Procédé de fabrication de l'hydroxocobalamine
La présente invention vise un procédé de fabrication de l'hydroxocobalamine à partir de milieux naturels, à savoir le foie de solipèdes (bovidés, porcins et autres).
On connaît, notamment par les publications de
Rickes et de ses collaborateurs (voir par exemple
Science (N. Y.), 1948, t. 107, p. 396), un groupe de composés appelés vitamines B 12, ou encore cobalamines du fait que leur molécule comporte un atome central de cobalt.
Ces composés ont acquis une importance considérable en thérapeutique, en particulier dans le traitement de la leucémie.
Bien que la nomenclature ne soit pas encore parfaitement fixée, on désigne en général par vitamine
B 12 ou cyanocobalamine un composé dans lequel l'atome de cobalt porte un radical nitrile et comporte donc un groupe cyanure Co-C=N-.
Parmi les dérivés apparentés au précédent, le plus intéressant est l'hydroxocobalamine, généralement appelée vitamine B 12b (parfois aussi B 12a), qui comporte le groupe Co - OH et à laquelle le radical hydroxyle confère des propriétés basiques lui permettant de pénétrer plus facilement dans le métabolisme des individus.
L'hydroxocobalamine peut être obtenue à partir de la cyanocobalamine par différentes méthodes, comportant en général une réduction suivie d'une oxydation.
On a toutefois constaté que l'hydroxocobalamine obtenue à partir de milieux naturels, et notamment du foie, pouvait avoir une plus grande activité thérapeutique que le produit de synthèse. On a donc cherché à extraire l'hydroxocobalamine de divers milieux naturels, tels que les cellules de bacilles propioniques ou mégathériums et les cultures de divers streptomycès.
Cependant les méthodes préconisées ne sont applicables qu'à des poudres sèches. Or, la dessiccation entraîne une perte sensible en vitamine B 12.
La présente invention a pour but de permettre l'extraction de l'hydroxocobalamine native par un procédé s'appliquant notamment à des milieux naturels contenant une très forte proportion d'humidité.
Conformément à la présente invention, le procédé de fabrication de l'hydroxocobalamine est caractérisé en ce que l'on effectue une addition massive de sulfate d'ammonium à l'extrait concentré ce qui assure le relargage et l'adsorption des protéines et des complexes protéines-hydroxocobalamine, le gâteau formé étant remis en solution, après quoi on provoque par addition d'un acide fort la destruction des complexes formés par l'hydroxocobaîamine avec les aminoacides ou protéines du foie traité, et la fixation de l'acide fort sur le groupe hydroxo.
L'addition massive de sulfate d'ammonium assure non seulement le relargage mais encore l'adsorption de l'hydroxocobalamine ainsi que de ses complexes (par relargage on entend l'élimination d'un composé organique d'une solution aqueuse au moyen de l'addition d'un sel). L'invention permet ainsi d'effectuer l'élution de l'hydroxocobalamine à partir de milieux aqueux, alcooliques ou hydro-alcooliques au moyen d'un solvant normalement miscible en toute proportion avec lesdits milieux, tel que l'acétone.
L'utilisation de sulfate d'ammonium dans la technique des vitamines B 12 a été proposée précédemment mais à des doses infiniment plus faibles que celles visées par l'invention, et pour un but tout dif férent, à savoir la stabilisation de solutions desdites
vitamines.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le foie haché est extrait par l'alcool aqueux à pH 4 environ; après agitation, on filtre. L'extrait alcoolique ainsi obtenu est concentré, de préférence sous vide, afin d'en chasser l'alcool.
On laisse reposer à basse température. Si un précipité se forme on l'élimine par centrifugation ou filtration.
