Verfahren zur Herstellung von Cephalosporinantibiotica
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren herstellbaren neuen Cephalosporinverbindungen haben folgende allgemeine Formel:
EMI1.1
in der R einen organischen Rest, R' Wasserstoff oder eine Acetoxygruppe und M ein pharmazeutisch annehmbares Kation bedeutet. Die Verbindungen enthalten eine Doppelbindung in der 3-Stellung und einen Dihydrothiazinring mit einem damit verschmolzenem ss-Lactam. Einige Verbindungen dieser Klasse haben zu der Annahme veranlasst, dass sie brauchbare Antibiotica zur Bekämpfung von Krankheiten, die durch verschiedene Gram-positive und Gram-negative Mikroorganismen verursacht werden, sind.
Einige Cephalosporinverbindungen, beispielsweise Natri umceph alotin- [7-(2'-thi enyl)- acetamidocephalosporansäurenatriumsalz] , werden im erheblichem Umfang als parenterale Antibiotica verabreicht, es besteht jedoch weiter ein Bedarf an anderen und besseren Antibiotica. Eine erhebliche Verbesserung wird nun dadurch erzielt, dass sich die erfindungsgemässen herstellbaren Verbindungen bei oraler Verabreichung durch eine beträchtliche Aktivität als Antibiotica auszeichnen.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Cephalosporinantibiotica der Formel
EMI1.2
worin R Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen und R' Wasserstoff oder eine Acetoxygruppe bedeuten, oder deren inneren Salzen oder Salzen mit einer pharmazeutisch annehmbaren Säure oder Base, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man 7-Aminocephalosporansäure bzw. 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure oder deren wasserlösliche Salze mit einem entsprechenden Acylierungsmittel acyliert, dessen Aminogruppe geschützt ist, und die Schutzgruppe entfernt.
Die erhaltenen Verbindungen können Einzelverbindungen oder verschiedene Mischungen stereoisomerer Formen von optisch aktiven Isomeren sein. Diese Verbindungen werden im allgemeinen in Form der Zwitter- ionen oder inneren Salze hergestellt. Sie können auch in Form von Salzen mit einer pharmazeutisch annehmbaren Base, beispielsweise in Form von Alkalimetallsalzen, zum Beispiel als Natrium- oder Kaliumsalz und als Ammonium- und substituierte Ammonium- und Aminsalze oder als Anion in einem pharmazeutisch annehmbaren anionischen Salz mit einer starken Säure (d. h. einem Säureadditionssalz einer starken Säure mit einem pK'a unter 4), zum Beispiel als Salz mit Salzsäure, Schwefelsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure oder Trifluoressigsäure und dergleichen verwendet werden.
Vorzugsweise werden diese Verbindungen in der oben erwähnten Zwitterionen- oder inneren Salzform hergestellt und als Antibiotica verwendet.
Beispiele für erfindungsgemäss herstellbare Verbindungen sind nachstehend als freie Aminosäureverbindungen angegeben, es ist jedoch zu beachten, dass sie in den verschiedenen Salzformen, die oben genannt wurden, verwendet werden können.
7-[4-(Aminomethyl)phenylacetamido]- cephalosporansäure 7-[4-(a-Aminoäthyl)phenylacetamido]- cephalosporansäure 7-[4-(a-Aminopropyl)phenylacetamido] cepahlosporansäure 7-[4'-(a-Aminoäthyl)phenylacetamido]- desacetoxycephalosporansäure, und 7-[4'-(a-Aminopropyl)phenylacetarnido]- desacetoxycephalosporansäure.
Die neuen Cephalosporansäureverbindungen sind insofern mit Cephalosporin C verwandt, als sie den 5,6-Dihydro-6H-thiazin-Ring mit einem in 5,6-Stellung damit verbundenen ss-Lactamring enthalten, der für Cephalosporin C charakteristisch ist. Im Unterschied zu Cephalosporin C, das in 7-Stellung die 5'-Amino N'-adipamylgruppe enthält, zeichnen sich die neuen Verbindungen jedoch durch eine Acylamidogruppe in 7-Stellung mit einem a-Amino-niederalkyl-Substituenten in der 4-Stellung an dem Phenylring eines Phenylessigsäurerest als Acylgruppe aus. Die neuen Desacetoxycephalosporansäureverbindungen enthalten ausserdem in 3-Stellung eine Methylgruppe anstelle einer Acetoxymethylgruppe, wie es bei Cephalosporin C der Fall ist.
Im Gegensatz zu Cephalosporin C, das eine verhältnismässig geringe antibakterielle Wirkung hat, sind die erfindungsgemäss herstellbaren Verbindungen ferner hochwirksame antibakterielle Mittel, die das Wachstum zahlreicher Arten von Mikroorganismen in den verschiedensten Umgebungen zu inhibieren vermögen.
Cephalosporin C, das das zweckmässigste Ausgangsmaterial zur Herstellung der neuen Verbindungen darstellt, kann durch Züchten eines Cephalosporin C erzeugenden Organismus in einem geeigneten Nährmedium hergestellt werden, wie es in der britischen Patentschrift 810196 beschrieben ist. Cephalosporin C kann auch nach einem in der USA-Patentschrift 3 082 155 beschriebenen Verfahren hergestellt werden, bei dem Cephalosporin C erzeugende Schimmelpilze der Species, zu der Cephalosporium I.M.I. 49137 gehört, in einem Medium, das geeignete Nährstoffe, hierunter eine Quelle für organischen Stickstoff, enthält, in Gegenwart von molekularem Sauerstoff verwendet und das dabei erzeugte Cephalosporin C abgetrennt wird.
Cephalosporin C lässt sich leicht in die entsprechende Grundverbindung 7-Aminocephalosporansäure(7-ACA), durch Spaltung der 5'-Amino-N'-adipamyl-Seitenkette zwischen ihrer Amidocarbonylgruppe und deren Amidostickstoff zweckmässig durch Umsetzung von Cephalosporin C mit Nytrosylchlorid in Ameisensäure und anschliessende hydrolytische Spaltung nach dem Verfahren der USA-Patentschrift 3 188 311 überführen.
Wenn die Desacetoxycephalosporansäureverbindungen gewünscht werden, kann Cephalosporin C in Desacetoxycephalosporansäure (7-ADCA) durch übliche Verfahren, zum Beispiel durch katalytische Hydrierung von Cephalosporin C und anschliessende hydrolytische Entfernung der 5-Aminodipoylseitenkette übergeführt werden, wie es beispielsweise in der USA-Patentschrift 3 129 224 beschrieben ist. Die 7-ADCA wird dann anstelle der 7-ACA zur Herstellung der neuen Verbindungen verwendet.
Die neuen 7-{2'-[4"-(a-Aminoalkyl)phenylj- acetamido)cephalosporansäureverbindungen werden durch Acylierung der 7-ACA oder 7-ADCA entweder als freie Säure oder als ein geeignetes wasserlösliches Salz, wie sie in der USA-Patentschrift 3 207 755 beschrieben sind, mit einem Acylierungsmittel, das sich von der gewählten 4-(a-Aminoalkyl)-phenylessigsäure ableitet, nach üblichen Acylierungsverfahren hergestellt. Ein zweckmässiges Acylierungsmittel für diesen Zweck ist das entsprechende 4a-Aminoalkylphenylacetylchlorid oder -bromid, in dem die Aminogruppe in üblicher Weise mit einer blockierenden Gruppe, zum Beispiel einer Carbobenzoxy-, Carboallyloxy-, tert.-Butoxycarbonyl-, ss-Oxoalkyliden-, Furfu ryloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonylgruppe oder dergleichen geschützt ist.
Die Acylierung von 7-ACA oder 7-ADCA wird in Wasser oder einem geeigneten organischen Lösungsmittel durchgeführt, vorzugsweise unter praktisch neutralen pH-Bedingungen und vorzugsweise bei oder etwas unter Zimmertemperatur, zum Beispiel oberhalb des Gefrierpunktes der Reaktionsmischung und bis zu etwa 200 C. Nach einer typischen Arbeitsweise wird 7-ACA oder 7-ADCA zusammen mit einer ausreichenden Menge Natriumbicarbonat oder einem anderen geeigneten Alkali, so dass vorzugsweise der pH-Wert der Mischung zwischen 5 und 9 gehalten und die Salzbildung und Auflösung gefördert wird, in wässrigem 50-volumenprozentigem Aceton gelöst, so dass die Konzentration der 7-ACA oder 7-ADCA etwa 1 bis 4 Gewichts- /o beträgt.
