Verfahren zur Herstellung von Chromomycin-A3-hemisuccinaten
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer und brauchbarer Chromomycin-A3- derivate.
Chromomycin-A3 ist ein brauchbares und im Handel erhältliches Antibiotikum, das das Wachstum von grampositiven Bakterien hemmt. Chromomycin-A3 ist jedoch in Wasser ziemlich unlöslich, so dass es bisher schwierig war, das Antibiotikum in pharmazeutischen Präparaten in Form von parenteral verabreichbaren Lösungen anzuwenden.
Chromomycin-A8 hat im Molekül viele funktionelle Gruppen einschliesslich alkoholischer Hydroxylgruppen und phenolischer Hydroxylgruppen. Es sind Versuche unternommen worden, in derartige funktionelle Gruppen im Chromomycin-A3-Molekül hydrophile Gruppen einzuführen. Jedoch waren die Ergebnisse schlecht: in manchen Fällen waren die erhaltenen Derivate in Wasser nicht so löslich, wie es für praktische Zwecke erwünscht ist, und in anderen Fällen fehlte den erhaltenen Derivaten, selbst wenn sie wasserlöslich waren, die antibiotische Wirksamkeit des Chromomycin-As.
Es wurde gefunden, dass die partielle Veresterung von Chromomycin-A3 durch Behandlung mit Bernsteinsäure oder einem reaktionsfähigen funktionellen Derivat derselben die Anforderungen erfüllt und dass das Produkt, Chromomycin-A3-hemisuccinat und dessen Alkalimetall-, Erdalkalimetall- und Ammoniumsalze genügend wasserlöslich sind und die antibiotische Wirksamkeit von Chromomycin-A3 in wirksamer Weise beibehalten.
Es wurde auch gefunden, dass in dem Molekül von Chromomycin-A3-hemisuccinat nicht mehr als 3 Wasserstoffatome von alkoholischen Hydroxylgruppen des Chromomycin-A3-Stammkörpers durch die entsprechende Anzahl von Gruppen der Formel -O-CO-CH=CH°COOH ersetzt worden sind und dass Chromomycin-A3-hemisuccinat sowie seine Alkalimetall-, Erdalkalimetall- und Ammoniumsalze die gleiche antiobiotische Wirksamkeit haben wie Chromomycin-A3, während die Ester des Chromomycin-Ass, die durch Reaktion zwischen einer phenolischen Hydroxylgruppe des Chromomycin-A3 und der Carboxylgruppe der Bernsteinsäure gebildet sind, nur wenig der antibiotischen Wirksamkeit des Chromomycin A : l oder überhaupt keine antibiotische Wirksamkeit haben.
Das erste Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von Chromomycin-A3-hemisuccinat, das als nichttoxisches parenteral oder oral verabreichtes therapeutisches Mittel brauchbar ist, weil es - wie der Chromomycin-A3-Stammkörper-das Wachstum von grampositiven Bakterien hemmt und in Wasser löslich ist.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung von Chromomycin-A3-hemisuccinat sowie dessen Alkalimetall-, Erdalkalimetall- und Ammoniumsalzen.
Erfindungsgemäss wird Chromomycin-A3-hemisuccinat hergestellt, indem man Chromomycin-A3 mit Bernsteinsäure oder einem reaktionsfähigen funktionellen Derivat davon, wie z. B. Bernsteinsäureanhydrid oder Succinylchlorid, in einem Lösungsmittel bei einer Temperatur unterhalb 100 C, zweckmässig zwischen 0 und -100 C, behandelt. Als Lösungsmittel wird vorzugsweise Pyridin verwendet. Das erwähnte Verfahren wird vorzugsweise in Gegenwart einer basischen Substanz, wie z. B. Pyridin oder Chinolin, ausgeführt. Das so in dem Reaktionsgemisch erzeugte Chromomycin - A3 - hemi - succinat kann isoliert werden, wobei man die Eigenschaften des Chromomycin-A3-hemisuccinats, z. B.
Unterschiede zwischen dem Chromomycin-A-3-hemisuccinat und den Verunreinigungen hinsichtlich der Löslichkeit, des Verteilungsverhältnisses in flüssigen Phasen, der Absorbierbarkeit oder des Zusammenhaltens der Ionen, angemessen berücksichtigt. Zur Gewinnung des Chromomycin-A3-hemisuccinats aus dem Reaktionsgemisch kann es beispielsweise auf einer mit Silikagel gefüllten Säule adsorbiert und mit kleinen Mengen Oxalsäure enthaltendem Äthylacetat eluiert werden.
Chromomycin-A3-hemisuccinat kann an der -Carb oxylgruppe des Chromomycin-A3-hemisuccinats die ent sprechenden Salze der Alkalimetalle, Erdalkalimetalle und des Ammoniums bilden, und im allgemeinen sind diese Salze leichter löslich in Wasser als das freie Chromomycin-A3-hemisuccinat, und diese Salze fallen ebenfalls in den Rahmen der Erfindung. Unter diesen
Salzen werden die Alkalimetallsalze des Chromomycin A3-hemisuccinats vorzugsweise verwendet, da sie in Wasser leicht löslich sind und in einer an sich bekannten Weise hergestellt werden können, beispielsweise durch Umsetzung von Chromomycin-A3-hemisuccinat mit einem Alkali, wie z. B. Natriumhydrogencarbonat oder Kaliumhydrogencarbonat.