La liqueur finalement recueillie contient l'hydroxocobalamine qui en majeure partie existe sous forme de complexe (en effet la fonction basique de l'hydroxocobalamine contenue dans le foie lui permet de se fixer sur la fonction acide aminé des protéines dont le point isoélectrique est inférieur à 7); on en isole cette vitamine, accompagnée de protéines, par la méthode suivante:
On détermine la teneur en extrait sec de cette liqueur, on en déduit par différence la teneur en eau et on ajoute du sulfate d'ammonium à raison de 50 à 70 parties en poids pour 100 parties d'eau. On agite et porte à une température de 50 à 700 C pour dissoudre le sulfate d'ammonium. La solution ainsi obtenue est refroidie à 00 C ou un peu au-dessus.
I1 se produit un relargage; le gâteau formé contient, d'une part une quantité importante de sulfate d'ammonium et, d'autre part, divers produits organiques dont, pratiquement, la totalité de l'hydroxocobalamine présente dans la liqueur initiale.
En effet, grâce à l'addition massive de sulfate d'ammonium, les protéines du foie étant relarguées, entraînent les cobalamines liées comme expliqué précédemment, ce qui permet une première concentration de ces cobalamines et une première purification.
Par addition d'acide fort en excès qui abaisse le pH on déplace la liaison faiblement acide des protéines pour bloquer l'hydroxocobalamine, non plus sur l'acide aminé mais sur l'acide fort utilisé. La fixation a lieu sur le groupe hydroxo.
On laisse les réactifs en présence pendant un certain temps, puis on reprend par un solvant organique tel que l'acétone; on agite et on laisse décanter.
Du fait de la haute teneur en sulfate d'ammonium, il se forme deux couches : une couche inférieure aqueuse contenant pratiquement la totalité du sulfate d'ammonium et une couche supérieure acétonique contenant la vitamine recherchée.
La couche inférieure est rejetée, après vérification de l'absence de vitamine. (Si, du fait d'un mauvais réglage, cette couche en contenait encore, une deuxième extraction acétonique serait effectuée.)
On laisse la couche supérieure au repos à basse température pour assurer une séparation complète dc la vitamine d'avec les protéines.
On ajoute alors la quantité d'acétone nécessaire pour porter le titre à environ 80 O/o d'acétone. S'il se produit une précipitation de protéines, on élimine le précipité par filtration ou centrifugation ; ces protéi- nes sont épuisées par un peu d'acétone à 80 o/o environ et on s'assure qu'une solution aqueuse de ces protéines ne contient pratiquement plus d'hydroxo
cobalamine.
La solution acétonique filtrée est ensuite chromatographiée sur une colonne d'alumine tamponnée à un pH voisin de la neutralité. On élue avec de l'acé- tone à 50 /o environ. La fraction contenant la vitamine est amenée à un pH compris entre 3,5 et 4, puis l'acétone est chassée sous vide. On effectue un deuxième relargage au sulfate d'ammonium, puis le gâteau est repris par l'acétone comme indiqué précédemment. On chromatographie une deuxième fois sur alumine; la fraction de coeur de la chromatographie contenant l'hydroxocobalamine, est portée à un pH de 8,5 à 9, de façon à libérer cette vitamine des complexes qu'elle aurait pu former avec les acides contenus dans la liqueur.
Le titre de la solution est alors ajusté à 10 à 12 volumes d'acétone pour 1 volume d'eau. Par repos à froid, l'hydroxocobalamine cristallise.
D'autres particularités de l'invention résulteront encore de la description ci-après, donnée à titre d'exemple.
Exemple. - 1000 kg de foie de boeuf sont haches puis repris, à la température ambiante, par 2000 litres d'alcool éthylique à 50O amené à pH 4 par addition d'acide chlorhydrique. Après agitation et chauffage à 500 C, on filtre (sur filtre-presse ou filtre rotatif) puis on lave le résidu resté sur le filtre par passage de 200 litres d'alcool à 500. On obtient 2200 litres d'un extrait de couleur jaune qui est ramené à 250 litres par concentration sous vide à basse température.
Ce concentré est abandonné au repos pendant 12heures à une température comprise entre 0O et 5" et il est éventuellement clarifié par centrifugation.
