Verfahren zur Herstellung von Tylosin mit erhöhter Ausbeute durch Fermentation von Mikroorganismen Die Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Ver fahren zur Herstellung von Tylosin. Die Erfindung be trifft ein Verfahren zur Erzielung verbesserter Ausbeu ten an Tylosin, wobei dem Fermentationsmedium, in dem das Antibiotikum erzeugt wird, bestimmte chemi sche Stoffe zugesetzt werden, die die Erzeugung des ge wünschten Antibiotikums fördern.
überraschenderweise wurde gefunden, dass be stimmte, bei der hydrolytischen Spaltung von Tylosin und verwandten Antibiotika gebildete Abbauprodukte die Ausbeuten des Antibiotikums in einem unerwartet grossen Masse erhöhen, wenn sie dem Fermentations- medium zugesetzt werden. Der Mechanismus, auf Grund dessen diese zugesetzten Substanzen die Erhöhung der Tylosinausbeute bewirken, ist noch nicht bekannt.
Es wurde jedoch gefunden, dass diese erhöhten Ausbeuten offenbar das Ergebnis einer echten Anregung der Tylo- sinbildung und nicht einfach der Umwandlung der zu gesetzten Stoffe in Tylosin sind. Die erzielte Zunahme der gebildeten Tylosinmenge ist in vielen Fällen bis zu lOX grösser als diejenige, die sich aus einer stöchio- metrischen Umwandlung der zugesetzten Abbaupro dukte in das Antibiotikum ergeben würde.
Zu den durch hydrolytische Spaltung von Tylosin erhältlichen Abbauprodukten gehören u. a. Desmycosin, O-Mycaminosyltylonolid, Mycarose, Mycaminose und Mycinose.
O-Mycaminosyltylonolid, das im folgenden als OMT bezeichnet wird, und Desmycosin sind selbst antibak teriell wirksame Substanzen. Mycinose, Mycarose und Mycaminose sind Zuckerderivate; die zuletzt genannte Substanz ist ein basischer Aminozucker.
Alle oben genannten Tylosinabbauprodukte regen, wenn sie dem Fermentationsmedium zugesetzt werden, die Tylosinbildung in gewissem Umfang an, Desmycosin und OMT sind jedoch die besonders bevorzugten Sti- mulantien. Die Abbauprodukte können in gereinigtem Zustand zugesetzt werden,
doch kann man - falls er wünscht - auch rohe Zubereitungen mit befriedigenden Ergebnissen verwenden. Das rohe Tylosinhydrolysat kann durch Erwärmen einer wässrigen Lösung von Ty- losin oder eines Säureadditionssalzes von Tylosin bei einem pH-Wert von etwa 2, Waschen der Reaktions mischung mit einem damit nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, zum Beispiel Chlororform, und Einen gen der gewaschenen wässrigen Phase zur Trockne her gestellt werden.
Die entsprechenden Abbauprodukte des Dihydro- tylosins, das im allgemeinen bei der Fermentation neben Tylosin gebildet wird, wirken gleichfalls anregend auf die Tylosinbildung. Diese Abbauprodukte sind Dihydro- desmycosin und Dibydro-OMT sowie die oben genann ten Zucker.
Erfindungsgemäss besteht das Verfahren zur Her stellung von Tylosin mit erhöhter Ausbeute durch Fer mentation eines Nährmediums mittels des Mikroorganis mus Streptomyces fradiae NT2RL 2702 oder NRRL 2703 darin, dass man dem Fermentationsmedium 50 bis<B>1500</B> mcg/ml eines Tylosinhydrolysats oder Dihydro- tylosinhydrolysats zusetzt.
Die im Fermentationsmedium zur Erhöhung der Tylosinausbeute verwendete Konzentration der Abbau produkte kann von etwa 50 bis 1500 mcg/ml betragen. Bei Zusatzmengen von bis zu etwa 500 mcg/ml haben Erhöhungen der Menge des Zusatzes proportionale Steigerungen der Tylosinausbeute zur Folge.
Bei Kon zentrationen von über etwa 500 mcg/ml steigt dagegen die gebildete Tylosinmenge nicht proportional mit der eingesetzten Menge des Zusatzes an, und bei sehr hohen Zusätzen ist die gebildete Tylosinmenge geringer als bei Verwendung optimaler Konzentrationen des Zusatzstof fes. Jedoch ist selbst bei diesen hohen Konzentrationen die gebildete Tylosinmenge grösser, als sie in Abwesen- heit des Zusatzstoffes erhalten wird.
Eine optimale Ty- losinerzeugung erfolgt offenbar dann, wenn Zusatzstoff konzentrationen von etwa 100 bis 200 mcg@'ml verwen det werden, weshalb solche Konzentrationen bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemässen Ver fahrens bevorzugt sind.
