Verfahren zur Gewinnung eines Antibiotikums
Die Erfindung betrifft die Herstellung einer neuen, als Coumermycin bezeichneten Substanz. Coumermycin hemmt das Wachstum grampositiver Bakterien. Es ist ungiftig und zeigt eine therapeutische Wirkung gegen über mit grampositiven Bakterien infizierten Mäusen.
Coumermycin ist gleichfalls bei der Behandlung von Infektionen bei Menschen, die durch grampositive Bakterien hervorgerufen wurden wie beispielsweise Pneumo- nie, wertvoll. Coumermycin wurde auch als Antibioti- kum Bu 620 bezeichnet.
Gemäss dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein antibiotischer Wirkstoff erhalten, der das Wachstum grampositiver Bakterien hemmt und aus einer sauren Substanz, dem Coumermycin, besteht, das sich leicht in Aceton, Dioxan und alkalischem Wasser löst, das mässig in Athanol, Butanol, Athylacetat, Butylacetat und Methylisobutylketon, wenig löslich in Benzol, Methanol und Chloroform und unlöslich in Tetrachlorkohlenstoff, Petroläther und angesäuertem Wasser ist, das ferner positive Fehling-und Molisch-Reaktionen ergibt, Brom entfärbt, negative Ninhydrin-, Tollensund Anthronreaktionen ergibt, in gereinigter Form bei 222-224 C schmilzt und [a] D20 = -134 (C = 1, 0, Aceton) aufweist,
ein ultraviolettes Absorptionsspektrum in Athanol mit einem Maximum bei 275 m, u (E 1 cm 1% = 595) und bei 335 mat (E= 498) besitzt, in n/10 HCI Maxima bei 275 m (E1cm 1% = 287) und 345 mu.
(E IL/o = 277) und in n/10 NaOH ein Maximum bei 280 m, (E 766), hat, ein Neutralisationsäquiva- lent von 548 aufweist und folgende durchschnittliche Elementaranalyse ergibt : C 59, 1 % ; H 5, 35 % ; N 5, 90% und O (als Differenz) 29, 65 % ; beim Einschliessen in Kaliumbromid zeigt die Substanz eine charakteristische Absorption im Infrarotgebiet, wie in Fig. 1 gezeigt ist.
In bezug auf die Zeichnungen ist Fig. 1 eine Kurve des Infrarot-Absorptionsspektrums der freien Coumermycinsäure in Kaliumbromid.
Fig. 2 ist eine Kurve des Ultraviolett-Absorptions- spektrums des Coumermycins in einer Athanol'Tösung, in 0, 1n HCI und in 0, ln NaOH.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Gewinnung einer antibiotischen Substanz, die als Coumermycin bezeichnet wird, ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Stamm des Streptomyces rishiriensis in einem wässrigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle und ein stick stoffhaltiges Nährmittel enthält, unter submersen aeroben Bedingungen gezüchtet wird, bis eine wesentliche Wirksamkeit gegenüber grampositiven Bakterien in der Lösung vorhanden ist, worauf das Coumermycin aus der Lösung abgeschieden wird.
Der das Antibiotikum erzeugende Organismus wurde aus einer Bodenprobe in Rishiri Island, Hokkaido, Japan, isoliert und ist eine neue Art der Streptomyces, die als Streptomyces rishiriensis bezeichnet wird. Eine Kultur des lebenden Organismus mit der Laboratoriumsbezeichnung 404 Y 3 und A 9795 wurde in der American Type Culture Collection, Washington, D. C. hinterlegt und der dortigen Sammlung von Mikroorga- nismen A. T. C. C. 14812 zugefügt.
Der Stamm Nr. 404 Y 3 des S. rishiriensis hat folgende Merkmale :
Kennzeichen der Kultur
W = Wachstum
L = Luftmycel
P = lösliches Pigment
B = biologische Eigenschaften 1. Czapek's Agar :
W : mässig, gelbgrau bis hell braungrau oder elfenbeinfarbig gelb
L : gering, pulverig, wei#
P : keines
2. Glycerin-Czapek's Agar
W : mässig, gelbgrau oder hell braungrau bis blass gelb mit undeutlichem Braun
L : gering, pulverig, weiss
P : keines oder blassgelb mit undeutlichem Braun 3. Glycerm-AmmoniumsaIz-Agar------
W : mässig, leicht gelbgrau bis gelbweiss
L : kärglich, pulverig, deicht gelbgrau bis hellgrau
P : keines
4.
Glukose-Asparagin-Agar
W : gering, dünm, tanzend, hell gelbgraut@@@@@@@@@@
L. keines .-,-,,."!,/;':Li.u;
5. Stärke-Agar
W: gut, hell, gelbbraun bis elfenbeinfarben
L: mä#ig, pulverig, ausgendehr, undeutlich braun bis hellbraun mit Grau P :keines
B : Hydrolyse ist mässig stark
6. Nährmittel-Agar''T
W: mä#ig, rehbraun
L: gering, pulverig, wei#
P : dunkelbraun < .;-"'
7. Bennett's Agar
W: mä#ig, grauolivbraun bis graubraun L : mä#ig, wei# bis hellbraun oder graubraun
P : gelbbraun
8.
HafermehI-Spyton-Agar.,
W: gut, hellgelb mit undeutlichem Braun
L: mä#ig, wei# bis grau mit undeutlichem Braun
P: hellgelb mit undeutlichem Braun
9. Kartoffelpfropfen .W;-'gut,glänzend,faltige'.Oberfläche.'".
'"'.L:'keaies./'"""/"','.
'P:.PfropDenwirdbraunschwarz'..-....j
10.Gelätinestäb'./L-'-.
10. Gelatinestab W: braunschwarze Kolonie auf der Oberflache
L: keines
P : dünkelbrauir." 'B:negativeVerflüssigung'' 1 Tyrösin-Hefe-GeIatinestab:-',. <
W : braunschwarze Kolonie auf der Oberfläche
L :'keines/."
P : dunkelbraun
B :negative.Verflüssigung-' 1 2. Milch
W : braune Ringbildung
L : keines
P : undeutlich braun.
B : nicht aufgeschlossen 13. Nitrallösung'J
W: wei#e, kugelige Masse an der Oberfläche
B: positive Reduktion zu Nitrit 14. Melanin bildendes Medium
W: gering, dünn, grauschwarz L : kärglich, weiss
P: braungrau bis graubraun
B: Melanin positiv 15. Kartoffel-Dextrose-Agar
W: gut, glänzend, braunschwarz.
L : wei# bis hellrosa bis : hellbraun mit undeutli- chem Grau.
P : grau bis tiefgrau Ausnutzung e-O & tMMssüssn
Xylose ++ Inulin ++
Arabinose ++ Salicin
Glucose++Mannit''i;'"."T'v'
Galactosc++Sorbit"
Fructose++Cdlobiose+
Sorbose @@ Rhanmose ++
Sucrose ++ Natriumcitrat +
Maltose Natriumsuccinat +
Lactose ++ Inosit ++
Raffinose + + Kontrolle .¯t'sWach¯stum¯-¯.¯.-¯-¯¯-¯:¯: + mittleres Wachstum ¯ geringes Wachstum -keinWachstum- .-no'i'.,j;';"ioi:ü
Mycologsche Kenezeichen
Die morphologischen Eigenschaften des Stammes wurden an Stärkeagar und Bennett's Agar festgestellt.
Die mikroskopische Untersuchung des Luftmycels ergab ein verwickeltes und verzweigtes Hyphen, das gelegent lich büschelig war, und Sporenträger, die linksgerich tete Spiralen bildeten. Die elektronenmikroskopische
HatersuchuNgg & b;.eineepti & ekbiarss:valehEorBi;der
SporenL.und/.ins.att & .OberNäche.,:l.:-.n.''.
Der Sfrepformyces 404 Y 3 weist ein braungraues
Luftmycel auf und erzeugt in organischen Medien ein braunes oder dunkelbraunes Pigment. Die gelatine verflüssigung dstsowohl beime Gelatinestab als auch beim
Tyrosin-Hefe-Gelatinestab negathy , und Milch wird nicht aufgeschlossen Aus nitrat wird Nitrit erzeigt, und Stärke wird hydrolysiert Der Stamm 404 Y 3 ähneltdem.n-ftdjr.'.di-f,
S.diastatochromosenes, 'i.;L,t!;!':?ittL.t..'K''!-JnDh.Hti'-:/"!-...(.!....
S, griseoruber
S, olivochromogenes, 'S.''aureus'''.""-'"'' 'bn.''..t..'].'ssi..,m..,ht;.Ji:.J..',.. f u,, d,-J fq
S. griseochromogenes,
S. hawaiensis und dem
S. naganisht in mancher Beziehung, wie der Spiralenbildung, der
Farbe des Luftmycels und des melanoiden Pigments, unterscheidet sich aber in gewissen Kulfur- und physio logischen Eigenschaften wie nachstehend gezeigt wird :''JrssoMüMss;.'L,'-.-..
Nach Waksman und Gurtis sind die Sporenträger gerade, und nach Jensen werden linksgerichtete Spiralen gebildet. Die Farbe des Luftmycles wird als wei# bis aschgrau auf Czapek's Agar und grau auf Glucose Asparagin-Agar beschrieben, Die Verflüssigung am
Gelatinestab verläuft ziemlich schnell. tS'Oss!'.'.....
;'ji, jDieForm;.der.S'pore.n,wird,als.zylindrischbeschrie- bete.Fa.rbe..derKaltttr.istro.tlicnorange,a
Czapek s und hell rötlichorange bis purpurront auf
Stärkeagan Unterschiede wurden auch bei der Aus nutzung der Kohlenstoffquelle, wie Sucrose, Raffinose,
Citrat undSuccinat,.gefunden,
S. olivochromagenes:
Unterschiede wurde in der Farbe der Kultur, dem IpchenPigmetaf:Glucose-Asparagtn-Agarun.ddei'
Verdauung von Gelatine und Milch festgestellt.
S. aureus:
Die Farbe der Kultur ist dunkelbraun auf Czapek's und hellorangefarben auf glucose-Asparagin-Agar. Die Gelatineverflüssigung lä#t spater schnelle nach.
S. griseochromogenes:
Dis Farbe des Luftmycels ist wei# bis leicht grau.
