Verfahren zur Herstellung von immunisierenden Impfstoffen
Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von immunisierenden Impfstoffen.
Es ist bekannt, Vakzine herzustellen, indem man infektiöse Mikroorganismen, z. B. infektiöse Virusarten, mit partiell inaktivierenden Mitteln, z. B.
Phenol, Formaldehyd oder Wasserstoffsuperoxyd, behandelt, oder indem man dieselben der Wirkung von Hitze oder von ultraviolettem Licht aussetzt, wobei man die infektiösen Eigenschaften derselben zerstört, während ihre antigenen Eigenschaften erhalten bleiben. Diese inaktivierenden Mittel weisen jedoch verschiedene Nachteile auf. Sie zerstören manchmal die antigene Struktur der Mikroorganismen, z. B. der Virusarten, zu sehr und es ist oft schwierig, die vollständige Vernichtung der infektiösen Eigenschaften der Mikroorganismen sicherzustellen. Es ist ferner möglich, dass gewisse infektiöse Mikroorganismen, welche durch die Behandlung mit einem Inaktivierungsmittel, z. B. Formaldehyd, inaktiviert werden, ihre infektiösen Eigenschaften wiedererlangen und so entweder während der Lagerung oder nach der Verabreichung als Vakzin an einen Patienten wieder krankheitserregende Mittel werden.
Es ist ferner auch möglich, dass Inaktivierungsmittel, wie z. B. Formaldehyd oder die Wirkung von ultraviolettem Licht zur Aggregatbildung von Mikroorganismen Veranlassung geben und solche Aggregate unbehandelte Teilchen von infektiösen Mikroorganismen beibehalten.
Es wurde nun gefunden, dass diese Nachteile behoben werden, wenn man bei der Herstellung von immunisierenden Impfstoffen eine bestimmte Klasse von Verbindungen als Inaktivierungsmittel verwendet.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von immunisierenden Impfstoffen besteht darin, dass man eine Verbindung der Formel 1:
EMI1.1
worin R einen Methyl-, thyl-, n-Propyl oder Isopropylrest bedeutet, auf infektiöse Mikroorganismen und/oder deren Antigene einwirken lässt.
Als infektiöse Mikroorganismen kommen z. B.
Virusarten, wie z. B. das Pferdeencephalomyelitisvirus, das Lansing (an Mäuse adaptierte) Poliomyelitisvirus, Rickettsien, wie z. B. Burnetti, und Bakterien, wie z. B. Staphylococcus albus, in Frage.
Die als Ausgangsmaterial dienenden infektiösen Mikroorganismen und/oder Antigene davon können in einer wässerigen Suspension, welche Schutzmittel, wie Puffer, z. B. Natriumhydrogenphosphat, enthalten kann, oder mit tierischem Gewebe, wie z. B.
Gehirnmasse von Meerschweinchen oder Mäusen oder Rückenmarkmaterial, vermischt, vorliegen.
Als eine besonders geeignete Verbindung gemäss Formel I sei z. B. das N-Acetyl-äthylenimin erwähnt.
Diese Verbindung wird gewöhnlich zu den infektiösen Mikroorganismen oder deren Antigenen, die vorzugsweise als eine wässerige Suspension bei niederer Temperatur, z. B. zwischen ungefähr 0 und ungefähr 370 C, vorliegen, zugegeben. Man erhält so ein Produkt, welches eine hohe Ausbeute von nichtinfektiöser, nichttoxischer Antigensubstanz ergibt. Es kann auch bei höheren Temperaturen gearbeitet werden, wodurch aber die Ausbeute vermindert wird.
Die Zeit, die dabei notwendig ist, um die Infektionsfähigkeit der infektiösen Mikroorganismen oder die Giftigkeit deren Antigene zu unterdrücken, ist von verschiedenen Umständen abhängig, wie z. B. von der Natur der verwendeten Mikroorganismen oder deren Antigene, von der Konzentration der Verbindung gemäss Formel I, von der Anfangskonzentration der verwendeten infektiösen Mikroorganismen oder Antigene, von der Konzentration des animalischen Gewebes, welches anwesend sein kann, und von der Temperatur, bei welcher das erfindungsgemässe Verfahren ausgeführt wird.