Der Zeitpunkt, zu welchem der Zusatzstoff in das Fermentationsmedium eingeführt wird, kann innerhalb weiter Grenzen schwanken. Die Tylosinausbeuten, die bei Zugabe des Abbauproduktes zu Beginn der Fermen tation erhalten werden, sind ungefähr den Ausbeuten gleichwertig, die man erhält, wenn der Zusatz etwa 20 bis 24 Stunden nach Beginn der Fermentation erfolgt. Die erzielbaren Höchstausbeuten an Tylosin fallen je doch wieder ab, wenn der Zusatzstoff erst 48 Stunden nach der Beimpfung eingeführt wird, und noch später vorgenommene Zusätze führen zu einer zunehmend ge ringer werdenden Anregung.
Die ersten Anzeichen der Anregung der Tylosiner- zeugung treten nach etwa 48-stündiger Fermentation auf. Mit fortschreitender Fermentation wird die Anre gung immer ausgeprägter. Bei Verwendung des Zusatzes in oder nahe bei der bevorzugten Konzentration von etwa 100 bis 200 meg;'ml kann seine Gegenwart im Fer- mentationsmedium während etwa der ersten 48 Stun den der Fermentation nachgewiesen werden. Nach Fort führung der Fermentation bis etwa 72 Stunden oder mehr sind jedoch keine nachweisbaren Mengen mehr vorhanden.
Bei Konzentrationen oberhalb des bevor zugten Bereichs und insbesondere bei Konzentrationen über etwa 500 mcglml verbleiben geringe Mengen unver änderten Zusatzstoffs während der gesamten Fermenta- tionsdauer in dem Medium.
Die beobachtete Anregung der Tylosinsyntliese tritt in einer grossen Anzahl verschiedener Fermentationsme- dien auf. Im allgemeinen sprechen die Medien, mit de nen ohne Anregung höhere Ausbeuten an Tylosin er halten werden, auch in grösserem Masse auf die Gegen wart des Ausbeute steigernden Zusatzes an. Je nach dem verwendeten Fermentationsmedium wurden Erhö hungen der Tylosinausbeute um etwa 10 bis 40 0,'o gegenüber Vergleichsfermentationen ohne stimulieren den Zusatz beobachtet.
Der Zusatz der Abbauprodukte bewirkt die gleiche Erhöhung der Tylosinbildung unabhängig davon, ob die Fermentation in Schüttelkolben oder in einer Rührvor- richtung durchgeführt wird. Darüber hinaus werden offenbar die Verhältnisse der Mengen der während der Fermentation gebildeten Tylosinarten durch Zugabe eines der Zusatzstoffe nicht erheblich beeinflusst.
So ist beispielsweise das Verhältnis des bei einer Fermentation gebildeten Tylosins und Dehydrotylosins praktisch un abhängig davon, ob die Fermentation nach dem bisher bekannten Verfahren oder aber nach dem verbesserten Verfahren der Erfindung unter Verwendung eines die Erzeugung stimulierenden Mittels durchgeführt wird.
Bei der praktischen Durchführung des erfindungs- gemässen Verfahrens ist praktisch keine Änderung des herkömmlichen Fermentationsverfahrens zur Erzeugung von Tylosin in Abwesenheit von Ausbeute erhöhenden Zusatzstoffen erforderlich. So können beispielsweise die in den einzelnen Stufen des Fermentationsverfahrens verwendeten Medien mit den bisher verwendeten mit Ausnahme des Zusatzes des Abbauproduktes zu dem Produktionsmedium identisch sein.
Sporensuspensionen der Tylosin erzeugenden Organismen Streptomyces fra- diae NRRL 2702 oder NRRL 2703 werden in der übli chen Weise aus Schrägagarkulturen zubereitet. Mit den Sporensuspensionen werden dann zunächst vegetative Kulturen hergestellt, die dann zum Beimpfen des für die Antibiotikumerzeugung eingesetzten Fermentations- mediums verwendet werden.
Wird das Abbauprodukt in Konzentrationen von unter etwa 500 mcglml verwen det, dann ist am Ende der Fermentation keiner der Zu satzstoffe in der Maische mehr zugegen, weshalb die Isolierung und Reinigung des Tylosins durch die hier für bekannte Arbeitsweise erfolgen kann.
Zur Bestimmung der Wirkung eines Zusatzes auf die Tylosinerzeugung ist es gewöhnlich nicht nötig, das kristalline Antibiotikum in reiner Form zu isolieren. Der Verlauf der Fermentation und die Wirkung des Zu satzes auf die Tylosinausbeuten lassen sich sehr einfach ermitteln,
indem man die auf einen pH-Wert von 5 ein gestellte Fermentationsmaische mit Chloroform extra hiert und den Tylosingehalt des Extraktes spektrophoto- metrisch durch Messen der Absorption des Chloroform extraktes bei 283 mii bestimmt und die erhaltenen Werte mit denen von Standardlösungen vergleicht. Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse stehen in sehr guter Übereinstimmung mit denen, die durch Isolierung des Antibiotikums erhalten werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens. <I>Herstellung von</I> OMT <I>A. Rohes</I> OMT Eine wässrige Lösung von Tylosin in Form der freien Base oder eines Säureadditionssalzes wurde durch Zugabe von i-lineralsäure auf pH 2 eingestellt. Die Säurelösung wurde auf einem Dampfbad etwa 100 Stunden lang erwärmt, abgekühlt und zur Entfernung gefärbter Stoffe mit Chloroform gewaschen.