A la solution obtenue, on ajoute 125 kg de sulfate d'ammonium, en agitant et en portant la température entre 55 et 600. On laisse refroidir à une température comprise entre 00 et 50. Il se produit un relargage ; on filtre sur filtre-presse ou filtre rotatif. On obtient 40kg de gâteau humide, contenant une forte proportion de sulfate d'ammonium ; le filtrat est rejeté, après contrôle de l'absence d'hydroxocobalamine, effectué par exemple au photomètre d'absorption.
Le gâteau est mis en solution par un volume d'eau sensiblement égal au sien ; la solution est ajustée à pH 3,8 au moyen d'acide chlorhydrique; on ajoute 40 litres d'acétone, on agite puis laisse décanter. On prend alors la densité de la couche supérieure, qui doit être sensiblement 0,910, correspondant à 60 o/o environ d'acétone.
Après contrôle de l'absence d'hydroxocobalamine, la couche inférieure aqueuse est rejetée. La couche supérieure est abandonnée pendant 12 heures à une température de 0O à 5O, puis on y ajoute le volume d'acétone voulu pour porter le degré acétonique à 80 O/o.
On filtre, puis on lave le résidu par 5 litres d'acétone à 80 0/o. On obtient 80 litres d'une solution acétonique (solution A) titrant 1 à 2 o/o d'extrait sec et 15 gamma d'hydroxocobalamine par centimètre cube. On chromatographie la solution précitée sur une colonne d'alumine tamponnée à pH 7, puis on élue avec de l'acétone à 50 /o. La vitamine se retrouve dans une fraction de coeur de 6 litres.
Cette solution est amenée à pH 3,5, puis concentrée sous vide ; on obtient 2 litres de solution aqueuse contenant l'hydroxocobalamine. On ajoute 1,3 kg de sulfate d'ammonium et on fait relarguer comme pré- cédemment. On obtient 0,6 kg d'un gâteau humide qui est repris par son volume d'eau amenée à pH 3,6.
On laisse en contact 2 heures puis on reprend par 600 cm' d'acétone. Après agitation et décantation, on ajuste, par addition d'acétone, la couche supérieure à une teneur de 80 O/o d'acétone.
On obtient 1200 cm3 d'une solution acétonique que l'on chromatographie sur une petite colonne d'alumine; on sépare une fraction de cceur de 250 cm3 que l'on amène à pH 9 par addition de soude. On porte le volume à 1250 cm3 par addition d'acétone et laisse cristalliser. Après filtration et séchage, on obtient 1 gramme d'hydroxocobalamine.
Il est évident que l'invention n'est pas limitée à la réalisation décrite, et qu'on peut apporter à celle-ci diverses variantes ; ainsi, le traitement de la solution acétonique (solution A) peut s'effectuer par toute méthode connue; on peut, d'autre part, selon les résultats des essais relatifs à la présence d'hydroxocobalamine dans les diverses fractions solides ou liquides, supprimer ou au contraire multiplier les extractions complémentaires mentionnées plus haut.
Manufacturing process for hydroxocobalamin
The present invention relates to a process for manufacturing hydroxocobalamin from natural media, namely the liver of solipeds (bovids, pigs and others).
We know, in particular from the publications of
Rickes and his collaborators (see for example
Science (N. Y.), 1948, t. 107, p. 396), a group of compounds called vitamins B 12, or cobalamins because their molecule has a central atom of cobalt.
These compounds have acquired considerable importance in therapy, in particular in the treatment of leukemia.
Although the nomenclature is not yet perfectly fixed, in general we mean by vitamin
B 12 or cyanocobalamin, a compound in which the cobalt atom carries a nitrile radical and therefore contains a cyanide group Co-C = N-.
Among the derivatives related to the previous one, the most interesting is hydroxocobalamin, generally called vitamin B 12b (sometimes also B 12a), which contains the Co - OH group and to which the hydroxyl radical confers basic properties allowing it to penetrate more easily. in the metabolism of individuals.