Die Gelatineverflüssigung ist mä#ig Milch wird ohne Koagulation abgebaut. Unterschiede sind auch in der Ausnutzung der Kohlenstoffquellen, wie Rhamnose.
InuhnSicin'CitratundSuccinät,restzustetlen." .-nMM'/H:.
S. naganishi.
Die. Farbe der Kultur auf Stärkeagar ist creme farben mit purpurrot, und das lösliche Pigment auf Stärkeagar ist undeutlich rosa. Gelatine wird mä#ig verflüssig. Milch wird koaguliert und abgebaut. Unterschdss'werden;;.iB.,de.Ausnutzung:deF.Kohlenstoff- quellen, :'wie;:Sa6rQserHnd.Sorbit & stgestellt.
'Mm:;StämNie.Rbher'Produktivität.auszuwählea wurde'derursprünglicheStatnih:ultraviolettbestrahlt und"diiedürehMutationentstandenenStämmeausge- sondert. Einige dieser Stämme gro#er produktivität wurden mycologischt untersucht, wobei jedoch merkliche Unterschiede nicht festgestellt werden konnten; au#er da# einige Stämme mit wei#em Luftinycel erhalten wurden.
Im Hinblick auf die oben genannten Kennzeichen des Stammes wurde der Strepomyces 404 Y 3 als neue Art bestimmt und mit Strepomyces rishiriensis nov. sp. bezeichnet.,
Die hier beschriebene Spezies Streptomyces rishi riensis umfasst alle Coumermycin bildenden Stämme, die nicht.vomStammNr.404Y3Unterschiedenwer- den können, sowie dessen Subkulturen einschlie#lich der Mutationen und Varianten. Die Eigenschaften des
Coumermycins werden hier beschrieben, und nach
Kenntnis dieser Eigenschaften ist es leicht, die Coumer mycin bildenden Stämme von andern zu unterscheiden.
Unter geeigneten Bedingungen gezüchtet, erzeugt der Strepomyces rishiriensis Coumermycin. Eine
CoumermycinenthaltendeFermentationsbrühewird durch'Impf enont-Sporen oder Mycelen'des Coumer- mycin bildenden Organismus in einem geeigneten Me- diunilindanschliessendemZüchtenuntersubmers- aerobehBedingungenhergestellt.DieHerstellungeiner
CöUmBrMycilikultür.iheihem-festenMediumistan sichzwar-mpglich,\dochitdie.Herstellung einer grosse ren'Kultur'nur'in'ememflüssigenMediumwirtschaft- lich.'Daher'wird hier hur die tztgenannte Herstel- lung'be'antsprn.cht.Die'TemperaturderKulturkann sehr schwanken,undzwarbetragtsie am besten20bis
35'C;'vorzagsweise-beträgtsiejedochzwischen26 und30 'Cbei'einemimwesentlichenneutralenpH-
Wert.B & i:"dersübmersenaeroben:
Fermentationdes
Organi ! smus zur Erzeugung von Coumermycin enthält das MediunialsJKahlenstorfquelleeinimHandeL-er-. hältliches Glyceridöl oder Glycerin oder ein Kohlen hydrat, wie glucose, Maltose, Sucrose, Lactose,
Dextrin, Stärke usw. in reinem oder rohem Zustand, und als Quelle für den.'.
Stickstoff eme organische Substanz,"wieSojabohnenmehl,Erdnussmehl,Baum- wollsamenmehl,Fleischextrakt,Peptoh,.Fischmehl;
Heieextrakt,'MaisqüellWasserTisw.'und,falls.erforder- lich, anorganische-Sticlcst6ffquellen, wie-Nitrate und Ammoniumsalze, und Mineralsalze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, und Magnesiumsulfat und Pufferstoffe, wie Calciumearbonat oder -phosphat, und Spuren von Schwermetallsalzen;
diese Bestandteile sind in dem kanadischen Patent Nr. 513 324 in den britischen Patentschriften Nrn. 730 341 und 736 325 und in den USA-Patentschriften Nrn. 2 691 618, 2 658 018, 2 653 899, 2 586 762, 2 516080, 2483892, 2609 329 und 2 709 672aufgeführt.Beiderbelüftetensubmersen Züchtung wird zweckmä#igerwise ein Antischaummit- tel, wie beispielsweise ein flüssiges Paraffin, Fettöl oder ein Silikon, verwendet. Zur Herstellung, von Coumermycin kann mehr als eine Art von Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle oder Antischaummitel verwendet werden. Im allgemeinen wird die Züchtung fortgesetzt, bis sich mindestens mehrere hundert mcgXml Coumermycin im Medium angesammelt haben. In einigen Fällen fällt der pH-Wert der Brühe am Anfang und steigt dann allmählich wieder.
Beispiel 7 TXefürdieHerstellungdesÄntibiotikumsCoomer- mycihgeeignetenFermentationsbedinungenwurden: untersucht, und es wurde folgende Zusammensetzung des Mediums als vorteilhaft festgestellt: 1,5%'lösticheStärke, 2% Baumwollsamenmehl (PharmamediÅa),
0,1% K2HPO4,
0,1% NaCl, .,0,05.MgS07H2Q,
0, 05 % CaCl & -0,00-1%ZiiS04.70und'
0, 2%Hefeextrakte.:
Coumermycin wird in 3 bis 5 Tagen Fermentation unter hinreichender Belüftung und Rühren erzeugt, und woeohl in der Filtratbrühe als auch im Mycel wurde eine Aktivität festgestellt.
Coumermyein wurde gegen über Staphyloeoccus aureus FDA 209 P durch die Pa pierseheiben-öderZylinderplattenmethodegeprüft.
Beispiel--2
Die iesubmerseaerobeFermentationyonS.rishipiensis (Stamm 404 Y 3) in einem Schüttelkolben und einem
6% Starke (Staelipse I), 3% entbitterte. Brauereihefe und 1% CaCO3 enthaltenden Medium ergab 300 bis
400 meg/ml Coumermycin.
Beispiel 3 -Die. submierse aerobe Fermentation von S. rishiriensis (Stamm 404 Y 3) in einem Schüttelkolben und einem
6% Stärke (Staelipse I), 3% Baumwollsamenmehl (Pharmamedia), 2,5% Destillers solubles und 1%
CaC, enthaltenden.Mediumei-gab150-200mcg/mt Cbümermycm.'
Beispiel 4
Die submerse aerobe Fermentation von S. rishiriensis (Stamm 404 Y 3) in einem Schüttelkolben und einem
1% Sojabohnemehl, 2% Baumwollsamenmehl (Pharma media), 2% lösliche Stärke; 0,5 % Glycerin, 0,2% Hefe extrakte, 0,2% K2HPO4, 0,1% MgSO4, 1% CaCO3 und
0,05% Silikon als Anti-Schaummittel enthaltenden Me dium ergab bei einem pH-Wert von 7 Coumermyein wie folgt :
Zeit pH-Wert Wirksamkeit in mcg/ml
5 Tage 7, 8 70
6 Tage 8, 1 80
7 Tage 8, 3 120
Beispiel 5
Zusammensetzung des Mediums
Sojabohnenmehl 2, 0%
Glycerin 1, 5% %
Hefeextrakt 0, 2 %
Kaliumphosphat, dibasisch 0, 1 %
Natriumchlorid 0, 1 %
Calciumchlorid 0, 05 %
Magnesiumsulfat 0, 05 %
Zinksulfat 0, 001 % pH-Wert 7, 0
Ein die obigen Bestandteile aufweisendes Kulturmedium (100 ml) wurde in einem Kolben mit 500 ml Inhalt sterilisiert, mit einer Kultur von Streptomyces rishiriensis, Stamm 404Y 3,
angeimpftund bei 27 1 C 6 Tage unter Schütteln bebrütet, wobei die Bildung von Coumermycin in der Fermentationsbrühe 150 mcg/ml erreichte.
Beispiel 7
Ein dieselben Substanzen wie in Beispiel 6 enthaltendes Kulturmedium (30 1) wurde in einem 50-1-Tank aus rostfreiem Stahl sterilisiert, mit einer Kultur von Streptomyces rishiriensis geimpft und bei 28 1 C 90 Stunden, bebrütet, wobei die Bildung von Coumermycin in der Fermentationsbrühe 120 mcg/ml erreichte.
Die Fermentationsflüssigkeit (5 1) wurde bei einem pH-Wert von 8, 0 filtriert, das Filtrat auf einen pH-Wert von 6, 0 eingestellt und mit 2 Litern Methylisobutylketon extrahiert. Der Mycelkuchen wurde unter hefti- gem Rühren mit 500 ml Aceton extrahiert und das Extrakt im Vakuum zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft. Das sich ergebende wässrige Konzentrat wurde bei einem pH-Wert von 6, 0 mit 200 ml Methyl- isobutylketon extrahiert.
Die beiden Ketonextrakte wurden vereinigt und mit 500 ml Wasser gewaschen, worauf die Aktivität in 1000 ml kaltes Wasser, das mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 10, 0 eingestellt war, übertragen wurde. Der wässrige Extrakt wurde auf einen pH-Wert von 6, 0 eingestellt und er neut mit 300 ml Athyl'acetat extrahiert, worauf das Konzentrat im Vakuum auf 30 ml eingeengt wurde.
Bei Zusatz von 150 ml Petroläther zu dem Konzentrat bildete sich ein hellbrauner Niederschlag, der aufgenommen, mit wenig Methanol zur Entfernung der Verunreinigungengewaschen und getrocknet wurde, wobei sich 750 mg Coumermycin als Pulver ergaben.
Das so erhaltene Coumermycinpulver (400 mg) wurde in 100 ml Athylacetat gelas und an einer mit 20 g Aluminiumoxyd beschickten, vorher mit Schwefelsäure behandelten Säule absorbiert. Die Säule wurde mit 200 ml Athylacetat gewaschen und mit Methanol eluiert. Das Eluat wurde in Anteilen von 10 ml aufgeteilt, die aktiven Fraktionen vereinigt und im Va kuum zur Trockne eingedampft. Das hellgelbe, feste Coumermycin wurde zweimal aus Methanol umkristalli- siert und ergab 70mgweisses,kristallinesCoumermycin, das bei 218-220 C unter Zersetzung schmolz.