Die wäss- rige Phase wurde zur Trockne eingedampft und lieferte ein rohes ONIT-Präparat mit einem 0i,IT-Gehalt von etwa 25 bis 30 Gew.-0!o. <I>B. Gereinigtes</I> OMT Die im vorstehenden Absatz A beschriebene Ar beitsweise wurde bis einschliesslich des Waschens mit Chloroform wiederholt. Die wässrige Phase wurde durch Zugabe einer wässrigen Base auf pH 5 eingestellt und wiederum mit Chloroform gewaschen, um etwa vor handenes Desmycosin zu entfernen.
Der pH-Wert der wässrigen Schicht wurde durch Zugabe einer Base auf PH 9 eingestellt, und die basische Lösung wurde mit Chloroform extrahiert. Die das OMT enthaltende Chlo- roformschicht wurde im Vakuum zur Trockne einge dampft. Die weitere Reinigung des ONIT wurde durch Chromatographieren einer Chloroformlösung an einer Säule mit Aluminiumoxyd bewirkt.
<I>Beispiel l</I> Eine Sporensuspension von Streptomyces fradiae NRRL 2702 wurde in üblicher Weise aus einer bei 4 C gehaltenen Schrägkultur des Mikroorganismus auf Limabohnenagar hergestellt. 5 ml der Sporensuspension wurden zum Impfen von 800 ml eines vegetativen Me diums in einem 2 Liter-Erlenmeyerkolben verwendet.
Das vegetative Medium enthielt 1,5 % Cerelose, 0,5 0/0 Maisquellwasserfeststoffe, 0,5 % Hefe und 0,3 % Cal- ciumcarbonat in destilliertem Wasser.
Das beimpfte ve getative Medium wurde bei 28 C 48 Stunden lang inku- biert, wodurch ein Impfmedium erhalten wurde. Dieses Medium wurde zum Beimpfen eines Produktionsme- diums verwendet, das 1,75 % Fischmehl, 2,0 % Rü- benmelasse, 3,0 % rohes Sojabohnenöl, 0,
2 % Calcium- carbonat, 0,04 % Diammoniumphosphat und 0,1 0l0 Natriumchlorid in Wasser enthielt. Das Medium wurde auf eine Reihe von 500 ml Weithalskolben verteilt, in die jeweils 100 ml des Mediums eingeführt wurden, wor auf jeder Kolben mit 5 ml des oben beschriebenen Impf mediums beimpft wurde. Die beimpften Kolben wur den auf Rundschüttelvorrichtungen, die mit 250 U/min.
betrieben wurden, gebracht, und die Fermentation wurde bei 28 C 138 Stunden lang geführt.
Eine Parallelreihe von Kolben mit dem gleichen Produktionsmedium wurde in gleicher Weise beimpft und unter den gleichen Bedingungen inkubiert, wobei jedoch gleichzeitig mit der Beimpfung unterschiedliche Konzentrationen von OMT zugegeben wurden. Die Wir kung der OMT-Konzentration auf die Tylosinausbeute ist aus der folgenden Tabelle I zu ersehen.
EMI0003.0057
<I>Tabelle <SEP> 1</I>
<tb> OMT-Konzentration <SEP> gebildetes <SEP> TyIosin
<tb> meg/ml <SEP> mcg/m1
<tb> 0 <SEP> 4000
<tb> 50 <SEP> 4665
<tb> 100 <SEP> 5340
<tb> 200 <SEP> 5810
<tb> 300 <SEP> 6025
<tb> 500 <SEP> 5985
<tb> 750 <SEP> 6100a
<tb> <B>1000 <SEP> 5810a</B>
<tb> 1500 <SEP> 5580a
<tb> a <SEP> In <SEP> diesen <SEP> Maischen <SEP> war <SEP> nach <SEP> 6tägiger <SEP> Fermentation <SEP> noch <SEP> OMT
<tb> zugegen.
<I>Beispiel 2</I> Die Geschwindigkeit der Tylosinbildung in Gegen wart und Abwesenheit von OMT und die Wirkung un terschiedlicher Zeitpunkte des Zusatzes von OMT auf die gebildete Gesamtmenge an Tylosin wurden in dem folgenden Versuch ermittelt.
Schüttelkolben mit beimpften Produktionsmedien wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, vorbereitet. Es wurden zwei Fermentationsreihen durchgeführt: im er sten Fall allein mit dem beimpften Produktionsmedium und im zweiten Fall mit beimpftem Produktionsmedium, dem 500 mcg/ml OyfT zugesetzt wurden. Soweit nichts anderes angegeben ist, wurde das OMT unmittelbar nach der Beimpfung zugesetzt. Aus den Kolben wurden 6 Tage lang täglich Proben entnommen, um das Fort- schreiten der Fermentation zu verfolgen.