Man kühlt die Lösung auf etwa 0 bis 5 C und setzt unter Rühren und Kühlen die Lösung des geschützten 4-Aminoalkylphenylacetylchlorids oder -bromids als Acylierungsmittel in etwa 200/obigem Überschuss zu.
Der pH-Wert der Mischung kann, wenn er sich verändert, durch Zusatz von Natriumbicarbonat oder durch Einleiten von Kohlendioxyd etwa beim Neutralpunkt (pH 6 bis 7,5) gehalten werden. Nach beendeter Zugabe des Acylierungsmittels wird die Reaktionsmischung weiter gerührt und auf Zimmertemperatur erwärmen gelassen. Dann wird das Reaktionsprodukt mit Salzsäure oder einer anderen geeigneten Säure auf etwa pH 2 angesäuert, um die freie 7- {2'-[4"-(blockierte-a-Aminoalkyl)phenyl]-acetamido}cephalosporansäure oder die entsprechende Desacetoxycephalosporansäure zu bilden, die dann mit einem organischen Lösungsmittel, zum Beispiel Äthylacetat, extrahiert wird.
Der organische Lösungsmittelextrakt, der das blockierte Amino säurederivat von 7-ACA oder 7-ADCA enthält, wird mit einem alkalischen Material, zum Beispiel Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Ammoniumhydroxyd und einem geeigneten Amin oder einer anderen Base, die nach Bedarf ein Natrium-, Kalium-, Ammonium- oder anderes Kation enthält, auf etwa pH 5,5 eingestellt und mit Wasser extrahiert. Die wässrige Lösung, die das blockierte Aminozwischenprodukt als Anion in der Salzform enthält, wird abgetrennt und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in der Mindestmenge warmen Methanols aufgenommen, und das gewünschte Produkt wird durch Abkühlen und/oder Ein dampfen gegebenenfalls mit Isopropanol als Antilösungsmittel abgeschieden. Das so erhaltene kristalline Produkt wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet.
Vor oder nach dem Kristallisieren kann das so erhaltene Zwischenprodukt in üblicher Weise zur Entfernung der Schutzgruppe der Aminoalkylfunktion behandelt werden, zweckmässig durch Hydrierung unter milden Bedingungen in Gegemwart eines Palladiumkatalysators oder durch Behandlung unter milden sauren Bedingungen während kurzer Zeit (zum Beispiel mit Ameisensäure bei etwa Zimmertemperatur während etwa 1 bis 5 Stunden). Dieses Zwischenprodukt kann auch mit Trifluoressigsäure behandelt werden, um die Schutzgruppe zu entfernen und das Trifluoressigsäuresalz der gewünschten 7-{2'-[4"-(Aminoalkyl)-phenyl]- acetamido) cephalosporansäure oder desacetoxycephalosporansäure zu bilden.
Durch Behandlung dieses Säuresalzes mit einem geeigneten Anionenaustauscherharz in Basen- oder Acetatform nach üblichen Verfahren kann man die Trifluoressigsäuresalzgruppe entfernen und die Zwitterionenform des Produkts erzeugen. Zu Anionenaustauscherharzen, die für diesen Zweck geeignet sind, gehören beispielsweise die schwachen Anionenaustauscher, zum Beispiel die unter den Handelsbezeichnungen Amberlite IR4B und De-acidite-E bekannten Harze in der Acetatform und die starken Anionenaustauscher, die zur Entfernung von Chlorid und anderen Anionen aus der Cephalosporinlösung verwendet werden, beispielsweise Amberlite IRA-400 , Dowex 1 oder De-acidite FF .
Zu geeigneten organischen Anionenaustauscherharzen, die zur Herstellung der erfindungsgemässen Verbindungen verwendet werden können, gehören beispielsweise diejenigen, die von der Rohm and Haas Co. unter der Handelsbezeichnung Amberlite La-1 und Amberlite La-2 auf den Markt gebracht werden und in der USA-Patentschrift 2 870 207 beschrieben sind. Das Anionenaustauscherharz Amberlite La-1 ist ein Vertreter einer Gruppe von hochmolekularen flüssigen sekundären Aminen, die wasserunlöslich, jedoch in Kohlenwasserstoffen und anderen nichtwässrigen Lösungsmitteln gut löslich sind.
Amberlite La-1 -Harz hat beispielsweise eine Konfiguration aus zwei hochverzweigten aliphatischen Ketten, die an das Stickstoffatom gebunden sind. Diese Struktur ist für seine hervorragende Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln und seine ausserordentlich geringe Löslichkeit in wässrigen Lösungen verantwortlich. Diese Löslichkeitseigenschaften in Verbindung mit der Fähigkeit von sekundären Aminen, mit Säuren unter Bildung der entsprechenden Aminsalze zu reagieren, machen das Harz für die Entfernung von sauren Bestandteilen aus einer wässrigen Lösung geeignet.
Die Acylierung der 7-ACA oder 7-ADCA kann auch mit einer geeigneten 4'-(a-Aminoalkyl)phenylessigsäure in Verbindung mit einem Carbodiimid durchgeführt werden. Die Acylierung erfolgt in solchen Fällen bei gewöhnlichen Temperaturen. Für diesen Zweck sind beliebige Carbodiimide geeignet, die als aktive Gruppe die -N=C=N=-Struktur aufweisen. Zu Beispielen dafür gehören N,N'-Diäthylcarbodiimid, N,N'-Di-n -propylcarbodiimid, N,N'-Diisopropylcarbodiimid, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, N,N'-Diallylcarbodiimid, N,N'-Bis(p-dimethylaminophenyl)carbodiimid, N-Athyl-N'(4"-Athyl-2"-oxazinyl)carbodiimid und dergleichen. Andere geeignete Carbodiimide sind in der USA-Patentschrift 3 252 973 beschrieben.
Alternativ kann die Acylierung von 7-ACA oder7 ADCA mit einem aktivierten Derivat der gewählten 4'-(a-Aminoalkyl)phenylessigsäure, zweckmässig dem entsprechenden Säureanhydrid oder einem gemischten Anhydrid oder einem aktivierten Ester, zum Beispiel dem p-Nitrophenyl- oder Cyanmethylester, durchgeführt werden.
Einige dieser 4-(a-Aminoalkyl)phenylessigsäureverbindungen enthalten als solche oder in einer für die Acylierung von 7-ACA oder 7-ADCA geeigneten Form, zum Beispiel in Form des Acylhalogenids, gemischten Anhydride oder Halogenformiats asymmetrische Kohlenstoffatome und können daher in optisch aktiven isomeren Formen vorliegen. Diese stereoisomeren Verbindungen können in Form der getrennten Isomeren oder als verschiedene stereoisomere Mischungen der optischen Isomeren zur Herstellung der erfindungsgemässen Verbindungen verwendet werden.
Ein Beispiel für gemischte Verbindungen nach dieser Erfindung ist eine stereoisomere Mischung von 7-{2'-[4"-(d- und l-a-Aminoäthyl) phenyl] acetamidocephalosporansäure die beispielsweise durch Umsetzung von 7-ACA mit Mischungen von 4'-(d und 1-a-Aminoäthyl)phenylessigsäure oder deren reaktiven Derivaten oder durch Vermischen der einzelnen d- und Isomeren der 7-{2'-[4"-(a-Aminoäthyl) phenyl] acetamido) cephalosporansäureverbindungen, die wie in den folgenden Beispielen 1 bis 4 beschrieben hergestellt werden, erhalten werden.
Wenn die einzelnen optischen Cephalosporinisomeren gewünscht werden, kann die als Ausgangsmaterial gewählte 4'-(a-Aminoalkyl)phenylessigsäure in üblicher Weise aufgetrennt werden, zum Beispiel indem man die freie Säure mit Cinchonin, Strychnin, Brucin oder dergleichen umsetzt, dann die entstandenen Salze zur Trennnung der diastereoisomeren Salze fraktioniert kristallisiert und anschliessend die getrennten isomeren Salze getrennt ansäuert, um die gewünschte optisch aktive d- oder 1-Säure freizusetzen.