Gewöhnlich verwendet man als Ausgangsmaterial eine 20-Gew./Vol.0/o-Suspension von infektiösen Mikroorganismen und tierischem Gewebe in steriler wässeriger Salzlösung. Die Verbindung gemäss Formel I, z. B. das N-Acetyläthylenimin, wird gewöhnlich in Form einer Lösung in sterilem, destilliertem Wasser verwendet. Die Konzentration dieser Verbindung ist vorzugsweise zwischen den Grenzen von ungefähr 0,005 Vol./Vol.o/o und ungefähr 1 Vol./ Vol.O/o in bezug auf das vereinigte Volumen der wässerigen Suspension der Mikroorganismen oder deren Antigen und der Lösung der Verbindung.
Unter obigen Bedingungen ist die Zeit, die notwendig ist, um Inaktivierung in bezug auf das Infektionsvermögen der infektiösen Mikroorganismen oder in bezug auf die Giftigkeit von deren Antigenen bei einer Temperatur zwischen ungefähr 18 bis ungefähr 22 oder 37O C hervorzurufen im allgemeinen in der Grössenordnung von ungefähr einer Stunde bis ungefähr 12 Stunden.
Die so erhaltenen wässerigen Zubereitungen, welche das nichtinfektiöse und nichttoxische Antigenmaterial enthalten, können der Gefriertrocknung unterworfen werden. Man erhält so ein Trockenpräparat, welches stabil ist und unter Vakuum gelagert werden kann. Den wässerigen Zubereitungen kann auch eine sterile wässerige Saccharoselösung vorzugsweise in ungefähr 5 Gew./Vol.o/o zugemischt werden, und die so erhaltenen Mischungen können der Gefriertrocknung unterworfen und dann unter Vakuum gelagert werden. Die Trockenpräparate behalten während der Lagerung ihre antigenen Eigenschaften bei und sind nach Zusatz von sterilem, destilliertem Wasser oder steriler Salzlösung als Vakzine gebrauchsfertig.
Erfindungsgemäss hergestellte Präparate, z. B. ein mit N-Acetyl-äthylenimin behandelter Poliomyelitis- oder Influenzavirus, können für medizinische-, veterinärärztliche Zwecke oder als Diagnostiziermittel verwendet werden.
Beispiel 1
Mit Pferdeencephalomyelitisvirus (New Jerseystamm) infiziertes Meerschweinchengehirn wird mit sterilem Sand unter sterilen Bedingungen zerkleinert und dann in eine 20-gew./vol.0/oige Suspension übergeführt, indem man eine sterile 0,85-gew./ vol.0/oige Natriumchloridlösung zusetzt. Die so erhaltene Suspension wird 15 Minuten lang bei 4000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit vorsichtig entfernt. Die so erhaltene Flüssigkeit wird weitere 5 Minuten lang bei 4000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit vorsichtig entfernt.
Diese überstehende Flüssigkeit wird mit einem gleichen Volum 2-vol./vol.o/oiger steriler Lösung von N-Acetyl-äthylenimin in gekühltem, destilliertem Wasser gemischt und die so erhaltene Mischung unter gelegentlichem, schwachem Schütteln 90 Minuten lang auf ungefähr 18-22 C gehalten.
Eine Probe des so erhaltenen Präparates wurde intrazerebral 12 Mäusen (0,03 cm pro Maus) eingeimpft, um auf Anwesenheit von lebendem Virus zu prüfen; alle Mäuse blieben gesund. Das erhaltene Präparat kann mit 1j4 Volumteil einer 5-gew. l vol.0/o iger sterilen Saccharoselösung versetzt und die Mischung, in Anteilen von 2 cm3 in Ampullen verteilt, 24 Stunden lang einer Gefriertrocknung unterworfen werden. Die Trockenampullen werden dann bei 20 C gelagert. Zum Gebrauch werden 2 cm3 steriles, destilliertes Wasser zugesetzt, wobei rasche Lösung unter Bildung einer klaren Flüssigkeit eintritt.
Proben davon können auf Infektionsfähigkeit und Giftigkeit geprüft werden, indem man je 20 Mäusen, 0,5 cm3 intraperitonäal in 3 getrennten Versuchen einspritzt, so dass jede Maus insgesamt 1,5 cm3 in einer Zeitperiode von 7 Tagen zwischen jeder Einspritzung erhält. Es wurde gefunden, dass keine Infektionsfähigkeit und Giftigkeit vorhanden ist; alle Mäuse überleben und sind noch nach 4 Monaten bei guter Gesundheit.