Die Tylosin- ausbeuten sind in Tabelle 1I angegeben:
EMI0003.0073
<I>Tabelle <SEP> 11</I>
<tb> Fermentations- <SEP> beimpftes <SEP> beimpftes <SEP> Produktions dauer <SEP> Produktionsmedium <SEP> medium <SEP> plus <SEP> OMT
<tb> Stunden <SEP> mcg/ml <SEP> mcg/ml
<tb> 24 <SEP> 45 <SEP> 50
<tb> 48 <SEP> 530 <SEP> 655
<tb> 72 <SEP> 1500 <SEP> 2155
<tb> 96 <SEP> 2575 <SEP> 3750
<tb> 120 <SEP> 3345 <SEP> 4680
<tb> 144 <SEP> 4325 <SEP> 5800
<tb> 144 <SEP> 4325 <SEP> 5700a
<tb> 144 <SEP> 4325 <SEP> 4875b
<tb> 144 <SEP> 4325 <SEP> 4650e
<tb> a <SEP> OMT-Zusatz <SEP> 24 <SEP> Stunden <SEP> nach <SEP> Beimpfen
<tb> b <SEP> OMT-Zusatz <SEP> 48 <SEP> Stunden <SEP> nach <SEP> Beimpfen
<tb> c <SEP> OMT-Zusatz <SEP> 72 <SEP> Stunden <SEP> nach <SEP> Beimpfen
<I>Beispiel 3</I> Die Fähigkeit von OMT, die Tylosinerzeugung in Medien unterschiedlicher Zusammensetzung zu stimu lieren, wurde folgendermassen nachgewiesen: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitel mit der Ausnahme, dass die Zusammensetzung des Pro duktionsmediums abgeändert wurde.
Medium I war mit dem nach Beispiel 1 verwendeten identisch.
Medium 11 enthielt 2 % Rübenmelasse, 2 % Hefe- extrakt, 0,5 % Maisquellwasser und 3 % rohes Soja- bohnenöl in Wasser.
Medium III hatte folgende Zusammensetzung:
EMI0003.0097
Dikaliumhydrogenphosphat <SEP> 2,3 <SEP> 0/0
<tb> Natriumchlorid <SEP> 2 <SEP> g/1
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 5 <SEP> g/1
<tb> Ferriammoniumcitrat <SEP> 1 <SEP> g/1
<tb> Zinksulfat-heptahydrat <SEP> 0,01 <SEP> 0/0
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 3 <SEP> %
<tb> Glycin <SEP> 7 <SEP> 0/0
<tb> L-Alanin <SEP> 2 <SEP> %
<tb> L-Valin <SEP> 1 <SEP> 0/0
<tb> Betain <SEP> 5 <SEP> 0/0
<tb> Dextrose <SEP> 3,5 <SEP> %
<tb> Methyloleat <SEP> 2,5 <SEP> % Der pH-Wert des Mediums III wurde vor dem Sterilisieren im Autoklaven auf etwa 7,5 eingestellt.
Die Wirkung von OMT bei verschiedenen Konzen trationen auf die Tylosinausbeuten in den einzelnen oben beschriebenen Fermentationsmedien ergibt sich aus Tabelle III.
EMI0004.0001
Medium <SEP> 1 <SEP> Medium <SEP> II <SEP> Medium <SEP> III
<tb> zugesetztes <SEP> Tylosin- <SEP> Erhöhung <SEP> gegen- <SEP> Tylosin- <SEP> Erhöhung <SEP> gegen- <SEP> Tylosin- <SEP> Erhöhung <SEP> gegen OMT <SEP> Ausbeutea <SEP> über <SEP> Blindversuch <SEP> Ausbeutea <SEP> über <SEP> Blindversuch <SEP> Ausbeutea <SEP> über <SEP> Blindversuch
<tb> mcg/ml <SEP> mcg/ml <SEP> /o <SEP> mcg/ml <SEP> % <SEP> mcg/ml <SEP> a/o
<tb> 0 <SEP> 4360 <SEP> - <SEP> 3395 <SEP> - <SEP> 1870 <SEP> 50 <SEP> 5580 <SEP> 28 <SEP> 3745 <SEP> 9 <SEP> 1895
<SEP> 100 <SEP> 5745 <SEP> 30 <SEP> 3830 <SEP> 13 <SEP> 2125 <SEP> 14
<tb> 200 <SEP> 6030 <SEP> 38 <SEP> 3770 <SEP> 9 <SEP> 2095 <SEP> 12
<tb> a <SEP> unter <SEP> Berücksichtigung <SEP> der <SEP> Umwandlung <SEP> von <SEP> OMT <SEP> in <SEP> Tylosin <SEP> korrigiert <I>Beispiel 4</I> Die Anregung der Tylosinerzeugung durch andere Abbauprodukte von Tylosin wurde mit Hilfe einer Ar beitsweise nachgewiesen, die der in Beispiel 1 beschrie benen entsprach.