Jede der so erhaltenen d- und 1-4'-(a-Aminoalkyl)phenylessigsäuren kann als solche mit einem Carbodiimid zur Acylierung von 7-ACA oder 7-ADCA eingesetzt oder nach üblichen Verfahren in das entsprechende Säurehalogenid, gemischte Anhydrid oder Halogenformiat als Acylierungsmittel übergeführt werden, wobei dafür gesorgt wird, dass extreme Bedingungen vermieden werden, die zur Racemisierungen führen könnten.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Beispiel I
Eine Mischung aus 475 mg (5 mMol) Methylenchlorformiat in 25 ml Aceton, das 2 Tropfen Dime thylbenzylamill enthält, wird in einem Eis-Alkohol-Bad gekühlt. Die gekühlte Mischung wird unter Rühren während 30 Minuten tropfenweise mit 1,4 g (5 mMol) 4-[N-(tert.-Butoxycarbonyl)d- fl-aminoäthyl] phenylessigsäure in 25 ml Aceton, das 500 mg Triäthylamin enthält, versetzt, um das gemischte Anhydrid zu bilden. Dann wird langsam unter Rühren während 5 Minuten eine vorher mit Aktivkohle behandelte und gekühlte Mischung von 1,5 g (5,5 mMol) 7-ACA in 30 ml Wasser, das 550 mg (5,5 mMol) Triäthylamin enthält, zugesetzt.
Die Mischung wird in der Kälte eine weitere Stunde gerührt, um eine möglichst vollständige Umsetzung zu der blockierten Amino-7-(2'-4"-(N-tert.-Butoxycarbonyl d-a-aminoäthyl)phenyl]-acetamido}cephalosporansäure zu gewährleistcn.
Zur Reinigung der erhaltenen Säure entfernt man das Aceton, wäscht den Rückstand mit Wasser, kühlt die Mischung und extrahiert in ein nichtwässriges Lösungsmittel indem man die Mischung in Gegenwart von Äthylacetat mit 1n Salzsäure auf pH 2,5 ansäuert.
Eine Abscheidung von 7-ACA wird nicht festgestellt.
Das Lösungsmittelsystem wird getrennt, und das Produkt in der Äthylacetatschicht wird über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernung des Athylacetats werden 2,5 g (930/, Ausbeute) des gewünschten N-blockierten Cephalosporins als amorpher Rückstand erhalten, der nicht kristallisiert werden kann.
Das blokkierte Aminosäurederivat von 7-ACA wird mit Diisopropyläther verrieben und im Vakuum getrocknet, wodurch 2.0 g 7-{2'-[4"-(N-tert.-Butoxycarbonyl-d-a- aminoäthyl)phenyl]acetamido) cephalosporansäure mit folgenden Analysenwerten erhalten werden:
Analyse für C2oH3tN306:
Berechnet: C 56,28 6/0 H 5,86 0/o N 7,88 0/0
Gefunden: C 55,94wozu H 6,41 0/0 N 6,91 0/0
Der pK'a der Verbinduno beträgt 4,95. Das Ultraviloettspektrum ergibt Am2ss0 = 8050 in Äthylalkohol.
Beispiel 2
1 g der wie in Beispiel 1 hergestellten 7- {2'-[4"-(N-tert.-Butoxycarbonyl-d-a-aminoäthyl- pheny]acetamidocephalosporansäure wird in 10 ml kalter Trifluoressigsäure gelöst und 2 Stunden in der Kälte gehalten, um die tert,-Butoxycarbonylschutzgruppe abzuspalten und das Trifluoressigsäuresalz von 7- {2'-[4"-(d-a-Aminoäthyl)-phenyl] acetamido} - cephalosporansäure zu bilden. Dieses Salz wird aus der Lösung durch Zusatz von wasserfreiem Äthyl äther in 3 Anteilen von jeweils 30ml abgeschieden. Das Salz wird von der Flüssigkeit abgetrennt, in einer Zentrifuge mit Äthyl äther gewaschen und in einem Vakuumexsikkator getrocknet.
Man erhält 800 mg (78 0/0 Ausbeute) des Trifluoressigsäuresalzes von 7-[-d-4-a-Aminoäthylphenylacetamido] - cephalosporansäure mit pK'a-Werten von 4,7 und 9,2. Das Ultraviolettspektrum in Äthanol ergibt Am260 =7730.
500 mg (0,9 mMol) des Trifluoressigsäuresalzes von 7-(2'-[4"-(d-a-Aminoäthyl)phenyl]- acetamido}cephalosporansäure werden in 4 ml Wasser gelöst und eine Stunde bei Zimmertemperatur in 20 ml einer flüssigen Mischung von 25 o/o Anionenaustauscherharz ( Amberlite La-1 ) in der Acetatform in Methylenisobutylketon gerührt.
Die wässrige Phase wird abgetrennt, mit Methylisobutylketon und dann mit Äthyläther gewaschen. Das Zwitterionenprodukt (inneres Salz) 7-{2'-[4"-d-a-Aminoäthyl)phenyl]- acetamido}cephalosporansäure fällt beim Einengen der Mischung im Vakuum aus, kristallisiert jedoch nicht. Das Gewicht des gewonnenen Produkts beträgt 265 mg (68 /n Ausbeute). Das Infrarot- und Ultraviolettspektrum stimmen mit der angenommenen Struktur überein. Die Verbindung hat pK'a-Werte von 4,8 und 9,35 und einen spezifischen Drehwertvon T 103,6 .
Dieses Produkt 7-{2'-[4"-(d-a-Aminoäthyl)phenyl]- acetamido)-cephalosporansäure weist minimale Hemmkonzentrationen (MIC) gegen über vier klinischen Isolaten von penicillinresistenten Staphylococcus aureus von 0,2 bis 0,8,ug/ml in Gegenwart menschlichen Blutserums und von 0,3 bis 0,8,zug/ ml in Abwesenheit von Serum gegenüber einer MIC von Serum und von 0,9 bis 2,2,ug/ml für Cephaloglyvon Setum und von 0,0 bis 2,2cg/ml für Cephaloglycin in Abwesenheit von Serum, aufgrund von Messungen nach dem Gradienten-Platten-Verfahren auf.
Das Produkt hat eine mittlere wirksame Dosis (ED,o), gegenüber 13-hämolytischem Streptococcus pyogenes, Stamm 0203 bei zweimaliger oraler Verabreichung an Mäuse von 7,5 mg/kg
Gegenüber Gram-negativen Organismen werden nach einem standardisierten Gradienten-Platten-Verfahren folgende minimale Hemmkonzentrationen festgestellt:
: Organismus MIC Fgiml N- 9 Shigellasp. 24 N-10 Escherichia coli 15 N-26 Escherichia coli 16 X-26 Klebsiella pneumoniae 10 X-68 Aerobacter aerogenes 10 K- 1 Klebsiella pneumoniae > 50
Shigella sonnei 20
Beispiel 3
Nach der Arbeitsweise von Beispiel 1 wird 7- {2'-[4"-(N-tert.-ButoxycarbonyM-a- aminoäthyl)phenyl] acetamido) cephalosporansäure durch Umsetzung von 2-[4'-(N-tert. -Butoxycarbonyl-la-aminoäthyl)phenyl] acetylchlorid mit 7-ACA hergestellt.
Nach Verreiben der Verbindung in Diisopropyl äther werden 1,8 g 7-{2'-[4"-(N-tert.-Butoxycarbonyl-l-a- aminoäthyl)phenyl] acetamido) cephalosporansäure als Produkt erhalten, das nicht schmilzt, sich aber bei etwa 1100 C zersetzt. Die Ultraviolett-Hauptabsorption bei Am362 mit beträgt in Äthylalkohol 7400 und in Wasser 8200. Die Verbindung weist einen pK'a von 4,9 auf.
Das Infrarotspektrum stimmt mit der Struktur überein.
Das Produkt weist folgende Analysenwerte auf:
Analyse für C2sH3tN308S:
Berechnet: C 56,270/o H 5,860/o N 7,880/o
Gefunden: C 55,690/0 H 6,39 0/o N 7,64 0/
Beispiel 4
1 g 7-(2'-C4"-(N-tert.-Butoxycarbonyl)-l-a- aminoäthyl)phenyl acetamido)cephalosporansäure (wie in Beispiel 3 hergestellt) wird in 10 ml kalter Trifluoressigsäure gelöst und 2 Stunden in der Kälte gehalten, um die Schutzgruppe abzuspalten und das Trifluoressigsäuresalz von 7-{2'-[4"-(l-a-Aminoäthyl)phenyl]- acetamido}cephalosporansäure zu bilden.