In dem Molekül des so erhaltenen Chromomycin-A3hemisuccinats sind die Wasserstoffatome von nicht mehr als drei alkoholischen Hydroxylgruppen des Chromo mycin-A3 durch die entsprechende Anzahl von Gruppen der Formel-O-CO-CH°CH=COOH ersetzt, während die phenolischen Hydroxylgruppen der Chromomycin As-Struktur nicht verestert sind.
Diese Chromomycin-A3-hemisuccinate sowie ihre wasserlöslichen Salze, z. B. die Alkalimetallsalze, Erdalkalimetallsalze und Ammoniumsalze, haben die antibiotische Wirksamkeit des Chromomycin-A3 und sind löslicher in Wasser und weniger toxisch als Chromomycin-A3. Die erfindungsgemäss hergestellten Produkte sind daher für die gleichen Zwecke wie Chromomycin A brauchbar, d. h. als therapeutische Mittel zur Hemmung des Wachstums von grampositiven Bakterien und für die Behandlung von Krankheiten, wie sie durch Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus hervorgerufen werden. So sind die neuen Hemisuccinate beispielsweise brauchbar für die Behandlung von durch B. subtilis infizierten Wunden und von durch Staphylococcus pyogenes var. aureus gebildeten eiternden Verletzungen in beliebigen tierischen Organen oder Geweben.
Die orale Dosis der neuen Hemisuccinate beträgt etwa 0,5 bis etwa 10 mg pro kg Körpergewicht, gewöhnlich etwa 1 bis 3 mg pro kg. Eine Salbe, die durch Kneten von etwa 40 mg beliebiger der Hemisuccinate pro g in eine Salbengrundlage (z. B. Lanolin oder weisse Vaseline) hergestellt ist, lässt sich ohne Reizung in wirksamer Weise für die Behandlung örtlicher Verletzungen anwenden.
Die folgenden Beispiele legen eine zur Zeit bevorzugte erläuternde, aber nicht einschränkende Ausführungsform der Erfindung dar.
Beispiel I
Eine kleine Menge körniges Natriumhydroxyd wird in 98 cm3 Pyridin gelöst. In der Pyridinlösung werden bei einer Temperatur zwischen 0 und -5 C 14 g gereinigtes Chromomycin-A3 gelöst. Zu dieser Pyridinlösung von Chromomycin-A3 werden 28 g Bernsteinsäureanhydrid gegeben, und dann wird das Gemisch bei einer Temperatur zwischen 0 und-5 C 40 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in etwa 250 cm3 kaltes Wasser gegossen, und das Reaktionsprodukt wird mit 300 cm3 Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen und dann mit 5- bis 10% iger wässriger Ameisensäurelösung geschüttelt, um das Pyridin vollständig aus der Äthylacetatschicht zu entfernen.
Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen und mit etwa 0,5% iger wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung geschüttelt, um die überschüssige Ameisensäure aus der Äthylacetatschicht zu entfernen.
Die Äthylacetatschicht wird mit einer wässrigen Natriumhydrogencarbonatlösung der gleichen Konzentration wie oben geschüttelt. Die gelbliche wässrige Schicht wird gesammelt. Zu dieser wässrigen Lösung werden zwei- bis dreimal so viel Wasser wie die wässrige Lösung gegeben, um die Konzentration an Natriumhydrogencarbonat in der wässrigen Lösung zu verdünnen. Diese wässrige Lö sung wird mehrere Male mit Äthylacetat extrahiert, bis die gelbliche Farbe in der Äthylacetatschicht verschwindet. 5% ige wässrige Ameisensäurelösung wird zu der wässrigen Lösung gegeben, um die letztere auf einen pH von etwa 4 bis 4,5 anzusäuern, und dann wird sie mit
300 cm3 Äthylacetat extrahiert. Dieser Sithylacetat- extrakt wird mehrere Male mit Wasser gewaschen, um die Ameisensäure praktisch zu entfernen.
Die Äthyl- acetatlösung wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur eingeengt. Der Rückstand wird mit Petroläther versetzt, wobei sich etwa 6,5 g eines gelblichen Niederschlages bilden. 6,5 g des Niederschlages werden in etwa 30 cm3 Äthylacetat gelöst. Zu der Athyl- acetatlösung werden etwa 120 cm3 Diäthyläther gegeben, wobei sich ein gelblicher Niederschlag bildet. Der Niederschlag wird mit Diäthyläther und dann mit Petrol äther gewaschen, wobei er etwa 5,3 g eines homogenen gelblichen Pulvers von Chromomycin-A3-hemisuccinat liefert.
Die physikochemischen und biologischen Eigenschaften des so hergestellten Chromomycin-A3-hemisuccinats sind im folgenden angegeben:
1. Elementaranalyse
Das Chromomycin-A3-hemisuccinat wurde bei 600 C getrocknet: C 55,74%, H 6,86%, OCH3 4,89%.