Eine zweite Gruppe von 20 Mäusen erhält das Vakzin und wird dann nach folgender Technik mit lebendem Virus geprüft. Zwanzig, vor kurzem entwöhnten Mäusen mit einem Durchschnittsgewicbt von 12-15 g werden je 0,5 cm3 des Vakzins intraperitonäal in drei getrennten Versuchen eingespritzt, so dass jede Maus insgesamt 1,5 cm erhält und zwischen jeder Einspritzung 7 Tage liegen. 7 Tage nach der letzten Behandlung mit Vakzin werden die Mäuse intrazerebral mit lebendem Virus geimpft, wobei die Menge der Dosis so bemessen ist, dass sie die 30fache Menge der Dosis beträgt, die bei intrazerebraler Verabreichung bei Mäusen 100010 ig zum Tode führt. Es wird gefunden, dass 40 /e der Mäuse diese Infektion mit lebendem Virus überleben.
In einem Kontrollversuch, wobei nicht mit Vakzin behandelte Mäuse verwendet werden, beträgt die Letalität 100 /o.
Beispiel 2
Das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt, wobei an Stelle einer 2-vol./vol.0/o igen Lösung von N-Acetyl-äthylenimin eine 0,5-vol./ vol.0/oige Lösung von N-Acetyl-äthylenimin verwendet wird. Die so erhaltene Mischung wird 3 Stunden lang unter gelegentlichem, schwachem Schütteln bei ungefähr 18-22"C gehalten.
Eine Probe des so erhaltenen Präparates wird 12 Mäusen (0,03 cm3 pro Maus) intrazerebral eingeimpft, um auf Anwesenheit von lebendem Virus zu prüfen. Es wird kein lebendes Virus gefunden, da alle Mäuse bei guter Gesundheit den Versuch überleben. Zum Präparat kann ¸ Volumteil einer 5-gew./vol.0/o igen, sterilen, wässerigen Saccharoselösung gegeben werden. Die so erhaltene Mischung wird in Anteilen von je 2 cm3 in Ampullen verteilt, 24 Stunden der Gefriertrocknung unterworfen und dann unter Vakuum geschlossen. Die Vakzinpräparate werden bei 20 C gelagert.
Bei Gebrauch werden 2 cm3 steriles destilliertes Wasser zugesetzt, wobei rasche Lösung unter Bildung einer klaren Flüssigkeit eintritt. Proben dieser Flüssigkeit werden auf Infektionsfähigkeit und Giftigkeit geprüft, indem man je 20 Mäusen 0,5 cm3 intraperitonäal in drei getrennten Versuchen einspritzt, so dass jede Maus insgesamt 1,5 cm3 in einer Zeitperiode von 7 Tagen zwischen jeder Einspritzung erhält. Es wird gefunden, dass keine Infektionsfähigkeit und Giftigkeit vorhanden ist.
Eine zweite Gruppe von 20 Mäusen erhält das Vakzin und wird dann mit folgender Technik mit lebendem Virus geprüft. Zwanzig vor kurzem entwöhnten Mäusen mit einem Durchschnittsgewicht von 12-15 g werden je 0,5 cm des Vakzins intraperitonäal in drei getrennten Versuchen eingespritzt, so dass jede Maus insgesamt 1,5 cm3 erhält und zwischen jeder Einspritzung 7 Tage liegen. 7 Tage nach der letzten Behandlung mit Vakzin werden die Mäuse intrazerebral mit einer 30fachen LDloo an lebendem Virus geimpft. Es wird gefunden, dass 50"/0 der Mäuse diese Infektion überleben. In einem Kontrollversuch, wobei nicht mit Vakzin behandelte Mäuse verwendet werden, ist die Letalität 1000/o.
Beispiel 3
Das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt, indem man anstatt einer 2-vol./vol.'/oigen Lösung von N-Acetyl-äthylenimin eine 0,25-vol./ vol.0/oige Lösung davon verwendet und die Mischung unter gelegentlichem- schwachem Schütteln 3 Stunden lang bei 370 C hält.
Das so erhaltene Präparat enthält kein lebendes Virus mehr, wie durch intrazerebrale Einimpfung einer Probe des Präparates an Mäusen gezeigt werden kann. Wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben wurde, kann ein Trockenampullen-Präparat hergestellt und dessen Wirksamkeit an Mäusen geprüft werden.