Hydroxocobalamin can be obtained from cyanocobalamin by various methods, usually involving reduction followed by oxidation.
However, it has been observed that the hydroxocobalamin obtained from natural media, and in particular from the liver, could have greater therapeutic activity than the synthetic product. It has therefore been sought to extract hydroxocobalamin from various natural media, such as the cells of propionic bacilli or megatheriums and cultures of various streptomyces.
However, the recommended methods are applicable only to dry powders. However, desiccation leads to a significant loss of vitamin B 12.
The object of the present invention is to allow the extraction of native hydroxocobalamin by a process applying in particular to natural media containing a very high proportion of moisture.
According to the present invention, the process for the manufacture of hydroxocobalamin is characterized in that a massive addition of ammonium sulfate to the concentrated extract is carried out, which ensures the release and adsorption of proteins and complexes. proteins-hydroxocobalamin, the cake formed being put back into solution, after which the addition of a strong acid is caused by the destruction of the complexes formed by the hydroxocobaïamine with the amino acids or proteins of the treated liver, and the binding of the strong acid on the hydroxo group.
The massive addition of ammonium sulphate ensures not only the release but also the adsorption of the hydroxocobalamin as well as of its complexes (by release is meant the elimination of an organic compound from an aqueous solution by means of addition of a salt). The invention thus makes it possible to carry out the elution of hydroxocobalamin from aqueous, alcoholic or hydro-alcoholic media by means of a solvent normally miscible in any proportion with said media, such as acetone.
The use of ammonium sulphate in the vitamin B 12 technique has been proposed previously, but at infinitely lower doses than those targeted by the invention, and for a quite different purpose, namely the stabilization of solutions of said solutions.
vitamins.
According to a particularly advantageous embodiment of the invention, the minced liver is extracted with aqueous alcohol at approximately pH 4; after stirring, it is filtered. The alcoholic extract thus obtained is concentrated, preferably under vacuum, in order to remove the alcohol therefrom.
Let stand at low temperature. If a precipitate forms it is removed by centrifugation or filtration.
The liquor finally collected contains hydroxocobalamin which for the most part exists in the form of a complex (in fact the basic function of hydroxocobalamin contained in the liver allows it to bind to the amino acid function of proteins whose isoelectric point is less than 7); this vitamin is isolated from it, along with proteins, by the following method:
The solids content of this liquor is determined, the water content is deduced therefrom and ammonium sulphate is added in an amount of 50 to 70 parts by weight per 100 parts of water. Stirred and brought to a temperature of 50 to 700 C to dissolve the ammonium sulfate. The solution thus obtained is cooled to 00 C or a little above.
A release occurs; the cake formed contains, on the one hand, a large amount of ammonium sulphate and, on the other hand, various organic products including practically all of the hydroxocobalamin present in the initial liquor.
Indeed, thanks to the massive addition of ammonium sulphate, the liver proteins being released, entrain the cobalamins bound as explained previously, which allows a first concentration of these cobalamins and a first purification.
By adding excess strong acid which lowers the pH, the weak acidic bond of the proteins is displaced to block the hydroxocobalamin, no longer on the amino acid but on the strong acid used. Binding takes place on the hydroxo group.
The reagents are left in the presence for a certain time, then the residue is taken up in an organic solvent such as acetone; it is stirred and left to settle.
Due to the high content of ammonium sulfate, two layers are formed: a lower aqueous layer containing almost all of the ammonium sulfate and an upper acetone layer containing the desired vitamin.
The lower layer is discarded, after checking for the absence of vitamin. (If, due to improper adjustment, this layer still contained it, a second acetone extraction would be performed.)
The top layer is left to stand at low temperature to ensure complete separation of the vitamin from the protein.
The quantity of acetone necessary to bring the titer to about 80 O / o of acetone is then added. If protein precipitation occurs, the precipitate is removed by filtration or centrifugation; these proteins are exhausted by a little acetone at about 80 o / o and it is ensured that an aqueous solution of these proteins hardly contains any more hydroxo
cobalamin.