Das Coumermycin wurde weiter nach der Methode e von Craig der Gegenstromverteilung unter Verwen- dung von einem Lösungsmittelsystem aus fünf Teilen (Volumteils) Tetrachlorkohlenstoff, einem Teil Chloro- form, fünf Toiles Methanol und einem Teil Wasser gereinigt. Nach 50 Dbertragungen wurde die Spitzenr konzentration durch die biologische Kurve, die UV Kurve und die Gewichtskurve in Rohr 26 gefunden ; diese Kurven stimmen mit der theoretischen Kurve überein. Die Gefriertrocknung von 10 Röhren um die Spitze ergab reines Coumermycin.
Coumermycin wurde auch durch Umkristallisieren aus wässrigem Aceton und anschliessend aus absolutem Methanol gereinigt, wobei eine bei 220 C unter Zersetzung schmelzende Substanz erhalten wurde.
Coumermycin wurde ferner durch Chromatographie an Aluminiumoxyd gereinigt, wobei 39, 7 mg (Wirksamkeit 500 mcg/mg) in Athylacetat gelöst und an 2 g A1203 (pH-Wert 4, 7, behandelt mit H2SO4) absor- biert wurden. Nach Waschen mit Athylacetat wurde die Säule anschliessend mit Methanol und angesäuertem Methanol eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, neutralisiert, im Vakuum eingeengt und dann der Gefriertrocknung unterworfen, wobei 12, 4 mg als hellgelbes Pulver (Wirksamkeit 700 mcg/mg) erhalten wurden.
Das Coumermycin (480 mg) wurde mit einer geringen Menge Aktivkohle in Acetonlösung behandelt und anschliessend aus heissem Athanol umkristallisiert, wobei 230 mg kristallines Coumermycin erhalten wurden, die im Vakuum drei Stunden bei 50 C getrocknet wurden.
Schmelzpunkt 222-224 C (Zers.), pKa. 6, 32 in 75 Aceton ; Titrationsäquivalent 526, 5.
Analyse : Berechnet für C2GH26N2Oso :
C 59, 35 H 4, 98 N 5, 32
Gefunden. : C 59, 1 H 5, 35 N 5, 90
Die Molekulargewichtsbestimmung nach der kryoskopischen Methode in Dioxan ergab einen Wert von 500 + 20. Die spezifische Drehung [a] D betrug -134, 4 (C = 1%, Aceton) im Vergleich zu-69, 6 für Novobiocin unter denselben Bedingungen. Coumermycin ergab eine negative (braun) Anthronreaktion, während Novobiocin eine positive (grün) Reaktion ergab.
Eine Lösung von 100 mg Coumermycin in 120 ml absolutem Athanol wurde mit 0, 25 g Katalysator nach Adams unterAtmosphärendruck vonWasserstoff dreissig Minuten bei Raumtemperatur verrührt. Eine Wasser- stoffaufnahme wurde nicht beobachtet. Nach Entfernung des Katalysators wurden dem Filtrat 35 ml Wasser unter heftigem Rühren zugesetzt. Durch Zufügen von 0, 5 ml einer unnormalen Salzsäure zu der entstandenen Emulsion wurde eine feste, weisse Substanz ausgefällt, die aufgenommen und getrocknet wurde ; das Gewicht betrug 88, 7 mg, und die Papierchromatographie ergab, dass es sich um das ursprüngliche Aus gangsmaterial, das heisst Coumermycin, handelt. Unter denselben Bedingungenergabengemässder papierchromatographischen Analyse (F. I.
Wolf et al., Antibiotics Annual 1956-1957, S. 1035) 1000 mg Novo biocin 946 mg Dihydronovobiocin.
Coumermycin gibt positive Fehling-und Molischreaktionen und entfärbt Brom.
Die Papierstreifen-Chromatographie des Coumermycins lieferte folgende Ergebnisse :
Lösungsmittelsystem Rf-Werte
Wässriges Butanol 0, 15 3%iges wä#riges Ammoniumchlorid 0, 03
75% iges Phenol 0, 95
50%iges Aceton 0, 75 Butanol-Methanol-Wasser(4:1 : 2) + 2%
Methylorange 0, 45 Butanol-Methanol-Wasser (4 : 1 : 2) 0, 40 Benzol-Methanol (4 : 1) 0, 05
Destilliertes Wasser 0, 05 Butanol-Wasser (4 : 1) + 0, 25% p-Toluol isulfonsäure 0, 30 Butanol-Wasser-Essigsäure (2 : 1 : 1) 0, 50
Butanol-Wasser (4 :
1) + 2% Piperidin 0, 25
Coumermycin ist leicht in Aceton, Dioxan und alkalischem Wasser, mässig in Athanol, Butanol, Athyl acetat, Butylacetat und Methylisobutylketon, wenig in
Benzol, Methanol und Chloroform löslich und unlös- lich in Tetrachlorkohlenstoff, Petroläther und ange säuertem Wasser.
Wie in Fig. 2 zu sehen ist, zeigt das Ultraviolett Absorptionsspektrum folgende Maxima : Maxima in Athanol
275 m, (E=595), 335 m, (E}=498) Maxima in n/10 HCl
275 m.(E=287), 345 m, (E=277) Maximum in n/10 NaOH
280 m, u (E z = 766)
Wie aus Fig. 1 zu entnehmen ist, zeigt Coumer mycin in Kaliumbromid charakteristische Infrarot-Ab- sorptionsmaxiima bei folgenden Wellenlängen in Mikron :
2, 99 ; 3, 36 (Schulter) ; 3, 45 ; 5, 88 (Schulter) ; 5, 92 ;
6, 10 ; 6, 24 ; 6, 45 ; 6, 55 ; 6, 7 ; 7, 2 ; 7, 65 ; 7, 85 ; 8, 9 ;
9, 2 ; 9, 6 ;
10, 05 ; 10, 3 ; 10, 6 ; 11, 3 ; 12, 25 ; 12, 65 ; 13, 1 ;
13, 35.
Damit sind Coumermycin und Novobiocin deutlich voneinander verschieden, beispielsweise durch den Schmelzpunkt, die Elementaranalyse,die spezifische Drehung, die Ultraviolett-und Infrarot-Absorptions- spektren, die Anthronreaktion und das Verhalten bei der Papierstreifenchromatographie.
Coumermycin ist eine saure organische Verbindung, die sich leicht in alkalischen Lösungen wie wässrigen Lösungen der Alkali-und Erdalkalimetallhydroxyde löst. Die Lösung des von Coumermycm in wässriger Natronlauge oder Calciumhydroxyd bildet das Natriumbzw. Calciumsalz, das beispielsweise durch Gefrier- trocknung, falls erwünscht, isoliert werden kann. In gleicher Weise werden Salze mit organischen Basen gebildet ; ein Zusatz von Streptomycin und Dihydro- streptomycin zu Coumermycin bildet die Streptomycinbzw. Dihydrostreptomycinsalze des Coumermycins ; bei dieser Reaktion wird vorteilhaft ein organisches Lö- sungsmittel, wie Äthylacetat, verwendet.
Andere Aminsalze, die verwendet werden können, sind die in der Therapie als Salze des Benzylpenicillins benützten, z. B. Procain, N-Benzyl-/?-phenäthylamin,Hydrabamin, Ephenamin, N, N'-Dibenzyläthylendiamin, Dehydro- abietylamin und Dicyclohexylamin. Ansäuern einer wässrigen Lösung von Natrium-Coumermycin dient zur Ausfällung des gereinigten Coumermycins als freie Säure.
Eine bevorzugte Methode zur Isolierung von Coumermycin aus einer Fermentationsflüssigkeit besteht im Extrahieren der gesamten Flüssigkeit bei einem pH Wert von 6, 01 mit dem halben Volumen Methylisobutylketon, Rückextraktion bei einem pH-Wert von 10, 0 in Wasser (ein Viertel des Volumes der Methyliso- butylketonphase) und erneuter Extraktion bei einem pH-Wert von 6, 0 in Äthylacetat oder Methylisobutylketon (ein Drittel des Volumens der letzten wässrigen Phase). Die schliesslich konzentrierte Lösung von Coumermycin in dem organischen Lösungsmittel wird dann auf ein Zehntel oder ein Zwanzigstel des ur sprünglichen Volumes durch Destillation im Vakuum eingeengt.
Das Coumermycin wird dann, wenn es nicht gleich ausfällt, durch Zusatz einer Mischung niederer Alkane ausgefällt, z. B. durch Zusatz von 10 Volumen der im Handel unter der Bezeichnung Skellysolve B befindlichen Substanz.
Coumermycin kann auch vollständig aus den filtrierten Brühen durch Adsorption an Aktivkohle ( Darco KB ) und anschliessendem Eluieren gewonnen werden ; dieses Verfahren ist der Lösungsmittelextrak- tion der gesamten Brühe jedoch nicht überlegen, da in vielen Brühen das Coumermycin sich im Mycel be- findet.
Mikrobiologische Untersuchungen des Coumermycins Antibakteriele Aktivitat in vitro. Die minimale Hemmungskonzentration (MHK) von Coumermycin gegen eine Vielzahl von Mikroorganismen wurde durch eineAgarverdünnungsreihe unter Verwendung von Pferdeblutagar für hämolytische Streptokokken und Pneumokokken,Glucose-Hefeextrakt-Pepton-Agarfür Milchsäurebazillen, Nährmittel-Agar für andere Bakterien, 2 % igen Glucose-Sabouraud-Agar für Pilze und Kirchners Flüssigkeit für Tuberkelbazillen bestimmt.
Die Ergebnisse sindinTabellenform nachstehend zu sammen mit den mit Novobiocin erhaltenen aufgeführt : Antibakterielles Spektrum des Coumermycins (Agar-Verdiinnungsmethode)
Hemmende Konzentration Testorganismen mcg/cm3
Coumermycin Novobiocin Gram-negativ
Escherichia coliNIHJ > 50 3, 13
Escherichia coli P01495 > 50 50
Klebsiella pneumoniae Type A 3, 13 12, 5
Salmonella typhi > 50 6, 25
Hemmende Konzentration Testorganismen mcg/cm3
Coumermycin Novobiocin
Shigella flexneri > 50 6, 25
Shigella dysenteriae A > 50 25 Neisseria sp.
