Procédé de préparation de l'acide citrique par fermentation La présente invention a pour objet un procédé de préparation de l'acide citrique par fermentation, ca ractérisé en ce :que l'on cultive dans des conditions aérobies le Trichoderma viride dans un milieu de cul ture contenant un saccharide.
L'acide citrique a été employé principalement jusqu'à présent pour assaisonner les denrées alimen taires, et une grande partie de l'acide citrique est actuellement employée dans ce but, par exemple pour donner une saveur acide à des, denrées telles que boissons rafraîchissantes, jus de fruits, confiture, gelée, pastilles, bonbons, etc., lors de leur fabrica tion.
Récemment, l'acide citrique a trouvé une nou- velle application comme matière industrielle, par exemple comme plastifiant. Entre autres, les esters tels que l'acétyl-triéthyl-citrate, le triéthyl-citrate, l'acétyl-tributyl-citrate, le tributyl-citrate, l'acétyl-tri- 2-éthyl-hexyl-citrate et analogues, sont utilisés pour la préparation de laques,
de tuyaux et d'emballages de denrées alimentaires. De plus, le sel de baryum, le sel de nickel, le :sel de sodium et le ses d'ammo nium (dibasique) de l'acide citrique sont employés respectivement pour :les peintures, 1e placage, la mé decine et les revêtements antirouille d'articles en fer.
On sait depuis longtemps que l'acide citrique peut être obtenu à partir de nombreux champignons. Il a été décrit par exemple par Foster, J. A., dans Chemical Activities of Fungi , 378, (1949), que des souches appartenant aux genres<I>Aspergillus,</I> Pe- nicillium (contenant l'ancien Citromyces), <I>Mucor, Bo-</I> <I>trytis,</I> Coniof ora et similaires,
peuvent produire de l'acide citrique dans des conditions de culture appro priées. Parmi celles-ci, celles appartenant aux genres <I>Aspergillus</I> et Penicillium ont une capacité marquée de produire de l'acide citrique. Cependant, la souche appartenant <I>à l'Aspergillus piger</I> est communément employée à présent pour la préparation commerciale d'acide citrique.
Comme mentionné ci-dessus, une grande variété de champignons peuvent produire de l'acide citrique, mais, au moins jusqu'à présent, il n'est nulle part mentionné que le Trichoderma viride puisse produire une quantité ,substantielle d'acide citrique.
Il a été découvert par les présents inventeurs que certaines souches appartenant au Trichoderma viride peuvent produire et accumuler une quantité substan tielle d'acide citrique dans des conditions de culture appropriées.
Une telle découverte est tout à fait nouvelle au vu de la nature des micro-organismes utilisés, et l'em ploi d'un procédé suivant l'invention offre de nom breux avantages en comparaison -du :procédé connu, à savoir le procédé utilisant <I>l'Aspergillus piger.</I>
Lorsqu'on emploie<I>l'Aspergillus piger</I> pour la fer mentation de l'acide citrique, les principales difficul tés qui ont été rencontrées ,sont les suivantes a) Problème des sous-produits ; b) on .a besoin d'une cure de fermentation résistant aux acides ; c) il faut employer des, matières premières purifiées ; d) la capacité de la culture de produire -de l'acide tend à dégénérer;
e) les matières amylacées doivent être hydrolysées avant l'emploi.
Lorsqu'on emploie le Trichoderma viride, on ne rencontre aucune de ces difficultés. En raison de sa forte activité d'amylase et de cellulase, même de l'amidon brut de dextrine peut être amené à fermen ter sans être soumis à aucun traitement préalable, et on peut le faire fermenter aussi facilement que des mono- ou di-saccharides tels que le glucose, le fruc tose, le sucrose, le maltose, etc.
Les milieux de culture peuvent contenir n'importe lequel des carbohydrates énumérés ci-dessus, sui vant leur disponibilité. Comme source d'azote, on peut employer toute matière organique telle que du son de froment, un gâteau de soya, du son de riz, etc. ou toute matière inorganique telle que du chlo rure d'ammonium, du sulfate d'ammonium, du nitrate de sodium, du nitrate d'ammonium, de l'urée, etc. De plus, on ajoute généralement au milieu du phos phate de potassium et du carbonate de calcium.
La fermentation est conduite généralement à des températures comprises entre 20 et 35 C et à un pH compris entre 3,0 et 7,0 pendant trois à sept jours dans des conditions aérobies. Lorsqu'on emploie un milieu liquide, on peut utiliser un procédé de culture submergé, rotatoire ou fixe ; lorsqu'on em ploie un milieu solide, on peut utiliser un procédé de culture rotatoire ou fixe.