Beispiel 4
Das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt, indem statt einer 2-vol./vol. s/o igen N-Acetyl-äthyleniminlösung eine 0,1 -vol./vol ./o ige Lösung davon verwendet wird. Die so erhaltene Mischung wird unter gelegentlichem schwachem Schütteln 4 Stunden lang bei 37O C gehalten. Das so erhaltene Präparat kann, wie oben beschrieben, einer Gefriertrocknung unterworfen und das getrocknete Produkt mit sterilem, destilliertem Wasser wieder aufgefüllt werden, um ein Vakzin zu erhalten.
Wenn dieses Vakzin Mäusen eingeimpft wird, welche dann mit lebenden Virus nach der in Beispiel 1 und 2 beschriebenen Technik behandelt werden, so wird gefunden, dass 100ovo der Mäuse die Infektion mit dem lebenden Virus überleben. In einem Kontrollversuch mit Mäusen, die keine Vakzinbehandlung erfahren haben, beträgt die Letalität 1000/0.
Beispiel 5
Mit Lansing (an Mäuse adaptiertes) Poliomyelitisvirus infiziertes Gehirn und Rückenmark wird mit sterilem Sand unter sterilen Bedingungen zerkleinert und dann durch Zusatz einer 0, 85-gew./vol. /oigen sterilen wässerigen Natriumchloridlösung in die Form einer 20-gew./vol.0/oigen Suspension gebracht.
Diese erhaltene 20-gew./vol.0/oige Lösung wird bei 4000 Umdrehungen pro Minute 30 Minuten lang zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit sorgfältig entfernt. Die so erhaltene überstehende Flüssigkeit wird weitere 5 Minuten lang bei 4000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit sorgfältig entfernt. Diese wird mit einem gleichen Volumen einer 2-vol./vol. /oigen sterilen Lösung von N-Acetyl-äthylenimin in gekühltem, destilliertem Wasser gemischt, und die so erhaltene Mischung während 2 Stunden unter gelegentlichem, schwachem Schütteln auf ungefähr 18 bis 220 C gehalten.
Das erhaltene Präparat kann, wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben, in ein Trockenampullen-Präparat übergeführt und die Wirksamkeit an Mäusen geprüft werden.
Beispiel 6
Das im Beispiel 5 beschriebene Verfahren wird wiederholt, anstatt einer 2-vol./vol.o/oigen Lösung von N-Acetyl-äthylenimin wird eine 0,5-vol./vol.o/oige Lösung davon verwendet. Die so erhaltene Mischung wird 6 Stunden lang unter gelegentlichem. schwachem Schütteln ungefähr bei 1 8220 C gehalten.
Das erhaltene Präparat kann lyophilisiert und die Wirksamkeit des Präparates an Mäusen getestet werden.
Beispiel 7
Das im Beispiel 5 beschriebene Verfahren wird wiederholt, aber an Stelle einer 2-vol./vol. /o igen N-Acetyläthyleniminlösung wird eine solche von 0,25 Vol./Vol. /o verwendet. Die so erhaltene Mischung wird 4 Stunden lang unter gelegentlich schwachem Schütteln bei ungefähr 37 C gehalten.
Das so erhaltene Präparat enthält kein lebendes Virus mehr und es kann unter Lyophilmachung getrocknet werden. Das so erhaltene getrocknete Material kann durch Zusatz von sterilem destilliertem Wasser gebrauchsfertig gemacht werden. Wenn die so erhaltene klare Flüssigkeit Mäusen intraperitonäal eingespritzt wird, so wird gefunden, dass sie frei von Infektionsmöglichkeiten und Giftigkeit ist, da alle Mäuse in guter Gesundheit mehrere Monate später überleben.
Beispiel 8
Das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren wird wiederholt, indem statt einer 2-vol.lvol.olcuigen N-Acetyl-äthyleniminlösung eine solche von 0,1 Vol./ Vol.O/o verwendet wird. Die so erhaltene Mischung wird 4 Stunden lang unter gelegentlichem schwachem Schütteln bei 37o C gehalten.
Das Präparat kann, wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben wurde, in ein Trockenampullen-Präparat übergeführt und dessen Wirksamkeit an Mäusen getestet werden.