The filtered acetone solution is then chromatographed on a column of alumina buffered at a pH close to neutrality. It is eluted with acetone at about 50%. The fraction containing the vitamin is brought to a pH of between 3.5 and 4, then the acetone is driven off under vacuum. A second salting out with ammonium sulphate is carried out, then the cake is taken up in acetone as indicated above. Chromatography is carried out a second time on alumina; the core fraction of the chromatography containing hydroxocobalamin is brought to a pH of 8.5 to 9, so as to release this vitamin from the complexes which it could have formed with the acids contained in the liquor.
The titer of the solution is then adjusted to 10 to 12 volumes of acetone per 1 volume of water. On standing cold, hydroxocobalamin crystallizes.
Other features of the invention will also result from the description below, given by way of example.
Example. - 1000 kg of beef liver are minced and then taken up, at room temperature, in 2000 liters of 50O ethyl alcohol brought to pH 4 by adding hydrochloric acid. After stirring and heating at 500 ° C., the mixture is filtered (on a filter press or rotary filter) then the residue remaining on the filter is washed by passing 200 liters of alcohol at 500 ° C. 2200 liters of a yellow extract are obtained. which is reduced to 250 liters by concentration under vacuum at low temperature.
This concentrate is left to stand for 12 hours at a temperature between 0O and 5 "and it is optionally clarified by centrifugation.
125 kg of ammonium sulphate are added to the solution obtained, with stirring and the temperature being raised between 55 and 600. The mixture is left to cool to a temperature of between 00 and 50. A release occurs; filtered through a filter press or rotary filter. 40 kg of wet cake is obtained, containing a high proportion of ammonium sulphate; the filtrate is rejected, after checking for the absence of hydroxocobalamin, carried out for example with an absorption photometer.
The cake is dissolved with a volume of water substantially equal to its own; the solution is adjusted to pH 3.8 using hydrochloric acid; 40 liters of acetone are added, the mixture is stirred and then allowed to settle. The density of the upper layer is then taken, which must be approximately 0.910, corresponding to approximately 60% of acetone.
After checking for the absence of hydroxocobalamin, the aqueous lower layer is discarded. The upper layer is left for 12 hours at a temperature of 0O to 5O, then the desired volume of acetone is added to it to bring the acetone degree to 80 O / o.
It is filtered, then the residue is washed with 5 liters of 80 ° / o acetone. 80 liters of an acetone solution (solution A) are obtained, titrating 1 to 2 o / o of dry extract and 15 gamma of hydroxocobalamin per cubic centimeter. The above solution is chromatographed on an alumina column buffered to pH 7, then eluted with acetone at 50%. The vitamin is found in a 6 liter fraction of the heart.
This solution is brought to pH 3.5, then concentrated in vacuo; 2 liters of aqueous solution containing hydroxocobalamin are obtained. 1.3 kg of ammonium sulphate are added and the mixture is salted out as before. 0.6 kg of a wet cake is obtained which is taken up in its volume of water brought to pH 3.6.
It is left in contact for 2 hours and then taken up in 600 cm 3 of acetone. After stirring and decantation, the upper layer is adjusted by adding acetone to a content of 80% acetone.
1200 cm3 of an acetone solution are obtained which is chromatographed on a small alumina column; separating a fraction of heart of 250 cm3 which is brought to pH 9 by adding sodium hydroxide. The volume is brought to 1250 cm3 by adding acetone and allowed to crystallize. After filtration and drying, 1 gram of hydroxocobalamin is obtained.
It is obvious that the invention is not limited to the embodiment described, and that various variants can be made thereto; thus, the treatment of the acetone solution (solution A) can be carried out by any known method; on the other hand, depending on the results of the tests relating to the presence of hydroxocobalamin in the various solid or liquid fractions, it is possible to eliminate or on the contrary multiply the additional extractions mentioned above.