Différents procédés habituels peuvent être appli qués pour recueillir l'acide citrique à partir .du milieu de culture après la fin de la fermentation. Lorsque du carbonate de calcium est utilisé comme ingrédient du milieu, par exemple, on ajoute de l'acide sulfuri que au bouillon fermenté et l'on sépare par filtrage les solides insolubles (formés principalement de my célium et de sulfate .de calcium), puis l'on traite le filtrat avec du charbon actif pour éliminer les impu retés, et le filtrat est séché vers 80- C environ, et l'on obtient de l'acide citrique brut.
Selon une va riante, une quantité calculée d'hydroxyde de calcium peut être ajoutée au filtrat (qui a été traité avec du charbon actif) de manière à recueillir l'acide citrique sous forme de citrate de calcium insoluble. On peut aussi ajouter de l'acide chlorhydrique au liquide de culture pour séparer et dissoudre l'acide citrique, pour éliminer les solides, tels que le mycélium et analogues, traiter le filtrat avec un charbon actif, y ajouter de l'ammoniaque aqueuse concentrée pour porter le pH à 7,5-8,0 et le faire bouillir pour re cueillir le citrate de calcium insoluble.
Le Trichodernia <I>virile tel</I> que défini dans la pré sente invention est basé sur la classification décrite dans Transactions of the British Mycological So- ciety , par Bisby G. R., 23, 149 (1939).
Il comprend donc le Trichodertna lignorm, le Trichoderma co- nirrgi, le Trichoderma <I>album</I> et le Verticilliirm glau- cum, qui sont identifiés comme tels en se basant sur l'ancienne classification. <I>Exemple d</I> Des spores du Trichoderma <I>virile</I> Pers. ex Fr.
No. K-0 (ATCC N 13233) furent inoculées dans un milieu liquide formé de 10 g de glucose et de 0,5 g d'extrait de levure pour 100 ml du milieu. Après avoir agité la culture à 250 C pendant vingt-quatre heures, 1 ml du liquide de culture fut transféré dans le milieu de fermentation comprenant 10g de pomme de terre, 0,5 g d'extrait de levure et 7 g de carbonate de calcium pour 100 ml du milieu et fut cultivé avec agitation à 25- C pendant 7 jours.
Le résultat fut le suivant:
EMI0002.0027
pH <SEP> 7,3
<tb> Acide <SEP> citrique <SEP> .86,4 <SEP> mg/ml
<tb> Amidon <SEP> résiduel <SEP> 9,0 <SEP> mg/ml
<tb> Rendement* <SEP> basé <SEP> sur <SEP> l'amidon <SEP> ajouté <SEP> 74,9%
<tb> Rendement** <SEP> basé <SEP> sur <SEP> l'amidon <SEP> con sommé <SEP> <B>83,2%</B>
EMI0002.0028
De l'acide chlorhydrique fut ajouté à 100 ml du bouillon fermenté pour porter le pH à 4,0-4,5 afin de libérer l'acide citrique. Ensuite les mycélia furent séparés par filtrage, et 1,0 g de charbon actif fut ajouté au filtrat, et l'on filtra de nouveau. Après cela, on ajouta au filtrat de l'ammoniaque aqueuse concentrée pour porter le pH à 7,5-8,0 et l'on fit bouillir pendant 30 minutes.
Par suite de ce traite ment, le citrate de calcium se précipite et peut être recueilli par filtrage. Le résultat fut le suivant
EMI0002.0031
Citrate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> brut <SEP> 14,6 <SEP> g <SEP> (pureté <SEP> 94,6 <SEP> % <SEP> )
<tb> Rendement <SEP> global <SEP> calculé
<tb> à <SEP> partir <SEP> de <SEP> l'amidon <SEP> ini tial <SEP> 68,8 <SEP> % <SEP> (poids) Exemple <I>2</I> L'exemple 1 fut répété en employant un milieu liquide formé de 10 g de poudre de pommes de terre douces, de 0,1 g de KH,PO_I, de 0,3 g de (NH,),SOt et de 7 g de CaCO., pour 100 ml du mi lieu. Le milieu contenait 7,75 g d'amidon disponible pour 100 ml du milieu.
Le bouillon contenait après fermentation 71 g de monohydrate d'acide citrique par litre de bouillon.
<I>Exemple 3</I> L'exemple 1 fut répété en employant un milieu liquide formé de 6,7g de farine de céréale (farine moulue), de 0,1 g de KH,PO4, de 0,3 g de NH@CI et de 5 g de CaCO,; pour 100 ml du milieu. Le milieu contenait 4,36g d'amidon disponible pour 100 ml du milieu. Le bouillon contenait après fer mentation 40,5 g de monohydrate d'acide citrique par litre de bouillon.