2. Spezifische Drehung
Das Chromomycin-A3-hemisuccinat wurde bei 600 C getrocknet: [a] D = -45 t 100 (c = 1, absolutes Äthanol) [aJu23 = -31 + 70 (c = 1, absolutes Methanol)
3.
Absorptionsspektrum
Das in Äthanol gemessene Ultraviolettabsorptions- spektrum ist in Fig. 2 dargestellt, und die maximalen Absorptionsbanden sind: imax (m,) 230 280 318 330 412
E1cm1% 198 370 58 48 65
Das mittels de Kaliumbromidpresslingverfahrens gemessene Infrarotabsorptionsspektrum ist in Fig. 1 dargestellt, und die wichtigen Absorptionsbanden in Mikron sind im folgenden angegeben:
2,9 (stark) 7,7 (schwach)
3,4 (mittel) 8,1 (mittel) 3,65-3,8 (schwach, breit) 8,5 (mittel)
5,75 (stark) 8,9 (schwach)
6,1 (stark) 9,35 (stark)
6,3 (schwach) 9,6 (Schulter)
6,6 (schwach) 10,6 (schwach)
7,0 (Schulter) 11,1 (mittel)
7,28 (mittel) 12,3 (schwach)
7,56 (schwach) 13,15 (schwach)
4.
Schmelzpunkt
Die Substanz erweicht bei 162 bis 1650 C und schmilzt bei 190 bis 1930 C unter Zersetzung.
5. Aussehen
Gelbliches Pulver.
6. Farbreaktion
Die Substanz zeigt eine blaue Farbreaktion mit Bartons Reagenz, das aus gleichen Volumen 1 % iger wässriger Ferrichloridlösung und 1 % iger wässriger Kaliumferricyanidlösung besteht, zeigt eine rote Farbreaktion von kurzer Dauer mit alkalischer Wasserstoffperoxydlösung und reduziert Fehlingsche Lösung.
7. Löslichkeit
Die Substanz ist löslich in Chloroform, Äthylacetat, Dioxan, Tetrahydrofuran, Aceton, Äthanol und Methanol, schwach löslich in Diäthyläther, unlöslich in Cyclohexan und Petroläther und leicht löslich in wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung, die die den freien Carboxylgruppen der Substanz äquivalente Menge Natriumhydrogencarbonat enthält.
8. Dünnschichtchromatographie
Ein homogenes Gemisch von 30 g Silikagel G (Merck, USA) und 60 cm3 Theorell-Pufferlösung (pH = 2,3, u 0,07) wird auf einer Glasplatte ausgebreitet, um eine 0,2 mm dicke Schicht auf der Glasplatte zu bilden, die dann eine Stunde lang bei 1000 C getrocknet wird. Auf diese Dünnschicht werden dann je eine Lösung von Chromomycin-A3 und Chromomycin-A3-hemisuccinat in Äthylacetat aufgetragen. Nach dem Trocknen werden die Flecken mit einem Gemisch von Benzol, Chloroform und Methanol (1: 2: 1 Volumen) entwikkelt. Chromomycin-A3 und Chromomycin-A3-hemisuccinat zeigen Rf-Werte von 0 67 + 0,1 bzw. 0,40 + 0 1
9.
Akute Toxizität
Die mittlere letale Dosis (LDÏo) bei Mäusen beträgt 11 78 + 0,56 mg pro kg Körpergewicht bei intravenöser Verabreichung und 14,64 + 0,60 mg pro kg Körpergewicht bei intraperitonealer Verabreichung.
10. Lokale Toxizität
Die verträglichen Höchstdosen von Chromomycin A3-hemisuccinat und Chromomycin-A3 und die schädlichen Mindestdosen derselben sind in Tabelle I wiedergegeben, wobei diese Dosen in Mikrogramm pro cm3 pro Kaninchen angegeben sind.
Tabelle I
Chromomycin- Chromomycin-
A3 A3-hemi- succinat Schädliche Mindestdosis 2 200 Verträgliche Höchstdosis 1,5 150
Wie in Tabelle I angegeben, beträgt die lokale Toxizität von Chromomycin-A3-hemisuccinat ein hundertstel derjenigen des Chromomycin-A3.
11. Mirkobizide Wirkung
Die Substanz zeigt mikrobizide Wirkungen von 1500 Einheiten pro mg gegen Staphylococcus aureus und etwa 3500 Einheiten pro mg gegen Bacillus subtilis, gemessen mittels des Waksman-Verdünnungsverfahrens.
Wenn die gleiche Reaktion wie im vorstehenden Beispiel während etwa 15 bis 30 Stunden statt während etwa 40 Stunden ausgeführt wird, wird hauptsächlich das Mono-hemisuccinat erzeugt, während die gleiche Reaktion während etwa 60 bis 70 Stunden hauptsächlich das Trihemisuccinat liefert. Die Wirkungen und Anwendungen derselben sind die gleichen wie für das Di-hemisuccinat. Es ist demgemäss auch möglich, ein Gemisch der drei partiellen Ester herzustellen; diese können als solche verwendet werden oder können in an sich bekannter Weise getrennt werden.
