous solutions of sulfonamides that are applied particularly frequently and read off after 1-2 minutes.
The color changes are compiled in the following table 111:
EMI0005.0000
Table <SEP> III
<tb> sulfonamide <SEP> 10 <SEP> mg <SEP>% <SEP> 25 <SEP> mg <SEP>% <SEP> 50 <SEP> mg <SEP> / o
<tb> Test- <SEP> Sulfametin <SEP> White <SEP> White <SEP> Weak <SEP> Yellowish
<tb> paper <SEP> sulfafurazole <SEP> white <SEP> white <SEP> weak <SEP> yellowish
<tb> with <SEP> sulfaphenazole <SEP> white <SEP> white <SEP> white
<tb> MPBA <SEP> Sulfamoxolum <SEP> White <SEP> Weak <SEP> Yellowish
<tb> <U> Yellowish </U>
<tb> Test- <SEP> Sulfametin <SEP> Yellowish <SEP> Yellow <SEP> Strong <SEP> Yellow
<tb> paper <SEP> Sulfafurazole <SEP> yellow <SEP> strong <SEP> yellow <SEP> very <SEP> strong <SEP> yellow
<tb> with <SEP> sulfaphenazole <SEP> white <SEP> weak <SEP> pink <SEP> weak <SEP>
pink
<tb> DABA <SEP> Sulfamoxolum <SEP> Yellow <SEP> Strong <SEP> Yellow <SEP> Very <SEP> Strong <SEP> Yellow
<tb> Sulfametin <SEP> = <SEP> N1- (5-methoxy-2-pyrimidiny) -sulfanilamide
<tb> Sulfafurazole <SEP> = <SEP> NI- (3,4-dimethyl-5-isoxazolyl) -sulfanilamide
<tb> sulfaphenzazole <SEP> = <SEP> N1- (1-phenyl-5-pyrazolyl) -sulfanilamide
<tb> Sulfamoxolum <SEP> = <SEP> NI- (4,5-dimethyl-2-oxazolyl) -sulfanilamide As can be seen from the table above, the color reaction to urobilinogen in the test strips according to the invention is caused by sulfonamide concentrations of up to 50 mg practically not bothered. Higher concentrations only occur for a short time after shock therapy and are therefore usually known to the observer.
Example 6 To produce a reagent film for the detection of urobilinogen, a mixture of the following components is prepared:
EMI0005.0003
A 300 μm thick layer of the above mixture is applied to a white polyvinyl chloride film and then dried with hot air, a water-insoluble film being formed. If this is wetted with a drop of urine containing urobilinogen, a red color appears after 1-2 minutes, which becomes even stronger after wiping off the urine. No staining is observed with urobilinogen-free urine.
Example 7 25 ml of urine are acidified with 12 ml of glacial acetic acid and extracted with 40 ml of ether. The extract is washed twice with 20 ml of water each time and made up to 40 ml with ether. 20 ml of this are taken, 0.5 ml of a solution of 1 g of p-N-morpholino-benzaldehyde in 5 ml of concentrated hydrochloric acid is added and the mixture is shaken vigorously. Then 6 ml of semi-saturated sodium acetate solution are added and shaken again, the red dye collecting in the aqueous phase. After separation, the ether is washed again with 2 ml of water. The combined aqueous extracts are made up to 20 ml, measured at 557 nm in the photometer and evaluated using a calibration curve drawn up beforehand.
Example 8 Filter paper (2316 from Schleicher & Schüll) is impregnated with a solution of 0.5 part of p-bis (diethylaminoethyl) aminobenzaldehyde bis-hydrogenoxalate, 30 parts of maleic acid and 0.5 part of polyethylene glycol 1000 in 100 parts of methanol . The paper reacts pink to red with urobilinogen-containing urines. Papers with the same analytical properties but better behavior when rolling and cutting are obtained when using 5 parts of polyethylene glycol 6000 or 20,000.
Example 9 Filter paper (2316 from Schleicher & Schüll) is impregnated with a solution of the following composition:
EMI0005.0016
p- (Cyclohexylamino) benzaldehyde <SEP> 0.05 <SEP> g
<tb> oxalic acid <SEP> 20.0 <SEP> g
<tb> Methanol <SEP> ad <SEP> 100.0 <SEP> ml After drying, a white test paper is obtained which, with urines containing urobilinogen bodies, has a more or less intense pink to violet depending on the content Staining shows. Urobilinogen low-body urine or a 3% aqueous urea solution do not lead to any color changes in the test paper. Urinary indicator gives no color reaction. The test papers can be read after 1-2 minutes.
Example 10 Filter paper (2316 from Schleicher & Schüll) is impregnated with a solution of the following composition:
EMI0005.0017
p- (sec-butylamino) benzaldehyde <SEP> 0.05 <SEP> g
<tb> Potassium bisulfate <SEP> 15.0 <SEP> g
<tb> polyethylene glycol <SEP> 5.0 <SEP> g
<tb> Water <SEP> ad <SEP> 100.0 <SEP> ml. After drying, a white test paper is obtained which has the same properties as the test paper produced according to Example 9.
Example 11 Filter paper (2316 from Schleicher & Schüll) is mixed with differently concentrated solutions of X parts each of p- (isopropylamino) benzaldehyde (iPABA), p- (n-propylamino) benzaldehyde (nPABA) or p- (Dimethylamino) benzaldehyde (DABA) and 20 parts of oxalic acid in 100 parts of methanol as described in Example 1, impregnated. The dry test papers are immersed in a 3% urea solution.