(CP-R) > 50 12, 5
Bordetella bronchiseptica ATCC 4617 > 50 > 50
Pseudomonas aeruginosa > 50 > 50 Vibrio metchinikovii 0, 025 0, 1 Gram-positiv
Staphylococcus aureus FDA 209P 0, 003 0, 049
S. aureus FDA 209P (SM, St-R) 0, 003 0, 049
S. aureus FDA 209P (NB-R) 1, 56 6, 25
S. aureus 52-34 (TC, EM, CM, PC-R) 0, 003 0, 1
S. aureus Smith strain 0, 006 0, 049
S. aureus 193 (PC, TC-R) 0, 003 0, 049
S. aureus 193 (PC, TC, EM, CM-R) 0, 003 0, 1
S. aureus 193 (PC, TC, EM-R) 0, 003 0, 049
S.
aureus Terajima 0, 003 0, 012
S. albus 0, 006 0, 049
Micrococcus flavus 0, 006 0, 049 SarcinaluteaPCI 1001 0, 025 0, 1
B. subtils PCI 219 50 0, 1
B. sphericus 122 0, 78 0, 1
B. mycoides Os- 0, 78 0, 39
B. cereusATCC10702 3, 13 0, 78
B. anthracis :
115 0, 78 0, 1 Lactobacillus casei ATCC 7469 > 50 0, 1
L. acidophilus B-406-1 > 50 0, 1
Streptococcus faecalis B-40203 3, 13 0, 39
S. pyogenes Type 3 3, 13 0, 78
Diplococcus pneumoniae Type II 1, 56 0, 78
Mycobacterium 607 50 50
Mycobacterium phlei 50 12, 5 Pilze
Aspergillus niger van Tieghem > 50 > 50
Penicillium chrysogenum > 50 > 50
Candida albicans > 50 > 50
Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 > 50 > 50
Trichophyton mentagrophytes > 50 > 50 Abkürzungen :
-R = Resistent
SM = Streptomycin
ST = Streptothricin
NB = Novobiocin
TC = Tetracyclin PC = PeniciBin
EM = Erythromycin
CM = Carbomycin
Die minimalen Hemmungskonzentrationen des Coumermycins wurden auch in einem zweifachen Röhrenverdünnungsverfahren unter Verwendung von Nährstoff-Flüssigkeit ausser für hämolytische Streptokokken und Pneumokokken untersucht, die mit einem Hirn-Herz-Aufguss geprüft wurden.
Die Ergebnisse sind nachstehend zusammen mit dem Aktivitätsverhältnis von Coumermycin und Novobiocin aufgeführt :
Antibakterielles Spektrum des Coumermycins (Röhren-Vordünnungsmethode)
Coumermycin Novobiocin
Testorganismen Verhältnis mcg/ml mcg/ml
Klebsiella pneumoniae 3,13 6,25 2
Staphylococcus aureus FDA 209P 0, 0015 0, 049 32 Staphylococcus aureus Terajima 0, 00075 0, 012 16 StaphylococcusaureusSmith 0, 0015 0, 024 16
SarcinaluteaPCI 1001 0, 006 0, 049 8 Corynebacteriumxerosis53-K-l0, 00075 0, 024 32 Bacillus cereus ATCC 10702 0, 78 0, 78 1 Bacillus anthracis 115 0,
39 0, 195 l/2 Streptococcus pyogenes Type 3 0, 049 0, 39 8 Diplococcus pneumoniae Type II 0, 098 0, 098 1
Coumermycin hemmt das Wachstum verschiedener grampositiver Bakterien ausser dem Bacillus subtils und Milchsäurebakterien, die gegenüber Novobiocin empfindlich sind. Coumermycin ist besonders aktiv gegen Staphylokokken, wobei die Aktivität 10-bis 30mal grösser als die des Novobiocins ist. Es besitzt jedoch gegenüber den im Laboratorium gegen Novobiocin resistent gemachten Staphylokokken verringerte Aktivität.
Wirkung der Impfstoffgrösse auf die Hemmungs- konzentration
Unter Verwendung von Staph. aureus Smith und
Staph. aureus, Stamm 193 als Testorganismen in Nährlösung wurden Rohrenverdünnungen mit verschiedenen Impfstoffgrössen durchgeführt. Die Ergebnisse sind nachstehend in einer Tabelle aufgeführt, und es ist zu sehen, dass die WirkunggrosserImpfsto-ffmengenähn- lich der von Novobiocin ist.
Wirkung der 7mpf0OH//MMtHK < 7KK < rOK Impfstoffgrösse (Zelle/ml)
Testorganismen Antibiotikum lOT lO6 105 104 103 102 (MHK in mcg/ml)
S. aureus Smith Coumermycin 0, 012 0, 012 O ;
U03 0, 003 0, 003 0, 003
S. aureusSmith Novobiocin 0, 39 0, 39 0, 195 0, 098 0, 098 0,098
S. aureus Coumermycin 0, 024 0, 003 0, 0015 0, 0015 0, 0015 0, 0015 strain 193 S. aureus Novobiocin 0, 78 0, 195 0, 098 0, 098 0, 098 0, 098 strain 193
Wirkung des pH-Wertes des Mediums auf die
Hemmungskonzentration
Die MHK des Coumermycins wurde durch die Me diumsverdünnungsmethode bestimmt, wobei der pH Wert auf verschiedene Werte eingestellt wurde.
Als Testmedium wurde Nährlösung und Difco's Hirn-Herz Aufgussbriihe verwendet, und eine lOfache Verdünnung einer eine Nacht alten Kultur von Staph. aureus
Smith (l'Os Zellen/ml) wurde in jeder Röhre geimpft.
Wie nachfolgend zu sehen ist, steigt die Aktivität von
Coumermycin bei saurem pH-Wert und fällt bei alka- lischem pH-Wert. Die vergleichsweisen Daten mit Novobiocin ergebeny dass Coumermycin durch den pH Wert des Mediums stärkerals.Novobiocinbeeinflusst wird.
Einwirkung des pH-Wertes des Mediums auf die MHK
Coumermycin Novobiocin pH des Mediums (MHK in mcg/ml)
NB* HHA** NB HHA
6, 3 0, 00010,000050,0240,024
7, 0 0, 003 0, 006 0, 098 0, 098
7, 6 0, 049 0, 098 0, 195 0, 39
8, 2 0, 39 0, 78 0, 78 0, 78
8, 5 1, 56 3, 13 1, 56 1, 56 * NB = Nährbrühe *6 HHA= Hirn-Herz-Aufguss Einfluss des Mediums czuf die Hemmungskonzentration
Der Einfluss wurde unter Verwendung von vier Medien bestimmt, nämlich Nährbrühe, Him-Herz- Aufguss (Difco), Tryptikase-Soja-Brühe und 1% Hefe extraktbrühe. Die MHK wurde durch die zur Bestimmung verwendeten Medien nicht beeinflusst,
solange der pH-Wert eingestellt wurde.
Einflu# des Serums auf die Hemmungskonzentration
Es wurden steigende Konzentrationen an menschlichem Serum der Nährbrühe zugesetzt, die einen Phbs phatpuffer von 1/10 m Konzentration enthielt, um den pH-Wert des Mediums auf 7, 2 zu halten. Als, Testorganismus wurde Staph. aureus Smith verwendet.
Die Impfmenge betrug 105 Zellen/ml. Wie nachfolgend zu sehen ist, wurde die MHK durch das Serum merklich beeinflusst : Serumeinflu# auf die MHK
MHK in mcg/ml Serumkonzentration Coumermycin Novobiocin ohne Serum 0, 003 0, 098
2, 5 % 0, 024 0, 195 5 % 0, 098 0, 195
10 % 0, 098 0, 39
20% 0, 098 0, 18
50% 0, 195 3, 13
Aktivität von Coumermycin gegenüber klinisch isolierten Staphylokokken
Eine Anzahl von Staph.
aureus-Kulturen (126 Stämme), die aus klinischen Quellen isoliert wurden, wurden in Vitro gegenüber Coumermycin und sechs handelsiiblichen Antibiotica untersucht, nämlich Benzyl pemcjlun,Dmydrostreptomycm,Tetracycun,Jbrythro- mycin, Kanamycin und Novobiocin.
Die durch zehnfache Agar-Reihen-Verdünnung erhaltenen MHK-Werte waren folgende : Empfindlichkeit klinisch isolierter Staphylokkken gegenüber Coumermycin und handelsüblichen Antibiotica
Coumer-Antibiotica mycin PC DSM TC EM KM NB > 100 0 0 3 0 0 0 0 100 0 1 16 2 1 0 0 10 0 7 103 0 3 0 1* 1 0 89 2 8 117 123 0 0, 1 1 * 21 0 114 3 3 122
0, 01 52 7 2 2 0 0 1
0, 001 48 0 0 0 2 0 2 0, 0001 21 0 0 0 0 0 0 0,
00001 4 0 0 0 0 0 0 * = gleicher Stamm
PC = Benzylpenicillin
DSM = Dihydrostreptomycin
TC = Tetracyclin
EM = Erythromycin
KM = Kanamycin
NB = Novobiocin
Die Ergebnisse zeigen, dal3 Coumermycin gegen Staphylokokken : hochwirksam ist und mit andern Antibiotica keine überlagerte Resistenz aufweist. Nur einer der 126 Stämme, der gegenüber Novobiocin resistent war, war gegen Coumermycin weniger empfindlich ; der MHK-Wert des Coumermycins bei diesem Stamm betrug jedoch auch 0, 1 mcg/ml.
In vivo-Versuche an Coumermycin Toxizität. Coumermycin ist ein Antibiotikum geringer Toxizität. Die intramuskuläre LDÏo wurde bei ; 500 mg/kg an Mäusen festgestellt.
Chemotherapeutische Wirlcung. Die Aktivität von Coumermycin in vivo wurde an Mäusen bei experimenteller Infektion mit Staph. aureus Smith festgestellt.
Die Mäuse wurden intraperitoneal mit 100 X LDao des Krankheitserregers infiziert, und das Antibiotikum wurde intramuskulär oder oral sofort nach der bakteriellen Infektion. Ein einzelner intramuskulärer CDÏO- Wert (50% heilende Dosis) von 0, 3 mg/kg und ein einzelner oraler CDgo-Wert von 4, 5 mg/kg wurde erhalten.