Die Wirkung des Zusatzes der ange gebenen Abbauprodukte auf die Tylosinausbeute ergibt sich aus Tabelle IV.
EMI0004.0006
<I>Tabelle <SEP> IV</I>
<tb> zugesetztes <SEP> Abbauprodukt <SEP> zugesetzte <SEP> Menge <SEP> Tylosin-Ausbeutea
<tb> mcg/ml
<tb> keines <SEP> - <SEP> 5990
<tb> OMT <SEP> 50 <SEP> 6525
<tb> Desmycosin <SEP> 50 <SEP> 6630
<tb> Mycinose <SEP> 200b <SEP> 6365
<tb> a <SEP> unter <SEP> Berücksichtigung <SEP> der <SEP> Umwandlung <SEP> von <SEP> OMT <SEP> in <SEP> Tylosin
<tb> korrigiert
<tb> b <SEP> Zusatz <SEP> 48 <SEP> Stunden <SEP> nach <SEP> dem <SEP> Beimpfen <I>Beispiel 5</I> Die Fähigkeit von OMT, die Tylosinerzeugung auch bei Verwendung einer Rührvorrichtung anzuregen,
wurde in einem Reaktionsgefäss aus korrosionsbestän digem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 15 Liter, das mit Rühreinrichtungen versehen war, nachgewie sen. Die Vorrichtung wurde vor der Beschickung 30 Minuten bei 120 C sterilisiert. ES wurde eine dreistu fige Fermentation angewandt.
Ein inkubiertes vegetati ves Impfmedium mit der in Beispiel 1 beschriebenen Zusammensetzung diente zum Beimpfen eines wässri- gen Zwischenstufenmediums, das 0,507o Hefe, 0,51110 Fischmehl, 1 % Maisquellwasser, 0,5 % rohes Soja- bohnenöl und 0,
3 % Calciumcarbonat enthielt. Das Pro- dukt dieser Zwischenstufe wurde dann zum Beimpfen des nach Beispiel 1 verwendeten Endstufenfermenta- tionsmediums verwendet. Die Wirkung auf die Tylosin- ausbeute nach einer 136-stündigen Fermentation bei 28 C ergibt sich aus der Tabelle V.
EMI0004.0036
<I>Tabelle <SEP> V</I>
<tb> zugesetztes <SEP> OMT <SEP> Tylosin-Ausbeute
<tb> mcg/ml <SEP> mcg/ml
<tb> keines <SEP> 3670
<tb> 50 <SEP> 4310
<tb> 100 <SEP> 3930
<tb> 100a <SEP> 4635.
<tb> a <SEP> OMT <SEP> wurde <SEP> 22 <SEP> Stunden <SEP> nach <SEP> der <SEP> Beimpfung <SEP> zugesetzt <I>Beispiel 6</I> Die Wirkung von Dihydro-OMT auf die Tylosin- ausbeute wurde nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise bestimmt. Am Ende der Fermentation war in der Maische kein Dihydro-OMT nachweisbar.
Die erzielte Wirkung ergibt sich aus der Tabelle VI.
EMI0004.0043
<I>Tabelle <SEP> V1</I>
<tb> Dihydro-OMT-Konzentration <SEP> gebildetes <SEP> Tylosin
<tb> mcg/ml <SEP> mcg/ml
<tb> 0 <SEP> 4960
<tb> 25 <SEP> 5100
<tb> 100 <SEP> 5410
<tb> 150 <SEP> 5660
<tb> 200 <SEP> 5450
Process for the production of tylosin with increased yield by fermentation of microorganisms The invention relates to an improved method for the production of tylosin. The invention be concerned with a method for achieving improved yields of tylosin, the fermentation medium in which the antibiotic is produced, certain chemical substances are added which promote the production of the desired antibiotic.
It has surprisingly been found that certain degradation products formed in the hydrolytic cleavage of tylosin and related antibiotics increase the yields of the antibiotic to an unexpectedly large extent when they are added to the fermentation medium. The mechanism by which these added substances cause the tylosin yield to be increased is not yet known.
It has been found, however, that these increased yields are evidently the result of a real stimulation of the formation of tylosin and not simply the conversion of the substances to be set into tylosin. The increase achieved in the amount of tylosin formed is in many cases up to 10X greater than that which would result from a stoichiometric conversion of the added degradation products into the antibiotic.
The degradation products obtainable by hydrolytic cleavage of tylosin include u. a. Desmycosin, O-mycaminosyltylonolide, mycarose, mycaminose and mycinosis.
O-Mycaminosyltylonolide, hereinafter referred to as OMT, and desmycosin are themselves antibacterial substances. Mycinose, mycarose and mycaminose are sugar derivatives; the last mentioned substance is a basic amino sugar.
All of the above-mentioned tylosin degradation products, when added to the fermentation medium, stimulate tylosin formation to a certain extent, but desmycosin and OMT are the particularly preferred stimulants. The degradation products can be added in a purified state,
but you can - if you wish - also use raw preparations with satisfactory results. The crude tylosin hydrolyzate can be prepared by heating an aqueous solution of tylosin or an acid addition salt of tylosin at a pH of about 2, washing the reaction mixture with an immiscible organic solvent, for example chloroform, and concentrating the washed aqueous phase to be made to dryness.