The color changes observed are compiled in the following table:
EMI0006.0000
X <SEP> iPABA <SEP> nPABA <SEP> DABA
<tb> 0.05 <SEP> white <SEP> yellowish <SEP> yellow
<tb> 0.075 <SEP> white <SEP> yellowish <SEP> yellow
<tb> 0.1 <SEP> white <SEP> yellow <SEP> yellow
<tb> 0.15 <SEP> weak <SEP> yellowish <SEP> yellow <SEP> strong <SEP> yellow As one can clearly see from this, the test paper according to the invention with iPABA is significantly less sensitive to urea and thus reacts more sensitively and more specific to urobilinogen bodies, as the pink color reaction
EMI0006.0003
Substance <SEP> I <SEP> reaction <SEP> with <SEP> usually containing
<tb> 3% <SEP> urea solution
<SEP> urine
<tb> or <SEP> Ubg.-poor <SEP> urine
<tb> p- (isopropylamino) -benzaldehyde <SEP> white * <SEP> rose red
<tb> p- (isopropylamino) -m-methyl benzaldehyde <SEP> weak <SEP> yellowish <SEP> pink-red
<tb> p- (sec-butylamino) -benzaldehyde <SEP> weak <SEP> yellowish <SEP> pink-red
<tb> p- (Pentyl-3-amino) -benzaldehyde <SEP> yellowish <SEP> pink-red
<tb> p- (2,4-dimethylpentyl-3-amino) benzaldehyde <SEP> yellow <SEP> red
<tb> p- (cyclopentylamino) -benzaldehyde <SEP> weak <SEP> yellowish <SEP> pink-violet
<tb> p- (2-methylcyclopentyl-amino) benzaldehyde <SEP> yellowish <SEP> pink-violet
<tb> p- (Cyclohexylamino) -benzaldehyde <SEP> Fast <SEP> White * <SEP> Pink-violet
<tb> p- (Cyclohexylamino) -m-methyl benzaldehyde <SEP> Weak <SEP> Yellowish <SEP> Pink-violet
<tb> p- (Cyclohexylamino) -m-isopropyl benzaldehyde <SEP> yellowish <SEP> pink-violet
<tb> p- (2-methylcyclohexyl-amino)
benzaldehyde <SEP> yellowish <SEP> pink-violet
<tb> p-menthylamino-benzaldehyde <SEP> yellow <SEP> orange
<tb> p- (1-Cyclohexylpropyl-2-amino) benzaldehyde <SEP> yellowish <SEP> pink-red
<tb> p- (cyclododecylamino) -benzaldehyde <SEP> weak <SEP> yellowish <SEP> pink
<tb> p- (norbornyl-2-amino) -benzaldehyde <SEP> yellow <SEP> pink red
<tb> p - (α-methylbenzylamino) -benzaldehyde <SEP> yellowish <SEP> pink-red
<tb> p - (?
-Isopropylbenzylamino) benzaldehyde <SEP> yellowish <SEP> pink-red
<tb> p- (1-phenylpropyl-2-amino) benzaldehyde <SEP> yellowish <SEP> pink-red
<tb> p- (indanyl-2-amino) -benzaldehyde <SEP> yellowish <SEP> pink-red
<tb> p- (N-diethylaminoethyl-N-isopropylamino) -benzaldehyde <SEP> yellowish <SEP> purple
<tb> *) <SEP> The <SEP> in <SEP> the <SEP> urine <SEP> dipped <SEP> strips <SEP> show <SEP> a <SEP> pale <SEP> yellow coloration, <SEP> which <SEP> through
<tb> the <SEP> intrinsic color <SEP> of the <SEP> urine <SEP> is conditionally <SEP>.
Example 13 To produce a film-like reagent layer for the detection of urobilinogen, a mixture of the following ingredients is prepared:
EMI0006.0004
p- (Cyclohexylamino) benzaldehyde <SEP> 0.05 <SEP> g
<tb> colloidal <SEP> silica <SEP> (Aerosil) <SEP> 1.00 <SEP> g
<tb> oxalic acid <SEP> 10.00 <SEP> g
<tb> Polyvinyl butyracetal <SEP> (Mowital) <SEP> 0.5 <SEP> g
<tb> Polyethylene glycol <SEP> 6000 <SEP> 0.5 <SEP> g
<tb> Methanol <SEP> 30.0 <SEP> ml The above mixture is applied approx. 1 mm thick to a white polyvinyl chloride film and then dried with warm air, creating a water-insoluble layer.
If this is wetted with a drop of urobilinogen-containing urine, then after 1-2 minutes a red color with urobilinogen arises, which is not covered by the more or less strong yellow color reaction with urea.
Example 12 Filter paper (23 S or 2316 from Schleicher & Schüll) is impregnated with methanolic solutions which, in 100 parts of solution, contain 0.05 part of the following substance I and 20 parts of oxalic acid. White to yellowish test papers are obtained.
The color reactions observed when these test papers are immersed are read off after 1-2 minutes and are summarized in the following table: Coloring. No staining is observed with urobilinogen-free urine.
Example 14 25 ml of urine are acidified with 12 ml of glacial acetic acid and extracted with 40 ml of ether. The extract is washed twice with 20 ml of water each time and made up to 40 ml with ether. Take 20 ml of this, add 0.5 ml of a solution of 1 g of p- (cyclopentylamino) benzaldehyde in 5 ml of concentrated hydrochloric acid and shake vigorously. Then add 2.5 ml of semi-saturated sodium acetate solution and 3.5 ml of water and shake again, the red dye collecting in the aqueous phase. After separation, the ether is washed again with 2 ml of water. The combined aqueous extracts are made up to 20 ml, measured at 557 nm in a photometer and evaluated using a previously established calibration curve.