Das Salz wird aus der Lösung durch Zusatz von wasserfreiem Athyläther in drei Anteilen von jeweils 30 ml abgeschieden. Das abgeschiedene Salz wird von der flüssigen Phase abgetrennt, auf einer Zentrifuge gewaschen und in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Das Gewicht des Trifluoressigsäuresalzes von 7-{2'-[4"-(l-a-Aminoäthyl)phenyl]- acetamido) cephalosporansäure beträgt 820 mag. Das Salz weist pK'a-Werte von und 9,2 auf. Das Ultraviolettspektrum ergibt Am260 m 6700.
500 mg des Trifluoressigsäuresalzes von 7-{2'-[4"-Qa-Aminoäthyl)- phenyl] acetamido) cephalosporansäure werden in 10ml Wasser gelöst und eine Stunde bei Zimmertemperatur mit 20 ml einer flüssigen Mischung von 25 o/o Anionenaustauscher Amberlite LA-1 in der Acetatform in Methylisobutylketon gerührt. Die wässrige Phase wird abgetrennt und mit Methylisobutylketon und dann mit Wasser gewaschen. Durch Einengen der wässrigen Mischung, bis sie fast trocken ist, erhält man 275 mg (70 O/o Ausbeute) eines kristallinen Zwitterionenprodukts (inneres Salz) von 7-{2'-[4"-(1-a-Aminoäthyl)phenyl]- acetamido) cephalosporansäure.
Das Ultraviolettspektrum zeigt Am260 =7720.
Die Verbindung weist zwei pK'a-Werte bei 4,7 und 9,3 auf. Das Infrarotspektrum stimmt mit diesem Produkt überein Der spezifische Drehwert der Verbindung beträgt + 97,8 .
Das Produkt 7-{2'-[4"-(l-a-Aminoäthyl)phenyl]acetamido}cephalosporansäure weist aufgrund von Messungen nach dem Gradienten Platten-Verfahren eine minimale Hemmkonzentration (MIC) gegenüber klinischen Isolaten von penidllinresi- stenten Staphyiococcus aureus von 0,1 bis 1 ,t4g/ml in Gegenwart von menschlichem Blutserum und von 0,4 bis 0,5,ug/ml in Abwesenheit von Serum im Vergleich zu einer MIC von 1,4 bis 9,ug/ml für Cephaloglycin in Gegenwart von Serum und 0,9 bis 2,2 g/ml für Cephaloglycin in Abwesenheit von Serum auf. Das Produkt hat eine mittlere wirksame Dosis (ED;,) von 5,14 mg/ kg gegenüber ss-hämolytischem Streptococcus pyogenes, Stamm 203 bei zweimaliger Verabreichung an Mäuse.
Gegenüber Gram-negativen Organismen weist es folgende minimale Hemmkonzentrationen auf: Organismus MIC mcg/ml N-9 24 N-10 10 N-26 11 X-26 7 X-68 4 X-l 750 Shigella sp. 16
Beispiel 5
2,75 g (10,4 mMol) 2-[4'-(tert.-Butoxycarbonyl- aminomethyl)-phenyl l essigsäure werden in einer Mischung aus 30 ml Dioxan und 15 ml Aceton gelöst. Die Mischung wird mit 1,05 g (10,4 mMol) Triäthylamin in 5 ml Aceton versetzt. Man kühlt die Mischung in einem Eis-Alkohol-Bad und gibt dann in 20 Minuten tropfenweise unter Rühren eine Lösung von 1,41 g Isobutylchlorformiat in 5 ml Dioxan zu. Die Mischung wird weitere 10 Minuten bei etwa -5 C gerührt, um eine vollständige Umsetzung zu dem gewünschten gemischten Anhydrid zu gewährleisten.
Die gekühlte Mischung wird dann auf einmal mit einer frisch zubereiteten Lösung von 2,S3 g (10,4 mMol) 7-ACA und 1,05 g Triäthylamin in 20 ml kaltem Wasser versetzt. Man lässt die Mischung bei 0 C über Nacht stehen. Die Mischung wird im Vakuum eingeengt, um einen Teil des Dioxans und Acetons zu entfernen. dann mit 30 ml Wasser verdünnt und mit 150 ml Äthylacetat gewaschen. Dann wird die Mischung mit 200 ml Äthylacetat überschichtet und unter Rühren mit 1 n Salzsäure auf pH 2,8 eingestellt.
Man trennt die Schichten, wäscht die Athylacetatschicht zweimal mit je 100 ml Wasser, schichtet das Athylace- tat, das das blockierte Aminoprodukt enthält, über 150 ml Wasser und stellt den pH-Wert der Mischung mit in Kaliumhydroxyd auf 6,5 ein, um das Kaliumsalz von 7-{2'-[4"-(N-tert.-Butoxycarbonylaminomethyl) phenyl]acetamidocephalosporansäure zu erzeugen. Dieses Salz in der wässrigen Phase wird mit 100 ml Athylacetat gewaschen und nach Abtrennung der wässrigen Phase von dem Äthylacetat wird die wässrige Phase im Vakuum eingedampft, wobei das Salz als halbkristalliner Rückstand zurückbleibt. Dieser Rückstand wird durch Auflösen in 15 ml warmem Methanol, Filtrieren der erhaltenen Lösung und anschliessende Zugabe von etwa 15 ml Isopropanol zur Kristallisation des Salzes gereinigt.
Die Salzkristalle in der flüssigen Mischung werden auf 0 C gekühlt, abfiltriert und dann im Vakuum getrocknet. Man erhält 1 g des 7-{2'-[4"-(N-tert.-Butoxy carbonylaminoäthyl)phenylj acetamido }- cephalosporansäure-kaliumsalzes.
Das Infrarotspektrum stimmt mit dem angegebenen Produkt überein.
Das Ultraviolettspektrum ergibt Am260 =8140.
Der pK'-a-Wert beträgt 4,8.
0,75 g dieses Salzes werden in 15 ml Wasser gelöst und dann mit 15 ml 98 0/obiger Ameisensäure versetzt.
Die Mischung wird etwa 3,5 Stunden bei 40C C gerührt. Dann engt man sie im Vakuum zu einem gummiartigen Körper ein, der kristallisiert. Das so erhaltene 7-{2'-[4"-(Aminomethyl)-phenyl]- acetamido}-cephalosporanat ist in heissem oder kaltem Wasser nur wenig löslich, in Äthylacetat und Essigsäure unlöslich, jedoch löslich in Ameisensäure. Man suspendiert das Salz in 10 ml Wasser und stellt mit 1 n Salzsäure auf pH 1 ein, wobei sich die Hauptmenge des Feststoffes löst. Man filtriert die Lösung und stellt den pH-Wert durch Zusatz von 5 n Natriumhydroxyd auf 4,2 ein. Es bildet sich eine kleine Menge eines flockigen Niederschlags, der abfiltriert wird.
Das Filtrat, das das innere Salz von 7-{2'-[4"-(Aminomethyl)phenyl]- acetamido}-cephalosporansäure enthält, macht etwa 20 ml aus und wird im Vakuum zur Trockne eingeengt, wobei Kristallisation erfolgt.
Die kristalline Säure wird dreimal mit je 2 ml kalten Wassers gewaschen und jedesmal filtriert. Das kristalline Produkt 7-( 2'-[4"-(Aminomethyl)-phenyI]- acetamido)cephalosporansäure weist pK'a-Werte von 4,7 und 9,4 in einer Mischung von 2/3 Dimethylformamid in Wasser auf. Das Infra lotspektrum stimmt mit der angegebenen Struktur überein. Das Ultraviolettspektrum ergibt Am260 =6930.
Das Produkt 7-{2'-[4"-(Aminomethyl)phenyl]- acetamido}cephalosporansäure weist eine minimale Hemmkonzentration (MIC) gegen über 4 klinischen Isolaten von penicillinresistenten Staphylococcus aureus von 0,4,ug/ml in Gegenwart von menschlichem Blutserum und von 0,8 bis 1,ug/ml in Abwesenheit von Serum, gemessen nach dem Gradienten-Platten-Verfahren, auf. Das Produkt hat eine mittlere wirksame Dosis (ED,o) von 6,75 mg/kg gegenüber ,,-hämolytischem Streptococcus pyogenes Stamm C 203 bei zweimaliger Verabreichung an Mäuse.