Die Alkalimetall-, Erdalkalimetall- und Ammoniumsalze können in bekannter Weise aus den nicht in Salze übergeführten partiellen Estern hergestellt werden. Bevorzugte Salze sind z. B. das Kalium-, Natrium-, Calcium- und Ammoniumsalz.
Beispiel 2
Eine kleine Menge körniges Natriumhydroxyd wird in 98 cm3 Pyridin gelöst. In der Pyridinlösung werden bei einer Temperatur zwischen5 und - 70 C 14 g gereinigtes Chromomycin-A3 gelöst. Zu dieser Pyridinlösung von Chromomycin-A3 werden 28 g Bernsteinsäureanhydrid gegeben, und dann wird das Gemisch bei einer Temperatur zwischen -5 und 70 C 35 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in etwa 250 cm3 kaltes Wasser gegossen, und das Reaktion produkt wird mit 300 cm3 Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen und dann mit 5- bis 1 % iger Ameisensäurelösung geschüttelt, um das Pyridin aus der Athylacetatschicht vollständig zu entfernen.
Die Äthyiacetatschicht wird mit Wasser gewaschen und mit etwa 0,5 % iger wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung geschüttelt, um die überschüssige Ameisensäure aus der Äthylacetatschicht zu entfernen. Die Athylacetatschicht wird mit einer wässrigen Natriumhydrogencarbonatlösung der gleichen Konzentration wie oben geschüttelt. Die gelbliche wässrige Schicht wird gesammelt. Zu dieser wässrigen Lösung wird zwei- bis dreimal so viel Wasser wie die wässrige Lösung gegeben, um die Konzentration an Natriumhydrogencarbonat in der wässrigen Lösung zu verdünnen.
Diese wässrige Lösung wird mehrere Male mit Äthylacetat extrahiert, bis die gelbliche Farbe in der Athylacetatschicht verschwindet. 5 S ige wässrige Ameisensäurelösung wird zu der wässrigen Lösung gegeben, um die letztere auf einen pH-Wert von etwa 4 bis 4,5 anzusäuern, dann wird sie mit 300 cm3 Äthylacetat extrahiert. Dieser Äthylacetatextrakt wird mehrere Male mit Wasser gewaschen, um die Ameisensäure praktisch zu entfernen. Die Athylacetatlösung wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur eingeengt.
Zu dem Rückstand wird Petroläther gegeben, wobei man etwa 5,2 g eines gelblichen Niederschlages erhält.
5,2 g des Niederschlages werden in etwa 30 cm3 Sithyl- acetat gelöst. Zu der Athylacetatlösung werden etwa 120 cm3 Diäthyläther gegeben, wobei sich ein gelblicher Niederschlag bildet. Der Niederschlag wird mit Diäthyl äther und dann mit Petroläther gewaschen, wobei er etwa 4,0 g eines homogenen gelblichen Pulvers von Chromomycin-A3-hemisuccinat liefert.
70 g Silikagel (Merck, USA, 0,08 mm) werden in
150 cm3 Athylacetatlösung, die 0,5 Gew. % Oxalsäure enthalten, suspendiert, und die Suspension wird in einer gleichmässigen Dicke auf einer Glasplatte von 40 X 35 cm ausgebreitet, die dann bei Zimmertemperatur mehrere Stunden lang in natürlicher Weise getrocknet wird. 70 mg des oben erhaltenen Chromomycin-As-hemisuccinates werden in etwa 1,5 cm3 Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird dann gleichmässig auf einer Linie in etwa 5 cm Entfernung vom Ende der Dünnschicht aufgetragen, und nach dem Trocknen wird sie mit Äthylacetat, das etwa 1% Oxalsäure enthält, mehrere Stunden lang in einem geschlossenen Gefäss entwickelt, worauf auf der Schicht mehrere gelbliche Bänder erscheinen.
Unter diesen Bändern kann man die Bänder mit Rf-Werten von 0,32 + 003 und 0,43 + 0,05 am deutlichsten unterscheiden, und beide werden mit Chromomycin-A3-monohemisuccinat identifiziert. Im folgenden werden das Chromomycin-A3monohemisuccinat mit den Rf-Werten 0,32 # 0,03 und 0,43 # 0,05 als CHS-I bzw. CHS-II bezeichnet, Jedes der Bänder von CHS-I und CHS-II wird gesammelt und mit einer kleinen Menge Aceton eluiert, wobei man eine gelbliche Acetonlösung erhält. Zu jeder der Acetonlösungen wird ein etwa viermal so grosses Volumen Äthylacetat wie das Volumen der Acetonlösung gegeben und danach siebenmal mit Wasser gewaschen.
Jede der so erhaltenen Äthylacetatlösungen wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Zu jedem der Konzentrate wird Petroläther oder eine kleine Menge Diäthyläther (peroxydfrei) gegeben, wobei ein gelbliches Pulver erhalten wird. CHS-I und CHS-II geben bei der Dünnschichtchromatographie, die in ähnlicher Weise wie oben erwähnt ausgeführt wird, einzelne Flecken mit dem Rf-Wert 0,30 bzw. 0,40.