The corresponding degradation products of dihydro- tylosin, which is generally formed in addition to tylosin during fermentation, also have a stimulating effect on tylosin formation. These breakdown products are dihydro- desmycosin and dibydro-OMT as well as the sugars mentioned above.
According to the invention, the method for the manufacture of tylosin with increased yield by fermentation of a nutrient medium by means of the microorganism Streptomyces fradiae NT2RL 2702 or NRRL 2703 consists in adding 50 to 1500 mcg / ml of a tylosin hydrolyzate to the fermentation medium Dihydro- tylosinhydrolyzats added.
The concentration of the degradation products used in the fermentation medium to increase the tylosin yield can be from about 50 to 1500 mcg / ml. With additions of up to about 500 mcg / ml, increases in the amount of additive result in proportional increases in the tylosin yield.
At concentrations above about 500 mcg / ml, on the other hand, the amount of tylosin formed does not increase proportionally with the amount of additive used, and with very high additions the amount of tylosin formed is less than when using optimal concentrations of the additive. However, even at these high concentrations, the amount of tylosin formed is greater than that obtained in the absence of the additive.
Optimal tylosin production obviously takes place when additive concentrations of about 100 to 200 mcg @ 'ml are used, which is why such concentrations are preferred in the practical implementation of the method according to the invention.
The point in time at which the additive is introduced into the fermentation medium can vary within wide limits. The tylosin yields that are obtained when the degradation product is added at the beginning of the fermentation are approximately equivalent to the yields that are obtained when the addition is made about 20 to 24 hours after the start of the fermentation. The maximum yields of tylosin that can be achieved, however, fall again if the additive is only introduced 48 hours after inoculation, and additions made later lead to increasingly less stimulation.
The first signs of stimulation of tylosin production appear after about 48 hours of fermentation. As the fermentation progresses, the stimulation becomes more and more pronounced. When the additive is used at or near the preferred concentration of about 100 to 200 mcg, its presence in the fermentation medium can be detected during about the first 48 hours of fermentation. After the fermentation has continued for up to about 72 hours or more, however, there are no longer any detectable amounts.
At concentrations above the preferred range and in particular at concentrations above about 500 mcglml, small amounts of unchanged additive remain in the medium during the entire fermentation period.
The observed stimulation of the tylosin synthetics occurs in a large number of different fermentation media. In general, the media with which higher yields of tylosin are obtained without stimulation also respond to a greater extent to the presence of the additive which increases the yield. Depending on the fermentation medium used, increases in the tylosin yield by about 10 to 40 0, 'o compared to comparison fermentations without stimulating the addition were observed.
The addition of the degradation products causes the same increase in tylosin formation regardless of whether the fermentation is carried out in shake flasks or in a stirrer. In addition, the proportions of the amounts of the types of tylosin formed during fermentation are apparently not significantly influenced by adding one of the additives.
For example, the ratio of the tylosin and dehydrotylosin formed during fermentation is practically independent of whether the fermentation is carried out according to the previously known method or according to the improved method of the invention using an agent which stimulates production.
When the process according to the invention is carried out in practice, practically no change to the conventional fermentation process for producing tylosin in the absence of yield-increasing additives is necessary. For example, the media used in the individual stages of the fermentation process can be identical to those previously used with the exception of the addition of the degradation product to the production medium.
Spore suspensions of the tylosin-producing organisms Streptomyces fradiae NRRL 2702 or NRRL 2703 are prepared in the usual way from agar slant cultures. The spore suspensions are then used to first produce vegetative cultures, which are then used to inoculate the fermentation medium used to produce antibiotics.
If the degradation product is used in concentrations of less than about 500 mcglml, then none of the additives are present in the mash at the end of the fermentation, which is why the isolation and purification of the tylosin can be carried out using the method known here.
To determine the effect of an additive on tylosin production, it is usually not necessary to isolate the crystalline antibiotic in its pure form. The course of the fermentation and the effect of the additive on the tylosin yields can be determined very easily,
by extracting the fermentation mash, which has been adjusted to a pH value of 5, with chloroform and determining the tylosin content of the extract spectrophotometrically by measuring the absorption of the chloroform extract at 283 ml and comparing the values obtained with those of standard solutions. The results obtained in this way are in very good agreement with those obtained by isolating the antibiotic.
The following examples explain the implementation of the process according to the invention. <I> Manufacture of </I> OMT <I> A. Crude OMT An aqueous solution of tylosin in the form of the free base or an acid addition salt was adjusted to pH 2 by adding i-lineral acid. The acid solution was heated on a steam bath for about 100 hours, cooled, and washed with chloroform to remove colored matter.
The aqueous phase was evaporated to dryness and yielded a crude ONIT preparation with an IT content of about 25 to 30% by weight. <I> B. Purified OMT The procedure described in paragraph A above was repeated up to and including washing with chloroform. The aqueous phase was adjusted to pH 5 by adding an aqueous base and washed again with chloroform in order to remove any desmycosin present.