Gegen über Gram-negativen Organismen weist es aufgrund von Messungen nach dem Gradienten-Platten-Verfahren folgende minimale Hemmkonzentrationen auf: Organismus MIC llg/ml N-9 36 N-10 10 N-26 8 X-26 5 X-68 4 K-1 5 Shigella sonnei 12
Beispiel 6
Aus einer Mischung von 5 g (0,0186 Mol) 2-[4'-(tert.-Butoxycarbonylaminomethyl)phenyl] essigsäure, essigsäure, 1,9 g Triäthylamin und 2,52 g Isobutylchlorformiat in 100 ml Tetrahydrofuran wird das aminblockierte 2-[4'-(tert,-Butoxylcarbonylaminomethyl)- phenyl]-acetylisobutyl-Mischanhydrid hergestellt.
Die das gemischte Anhydrid enthaltende Mischung wird unter Rühren und Kühlen mit einer Lösung versetzt, die durch Rühren von 4,0 g 7-Aminobisacetoxycephalosporansäure in 60 ml Tetrahydrofuran und 60 ml Wasser unter Zugabe von Triäthylamin bis zu einem pH-Wert von 8 bereitet wurde.
Man lässt die erhaltene Reaktionsmischung vollständig reagieren. Das Zwischenprodukt 7-{2'-[4"-(N-tert.-Butoxycarbonyl- aminomethyl)phenyl]-acetamido} desacetoxycepahlosporansäure wird dann nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren isoliert. Es werden 2,06 g dieses Produktes erhalten. Das Ultraviolettspektrum ergibt Am260 =4770.
Die Verbindung weist pK'a-Werte von 5,55 und 7,1 auf.
Durch Umfällen der Verbindung aus Diäthyläther und Petroläther werden 1,6 g eines reineren Produkts mit Ultraviolettabsorption von Aa335 = 12800, Am260 = 5700 und pK'a-Werten von 5,5 und 7,2 erhalten.
1,6oder 7-{2'-[4"-(N-tert.-Butoxycarbonyl- aminomethyl)phenyl]-acetamido)- desacetoxycephalosporansäure werden wie in Beispiel 4 mit 6 ml Trifluoressigsäure behandelt, um die Schutzgruppe von der Aminomethylgruppe zu entfernen und das Trifluoressigsäuresalz von 7-{2'-[4"-(Aminomethyl)phenyl[- acetamido)desacetoxycephalosporansäure zu bilden, das aus der Lösung durch Zusatz von Äthyl- äther abgeschieden wird. Es werden 1,2 g dieses Salzes erhalten. Das Ultraviolettspektrum ergibt Am260 =6500.
Das Produkt weist pK'a-Werte von 5,55 und 9,1 auf.
1 g dieses Trifluoressigsäuresalzes wird zu einer Mischung von 2 ml Wasser und 2 ml Methylisobutylketon gegeben, in der das Salz nicht löslich ist. Man setzt 3 ml Wasser zu und behandelt die erhaltene Suspension mit dem Anionenaustauschharz LA-1 von Rohm and Haas in der Acetatform. Die Mischung wird etwa eine Stunde gerührt, um eine vollständige Umsetzung zu gewährleisten. Dann wird der ausgefallene Feststoff abfiltriert, mit Wasser, Methylisobutylketon und Acetonitril gewaschen und getrocknet, wodurch 390 mg der gewünschten 7- {2'-4"-(Aminomethyl)phenyljacetamido}- 3-methyl-3-cephen-4-carbonsäure in Form des inneren Salzes erhalten werden. Das Infrarotspektrum stimmt mit dieser Struktur überein. Das Ultraviolettspektrum ergibt Am216 13070, Am260 =7130.
Der Moore Stein-Test ergibt eine grosse Spitze. Das Produkt hat pK'a-Werte von 5,35 und 9,2.
Diese 7-{2'-[4"-(Aminomethyl)phenyl]- acetamido)-3-methyl-3-cephem-4- carbonsäureverbindung erweist sich bei einem Test an Mäusen als wirksames orales Antibioticum, wenn es wie oben beschrieben zweimal an eine Gruppe von Mäusen verabreicht wird.
Der ED50-Wert beträgt 31,2 mg/kg Körpergewicht gegenüber einem LDs0-Wert von 3250 mg/kg. Bei Agarverdünnungstests gegenüber verschiedenen Bakterien weist diese Verbindung 48 Stunden MIC-Werte von weniger als 6,25 Mikrogramm/ml gegenüber Streptococcus faecalis und von weniger als 6,25 Mikrogramm/ml gegenüber Escherichiacoli Nr. 2 auf. Die Verbindung weist MIC-Werte gegenüber 4 verschiedenen klinischen Isolaten von penicillinresistenten Staphylococcus aureus von 5 bis 8 Mikrogrommiml (,ug/ml) in Abwesenheit von menschlichem Blutserum und von 5 bis 11 Mikrogramm/ml in Gegenwart von menschlichem Blutserum auf.
Process for the preparation of cephalosporin antibiotics
The new cephalosporin compounds which can be prepared by the process according to the invention have the following general formula:
EMI1.1
in which R is an organic radical, R 'is hydrogen or an acetoxy group and M is a pharmaceutically acceptable cation. The compounds contain a double bond in the 3-position and a dihydrothiazine ring with an ß-lactam fused therewith. Some compounds in this class have been suggested to be useful antibiotics for combating diseases caused by various gram-positive and gram-negative microorganisms.
Some cephalosporin compounds, such as sodium cephalotin- [7- (2'-thienyl) -acetamidocephalosporanic acid sodium salt], are widely administered as parenteral antibiotics, but there is still a need for different and better antibiotics. A considerable improvement is now achieved in that the compounds according to the invention which can be prepared are distinguished by a considerable activity as antibiotics when administered orally.
The invention relates to a process for the preparation of cephalosporin antibiotics of the formula
EMI1.2
wherein R is hydrogen or an alkyl group having 1 or 2 carbon atoms and R 'is hydrogen or an acetoxy group, or their inner salts or salts with a pharmaceutically acceptable acid or base, which is characterized in that 7-aminocephalosporanic acid or 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid or their water-soluble salts are acylated with an appropriate acylating agent, the amino group of which is protected, and the protective group is removed.
The compounds obtained may be single compounds or various mixtures of stereoisomeric forms of optically active isomers. These compounds are generally produced in the form of the zwitterions or internal salts. They can also be in the form of salts with a pharmaceutically acceptable base, for example in the form of alkali metal salts, for example as the sodium or potassium salt and as the ammonium and substituted ammonium and amine salts, or as an anion in a pharmaceutically acceptable anionic salt with a strong acid ( that is, an acid addition salt of a strong acid having a pK'a under 4), for example, as a salt with hydrochloric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid or trifluoroacetic acid and the like can be used.
Preferably these compounds are prepared in the above-mentioned zwitterion or inner salt form and used as antibiotics.
Examples of compounds which can be prepared according to the invention are given below as free amino acid compounds, but it should be noted that they can be used in the various salt forms mentioned above.
7- [4- (aminomethyl) phenylacetamido] - cephalosporanic acid 7- [4- (a-aminoethyl) phenylacetamido] - cephalosporanic acid 7- [4- (a-aminopropyl) phenylacetamido] cepahlosporanoic acid 7- [4 '- (a-aminoethyl) phenylacetamido] -desacetoxycephalosporanic acid, and 7- [4 '- (α-aminopropyl) phenylacetarnido] -desacetoxycephalosporanic acid.
The new cephalosporanic acid compounds are related to cephalosporin C insofar as they contain the 5,6-dihydro-6H-thiazine ring with an β-lactam ring connected to it in the 5,6-position, which is characteristic of cephalosporin C. In contrast to cephalosporin C, which contains the 5'-amino N'-adipamyl group in the 7-position, the new compounds are, however, characterized by an acylamido group in the 7-position with an α-amino-lower alkyl substituent in the 4-position the phenyl ring of a phenylacetic acid residue as an acyl group. The new deacetoxycephalosporanic acid compounds also contain a methyl group in the 3-position instead of an acetoxymethyl group, as is the case with cephalosporin C.
In contrast to cephalosporin C, which has a relatively low antibacterial effect, the compounds which can be prepared according to the invention are also highly effective antibacterial agents which are able to inhibit the growth of numerous types of microorganisms in a wide variety of environments.