Die physikochemischen und biologischen Eigenschaften der so hergestellten Chromomycin-A3-monohemisuccinate (CHS-I, CHS-II) werden inm folgenden angegeben:
1. Elementaranalyse
Berechnet für C51H72O23 # H2O # C4H4O3 # H2O:
C 55,65% H6,73% OCH3 5,22%.
Berechnet für C51H72O23 # H2O # C4H4O3:
C 56,41% H 6,71% OCH3 5,29%.
Berechnet für C51H72O23 # C4H4O3:
C 57,25% H 6,60% OCH3 5,38%.
Gefunden (Chromomycin - A3 - monohemisuccinat I [CHS-I], bei 55 C im Vakuum getrocknet):
C 56,10% H 6,77% OCH3 4,85%,
C 55,59% H 6,64% OCH3 5,00%.
Gefunden (Chromomycin - A3 - monohemisuccinat II [CHS-II], bei 550 C im Vakuum getrocknet:
C 56,60% H 6,94% OCH3 5,08 %,
C 57,00% H 6,97% OCH3 5,30%.
2. Spezifische Drehung
Chromomycin-A3-monohemisuccinat I, bei 550 C im Vakuum getrocknet: [α]D23 = -75 + 150 (c = 1, absolutes Äthanol).
Chromomycin-A3-monohemisuccinat II, bei 550 C im Vakuum getrocknet: [a]23 = ¯35 + 100 (c = 1, absolutes Äthanol),
3. Absorptionsspektrum
Die maximalen Absorptionen der in Athanol gemessenen Ultraviolettabsorptionsspektren sind: CHS-I #max (m ) 230 280 305 318 330 412-415 E1cm1% 190 405 Schulter 60 48 67 CHS-II #max (m ) 230 280 305 318 330 412-415 E1cm1% 180 400 Schulter 60 48 67
Die Infrarotabsorptionsspektren von CHS-I und CHS-II sind praktisch die gleichen wie in Fig. 1.
4. Schmelzpunkt
CHS-I erweicht bei 163 bis 1650 C und schmilzt bei 190 bis 1920 C unter Zersetzung.
CHS-II erweicht bei 158 bis 1610 C und schmilzt bei 187 bis 1900 C unter Zersetzung.
5. Mikrobizide Wirkung
CHS-I und CHS-II zeigen mikrobizide Wirkungen von etwa 1000 bis 2000 Einheiten pro mg gegen Staphylococcus aureus und etwa 2000 bis 5000 Einheiten pro mg gegen Bacillus subtilis, gemessen mittels des Waksman-Verdünnungsverfahrens.
6. Aussehen, Farbreaktionen, Löslichkeit, akute
Toxizität und lokale Toxizität
Diese Eigenschaften sind praktisch gleich wie diejenigen des in Beispiel 1 beschriebenen Chromomycin A3-hemisuccinats.
Process for the preparation of Chromomycin A3 hemisuccinates
The present invention relates to a process for the preparation of new and useful chromomycin A3 derivatives.
Chromomycin-A3 is a useful and commercially available antibiotic that inhibits the growth of gram-positive bacteria. Chromomycin-A3, however, is rather insoluble in water, so that it has hitherto been difficult to use the antibiotic in pharmaceutical preparations in the form of parenterally administrable solutions.
Chromomycin-A8 has many functional groups in the molecule including alcoholic hydroxyl groups and phenolic hydroxyl groups. Attempts have been made to introduce hydrophilic groups into such functional groups in the chromomycin A3 molecule. However, the results were poor: in some cases the derivatives obtained were not as soluble in water as is practical for practical purposes, and in other cases the derivatives obtained, even if they were water-soluble, lacked the antibiotic activity of Chromomycin-A.
It has been found that the partial esterification of chromomycin-A3 by treatment with succinic acid or a reactive functional derivative thereof meets the requirements and that the product, chromomycin-A3 hemisuccinate and its alkali metal, alkaline earth metal and ammonium salts are sufficiently water-soluble and the antibiotic Effectively maintain the effectiveness of Chromomycin A3.
It was also found that in the molecule of chromomycin A3 hemisuccinate no more than 3 hydrogen atoms of alcoholic hydroxyl groups of the chromomycin A3 parent body have been replaced by the corresponding number of groups of the formula -O-CO-CH = CH ° COOH and that Chromomycin-A3 hemisuccinate and its alkali metal, alkaline earth metal and ammonium salts have the same antibiotic activity as Chromomycin-A3, while the esters of Chromomycin-Ass, which are formed by the reaction between a phenolic hydroxyl group of Chromomycin-A3 and the carboxyl group of succinic acid have little or no antibiotic activity of Chromomycin A: l.
The first object of the present invention is to produce chromomycin A3 hemisuccinate which is useful as a nontoxic parenterally or orally administered therapeutic agent because, like chromomycin A3 parenthesis, it inhibits the growth of gram positive bacteria and is soluble in water .