In einem Verglbichsversuch wurden die intramuskulären und oralen CDSo-Werte des Novobiocins zu 6, 0 mg/kg und 10,0mg/kgermittelt. Die Daten werden nachstehend aufgeführt:
Chemotherapeutische Wirkung des Coumermycins (Intramuskulare Therapie)
Dosis in mg/kg Coumermycin Novobiocin
50 5/5* 6/6
25 5/5 6/6
12, 5 5/5 4/6
6, 25 11/11 4/6
3, 12 6/6 1/6
1, 56 6/6 0/6
0, 78 12/12 0/6
0, 39 4/6- 0, 19 1/6
0,
10 1/6-
0, 05 0/6-
Kontrolle 0/12 0/12 * = Zahl der überlebenden Mäuse/Zahl der infizierten Mäuse Chemotherapeutische Wirkung von Coumermycin (Orale Therapie)
Dosis in mg/kg Coumermycin Novobiocin 100 5/5
50 11/11 6/6
25 6/6 6/6
12, 5 6/6 5/6
6, 25 10/12 1/6
3, 12 1/6 1/6
1, 56 0/6 0/6
0, 78 0/6 0/6
Kontrolle 0/12 0/12
Coumermycin ist ein wertvolles Mittel zur Behand- lung der Mastitis des Viehs oder der Kälberruhr ;
für diesen Zweck werden beispielsweise Suspensionen in pflanzlichen Olen zum Einflössen in die Zitzen der zu behandelten Mastitis hergestellt, die 1 bis 1000 mg/ml und vorzugsweise etwa 50 mg des Antibiotikums ent- halten, oder genügend Kapseln bereitet, so dass eine Gesamtdosis von 0, 25 bis 2, 0 g bei oraler Anwendung für die Kalbsruhr vorliegt.
Falls es für besondere Zwecke erforderlich und pharmazeutisch verträglich ist, können mit dem erfin- dungsgemäss gewonnenen Antibiotikum noch andere Mediamente, wie Antihistamine, Sulfaverbindungen [z. B. Sulfadiazin, Sulfabenzamid,Sulfacetamid,
Sulfanilamid, Sulfapyridin, Sulfathiazol,
Sulfapyrazin, Sulfaguanidin, Sulfathalidin,
Sulfasuccidin, Sulfaisoxazol, Sulfamylon, Phthalylsulfacetamid,
N'-3, SDimethylbenzoylsulfanilamid,
Benzylsulfanilamid und N-2-[2-(chinoxalyl)-sulfanilamid], lipotrope Mittel (besonders Methionin, Cholin,
Inosit und/ ss-Sitosterol und deren Mischungen),
Stimulation des Zentralnervensystems (z. B, Coffein, Amphetamine) Lokalanästetika, Analygetika (z. B. Acetylsalicylsäure, Salicylamid,
Natriumgentisat, p-Acetylaminophenol, Phenacetin, Codein), Sedativa (z. B. Barbiturate, Bromide),
Salze des, Benzylpenicillins (z.
B. Kalium-Penicillin G, Procain-Penicillin G, 1-Ephenamin-PeniciHin G, Dibenzylamin-Penicillin G, weitere in der USA-Patentschrift Nr. 2 627 491 beschriebene Salze, wobei diese Kombinationen besonders zur Anderung des Blutbildes dienen), Phenoxymethpenicillin, Phenäthicillin, Methicillin, Oxacillin, Cloxacillin, Nafcillin, Cephalothin und andere synthetische Penicilline und deren Salze, andere Antibiotika (z. B.
Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Bacitracin, Polymyxin, Tyrothricin, Erythromycin, Chlortetracyclin, Oxytetracyclin, Tetracyclin, Oleandomycin,
Chloramphenicol, Magnamycin, Novobiocin, Cycloserin, Neomycin, Kanamycin ; in manchen Fällen greifen diese Kombinationen ein grösseres Gebiet von Organismen an, zeigen synergistische Wirksamkeit oder besitzen eine verringerte Toxizität bei gleicher Wirksamkeit),
Vitamine (z. B. A, Ai, Bl, B2, B6, B12, und Glieder dieser Gruppe, Folsäure und Glieder dieser
Reihe, Vitamine C, D2, Ds und E),
Hormone (z. B. Cortison, Hydrocortison, 9-a-Fluorcortison,9-a-FIuorhydrocortison,
Prednison und Prednisolon), anaboHsche Mittel (z.
B. 11, 17-Dihydroxy-9-a-fluor 17a-methyl-4-androsten-3-on ; 17-a-i2ithyl-l9-nortestosteron) und
Fungicide (z. B. Mycostatin).
Das erfindungsgemäss gewonnene Antibiotikum ist ein wertvolles Mittel zur Bestimmung von Verseuchungen durch grampositive Bakterien, Pilze, Hefepilze und dergleichen der Erzeugung der Enzyme Streptokinase und Streptodbmase durch Züchtung von Streptokollen und der Erzeugung von Amylase durch Fermentation von B. subtilis oder B. cereus. So ermöglicht der Zusatz von 1 bis 1000 mcg/ml und vorzugsweise von etwa 10 mcg/ml des Antibiotikums zu einer entspre- chenden Menge des geimpften und anschliessend bebrüteten Mediums das Wachstum unerwünschter Begleitstoffe und deren visuelle Bestimmung.
Method for obtaining an antibiotic
The invention relates to the production of a new substance called coumermycin. Coumermycin inhibits the growth of gram-positive bacteria. It is non-toxic and has a therapeutic effect on mice infected with gram-positive bacteria.
Coumermycin is also useful in treating infections in humans caused by gram-positive bacteria, such as pneumonia. Coumermycin was also called the antibiotic Bu 620.
According to the process of the present invention, an antibiotic agent is obtained which inhibits the growth of gram-positive bacteria and consists of an acidic substance, coumermycin, which dissolves easily in acetone, dioxane and alkaline water, which is moderately dissolved in ethanol, butanol, ethyl acetate, Butyl acetate and methyl isobutyl ketone, slightly soluble in benzene, methanol and chloroform and insoluble in carbon tetrachloride, petroleum ether and acidified water, which also gives positive Fehling and Molisch reactions, decolorizes bromine, gives negative ninhydrin, Tollens and anthrone reactions, in purified form at 222 -224 C melts and [a] D20 = -134 (C = 1, 0, acetone),
has an ultraviolet absorption spectrum in ethanol with a maximum at 275 m, u (E 1 cm 1% = 595) and at 335 m (E = 498), in n / 10 HCl maxima at 275 m (E1 cm 1% = 287) and 345 mu.
(E IL / o = 277) and in n / 10 NaOH has a maximum at 280 m, (E 766), has a neutralization equivalent of 548 and the following average elemental analysis gives: C 59.1%; H 5, 35%; N 5.90% and O (as difference) 29.65%; when enclosed in potassium bromide, the substance shows a characteristic absorption in the infrared region, as shown in FIG.
Referring to the drawings, Fig. 1 is an infrared absorption spectrum graph of free coumermycic acid in potassium bromide.
2 is a graph of the ultraviolet absorption spectrum of coumermycin in an ethanol solution, in 0.1N HCl and in 0.1N NaOH.
The method of the present invention for obtaining an antibiotic substance called coumermycin is characterized in that a strain of Streptomyces rishiriensis is grown in an aqueous medium containing a carbon source and a nitrogenous nutrient under submerged aerobic conditions to there is substantial effectiveness against gram-positive bacteria in the solution, whereupon the coumermycin is separated from the solution.
The organism producing the antibiotic was isolated from a soil sample in Rishiri Island, Hokkaido, Japan and is a new species of Streptomyces called Streptomyces rishiriensis. A culture of the living organism with the laboratory designation 404 Y 3 and A 9795 was deposited in the American Type Culture Collection, Washington, D.C. and added to the A.T.C.C.14812 collection of microorganisms there.
The strain No. 404 Y 3 of S. rishiriensis has the following characteristics:
Hallmarks of culture
W = growth
L = aerial mycelium
P = soluble pigment
B = biological properties 1. Czapek's agar:
W: moderate, yellow-gray to light brown-gray or ivory yellow
L: low, powdery, white #
P: none
2. Glycerin-Czapek's Agar
W: moderate, yellow-gray or light brown-gray to pale yellow with indistinct brown
L: low, powdery, white
P: none or pale yellow with indistinct brown 3.Glycerm ammonium salt agar ------
W: moderate, slightly yellow-gray to yellow-white
L: scanty, powdery, dense yellow-gray to light gray
P: none
4th
Glucose asparagine agar
W: low, thin, dancing, light yellow-gray @@@@@@@@@@
L. none .-, - ,,. "!, /; ': Li.u;
5. Starch agar
W: good, light, yellow-brown to ivory-colored
L: moderate, powdery, extremely dear, indistinct brown to light brown with gray P: none
B: Hydrolysis is moderately strong
6. Nutrient Agar``T
W: moderate, fawn brown
L: low, powdery, white #
P: dark brown <.; - "'
7. Bennett's agar
W: moderate, gray olive brown to gray brown L: moderate, white to light brown or gray brown
P: yellow-brown
8th.
Oat Meal Spyton Agar.,
W: good, light yellow with indistinct brown
L: moderate, white to gray with indistinct brown
P: light yellow with indistinct brown
9. Potato wad .W; - 'good, shiny, wrinkled' surface. '".
'"' .L: 'keaies ./'"""/"', '.
'P: .PfropDenwirdbraunschwarz' ..-.... j
10. Gelatin stick './ L -'-.
10. Gelatin stick W: brown-black colony on the surface
L: none
P: dunkelbrauir. "'B: negative liquefaction' '1 tyrösin-yeast-gelatin stick: -' ,. <
W: brownish black colony on the surface
L: 'none /. "
P: dark brown
B: negative. Liquefaction- '1 2. milk
W: brown ring formation
L: none
P: indistinct brown.
B: not digested 13. Nitral solution'J
W: white, spherical mass on the surface
B: positive reduction to nitrite 14. Melanin-forming medium
W: slight, thin, gray-black L: scanty, white
P: brown-gray to gray-brown
B: melanin positive 15. Potato dextrose agar
W: good, shiny, brown-black.