Cephalosporin C, which is the most convenient starting material for the preparation of the new compounds, can be prepared by growing a cephalosporin C producing organism in a suitable nutrient medium, as described in British Patent 810196. Cephalosporin C can also be prepared by a process described in U.S. Patent 3,082,155 in which cephalosporin C producing molds of the species to which Cephalosporium I.M.I. 49137 belongs, in a medium that contains suitable nutrients, including a source of organic nitrogen, used in the presence of molecular oxygen and the cephalosporin C produced is separated.
Cephalosporin C can easily be converted into the corresponding basic compound 7-aminocephalosporanic acid (7-ACA), by cleaving the 5'-amino-N'-adipamyl side chain between its amidocarbonyl group and its amido nitrogen, expediently by reacting cephalosporin C with nytrosyl chloride in formic acid and subsequent hydrolytic cleavage by the process of US Pat. No. 3,188,311.
If the desacetoxycephalosporanic acid compounds are desired, cephalosporin C can be converted into desacetoxycephalosporanic acid (7-ADCA) by conventional methods, for example by catalytic hydrogenation of cephalosporin C and subsequent hydrolytic removal of the 5-aminodipoyl side chain, as is for example in US Pat. No. 3,129 is described. The 7-ADCA is then used instead of the 7-ACA to make the new compounds.
The new 7- {2 '- [4 "- (α-aminoalkyl) phenylj-acetamido) cephalosporanic acid compounds are obtained by acylation of the 7-ACA or 7-ADCA either as the free acid or as a suitable water-soluble salt, as they are in the USA Patent specification 3,207,755 are described, with an acylating agent which is derived from the selected 4- (α-aminoalkyl) -phenylacetic acid, prepared by customary acylation processes. A suitable acylating agent for this purpose is the corresponding 4a-aminoalkylphenylacetyl chloride or bromide in which the amino group is protected in the usual manner with a blocking group, for example a carbobenzoxy, carboallyloxy, tert-butoxycarbonyl, β-oxoalkylidene, furfuryloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl group or the like.
The acylation of 7-ACA or 7-ADCA is carried out in water or a suitable organic solvent, preferably under practically neutral pH conditions and preferably at or slightly below room temperature, for example above the freezing point of the reaction mixture and up to about 200 C. A typical procedure is 7-ACA or 7-ADCA along with sufficient sodium bicarbonate or other suitable alkali to preferably maintain the pH of the mixture between 5 and 9 and promote salt formation and dissolution, in aqueous 50 percent by volume Acetone dissolved, so that the concentration of 7-ACA or 7-ADCA is about 1 to 4 wt / o.
The solution is cooled to about 0 to 5 ° C. and, with stirring and cooling, the solution of the protected 4-aminoalkylphenylacetyl chloride or bromide as acylating agent is added in about 200% excess.
If the pH value of the mixture changes, it can be kept at around the neutral point (pH 6 to 7.5) by adding sodium bicarbonate or introducing carbon dioxide. After the addition of the acylating agent has ended, the reaction mixture is stirred further and allowed to warm to room temperature. The reaction product is then acidified to about pH 2 with hydrochloric acid or another suitable acid to form the free 7- {2 '- [4 "- (blocked-a-aminoalkyl) phenyl] -acetamido} cephalosporanic acid or the corresponding deacetoxycephalosporanic acid, which is then extracted with an organic solvent, for example ethyl acetate.
The organic solvent extract, which contains the blocked amino acid derivative of 7-ACA or 7-ADCA, is mixed with an alkaline material, for example sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide and a suitable amine or other base, which as required a sodium, potassium , Ammonium or other cation, adjusted to about pH 5.5 and extracted with water. The aqueous solution, which contains the blocked amino intermediate as an anion in the salt form, is separated off and evaporated to dryness. The residue is taken up in the minimum amount of warm methanol, and the desired product is deposited by cooling and / or evaporating, if necessary with isopropanol as an anti-solvent. The crystalline product thus obtained is filtered off, washed with acetone and dried.
Before or after crystallization, the intermediate product thus obtained can be treated in the usual way to remove the protective group of the aminoalkyl function, expediently by hydrogenation under mild conditions in the presence of a palladium catalyst or by treatment under mildly acidic conditions for a short time (for example with formic acid at about room temperature for about 1 to 5 hours). This intermediate can also be treated with trifluoroacetic acid to remove the protecting group and form the trifluoroacetic acid salt of the desired 7- {2 '- [4 "- (aminoalkyl) phenyl] - acetamido) cephalosporanic acid or desacetoxycephalosporanic acid.
By treating this acid salt with a suitable anion exchange resin in base or acetate form by conventional methods, one can remove the trifluoroacetic acid salt group and produce the zwitterionic form of the product. Anion exchange resins that are suitable for this purpose include, for example, the weak anion exchangers, for example the resins in the acetate form known under the trade names Amberlite IR4B and De-acidite-E and the strong anion exchangers, which are used to remove chloride and other anions from the Cephalosporin solution can be used, for example Amberlite IRA-400, Dowex 1 or De-acidite FF.
Suitable organic anion exchange resins which can be used to prepare the compounds of the present invention include, for example, those marketed by Rohm and Haas Co. under the tradenames Amberlite La-1 and Amberlite La-2 and in the United States patent 2,870,207. The anion exchange resin Amberlite La-1 is a member of a group of high molecular weight liquid secondary amines that are insoluble in water, but readily soluble in hydrocarbons and other non-aqueous solvents.
Amberlite La-1 resin, for example, has a configuration of two hyperbranched aliphatic chains attached to the nitrogen atom. This structure is responsible for its excellent solubility in organic solvents and its extremely low solubility in aqueous solutions. These solubility properties, combined with the ability of secondary amines to react with acids to form the corresponding amine salts, make the resin suitable for the removal of acidic components from an aqueous solution.
The acylation of 7-ACA or 7-ADCA can also be carried out with a suitable 4 '- (α-aminoalkyl) phenylacetic acid in conjunction with a carbodiimide. The acylation takes place in such cases at ordinary temperatures. Any carbodiimides which have the -N = C = N = structure as the active group are suitable for this purpose. Examples include N, N'-diethylcarbodiimide, N, N'-di-n -propylcarbodiimide, N, N'-diisopropylcarbodiimide, N, N'-dicyclohexylcarbodiimide, N, N'-diallylcarbodiimide, N, N'-bis ( p-dimethylaminophenyl) carbodiimide, N-ethyl-N '(4 "-ethyl-2" -oxazinyl) carbodiimide and the like. Other suitable carbodiimides are described in U.S. Patent 3,252,973.
Alternatively, the acylation of 7-ACA or 7 ADCA can be carried out with an activated derivative of the selected 4 '- (a-aminoalkyl) phenylacetic acid, expediently the corresponding acid anhydride or a mixed anhydride or an activated ester, for example the p-nitrophenyl or cyanomethyl ester will.
Some of these 4- (a-aminoalkyl) phenylacetic acid compounds contain, as such or in a form suitable for the acylation of 7-ACA or 7-ADCA, for example in the form of the acyl halide, mixed anhydrides or haloformate, asymmetric carbon atoms and can therefore be in optically active isomers Forms are available. These stereoisomeric compounds can be used in the form of the separate isomers or as various stereoisomeric mixtures of the optical isomers for the preparation of the compounds of the present invention.
An example of mixed compounds according to this invention is a stereoisomeric mixture of 7- {2 '- [4 "- (d- and la-aminoethyl) phenyl] acetamidocephalosporanic acid which can be obtained, for example, by reacting 7-ACA with mixtures of 4' - (d and 1-a-aminoethyl) phenylacetic acid or its reactive derivatives or by mixing the individual d- and isomers of the 7- {2 '- [4 "- (a-aminoethyl) phenyl] acetamido) cephalosporanic acid compounds, which are prepared as in the following examples 1 to 4 described can be obtained.
If the individual optical cephalosporin isomers are desired, the 4 '- (a-aminoalkyl) phenylacetic acid selected as starting material can be separated in the usual way, for example by reacting the free acid with cinchonine, strychnine, brucine or the like, then the resulting salts to Separation of the diastereoisomeric salts crystallized in fractional form and then the separated isomeric salts are acidified separately in order to liberate the desired optically active d- or 1-acid.
Each of the d- and 1-4 '- (a-aminoalkyl) phenylacetic acids obtained in this way can be used as such with a carbodiimide for the acylation of 7-ACA or 7-ADCA or, according to conventional methods, into the corresponding acid halide, mixed anhydride or haloformate as acylating agent being transferred, taking care to avoid extreme conditions that could lead to racemizations.