Another object of the present invention is to provide a process for the preparation of chromomycin A3 hemisuccinate and its alkali metal, alkaline earth metal and ammonium salts.
According to the invention, chromomycin A3 hemisuccinate is prepared by reacting chromomycin A3 with succinic acid or a reactive functional derivative thereof, such as. B. succinic anhydride or succinyl chloride, in a solvent at a temperature below 100 C, conveniently between 0 and -100 C, treated. Pyridine is preferably used as the solvent. The aforementioned method is preferably carried out in the presence of a basic substance, such as. B. pyridine or quinoline performed. The chromomycin A3 hemisuccinate thus generated in the reaction mixture can be isolated using the properties of the chromomycin A3 hemisuccinate, e.g. B.
Differences between the Chromomycin-A-3-hemisuccinate and the impurities with regard to the solubility, the distribution ratio in liquid phases, the absorbability or the cohesion of the ions are adequately taken into account. To obtain the chromomycin A3 hemisuccinate from the reaction mixture, it can be adsorbed, for example, on a column filled with silica gel and eluted with ethyl acetate containing small amounts of oxalic acid.
Chromomycin A3 hemisuccinate can form the corresponding salts of alkali metals, alkaline earth metals and ammonium on the carb oxyl group of Chromomycin A3 hemisuccinate, and these salts are generally more soluble in water than the free Chromomycin A3 hemisuccinate, and these salts also fall within the scope of the invention. Under these
Salts, the alkali metal salts of Chromomycin A3 hemisuccinate are preferably used since they are readily soluble in water and can be prepared in a manner known per se, for example by reacting Chromomycin A3 hemisuccinate with an alkali, such as. B. sodium hydrogen carbonate or potassium hydrogen carbonate.
In the molecule of the chromomycin-A3hemisuccinate thus obtained, the hydrogen atoms of not more than three alcoholic hydroxyl groups of chromomycin-A3 are replaced by the corresponding number of groups of the formula -O-CO-CH ° CH = COOH, while the phenolic hydroxyl groups of chromomycin As structure are not esterified.
These chromomycin A3 hemisuccinates and their water-soluble salts, e.g. B. the alkali metal salts, alkaline earth metal salts and ammonium salts, have the antibiotic activity of Chromomycin-A3 and are more soluble in water and less toxic than Chromomycin-A3. The products prepared according to the invention can therefore be used for the same purposes as chromomycin A; H. as therapeutic agents for inhibiting the growth of gram positive bacteria and for the treatment of diseases such as those caused by Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus. For example, the new hemisuccinates can be used for the treatment of wounds infected by B. subtilis and of festering injuries formed by Staphylococcus pyogenes var. Aureus in any animal organs or tissues.
The oral dose of the new hemisuccinates is about 0.5 to about 10 mg per kg of body weight, usually about 1 to 3 mg per kg. An ointment made by kneading about 40 mg of any of the hemisuccinates per gram into an ointment base (e.g., lanolin or white petroleum jelly) is effective in treating localized injuries without irritation.
The following examples set forth a presently preferred illustrative but not limiting embodiment of the invention.
Example I.
A small amount of granular sodium hydroxide is dissolved in 98 cm3 of pyridine. 14 g of purified chromomycin-A3 are dissolved in the pyridine solution at a temperature between 0 and -5 C. To this pyridine solution of chromomycin-A3 are added 28 g of succinic anhydride, and then the mixture is stirred at a temperature between 0 and -5 ° C. for 40 hours. The reaction mixture is poured into about 250 cm3 of cold water and the reaction product is extracted with 300 cm3 of ethyl acetate. The ethyl acetate layer is washed with water and then shaken with 5-10% formic acid aqueous solution to completely remove the pyridine from the ethyl acetate layer.
The ethyl acetate layer is washed with water and shaken with about 0.5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution to remove the excess formic acid from the ethyl acetate layer.
The ethyl acetate layer is shaken with an aqueous sodium hydrogen carbonate solution of the same concentration as above. The yellowish aqueous layer is collected. Two to three times as much water as the aqueous solution is added to this aqueous solution in order to dilute the concentration of sodium hydrogen carbonate in the aqueous solution. This aqueous solution is extracted several times with ethyl acetate until the yellowish color in the ethyl acetate layer disappears. 5% aqueous formic acid solution is added to the aqueous solution to acidify the latter to a pH of about 4 to 4.5, and then it is mixed with
300 cm3 of ethyl acetate extracted. This sithyl acetate extract is washed several times with water in order to practically remove the formic acid.
The ethyl acetate solution is dried with anhydrous sodium sulfate and then concentrated under reduced pressure at low temperature. Petroleum ether is added to the residue, about 6.5 g of a yellowish precipitate being formed. 6.5 g of the precipitate are dissolved in about 30 cm3 of ethyl acetate. About 120 cm3 of diethyl ether are added to the ethyl acetate solution, a yellowish precipitate forming. The precipitate is washed with diethyl ether and then with petroleum ether, yielding about 5.3 g of a homogeneous yellowish powder of chromomycin A3-hemisuccinate.