L: white # to light pink to: light brown with indistinct gray.
P: gray to deep gray Utilization e-O & tMMssüssn
Xylose ++ inulin ++
Arabinose ++ salicin
Glucose ++ Mannitol``i; '"." T'v'
Galactosc ++ sorbitol "
Fructose ++ cdlobiose +
Sorbose @@ rhanmosis ++
Sucrose ++ sodium citrate +
Maltose sodium succinate +
Lactose ++ inositol ++
Raffinose + + control .¯t's growth¯-¯.¯.-¯-¯¯-¯: ¯: + medium growth ¯ low growth -no growth-.-No'i '., J;'; "ioi : ü
Mycologic characteristics
The morphological properties of the strain were determined on starch agar and Bennett's agar.
Microscopic examination of the aerial mycelium revealed a tangled and branched hyphae that was occasionally tufted and spore-carriers forming left-handed spirals. The electron microscopic
HatersuchuNgg &b; .eineepti & ekbiarss: valehEorBi; der
SporenL. And / .ins.att & .OberNäne.,: L.:-.n. ''.
The Sfrepformyces 404 Y 3 has a brownish gray
Aerial mycelium and creates a brown or dark brown pigment in organic media. The gelatin liquefaction occurs both in the gelatin stick and in the
Tyrosine yeast gelatin stick negathy, and milk is not digested Nitrite is produced from nitrate and starch is hydrolyzed. The 404 Y 3 strain is similar to the n-ftdjr. '. Di-f,
S. diastatochromosenes, 'i.; L, t!;!' :? ittL.t .. 'K' '! - JnDh.Hti' -: / "! -... (.! ....
S, griseoruber
S, olivochromogenes, 'S.' 'Aureus' ''. "" - '"' '' bn. '' .. t .. '].' Ssi .., m .., ht; .Ji: .J .. ', .. fu ,, d, -J fq
S. griseochromogenes,
S. hawaiensis and the
S. naganisht in some respects, such as the spiral formation, the
Color of the air mycelium and the melanoid pigment, but differs in certain cultural and physiological properties as shown below: '' JrssoMüMss;. 'L,' -.- ..
According to Waksman and Gurtis, the spore carriers are straight, and according to Jensen, left-handed spirals are formed. The color of the Luftmycles is described as white to ash gray on Czapek's agar and gray on glucose asparagine agar. The liquefaction on
Gelatin stick runs pretty quickly. tS'Oss! '.'.....
; 'ji, jThe shape; .der.S'pore.n, is described as.cylindrical.Fa.rbe..derKaltttr.istro.tlicnorange, a
Czapek s and light reddish orange to purple on
Starch differences were also found in the exploitation of carbon sources such as sucrose, raffinose,
Citrate and succinate,. Found,
S. olivochromagenes:
Differences were found in the color of the culture, the IpchenPigmetaf: Glucose-Asparagtn-Agarun.ddei '
Digestion of gelatin and milk noted.
S. aureus:
The color of the culture is dark brown on Czapek's and light orange on glucose-asparagine agar. The gelatin liquefaction slows down later.
S. griseochromogenes:
The color of the air mycelium is white to light gray.
The gelatin liquefaction is moderate. Milk is broken down without coagulation. Differences are also in the utilization of carbon sources such as rhamnose.
InuhnSicin'CitrratundSuccinät, put in rest. ".-NMM '/ H :.
S. Naganishi.
The. The color of the culture on starch agar is creamy with purple-red, and the soluble pigment on starch agar is indistinctly pink. Gelatine is moderately liquefied. Milk is coagulated and broken down. Distinctions are made ;;. IB., De.use: deF.carbon sources,: 'such as;: Sa6rQserHnd.Sorbitol & st.
'Mm:; strains never.Rbher' productivity.selecta was 'the original status: ultraviolet-irradiated and' the strains formed by the mutation were discarded. Some of these strains of high productivity were examined mycologically, but noticeable differences could not be found; apart from some strains white air vinyl cells were obtained.
With regard to the above-mentioned characteristics of the strain, Strepomyces 404 Y 3 was identified as a new species and identified with Strepomyces rishiriensis nov. sp. designated.,
The species Streptomyces rishi riensis described here includes all coumermycin-producing strains that cannot be differentiated from strain number 404Y3, as well as its subcultures including mutations and variants. The properties of the
Coumermycins are described here, and after
Knowing these properties it is easy to distinguish the coumer mycin-producing strains from others.
Grown under suitable conditions, Strepomyces rishiriensis produces coumermycin. A
Fermentation broth containing coumermycin is produced by “inoculating enont spores or mycelia” of the coumermycin-producing organism in a suitable medium under subsequent breeding under-submerged aerobic conditions
CöUmBrMycilikultür.them solid medium is indeed possible, \ but it is only economical to produce a larger 'culture' in a 'liquid medium'. Therefore, the above-mentioned production is permitted here. The temperature of the culture can fluctuate a lot , and it is best to take 20 to
35'C; 'preferably-it is, however, between 26 and 30' C for 'an essentially neutral pH-
Value.B & i: "dersübmersenaeroben:
Fermentation des
Organi! The medium for the production of coumermycin contains the medium-sized Kahlenstorfquelle in the trade. Available glyceride oil or glycerine or a carbohydrate such as glucose, maltose, sucrose, lactose,
Dextrin, starch, etc. in the pure or raw state, and as a source of the. '.
Nitrogen an organic substance such as soy bean meal, peanut meal, cotton seed meal, meat extract, peptoh, fish meal;
Hot extract, corn-soaked water, etc. and, if necessary, inorganic nitrogen sources such as nitrates and ammonium salts, and mineral salts such as sodium chloride, potassium chloride and magnesium sulphate and buffer substances such as calcium carbonate or phosphate and traces of heavy metal salts;
these components are described in Canadian Patent No. 513,324, British Patent Nos. 730,341 and 736,325, and U.S. Patent Nos. 2,691,618, 2,658,018, 2,653,899, 2,586,762, 2,516,080, 2,483,892 , 2609 329 and 2 709 672. In both aerated submerged breeding, an antifoam agent, such as a liquid paraffin, fatty oil or silicone, is expediently used. More than one type of carbon source, nitrogen source, or antifoam agent can be used in the manufacture of coumermycin. In general, cultivation is continued until at least several hundred mcgXml of coumermycin have accumulated in the medium. In some cases, the pH of the broth will initially drop and then gradually rise again.
Example 7 The fermentation conditions suitable for the production of the antibiotic Coomer my were: investigated, and the following composition of the medium was found to be advantageous: 1.5% soluble starch, 2% cottonseed flour (PharmamediÅa),
0.1% K2HPO4,
0.1% NaCl,., 0.05 .MgS07H2Q,
0.05% CaCl & -0.00-1% ZiiS04.70 and '
0.2% yeast extracts .:
Coumermycin is produced in 3 to 5 days of fermentation with adequate aeration and agitation, and activity was found both in the filtrate broth and in the mycelium.
Coumermyein was tested against Staphyloeoccus aureus FDA 209 P by the paper-disc-or-cylinder plate method.
Example - 2
The iesubmerseaerobicFermentationyon S.rishipiensis (strain 404 Y 3) in a shake flask and a
6% strong (Staelipse I), 3% debittered. Brewer's yeast and medium containing 1% CaCO3 yielded 300 bis
400 meg / ml coumermycin.
Example 3 -The. submierse aerobic fermentation of S. rishiriensis (strain 404 Y 3) in a shake flask and a
6% starch (Staelipse I), 3% cottonseed flour (Pharmamedia), 2.5% distillers solubles and 1%
CaC containing. Medium egg gave 150-200 mcg / mt Cbümermycm. '
Example 4
The submerged aerobic fermentation of S. rishiriensis (404 Y 3 strain) in a shake flask and a
1% soybean meal, 2% cottonseed meal (Pharma media), 2% soluble starch; 0.5% glycerin, 0.2% yeast extracts, 0.2% K2HPO4, 0.1% MgSO4, 1% CaCO3 and
A medium containing 0.05% silicone as an anti-foaming agent resulted in Coumermyein at a pH value of 7 as follows:
Time pH effectiveness in mcg / ml
5 days 7, 8 70
6 days 8, 1 80
7 days 8, 3 120
Example 5
Composition of the medium
Soybean meal 2.0%
Glycerin 1.5%%
Yeast extract 0.2%
Potassium phosphate, dibasic 0.1%
Sodium chloride 0.1%
Calcium chloride 0.05%
Magnesium sulfate 0.05%
Zinc sulfate 0.001% pH 7.0
A culture medium (100 ml) containing the above ingredients was sterilized in a 500 ml flask with a culture of Streptomyces rishiriensis, strain 404Y 3,
inoculated and incubated at 27 ° C. for 6 days with shaking, the formation of coumermycin in the fermentation broth reaching 150 mcg / ml.
Example 7
A culture medium (30 1) containing the same substances as in Example 6 was sterilized in a 50-1 stainless steel tank, inoculated with a culture of Streptomyces rishiriensis and incubated at 28 ° C. for 90 hours, with the formation of coumermycin in the Fermentation broth reached 120 mcg / ml.
The fermentation liquid (5 l) was filtered at a pH of 8.0, the filtrate was adjusted to a pH of 6.0 and extracted with 2 liters of methyl isobutyl ketone. The mycelial cake was extracted with 500 ml of acetone while stirring vigorously and the extract was evaporated in vacuo to remove the solvent. The resulting aqueous concentrate was extracted at a pH of 6.0 with 200 ml of methyl isobutyl ketone.
The two ketone extracts were combined and washed with 500 ml of water, whereupon the activity was transferred to 1000 ml of cold water which had been adjusted to a pH of 10.0 with sodium hydroxide. The aqueous extract was adjusted to pH 6.0 and extracted again with 300 ml of ethyl acetate, whereupon the concentrate was concentrated to 30 ml in vacuo.
When 150 ml of petroleum ether were added to the concentrate, a light brown precipitate formed which was taken up, washed with a little methanol to remove the impurities and dried, giving 750 mg of coumermycin as a powder.