The pH of the aqueous layer was adjusted to pH 9 by adding a base, and the basic solution was extracted with chloroform. The chloroform layer containing the OMT was evaporated to dryness in vacuo. The ONIT was further purified by chromatography of a chloroform solution on a column with aluminum oxide.
<I> Example 1 </I> A spore suspension of Streptomyces fradiae NRRL 2702 was prepared in the usual way from a slant culture of the microorganism kept at 4 ° C. on lima bean agar. 5 ml of the spore suspension was used to inoculate 800 ml of a vegetative medium in a 2 liter Erlenmeyer flask.
The vegetative medium contained 1.5% cerelose, 0.5% corn steeple solids, 0.5% yeast, and 0.3% calcium carbonate in distilled water.
The inoculated vegetative medium was incubated at 28 ° C. for 48 hours, whereby an inoculation medium was obtained. This medium was used to inoculate a production medium containing 1.75% fish meal, 2.0% beet molasses, 3.0% crude soybean oil, 0,
2% calcium carbonate, 0.04% diammonium phosphate and 0.1 0l0 sodium chloride in water. The medium was divided into a series of 500 ml wide-necked flasks, into each of which 100 ml of the medium was introduced, and each flask was inoculated with 5 ml of the inoculation medium described above. The inoculated flasks were placed on rotary shakers running at 250 rpm.
were operated, and the fermentation was carried out at 28 C for 138 hours.
A parallel row of flasks with the same production medium was inoculated in the same way and incubated under the same conditions, but different concentrations of OMT were added at the same time as the inoculation. The effect of the OMT concentration on the tylosin yield can be seen from Table I below.
EMI0003.0057
<I> Table <SEP> 1 </I>
<tb> OMT concentration <SEP> <SEP> TyIosin formed
<tb> meg / ml <SEP> mcg / m1
<tb> 0 <SEP> 4000
<tb> 50 <SEP> 4665
<tb> 100 <SEP> 5340
<tb> 200 <SEP> 5810
<tb> 300 <SEP> 6025
<tb> 500 <SEP> 5985
<tb> 750 <SEP> 6100a
<tb> <B> 1000 <SEP> 5810a </B>
<tb> 1500 <SEP> 5580a
<tb> a <SEP> In <SEP> these <SEP> mashes <SEP> <SEP> was <SEP> OMT after <SEP> 6 days of <SEP> fermentation <SEP>
<tb> present.
<I> Example 2 </I> The rate of tylosin formation in the presence and absence of OMT and the effect of different points in time of the addition of OMT on the total amount of tylosin formed were determined in the following experiment.
Shake flasks with inoculated production media were prepared as described in Example 1. Two fermentation series were carried out: in the first case with the inoculated production medium alone and in the second case with inoculated production medium to which 500 mcg / ml OyfT were added. Unless otherwise stated, the OMT was added immediately after inoculation. Samples were taken from the flasks daily for 6 days to monitor the progress of the fermentation.
The tylosin yields are given in Table 1I:
EMI0003.0073
<I> Table <SEP> 11 </I>
<tb> Fermentation <SEP> inoculated <SEP> inoculated <SEP> production time <SEP> production medium <SEP> medium <SEP> plus <SEP> OMT
<tb> hours <SEP> mcg / ml <SEP> mcg / ml
<tb> 24 <SEP> 45 <SEP> 50
<tb> 48 <SEP> 530 <SEP> 655
<tb> 72 <SEP> 1500 <SEP> 2155
<tb> 96 <SEP> 2575 <SEP> 3750
<tb> 120 <SEP> 3345 <SEP> 4680
<tb> 144 <SEP> 4325 <SEP> 5800
<tb> 144 <SEP> 4325 <SEP> 5700a
<tb> 144 <SEP> 4325 <SEP> 4875b
<tb> 144 <SEP> 4325 <SEP> 4650e
<tb> a <SEP> OMT addition <SEP> 24 <SEP> hours <SEP> after <SEP> inoculation
<tb> b <SEP> OMT addition <SEP> 48 <SEP> hours <SEP> after <SEP> inoculation
<tb> c <SEP> OMT addition <SEP> 72 <SEP> hours <SEP> after <SEP> inoculation
<I> Example 3 </I> The ability of OMT to stimulate tylosin production in media of different composition was demonstrated as follows: It was worked as described in Example 1 with the exception that the composition of the production medium was changed.
Medium I was identical to that used in Example 1.
Medium 11 contained 2% beet molasses, 2% yeast extract, 0.5% corn steep liquor, and 3% crude soybean oil in water.