The physicochemical and biological properties of the chromomycin A3 hemisuccinate so produced are given below:
1. Elemental analysis
The chromomycin A3 hemisuccinate was dried at 600 C: C 55.74%, H 6.86%, OCH3 4.89%.
2. Specific rotation
The chromomycin A3 hemisuccinate was dried at 600 C: [a] D = -45 t 100 (c = 1, absolute ethanol) [aJu23 = -31 + 70 (c = 1, absolute methanol)
3.
Absorption spectrum
The ultraviolet absorption spectrum measured in ethanol is shown in FIG. 2, and the maximum absorption bands are: imax (m,) 230 280 318 330 412
E1cm1% 198 370 58 48 65
The infrared absorption spectrum measured by the potassium bromide pellet method is shown in Figure 1, and the important absorption bands in microns are given below:
2.9 (strong) 7.7 (weak)
3.4 (medium) 8.1 (medium) 3.65-3.8 (weak, broad) 8.5 (medium)
5.75 (strong) 8.9 (weak)
6.1 (strong) 9.35 (strong)
6.3 (weak) 9.6 (shoulder)
6.6 (weak) 10.6 (weak)
7.0 (shoulder) 11.1 (medium)
7.28 (medium) 12.3 (weak)
7.56 (weak) 13.15 (weak)
4th
Melting point
The substance softens at 162 to 1650 C and melts at 190 to 1930 C with decomposition.
5. Appearance
Yellowish powder.
6. Color reaction
The substance shows a blue color reaction with Barton's reagent, which consists of equal volumes of 1% aqueous ferric chloride solution and 1% aqueous potassium ferricyanide solution, shows a red color reaction of short duration with alkaline hydrogen peroxide solution and reduces Fehling's solution.
7. Solubility
The substance is soluble in chloroform, ethyl acetate, dioxane, tetrahydrofuran, acetone, ethanol and methanol, slightly soluble in diethyl ether, insoluble in cyclohexane and petroleum ether and slightly soluble in aqueous sodium hydrogen carbonate solution, which contains the amount of sodium hydrogen carbonate equivalent to the free carboxyl groups of the substance.
8. Thin layer chromatography
A homogeneous mixture of 30 g of silica gel G (Merck, USA) and 60 cm3 of Theorell buffer solution (pH = 2.3, u 0.07) is spread on a glass plate to form a 0.2 mm thick layer on the glass plate which is then dried at 1000 C for one hour. A solution of chromomycin A3 and chromomycin A3 hemisuccinate in ethyl acetate is then applied to this thin layer. After drying, the stains are developed with a mixture of benzene, chloroform and methanol (1: 2: 1 volume). Chromomycin A3 and Chromomycin A3 hemisuccinate show Rf values of 0 67 + 0.1 and 0.40 + 0 1, respectively
9.
acute toxicity
The mean lethal dose (LDÏo) in mice is 11 78 + 0.56 mg per kg of body weight for intravenous administration and 14.64 + 0.60 mg per kg of body weight for intraperitoneal administration.
10. Local toxicity
The maximum tolerable doses of Chromomycin A3 hemisuccinate and Chromomycin A3 and the minimum harmful doses of the same are given in Table I, these doses being given in micrograms per cm3 per rabbit.
Table I.
Chromomycin Chromomycin
A3 A3 hemisuccinate Minimum harmful dose 2 200 Maximum tolerated dose 1.5 150
As indicated in Table I, the local toxicity of chromomycin A3 hemisuccinate is one hundredth that of chromomycin A3.
11. Microbicidal effect
The substance shows microbicidal effects of 1500 units per mg against Staphylococcus aureus and about 3500 units per mg against Bacillus subtilis as measured by the Waksman dilution method.
If the same reaction as in the previous example is carried out for about 15 to 30 hours instead of about 40 hours, the mono-hemisuccinate is mainly produced, while the same reaction mainly produces the trihemisuccinate for about 60 to 70 hours. The effects and uses thereof are the same as for the di-hemisuccinate. It is accordingly also possible to produce a mixture of the three partial esters; these can be used as such or can be separated in a manner known per se.
The alkali metal, alkaline earth metal and ammonium salts can be prepared in a known manner from the partial esters which have not been converted into salts. Preferred salts are e.g. B. the potassium, sodium, calcium and ammonium salts.
Example 2
A small amount of granular sodium hydroxide is dissolved in 98 cm3 of pyridine. 14 g of purified chromomycin A3 are dissolved in the pyridine solution at a temperature between 5 and 70 ° C. 28 g of succinic anhydride are added to this pyridine solution of chromomycin A3, and then the mixture is stirred at a temperature between -5 and 70 ° C. for 35 hours. The reaction mixture is poured into about 250 cm3 of cold water, and the reaction product is extracted with 300 cm3 of ethyl acetate. The ethyl acetate layer is washed with water and then shaken with 5 to 1% formic acid solution to completely remove the pyridine from the ethyl acetate layer.
The ethyl acetate layer is washed with water and shaken with about 0.5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution to remove the excess formic acid from the ethyl acetate layer. The ethyl acetate layer is shaken with an aqueous sodium hydrogen carbonate solution of the same concentration as above. The yellowish aqueous layer is collected. Two to three times as much water as the aqueous solution is added to this aqueous solution in order to dilute the concentration of sodium hydrogen carbonate in the aqueous solution.