The following examples illustrate the invention without restricting it.
Example I.
A mixture of 475 mg (5 mmol) of methylene chloroformate in 25 ml of acetone containing 2 drops of dimethylbenzylamill is cooled in an ice-alcohol bath. 1.4 g (5 mmol) of 4- [N- (tert-butoxycarbonyl) d-fl-aminoethyl] phenylacetic acid in 25 ml of acetone, which contains 500 mg of triethylamine, are added dropwise to the cooled mixture over 30 minutes, to form the mixed anhydride. Then a mixture, previously treated with activated charcoal and cooled, of 1.5 g (5.5 mmol) of 7-ACA in 30 ml of water containing 550 mg (5.5 mmol) of triethylamine is slowly added while stirring.
The mixture is stirred in the cold for a further hour in order to ensure the most complete conversion possible to the blocked amino-7- (2'-4 "- (N-tert-butoxycarbonyl-α-aminoethyl) phenyl] acetamido} cephalosporanic acid.
To purify the acid obtained, the acetone is removed, the residue is washed with water, the mixture is cooled and extracted into a non-aqueous solvent by acidifying the mixture to pH 2.5 with 1N hydrochloric acid in the presence of ethyl acetate.
A separation of 7-ACA is not found.
The solvent system is separated and the product in the ethyl acetate layer is dried over magnesium sulfate. After the ethyl acetate has been removed, 2.5 g (930% yield) of the desired N-blocked cephalosporin are obtained as an amorphous residue which cannot be crystallized.
The blocked amino acid derivative of 7-ACA is triturated with diisopropyl ether and dried in vacuo, giving 2.0 g of 7- {2 '- [4 "- (N-tert-butoxycarbonyl-da- aminoethyl) phenyl] acetamido) cephalosporanic acid with the following analytical values will:
Analysis for C2oH3tN306:
Calculated: C 56.28 6/0 H 5.86 0 / o N 7.88 0/0
Found: C 55.94, for which H 6.41 0/0, N 6.91 0/0
The pK'a of the compound is 4.95. The ultraviolet spectrum gives Am2ss0 = 8050 in ethyl alcohol.
Example 2
1 g of the 7- {2 '- [4 "- (N-tert-butoxycarbonyl-da-aminoäthyl- pheny] acetamidocephalosporanic acid) prepared as in Example 1 is dissolved in 10 ml of cold trifluoroacetic acid and kept in the cold for 2 hours to avoid the To split off tert -butoxycarbonyl protective group and to form the trifluoroacetic acid salt of 7- {2 '- [4 "- (da-aminoethyl) -phenyl] acetamido} - cephalosporanic acid. This salt is made from the solution by adding anhydrous ethyl ether in 3 parts The salt is separated from the liquid, washed with ethyl ether in a centrifuge and dried in a vacuum desiccator.
800 mg (78% yield) of the trifluoroacetic acid salt of 7 - [- d-4-α-aminoethylphenylacetamido] - cephalosporanic acid with pK'a values of 4.7 and 9.2 are obtained. The ultraviolet spectrum in ethanol gives Am260 = 7730.
500 mg (0.9 mmol) of the trifluoroacetic acid salt of 7- (2 '- [4 "- (da-aminoethyl) phenyl] - acetamido} cephalosporanic acid are dissolved in 4 ml of water and for one hour at room temperature in 20 ml of a liquid mixture of 25 o / o anion exchange resin (Amberlite La-1) in the acetate form in methylene isobutyl ketone.
The aqueous phase is separated off, washed with methyl isobutyl ketone and then with ethyl ether. The zwitterion product (inner salt) 7- {2 '- [4 "-da-aminoethyl) phenyl] - acetamido} cephalosporanic acid precipitates out when the mixture is concentrated in vacuo, but does not crystallize. The weight of the product obtained is 265 mg (68%). The infrared and ultraviolet spectra are consistent with the assumed structure. The compound has pK'a values of 4.8 and 9.35 and a specific rotation value of T 103.6.
This product 7- {2 '- [4 "- (da-aminoethyl) phenyl] - acetamido) -cephalosporanic acid has minimal inhibitory concentrations (MIC) against over four clinical isolates of penicillin-resistant Staphylococcus aureus of 0.2 to 0.8 μg / ml in the presence of human blood serum and from 0.3 to 0.8 pg / ml in the absence of serum versus an MIC of serum and from 0.9 to 2.2 µg / ml for cephalogly of setum and from 0.0 to 2 , 2cg / ml for cephaloglycine in the absence of serum, based on measurements using the gradient plate method.
The product has a median effective dose (ED, o) against 13-hemolytic Streptococcus pyogenes, strain 0203 when administered twice orally to mice of 7.5 mg / kg
In relation to Gram-negative organisms, the following minimum inhibitory concentrations are determined using a standardized gradient plate method:
: Organism MIC Fgiml N- 9 Shigellasp. 24 N-10 Escherichia coli 15 N-26 Escherichia coli 16 X-26 Klebsiella pneumoniae 10 X-68 Aerobacter aerogenes 10 K- 1 Klebsiella pneumoniae> 50
Shigella Sonnei 20
Example 3
Following the procedure of Example 1, 7- {2 '- [4 "- (N-tert-butoxycarbonyM-a-aminoethyl) phenyl] acetamido) cephalosporanic acid is obtained by reacting 2- [4' - (N-tert-butoxycarbonyl -la-aminoethyl) phenyl] acetyl chloride produced with 7-ACA.
After trituration of the compound in diisopropyl ether, 1.8 g of 7- {2 '- [4 "- (N-tert-butoxycarbonyl-la- aminoethyl) phenyl] acetamido) cephalosporanic acid are obtained as a product which does not melt, but which does about 1100 C. The main ultraviolet absorption at Am362 with is 7400 in ethyl alcohol and 8200 in water. The compound has a pK'a of 4.9.
The infrared spectrum agrees with the structure.
The product has the following analytical values:
Analysis for C2sH3tN308S:
Calculated: C 56.270 / o H 5.860 / o N 7.880 / o
Found: C 55.690 / 0 H 6.39 0 / o N 7.64 0 /
Example 4
1 g of 7- (2'-C4 "- (N-tert-butoxycarbonyl) -la- aminoethyl) phenyl acetamido) cephalosporanic acid (prepared as in Example 3) is dissolved in 10 ml of cold trifluoroacetic acid and kept in the cold for 2 hours, to split off the protective group and to form the trifluoroacetic acid salt of 7- {2 '- [4 "- (la-aminoethyl) phenyl] - acetamido} cephalosporanic acid.
The salt is separated from the solution by adding anhydrous ethyl ether in three portions of 30 ml each. The deposited salt is separated from the liquid phase, washed on a centrifuge and dried in a vacuum desiccator. The weight of the trifluoroacetic acid salt of 7- {2 '- [4 "- (la-aminoethyl) phenyl] - acetamido) cephalosporanic acid is 820 mag. The salt has pK'a values of 9.2 and 9.2. The ultraviolet spectrum gives Am260 m 6700.
500 mg of the trifluoroacetic acid salt of 7- {2 '- [4 "-Qa-aminoethyl) - phenyl] acetamido) cephalosporanic acid are dissolved in 10 ml of water and treated for one hour at room temperature with 20 ml of a liquid mixture of 25 o / o anion exchanger Amberlite LA- 1 in the acetate form in methyl isobutyl ketone. The aqueous phase is separated off and washed with methyl isobutyl ketone and then with water. By concentrating the aqueous mixture until it is almost dry, 275 mg (70% yield) of a crystalline zwitterion product (inner Salt) of 7- {2 '- [4 "- (1-a-aminoethyl) phenyl] - acetamido) cephalosporanic acid.
The ultraviolet spectrum shows Am260 = 7720.
The compound has two pK'a values at 4.7 and 9.3. The infrared spectrum is consistent with this product. The specific rotation value of the connection is + 97.8.
The product 7- {2 '- [4 "- (la-aminoethyl) phenyl] acetamido} cephalosporanic acid has a minimal inhibitory concentration (MIC) compared to clinical isolates of penidllin-resistant Staphyiococcus aureus of 0, based on measurements according to the gradient plate method. 1 to 1.t4g / ml in the presence of human blood serum and from 0.4 to 0.5 .ug / ml in the absence of serum compared to an MIC of 1.4 to 9.ug / ml for cephaloglycine in the presence of serum and 0.9 to 2.2 g / ml for cephaloglycine in the absence of serum The product has a mean effective dose (ED ;,) of 5.14 mg / kg to Streptococcus pyogenes ss-hemolytic strain 203 when administered twice on mice.