The coumermycin powder thus obtained (400 mg) was dissolved in 100 ml of ethyl acetate and absorbed on a column which had been charged with 20 g of aluminum oxide and previously treated with sulfuric acid. The column was washed with 200 ml of ethyl acetate and eluted with methanol. The eluate was divided into 10 ml portions, the active fractions were combined and evaporated to dryness in vacuo. The pale yellow, solid coumermycin was recrystallized twice from methanol and gave 70 mg of white, crystalline coumermycin which melted at 218-220 C with decomposition.
The coumermycin was further purified by Craig's method e of countercurrent distribution using a solvent system of five parts (by volume) carbon tetrachloride, one part chloroform, five parts methanol and one part water. After 50 transfers, the peak concentration was found in tube 26 by the biological curve, the UV curve and the weight curve; these curves agree with the theoretical curve. Freeze drying of 10 tubes around the tip gave pure coumermycin.
Coumermycin was also purified by recrystallization from aqueous acetone and then from absolute methanol, a substance which melted at 220 ° C. with decomposition was obtained.
Coumermycin was further purified by chromatography on aluminum oxide, 39.7 mg (potency 500 mcg / mg) being dissolved in ethyl acetate and absorbed on 2 g A1203 (pH 4.7, treated with H2SO4). After washing with ethyl acetate, the column was then eluted with methanol and acidified methanol. The active fractions were combined, neutralized, concentrated in vacuo and then subjected to freeze-drying to give 12.4 mg as a light yellow powder (potency 700 mcg / mg).
The coumermycin (480 mg) was treated with a small amount of activated charcoal in acetone solution and then recrystallized from hot ethanol, 230 mg of crystalline coumermycin being obtained, which were dried in vacuo at 50 ° C. for three hours.
Melting point 222-224 C (dec.), PKa. 6, 32 in 75 acetone; Titration equivalent 526.5.
Analysis: Calculated for C2GH26N2O so:
C 59.35 H 4.98 N 5.32
Found. : C 59.1H5.35 N5.90
The molecular weight determination by the cryoscopic method in dioxane gave a value of 500 + 20. The specific rotation [a] D was -134.4 (C = 1%, acetone) compared to -69.6 for novobiocin under the same conditions. Coumermycin gave a negative (brown) anthrone reaction, while novobiocin gave a positive (green) reaction.
A solution of 100 mg of coumermycin in 120 ml of absolute ethanol was stirred with 0.25 g of Adams catalyst under atmospheric pressure of hydrogen for thirty minutes at room temperature. No hydrogen uptake was observed. After removing the catalyst, 35 ml of water was added to the filtrate with vigorous stirring. By adding 0.5 ml of an abnormal hydrochloric acid to the resulting emulsion, a solid, white substance was precipitated, which was taken up and dried; the weight was 88.7 mg, and paper chromatography showed that it was the original starting material, that is to say coumermycin. Under the same conditions, according to paper chromatographic analysis (F. I.
Wolf et al., Antibiotics Annual 1956-1957, p. 1035) 1000 mg Novo biocin 946 mg dihydronovobiocin.
Coumermycin gives positive Fehling and Molisch reactions and decolorizes bromine.
The paper strip chromatography of the coumermycin gave the following results:
Solvent system Rf values
Aqueous butanol 0.15 3% aqueous ammonium chloride 0.03
75% phenol 0.95
50% acetone 0.75 butanol-methanol-water (4: 1: 2) + 2%
Methyl orange 0.45 butanol-methanol-water (4: 1: 2) 0.40 benzene-methanol (4: 1) 0.05
Distilled water 0.05 butanol-water (4: 1) + 0.25% p-toluene isulfonic acid 0.30 butanol-water-acetic acid (2: 1: 1) 0.50
Butanol-water (4:
1) + 2% piperidine 0.25
Coumermycin is light in acetone, dioxane and alkaline water, moderately in ethanol, butanol, ethyl acetate, butyl acetate and methyl isobutyl ketone, little in
Benzene, methanol and chloroform are soluble and insoluble in carbon tetrachloride, petroleum ether and acidified water.
As can be seen in FIG. 2, the ultraviolet absorption spectrum shows the following maxima: maxima in ethanol
275 m, (E = 595), 335 m, (E} = 498) maxima in n / 10 HCl
275 m. (E = 287), 345 m, (E = 277) maximum in n / 10 NaOH
280 m, u (E z = 766)
As can be seen from FIG. 1, Coumer mycin in potassium bromide shows characteristic infrared absorption maxiima at the following wavelengths in microns:
2.99; 3, 36 (shoulder); 3, 45; 5, 88 (shoulder); 5, 92;
6, 10; 6, 24; 6, 45; 6, 55; 6, 7; 7, 2; 7, 65; 7.85; 8, 9;
9, 2; 9, 6;
10.05; 10, 3; 10, 6; 11, 3; 12, 25; 12.65; 13, 1;
13, 35.
Coumermycin and novobiocin are therefore clearly different from one another, for example in terms of the melting point, elemental analysis, specific rotation, ultraviolet and infrared absorption spectra, anthrone reaction and behavior in paper strip chromatography.
Coumermycin is an acidic organic compound that dissolves easily in alkaline solutions such as aqueous solutions of alkali and alkaline earth metal hydroxides. The solution of Coumermycm in aqueous sodium hydroxide solution or calcium hydroxide forms the sodium or. Calcium salt, which can be isolated, for example, by freeze-drying, if desired. In the same way, salts are formed with organic bases; an addition of streptomycin and dihydro-streptomycin to Coumermycin forms the Streptomycinbzw. Dihydrostreptomycin salts of coumermycin; an organic solvent such as ethyl acetate is advantageously used in this reaction.
Other amine salts that can be used are those used in therapy as salts of benzylpenicillin, e.g. B. Procaine, N-benzyl - /? - phenethylamine, hydrabamine, ephenamine, N, N'-dibenzylethylenediamine, dehydroabietylamine and dicyclohexylamine. Acidification of an aqueous solution of sodium coumermycin serves to precipitate the purified coumermycin as the free acid.
A preferred method for isolating coumermycin from a fermentation liquid consists in extracting the entire liquid at a pH value of 6.01 with half the volume of methyl isobutyl ketone, back-extraction at a pH value of 10.0 in water (a quarter of the volume of the methyl isobutyl ketone butyl ketone phase) and renewed extraction at a pH value of 6.0 in ethyl acetate or methyl isobutyl ketone (one third of the volume of the last aqueous phase). The finally concentrated solution of coumermycin in the organic solvent is then concentrated to one tenth or one twentieth of the original volume by distillation in vacuo.
The coumermycin is then, if it does not precipitate immediately, precipitated by adding a mixture of lower alkanes, e.g. B. by adding 10 volumes of the commercially available under the name Skellysolve B substance.
Coumermycin can also be completely obtained from the filtered broths by adsorption on activated charcoal (Darco KB) and subsequent elution; however, this method is not superior to solvent extraction of the entire broth, since in many broths the coumermycin is located in the mycelium.
Microbiological investigations of the coumermycin antibacterial activity in vitro. The minimum inhibitory concentration (MIC) of coumermycin against a variety of microorganisms was determined by an agar dilution series using horse blood agar for hemolytic streptococci and pneumococci, glucose yeast extract peptone agar for lactic acid bacilli, nutrient agar for other bacteria, 2% sabourigen agar for other bacteria for mushrooms and Kirchner's liquid for tubercle bacilli.
The results are tabulated below along with those obtained with Novobiocin: Antibacterial spectrum of coumermycin (agar thinning method)
Inhibitory concentration of test organisms mcg / cm3
Coumermycin Novobiocin Gram negative
Escherichia coliNIHJ> 50 3, 13
Escherichia coli P01495> 50 50
Klebsiella pneumoniae type A 3, 13 12, 5
Salmonella typhi> 50 6, 25
Inhibitory concentration of test organisms mcg / cm3
Coumermycin Novobiocin
Shigella flexneri> 50 6, 25
Shigella dysenteriae A> 50 25 Neisseria sp.
(CP-R)> 50 12, 5
Bordetella bronchiseptica ATCC 4617> 50> 50
Pseudomonas aeruginosa> 50> 50 Vibrio metchinikovii 0, 025 0, 1 gram-positive
Staphylococcus aureus FDA 209P 0, 003 0, 049
S. aureus FDA 209P (SM, St-R) 0.003 0.049
S. aureus FDA 209P (NB-R) 1, 56 6, 25
S. aureus 52-34 (TC, EM, CM, PC-R) 0, 003 0, 1
S. aureus Smith strain 0, 006 0, 049
S. aureus 193 (PC, TC-R) 0.003 0.049
S. aureus 193 (PC, TC, EM, CM-R) 0, 003 0, 1
S. aureus 193 (PC, TC, EM-R) 0.003 0.049
S.
aureus Terajima 0, 003 0, 012
S. albus 0, 006 0, 049
Micrococcus flavus 0, 006 0, 049 SarcinaluteaPCI 1001 0, 025 0, 1
B. subtle PCI 219 50 0, 1
B. sphericus 122 0, 78 0, 1
B. mycoides Os 0, 78 0, 39
B. cereus ATCC10702 3, 13 0, 78
B. anthracis:
115 0, 78 0, 1 Lactobacillus casei ATCC 7469> 50 0, 1
L. acidophilus B-406-1> 50 0.1
Streptococcus faecalis B-40203 3, 13 0, 39
S. pyogenes Type 3 3, 13 0, 78
Diplococcus pneumoniae Type II 1, 56 0, 78
Mycobacterium 607 50 50
Mycobacterium phlei 50 12, 5 fungi
Aspergillus niger van Tieghem> 50> 50
Penicillium chrysogenum> 50> 50
Candida albicans> 50> 50
Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763> 50> 50
Trichophyton mentagrophytes> 50> 50 Abbreviations:
-R = Resistant
SM = streptomycin
ST = streptothricin
NB = novobiocin
TC = Tetracycline PC = PeniciBin
EM = erythromycin
CM = carbomycin
The minimum inhibitory concentrations of coumermycin were also tested in a two-fold tube dilution method using nutrient fluid except for hemolytic streptococci and pneumococci, which were tested with a brain-heart infusion.