Medium III had the following composition:
EMI0003.0097
Dipotassium hydrogen phosphate <SEP> 2,3 <SEP> 0/0
<tb> sodium chloride <SEP> 2 <SEP> g / 1
<tb> Magnesium sulfate <SEP> 5 <SEP> g / 1
<tb> Ferriammonium citrate <SEP> 1 <SEP> g / 1
<tb> Zinc sulphate heptahydrate <SEP> 0.01 <SEP> 0/0
<tb> calcium carbonate <SEP> 3 <SEP>%
<tb> Glycine <SEP> 7 <SEP> 0/0
<tb> L-alanine <SEP> 2 <SEP>%
<tb> L-valine <SEP> 1 <SEP> 0/0
<tb> Betaine <SEP> 5 <SEP> 0/0
<tb> Dextrose <SEP> 3.5 <SEP>%
<tb> methyl oleate <SEP> 2.5 <SEP>% The pH of medium III was adjusted to about 7.5 in the autoclave before sterilization.
The effect of OMT at different concentrations on the tylosin yields in the individual fermentation media described above is shown in Table III.
EMI0004.0001
Medium <SEP> 1 <SEP> Medium <SEP> II <SEP> Medium <SEP> III
<tb> added <SEP> tylosin- <SEP> increase <SEP> against- <SEP> tylosin- <SEP> increase <SEP> against- <SEP> tylosin- <SEP> increase <SEP> against OMT <SEP> yield a <SEP> via <SEP> blind test <SEP> yielda <SEP> via <SEP> blind test <SEP> yielda <SEP> via <SEP> blind test
<tb> mcg / ml <SEP> mcg / ml <SEP> / o <SEP> mcg / ml <SEP>% <SEP> mcg / ml <SEP> a / o
<tb> 0 <SEP> 4360 <SEP> - <SEP> 3395 <SEP> - <SEP> 1870 <SEP> 50 <SEP> 5580 <SEP> 28 <SEP> 3745 <SEP> 9 <SEP> 1895
<SEP> 100 <SEP> 5745 <SEP> 30 <SEP> 3830 <SEP> 13 <SEP> 2125 <SEP> 14
<tb> 200 <SEP> 6030 <SEP> 38 <SEP> 3770 <SEP> 9 <SEP> 2095 <SEP> 12
<tb> a <SEP> under <SEP> consideration <SEP> the <SEP> conversion <SEP> from <SEP> OMT <SEP> to <SEP> tylosin <SEP> corrects <I> example 4 </I> the Stimulation of the production of tylosin by other degradation products of tylosin was demonstrated with the aid of a working procedure which corresponded to that described in Example 1.
The effect of adding the specified degradation products on the tylosin yield is shown in Table IV.
EMI0004.0006
<I> Table <SEP> IV </I>
<tb> added <SEP> degradation product <SEP> added <SEP> amount <SEP> tylosin yield a
<tb> mcg / ml
<tb> none <SEP> - <SEP> 5990
<tb> OMT <SEP> 50 <SEP> 6525
<tb> Desmycosin <SEP> 50 <SEP> 6630
<tb> Mycinosis <SEP> 200b <SEP> 6365
<tb> a <SEP> under <SEP> considering <SEP> the <SEP> conversion <SEP> from <SEP> OMT <SEP> to <SEP> tylosin
<tb> corrected
<tb> b <SEP> Addition <SEP> 48 <SEP> hours <SEP> after <SEP> the <SEP> inoculation <I> Example 5 </I> The ability of OMT to stimulate the generation of tylosin even when a stirring device is used ,
was proven in a reaction vessel made of corrosion-resistant steel with a capacity of 15 liters, which was provided with stirrers. The device was sterilized at 120 ° C for 30 minutes before loading. A three-stage fermentation was used.
An incubated vegetative inoculation medium with the composition described in Example 1 was used to inoculate an aqueous intermediate medium containing 0.507o yeast, 0.51110 fish meal, 1% corn steep liquor, 0.5% raw soybean oil and 0,
Contained 3% calcium carbonate. The product of this intermediate stage was then used for inoculating the final fermentation medium used according to Example 1. The effect on the tylosin yield after a 136-hour fermentation at 28 C is shown in Table V.
EMI0004.0036
<I> Table <SEP> V </I>
<tb> added <SEP> OMT <SEP> tylosin yield
<tb> mcg / ml <SEP> mcg / ml
<tb> none <SEP> 3670
<tb> 50 <SEP> 4310
<tb> 100 <SEP> 3930
<tb> 100a <SEP> 4635.
<tb> a <SEP> OMT <SEP> was added <SEP> 22 <SEP> hours <SEP> after <SEP> the <SEP> inoculation <SEP> <I> Example 6 </I> The effect of dihydro- OMT on the tylosin yield was determined according to the procedure described in Example 1. At the end of the fermentation no dihydro-OMT was detectable in the mash.
The effect achieved is shown in Table VI.
EMI0004.0043
<I> Table <SEP> V1 </I>
<tb> Dihydro-OMT concentration <SEP> <SEP> tylosin formed
<tb> mcg / ml <SEP> mcg / ml
<tb> 0 <SEP> 4960
<tb> 25 <SEP> 5100
<tb> 100 <SEP> 5410
<tb> 150 <SEP> 5660
<tb> 200 <SEP> 5450