<I>Exemple 4</I> L'exemple 1 fut répété en employant un milieu liquide formé de 10 g de glucose, de 0,3 g de NH_,NO;, de 0,1 g de KH,PO4, de 0,05 g de MgS04, de 0,05 g de KCl et de 7 g de CaCO3 pour 100 ml du milieu. Le bouillon produisit après fermentation 82,7 g de monohydrate d'acide citrique par litre de bouillon.
<I>Exemple 5</I> L'exemple 1 fut répété en employant comme souche le Trichoderma <I>virile</I> Pers. ex Fr. No. K-18 (ATCC No 13234), et un milieu liquide formé de 10 g d'amidon de pomme de terre, :de 0,3 g de NaN03, de 0,5 g de liqueur de grain macérée et de 7 g de CaCO3 pour 100 ml du milieu. Le milieu con tenait 8,9 g d'amidon disponible pour 100 ml du milieu.
Le bouillon produisit après :fermentation 80 g de monohydrate d'acide citrique par litre de bouillon.
Process for the preparation of citric acid by fermentation The present invention relates to a process for the preparation of citric acid by fermentation, characterized in that: that the Trichoderma viride is cultivated under aerobic conditions in a culture medium ture containing a saccharide.
Citric acid has heretofore been used mainly for flavoring foodstuffs, and a large part of citric acid is presently employed for this purpose, for example to impart an acidic flavor to foods such as soft drinks. , fruit juice, jam, jelly, pastilles, candies, etc., during their manufacture.
Recently, citric acid has found a new application as an industrial material, for example as a plasticizer. Among others, esters such as acetyl-triethyl-citrate, triethyl-citrate, acetyl-tributyl-citrate, tributyl-citrate, acetyl-tri-2-ethyl-hexyl-citrate and the like, are used for the preparation of lacquers,
of pipes and food packaging. In addition, barium salt, nickel salt, sodium salt and ammonium (dibasic) ammonium ses of citric acid are used respectively for: paints, plating, medicine and coatings. anti-rust of iron articles.
It has long been known that citric acid can be obtained from many fungi. It has been described, for example, by Foster, JA, in Chemical Activities of Fungi, 378, (1949), that strains belonging to the genera <I> Aspergillus, </I> Penicillium (containing the old Citromyces), < I> Mucor, Bo- </I> <I> trytis, </I> Coniof ora and the like,
can produce citric acid under suitable growing conditions. Among these, those belonging to the genera <I> Aspergillus </I> and Penicillium have a marked capacity to produce citric acid. However, the strain belonging to <I> Aspergillus piger </I> is now commonly used for the commercial preparation of citric acid.
As mentioned above, a wide variety of fungi can produce citric acid, but, at least so far, nowhere is it mentioned that Trichoderma viride can produce a substantial amount of citric acid.
It has been discovered by the present inventors that certain strains belonging to Trichoderma viride can produce and accumulate a substantial amount of citric acid under suitable culture conditions.
Such a discovery is completely new in view of the nature of the microorganisms used, and the use of a process according to the invention offers numerous advantages in comparison with the known process, namely the process using <I> Aspergillus piger. </I>
When using <I> Aspergillus piger </I> for the fermentation of citric acid, the main difficulties which have been encountered are as follows: a) By-product problem; b) an acid-resistant fermentation cure is needed; c) purified raw materials must be used; d) the capacity of the culture to produce acid tends to degenerate;
e) Starchy substances must be hydrolyzed before use.
When using Trichoderma viride, none of these difficulties are encountered. Due to its strong amylase and cellulase activity, even crude dextrin starch can be closed without being subjected to any pre-treatment, and can be fermented as easily as mono- or di-. saccharides such as glucose, fruit juice, sucrose, maltose, etc.
Culture media can contain any of the carbohydrates listed above, depending on their availability. As the nitrogen source, any organic material such as wheat bran, soy cake, rice bran, etc. can be used. or any inorganic material such as ammonium chloride, ammonium sulfate, sodium nitrate, ammonium nitrate, urea, etc. In addition, potassium phosphate and calcium carbonate are generally added to the medium.
Fermentation is generally carried out at temperatures between 20 and 35 C and at a pH between 3.0 and 7.0 for three to seven days under aerobic conditions. When using a liquid medium, a submerged, rotary or stationary culture method can be used; when a solid medium is employed, a rotary or fixed culture method can be used.