The results are shown below along with the activity ratio of coumermycin and novobiocin:
Antibacterial spectrum of coumermycin (tube pre-dilution method)
Coumermycin Novobiocin
Test organism ratio mcg / ml mcg / ml
Klebsiella pneumoniae 3.13 6.25 2
Staphylococcus aureus FDA 209P 0, 0015 0, 049 32 Staphylococcus aureus Terajima 0, 00075 0, 012 16 StaphylococcusaureusSmith 0, 0015 0, 024 16
SarcinaluteaPCI 1001 0, 006 0, 049 8 Corynebacterium xerosis53-K-l0, 00075 0, 024 32 Bacillus cereus ATCC 10702 0, 78 0, 78 1 Bacillus anthracis 115 0,
39 0, 195 l / 2 Streptococcus pyogenes type 3 0, 049 0, 39 8 Diplococcus pneumoniae type II 0, 098 0, 098 1
Coumermycin inhibits the growth of various gram-positive bacteria besides Bacillus subtle and lactic acid bacteria, which are sensitive to novobiocin. Coumermycin is particularly active against staphylococci, the activity being 10 to 30 times greater than that of novobiocin. However, it has reduced activity in relation to the staphylococci which have been made resistant to novobiocin in the laboratory.
Effect of vaccine size on inhibitory concentration
Using staph. aureus Smith and
Staph. aureus, strain 193 as test organisms in nutrient solution, tube dilutions were carried out with different vaccine sizes. The results are shown in a table below, and it can be seen that the effect of large amounts of vaccine is similar to that of Novobiocin.
Effect of the 7mpf0OH // MMtHK <7KK <rOK vaccine size (cell / ml)
Test organisms Antibiotic IOT 106 105 104 103 102 (MIC in mcg / ml)
S. aureus Smith coumermycin 0, 012 0, 012 O;
U03 0, 003 0, 003 0, 003
S. aureus Smith Novobiocin 0, 39 0, 39 0, 195 0, 098 0, 098 0.098
S. aureus coumermycin 0, 024 0, 003 0, 0015 0, 0015 0, 0015 0, 0015 strain 193 S. aureus novobiocin 0, 78 0, 195 0, 098 0, 098 0, 098 0, 098 strain 193
Effect of the pH of the medium on the
Inhibitory concentration
The MIC of the coumermycin was determined by the medium dilution method, the pH being adjusted to various values.
Nutrient solution and Difco's brain-heart infusion broth were used as the test medium, and a 10-fold dilution of a night-old culture of Staph. aureus
Smith (l'Os cells / ml) was inoculated in each tube.
As can be seen below, the activity increases from
Coumermycin at acidic pH and falls at alkaline pH. The comparative data with Novobiocin show that Coumermycin is more strongly influenced by the pH value of the medium than Novobiocin.
Effect of the pH value of the medium on the MIC
Coumermycin Novobiocin pH of the medium (MIC in mcg / ml)
NB * HHA ** NB HHA
6, 3 0, 00010, 000050, 0240, 024
7, 0 0, 003 0, 006 0, 098 0, 098
7, 6 0, 049 0, 098 0, 195 0, 39
8, 2 0, 39 0, 78 0, 78 0, 78
8, 5 1, 56 3, 13 1, 56 1, 56 * NB = nutrient broth * 6 HHA = brain-heart infusion Influence of the medium czuf the inhibition concentration
The influence was determined using four media, namely nutrient broth, heart-heart infusion (Difco), trypticase soy broth and 1% yeast extract broth. The MIC was not influenced by the media used for the determination,
as long as the pH has been adjusted.
Influence of the serum on the inhibitory concentration
Increasing concentrations of human serum were added to the nutrient broth, which contained a 1/10 m concentration of Phbs phate buffer, in order to keep the pH of the medium at 7.2. As a test organism, Staph. aureus Smith used.
The amount inoculated was 105 cells / ml. As can be seen below, the MIC was noticeably influenced by the serum: Serum Influence on the MIC
MIC in mcg / ml serum concentration coumermycin novobiocin without serum 0, 003 0, 098
2.5% 0, 024 0, 195 5% 0, 098 0, 195
10% 0.098 0.39
20% 0.098 0.18
50% 0, 195 3, 13
Activity of coumermycin against clinically isolated staphylococci
A number of staph.
aureus cultures (126 strains) isolated from clinical sources were tested in vitro against coumermycin and six commercially available antibiotics, namely benzyl pemcjlun, dmydrostreptomycin, tetracycun, jbrythromycin, kanamycin, and novobiocin.
The MIC values obtained by tenfold serial agar dilution were as follows: Sensitivity of clinically isolated staphylococci to coumermycin and commercially available antibiotics
Coumer antibiotics mycin PC DSM TC EM KM NB> 100 0 0 3 0 0 0 0 100 0 1 16 2 1 0 0 10 0 7 103 0 3 0 1 * 1 0 89 2 8 117 123 0 0, 1 1 * 21 0 114 3 3 122
0. 01 52 7 2 2 0 0 1
0.001 48 0 0 0 2 0 2 0 .0001 21 0 0 0 0 0 0 0,
00001 4 0 0 0 0 0 0 * = same trunk
PC = benzyl penicillin
DSM = dihydrostreptomycin
TC = tetracycline
EM = erythromycin
KM = kanamycin
NB = novobiocin
The results show that coumermycin against staphylococci: is highly effective and shows no superimposed resistance to other antibiotics. Only one of the 126 strains that was resistant to novobiocin was less sensitive to coumermycin; however, the MIC value of coumermycin in this strain was also 0.1 mcg / ml.
In vivo experiments on coumermycin toxicity. Coumermycin is a low toxicity antibiotic. The intramuscular LDÏo was at; 500 mg / kg found in mice.
Chemotherapeutic effect. The activity of coumermycin in vivo was determined in mice experimentally infected with Staph. aureus Smith noted.
The mice were infected intraperitoneally with 100 X LDao of the pathogen and the antibiotic was administered intramuscularly or orally immediately after the bacterial infection. A single intramuscular CDÏO value (50% healing dose) of 0.3 mg / kg and a single oral CDgo value of 4.5 mg / kg were obtained.
In a comparison experiment, the intramuscular and oral CDSo values of the novobiocin were found to be 6.0 mg / kg and 10.0 mg / kg. The dates are listed below:
Chemotherapeutic effect of coumermycin (intramuscular therapy)
Dose in mg / kg Coumermycin Novobiocin
50 5/5 * 6/6
25 5/5 6/6
12, 5 5/5 4/6
6, 25 11/11 4/6
3, 12 6/6 1/6
1, 56 6/6 0/6
0, 78 12/12 0/6
0.39 4 / 6- 0, 19 1/6
0,
10 1 / 6-
0.05 0 / 6-
Control 0/12 0/12 * = number of surviving mice / number of infected mice Chemotherapeutic effect of coumermycin (oral therapy)
Dose in mg / kg Coumermycin Novobiocin 100 5/5
50 11/11 6/6
25 6/6 6/6
12, 5 6/6 5/6
6, 25 10/12 1/6
3, 12 1/6 1/6
1, 56 0/6 0/6
0.78 0/6 0/6
Control 0/12 0/12
Coumermycin is a valuable agent in the treatment of mastitis in cattle or calf dysentery;
for this purpose, for example, suspensions in vegetable oils for infusion into the teats of the mastitis to be treated are prepared, which contain 1 to 1000 mg / ml and preferably about 50 mg of the antibiotic, or enough capsules are prepared so that a total dose of 0, 25 to 2.0 g is available for oral use for veal dysentery.
If it is required for special purposes and pharmaceutically acceptable, other medications, such as antihistamines, sulfa compounds [e.g. B. sulfadiazine, sulfabenzamide, sulfacetamide,
Sulfanilamide, sulfapyridine, sulfathiazole,
Sulfapyrazine, sulfaguanidine, sulfathalidine,
Sulfasuccidine, sulfaisoxazole, sulfamylon, phthalylsulfacetamide,
N'-3, SDimethylbenzoylsulfanilamide,
Benzylsulfanilamide and N-2- [2- (quinoxalyl) -sulfanilamide], lipotropic agents (especially methionine, choline,
Inositol and / ss-sitosterol and their mixtures),
Stimulation of the central nervous system (e.g. caffeine, amphetamines) Local anesthetics, analytics (e.g. acetylsalicylic acid, salicylamide,
Sodium, p-acetylaminophenol, phenacetin, codeine), sedatives (e.g. barbiturates, bromides),
Salts of benzylpenicillin (e.g.
B. Potassium penicillin G, procaine penicillin G, 1-ephenamine penicillin G, dibenzylamine penicillin G, other salts described in US Pat. No. 2,627,491, these combinations being used in particular to change the blood count), phenoxymethpenicillin , Phenethicillin, methicillin, oxacillin, cloxacillin, nafcillin, cephalothin and other synthetic penicillins and their salts, other antibiotics (e.g.
Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Bacitracin, Polymyxin, Tyrothricin, Erythromycin, Chlortetracycline, Oxytetracycline, Tetracycline, Oleandomycin,
Chloramphenicol, magnamycin, novobiocin, cycloserine, neomycin, kanamycin; in some cases these combinations attack a larger area of organisms, show synergistic effectiveness or have a reduced toxicity with the same effectiveness),
Vitamins (e.g. A, Ai, Bl, B2, B6, B12, and members of this group, folic acid and members of this
Series, vitamins C, D2, Ds and E),
Hormones (e.g. cortisone, hydrocortisone, 9-α-fluorocortisone, 9-α-fluorohydrocortisone,
Prednisone and prednisolone), anabolic agents (e.g.
B. 11, 17-dihydroxy-9-a-fluoro 17a-methyl-4-androsten-3-one; 17-a-i2ithyl-19-nortestosteron) and
Fungicides (e.g. mycostatin).
The antibiotic obtained according to the invention is a valuable means for determining contamination by gram-positive bacteria, fungi, yeasts and the like, the production of the enzymes streptokinase and streptodbmase by culturing streptocolla and the production of amylase by fermentation of B. subtilis or B. cereus. The addition of 1 to 1000 mcg / ml and preferably about 10 mcg / ml of the antibiotic to a corresponding amount of the inoculated and then incubated medium enables the growth of undesirable accompanying substances and their visual determination.