This aqueous solution is extracted several times with ethyl acetate until the yellowish color in the ethyl acetate layer disappears. 5% aqueous formic acid solution is added to the aqueous solution to acidify the latter to a pH of about 4 to 4.5, then it is extracted with 300 cm3 of ethyl acetate. This ethyl acetate extract is washed several times with water in order to practically remove the formic acid. The ethyl acetate solution is dried with anhydrous sodium sulfate and then concentrated under reduced pressure at low temperature.
Petroleum ether is added to the residue, about 5.2 g of a yellowish precipitate being obtained.
5.2 g of the precipitate are dissolved in about 30 cm3 of sithyl acetate. About 120 cm3 of diethyl ether are added to the ethyl acetate solution, a yellowish precipitate forming. The precipitate is washed with diethyl ether and then with petroleum ether, yielding about 4.0 g of a homogeneous yellowish powder of chromomycin A3-hemisuccinate.
70 g of silica gel (Merck, USA, 0.08 mm) are in
150 cm3 of ethyl acetate solution containing 0.5% by weight of oxalic acid is suspended, and the suspension is spread to a uniform thickness on a glass plate of 40 X 35 cm, which is then dried naturally at room temperature for several hours. 70 mg of the chromomycin As hemisuccinate obtained above are dissolved in about 1.5 cm3 of ethyl acetate. The solution is then evenly applied in a line about 5 cm from the end of the thin layer, and after drying it is developed with ethyl acetate, which contains about 1% oxalic acid, for several hours in a closed vessel, whereupon several yellowish ones on the layer Ribbons appear.
Among these bands, the bands with Rf values of 0.32 + 003 and 0.43 + 0.05 can most clearly be distinguished, and both are identified with Chromomycin A3 monohemisuccinate. In the following, the chromomycin A3 monohemisuccinate with Rf values 0.32 # 0.03 and 0.43 # 0.05 are referred to as CHS-I and CHS-II, respectively. Each of the bands of CHS-I and CHS-II becomes and eluted with a small amount of acetone to give a yellowish acetone solution. About four times as large a volume of ethyl acetate as the volume of the acetone solution is added to each of the acetone solutions and then washed seven times with water.
Each of the ethyl acetate solutions thus obtained is dried with anhydrous sodium sulfate and concentrated under reduced pressure. Petroleum ether or a small amount of diethyl ether (peroxide-free) is added to each of the concentrates, a yellowish powder being obtained. CHS-I and CHS-II give individual spots with Rf values 0.30 and 0.40, respectively, on thin layer chromatography carried out in a manner similar to that mentioned above.
The physicochemical and biological properties of the chromomycin A3 monohemisuccinate (CHS-I, CHS-II) produced in this way are given as follows:
1. Elemental analysis
Calculated for C51H72O23 # H2O # C4H4O3 # H2O:
C 55.65% H6.73% OCH3 5.22%.
Calculated for C51H72O23 # H2O # C4H4O3:
C 56.41% H 6.71% OCH3 5.29%.
Calculated for C51H72O23 # C4H4O3:
C 57.25% H 6.60% OCH3 5.38%.
Found (Chromomycin - A3 - monohemisuccinate I [CHS-I], dried at 55 C in a vacuum):
C 56.10% H 6.77% OCH3 4.85%,
C 55.59% H 6.64% OCH3 5.00%.
Found (Chromomycin - A3 - monohemisuccinate II [CHS-II], dried at 550 C in vacuo:
C 56.60% H 6.94% OCH3 5.08%,
C 57.00% H 6.97% OCH3 5.30%.
2. Specific rotation
Chromomycin A3 monohemisuccinate I, dried at 550 C in vacuo: [α] D23 = -75 + 150 (c = 1, absolute ethanol).
Chromomycin-A3-monohemisuccinate II, dried at 550 C in a vacuum: [a] 23 = ¯35 + 100 (c = 1, absolute ethanol),
3. Absorption spectrum
The maximum absorptions of the ultraviolet absorption spectra measured in ethanol are: CHS-I #max (m) 230 280 305 318 330 412-415 E1cm1% 190 405 shoulder 60 48 67 CHS-II #max (m) 230 280 305 318 330 412-415 E1cm1% 180 400 shoulder 60 48 67
The infrared absorption spectra of CHS-I and CHS-II are practically the same as in Fig. 1.
4. Melting point
CHS-I softens at 163 to 1650 C and melts at 190 to 1920 C with decomposition.
CHS-II softens at 158 to 1610 C and melts at 187 to 1900 C with decomposition.
5. Microbicidal effect
CHS-I and CHS-II show microbicidal effects of about 1000 to 2000 units per mg against Staphylococcus aureus and about 2000 to 5000 units per mg against Bacillus subtilis as measured by the Waksman dilution method.
6. Appearance, color reactions, solubility, acute
Toxicity and local toxicity
These properties are practically the same as those of the Chromomycin A3 hemisuccinate described in Example 1.