Various usual methods can be used to collect citric acid from the culture medium after the fermentation has ended. When calcium carbonate is used as an ingredient in the medium, for example, sulfuric acid is added to the fermented broth and the insoluble solids (formed mainly from mycelium and calcium sulfate) are filtered off, then the filtrate is treated with activated carbon to remove impurities, and the filtrate is dried at about 80 ° C, and crude citric acid is obtained.
Alternatively, a calculated amount of calcium hydroxide can be added to the filtrate (which has been treated with activated carbon) so as to collect the citric acid in the form of insoluble calcium citrate. Hydrochloric acid can also be added to the culture liquid to separate and dissolve citric acid, to remove solids, such as mycelium and the like, to treat the filtrate with activated carbon, to add concentrated aqueous ammonia to it. to bring the pH to 7.5-8.0 and boil it to collect the insoluble calcium citrate.
The <I> virile </I> Trichodernia as defined in the present invention is based on the classification described in Transactions of the British Mycological Society, by Bisby G. R., 23, 149 (1939).
It therefore includes Trichodertna lignorm, Trichoderma conirrgi, Trichoderma <I> album </I> and Verticilliirm glaucum, which are identified as such based on the old classification. <I> Example of </I> Spores of Trichoderma <I> virile </I> Pers. ex Fr.
No. K-0 (ATCC N 13233) were inoculated into a liquid medium consisting of 10 g of glucose and 0.5 g of yeast extract per 100 ml of the medium. After stirring the culture at 250 C for twenty-four hours, 1 ml of the culture liquid was transferred to the fermentation medium comprising 10 g of potato, 0.5 g of yeast extract and 7 g of calcium carbonate. per 100 ml of the medium and was cultured with shaking at 25 ° C. for 7 days.
The result was the following:
EMI0002.0027
pH <SEP> 7.3
<tb> Citric acid <SEP> <SEP> .86,4 <SEP> mg / ml
<tb> Residual <SEP> starch <SEP> 9,0 <SEP> mg / ml
<tb> Yield * <SEP> based <SEP> on <SEP> starch <SEP> added <SEP> 74.9%
<tb> Yield ** <SEP> based <SEP> on <SEP> starch <SEP> con sumed <SEP> <B> 83.2% </B>
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Hydrochloric acid was added to 100 ml of the fermented broth to bring the pH to 4.0-4.5 to liberate the citric acid. Then the mycelia were filtered off, and 1.0 g of activated carbon was added to the filtrate, and it was filtered again. After that, concentrated aqueous ammonia was added to the filtrate to bring the pH to 7.5-8.0 and boiled for 30 minutes.
As a result of this treatment, calcium citrate precipitates out and can be collected by filtration. The result was the following
EMI0002.0031
Raw <SEP> calcium <SEP> <SEP> <SEP> 14.6 <SEP> g <SEP> (purity <SEP> 94.6 <SEP>% <SEP>)
<tb> Total <SEP> efficiency <SEP> calculated
<tb> to <SEP> from <SEP> from <SEP> starch <SEP> initial <SEP> 68.8 <SEP>% <SEP> (weight) Example <I> 2 </I> L ' Example 1 was repeated using a liquid medium formed from 10 g of powdered sweet potatoes, 0.1 g of KH, PO_I, 0.3 g of (NH 3), SOt and 7 g of CaCO. , for 100 ml of the middle place. The medium contained 7.75 g of starch available per 100 ml of the medium.
The broth contained after fermentation 71 g of citric acid monohydrate per liter of broth.
<I> Example 3 </I> Example 1 was repeated using a liquid medium formed from 6.7g of cereal flour (ground flour), 0.1g of KH, PO4, 0.3g of NH @ CI and 5 g of CaCO; per 100 ml of the medium. The medium contained 4.36 g of starch available per 100 ml of the medium. The broth contained after fermentation 40.5 g of citric acid monohydrate per liter of broth.
<I> Example 4 </I> Example 1 was repeated using a liquid medium formed from 10 g of glucose, 0.3 g of NH 3, NO ;, 0.1 g of KH, PO 4, 0 , 05 g of MgSO4, 0.05 g of KCl and 7 g of CaCO3 per 100 ml of the medium. The broth after fermentation produced 82.7 g of citric acid monohydrate per liter of broth.
<I> Example 5 </I> Example 1 was repeated using the <I> virile </I> Pers. Trichoderma as the strain. ex Fr. No. K-18 (ATCC No 13234), and a liquid medium formed from 10 g of potato starch,: 0.3 g of NaNO3, 0.5 g of macerated grain liquor and of 7 g of CaCO3 per 100 ml of the medium. The medium contained 8.9 g of available starch per 100 ml of the medium.
The broth produced after: fermentation 80 g of citric acid monohydrate per liter of broth.