It has the following minimal inhibitory concentrations compared to gram-negative organisms: Organism MIC mcg / ml N-9 24 N-10 10 N-26 11 X-26 7 X-68 4 X-l 750 Shigella sp. 16
Example 5
2.75 g (10.4 mmol) of 2- [4 '- (tert-butoxycarbonyl-aminomethyl) -phenyl / acetic acid are dissolved in a mixture of 30 ml of dioxane and 15 ml of acetone. 1.05 g (10.4 mmol) of triethylamine in 5 ml of acetone are added to the mixture. The mixture is cooled in an ice-alcohol bath and a solution of 1.41 g of isobutyl chloroformate in 5 ml of dioxane is then added dropwise over 20 minutes with stirring. The mixture is stirred for an additional 10 minutes at about -5 C to ensure complete conversion to the desired mixed anhydride.
The cooled mixture is then treated all at once with a freshly prepared solution of 2.5 g (10.4 mmol) 7-ACA and 1.05 g triethylamine in 20 ml cold water. The mixture is left to stand at 0 ° C. overnight. The mixture is concentrated in vacuo to remove some of the dioxane and acetone. then diluted with 30 ml of water and washed with 150 ml of ethyl acetate. Then the mixture is covered with a layer of 200 ml of ethyl acetate and adjusted to pH 2.8 with 1N hydrochloric acid while stirring.
The layers are separated, the ethyl acetate layer is washed twice with 100 ml of water each time, the ethyl acetate, which contains the blocked amino product, is layered over 150 ml of water and the pH of the mixture is adjusted to 6.5 using potassium hydroxide To produce potassium salt of 7- {2 '- [4 "- (N-tert-butoxycarbonylaminomethyl) phenyl] acetamidocephalosporanic acid. This salt in the aqueous phase is washed with 100 ml of ethyl acetate and after separating the aqueous phase from the ethyl acetate becomes the aqueous Phase evaporated in vacuo, the salt remaining as a semicrystalline residue.This residue is purified by dissolving in 15 ml of warm methanol, filtering the resulting solution and then adding about 15 ml of isopropanol to crystallize the salt.
The salt crystals in the liquid mixture are cooled to 0 C, filtered off and then dried in vacuo. 1 g of the 7- {2 '- [4 "- (N-tert-butoxy carbonylaminoethyl) phenylj acetamido} - cephalosporanic acid potassium salt is obtained.
The infrared spectrum agrees with the specified product.
The ultraviolet spectrum gives Am260 = 8140.
The pK'-a is 4.8.
0.75 g of this salt are dissolved in 15 ml of water and then 15 ml of 98% of the above formic acid are added.
The mixture is stirred at 40 ° C. for about 3.5 hours. Then it is concentrated in a vacuum to form a rubber-like body that crystallizes. The 7- {2 '- [4 "- (aminomethyl) phenyl] - acetamido} -cephalosporanate obtained in this way is only sparingly soluble in hot or cold water, insoluble in ethyl acetate and acetic acid, but soluble in formic acid. The salt is suspended in 10 ml of water and adjusts to pH 1 with 1N hydrochloric acid, the bulk of the solid dissolving, the solution is filtered and the pH is adjusted to 4.2 by adding 5N sodium hydroxide, a small amount is formed a flaky precipitate which is filtered off.
The filtrate, which contains the inner salt of 7- {2 '- [4 "- (aminomethyl) phenyl] - acetamido} -cephalosporanic acid, amounts to about 20 ml and is evaporated to dryness in vacuo, with crystallization taking place.
The crystalline acid is washed three times with 2 ml of cold water each time and filtered each time. The crystalline product 7- (2 '- [4 "- (aminomethyl) -phenyI] - acetamido) cephalosporanic acid has pK'a values of 4.7 and 9.4 in a mixture of 2/3 dimethylformamide in water The infrared spectrum agrees with the structure given: the ultraviolet spectrum gives Am260 = 6930.
The product 7- {2 '- [4 "- (aminomethyl) phenyl] - acetamido} cephalosporanic acid has a minimum inhibitory concentration (MIC) against 4 clinical isolates of penicillin-resistant Staphylococcus aureus of 0.4 µg / ml in the presence of human blood serum and from 0.8 to 1.0 µg / ml in the absence of serum as measured by the gradient plate method. The product has a mean effective dose (ED, o) of 6.75 mg / kg versus ,, - hemolytic Streptococcus pyogenes strain C 203 when administered twice to mice.
Based on measurements using the gradient plate method, it exhibits the following minimum inhibitory concentrations against Gram-negative organisms: Organism MIC 11g / ml N-9 36 N-10 10 N-26 8 X-26 5 X-68 4 K- 1 5 Shigella sonnei 12
Example 6
From a mixture of 5 g (0.0186 mol) of 2- [4 '- (tert-butoxycarbonylaminomethyl) phenyl] acetic acid, acetic acid, 1.9 g of triethylamine and 2.52 g of isobutyl chloroformate in 100 ml of tetrahydrofuran, the amine-blocked 2- [4 '- (tert, -Butoxylcarbonylaminomethyl) - phenyl] -acetylisobutyl mixed anhydride prepared.
The mixture containing the mixed anhydride is added, with stirring and cooling, to a solution prepared by stirring 4.0 g of 7-aminobisacetoxycephalosporanic acid in 60 ml of tetrahydrofuran and 60 ml of water with the addition of triethylamine to a pH of 8.
The reaction mixture obtained is allowed to react completely. The intermediate 7- {2 '- [4 "- (N-tert-butoxycarbonyl-aminomethyl) phenyl] -acetamido} desacetoxycepahlosporanoic acid is then isolated by the method described in Example 1. 2.06 g of this product are obtained Ultraviolet spectrum gives Am260 = 4770.
The compound has pK'a values of 5.55 and 7.1.
By reprecipitating the compound from diethyl ether and petroleum ether, 1.6 g of a purer product with ultraviolet absorption of Aa335 = 12800, Am260 = 5700 and pK'a values of 5.5 and 7.2 are obtained.
1,6 or 7- {2 '- [4 "- (N-tert-butoxycarbonyl-aminomethyl) phenyl] -acetamido) - desacetoxycephalosporanic acid are treated as in Example 4 with 6 ml of trifluoroacetic acid in order to remove the protective group from the aminomethyl group and to form the trifluoroacetic acid salt of 7- {2 '- [4 "- (aminomethyl) phenyl [- acetamido) desacetoxycephalosporanic acid, which is precipitated from the solution by the addition of ethyl ether. 1.2 g of this salt are obtained. The ultraviolet spectrum gives Am260 = 6500.
The product has pK'a values of 5.55 and 9.1.
1 g of this trifluoroacetic acid salt is added to a mixture of 2 ml of water and 2 ml of methyl isobutyl ketone, in which the salt is not soluble. 3 ml of water are added and the suspension obtained is treated with the anion exchange resin LA-1 from Rohm and Haas in the acetate form. The mixture is stirred for about an hour to ensure complete conversion. The precipitated solid is then filtered off, washed with water, methyl isobutyl ketone and acetonitrile and dried, giving 390 mg of the desired 7- {2'-4 "- (aminomethyl) phenyljacetamido} - 3-methyl-3-cephen-4-carboxylic acid in the form The infrared spectrum agrees with this structure, the ultraviolet spectrum gives Am216 13070, Am260 = 7130.
The Moore Stein test gives a big peak. The product has pK'a values of 5.35 and 9.2.
This 7- {2 '- [4 "- (aminomethyl) phenyl] - acetamido) -3-methyl-3-cephem-4-carboxylic acid compound was found to be an effective oral antibiotic in a test on mice if it was administered twice as described above administered to a group of mice.
The ED50 value is 31.2 mg / kg body weight compared to an LDs0 value of 3250 mg / kg. In agar dilution tests against various bacteria, this compound has 48 hour MIC values of less than 6.25 micrograms / ml against Streptococcus faecalis and less than 6.25 micrograms / ml against Escherichia coli # 2. The compound has MIC values against 4 different clinical isolates of penicillin-resistant Staphylococcus aureus from 5 to 8 microgram / ml (.ug / ml) in the absence of human blood serum and from 5 to 11 micrograms / ml in the presence of human blood serum.