Beispiel 9
Das im Beispiel 5 beschriebene Verfahren wird wiederholt, statt der 2-vol./vol.o/oigen N-Acetyl äthyleniminlösung wird eine solche von 0,05 Vol./ Vol.01o verwendet. Die so erhaltene Mischung wird 12 Stunden lang unter gelegentlichem schwachem Schütteln bei 37 C gehalten.
Das erhaltene Präparat kann, wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben, in ein Trockenampullen-Präparat übergeführt und dessen Wirksamkeit an Mäusen getestet werden.
Beispiel 10
Das im Beispiel 5 beschriebene Verfahren wird wiederholt, indem man statt einer 2-vol./vol.o/oigen Lösung von N-Acetyl-äthylenimin eine solche von 0,025 Vol./Vol.o/o verwendet. Diese Mischung wird unter gelegentlichem schwachem Schütteln 12 Stun den lang auf 37O C gehalten.
Das so erhaltene Präparat kann, wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben wurde, in ein Trockenampullen Präparat übergeführt und dessen Wirksamkeit an Mäusen geprüft werden.
Beispiel 11
Eine ursprünglich aus der menschlichen Haut isolierte vollausgewachsene Kultur von Staphylococcus albus wird zentrifugiert. Die Bakterienzellen werden in steriler 0,85-gew./vol.6/o iger Natriumchloridlösung suspendiert, zentrifugiert und dann nochmals in steriler 0,85-gew./vol.0/oiger wässeriger Natriumchloridlösung suspendiert, so dass man eine Zellsuspension von optimaler Dichte von 1,6 erhält, wenn ein Muster in einer 1 -em-Spectrophoto- meterzelle bei Licht von einer Wellenlänge von 5800 Ä geprüft wird.
Zu 4 Teilen dieser so erhaltenen Zellsuspension wird 1 Teil einer l-vol./ vol.9/o igen Lösung von N-Acetyl-äthylenimin in Eiswasser zugesetzt und die erhaltene Mischung 24 Stunden lang unter gelegentlichem schwachem Schütteln bei 37O C gehalten.
Eine Probe des so erhaltenen Präparates wird in eine bakterielle Nährlösung und ebenso in ein bakterielles Agar-Agar-Nährmedium in einer Zuchtschale eingeimpft. Es werden keine lebenden Bakterien gefunden, wie in jedem Falle aus dem Fehlen von bakteriellem Wachstum bei 370 C innerhalb von 6 Tagen ersichtlich ist.
Zu dem Präparat kann i4 Volumteil einer 5-gew./vol. /o igen wässerigen Saccharoselösung zugesetzt und die Mischung in Anteilen von 2 cm in Ampullen verteilt, innerhalb 18 Stunden lyophili- siert und dann unter Vakuum verschlossen werden.
Das Vakzin-Präparat wird bei 18-22"C gelagert.
Jede Ampulle wird durch Zusatz von 2 cm3 sterilem destilliertem Wasser gebrauchsfertig gemacht, wobei rasch Lösung eintritt. Proben dieses Materials werden auf die Anwesenheit von lebendem Virus geprüft, indem man dieselben in eine bakterielle Nährlösung einspritzt, welche dann 6 Tage lang bei 37O C bebrütet wird. Die Abwesenheit von lebensfähigen Bakterien zeigt sich dadurch, dass unter diesen Bedingungen kein bakterielles Wachstum eintritt. Das gebrauchsfertig gemachte Vakzin wird Kaninchen subkutan eingespritzt. In keinem Falle zeigen diese toxische Symptome. Zwei Vakzininjektionen von 0,5 cm3 pro Kaninchen werden in der ersten Woche gegeben und zwei Injektionen von 1,0 cm3 pro Kaninchen werden in der zweiten Woche gegeben.
Das Serum dieser Kaninchen sowie von Kaninchen, welche keine Vakzinbehandlung erfahren haben, wird gesammelt. Der Antikörpertiter des Serums wird geschätzt durch die Agglutinationsreaktion mit einer Suspension der gleichen lebenden Bakterien. Es wird ein beträchtliches Anwachsen der Antikörper-Agglutination im Vergleich mit dem nicht mit Vakzin behandelten Kaninchenserum gefunden.
Beispiel 12
24 Stunden nach der Infektion mit kleinen Mengen von Influenza A-Virus werden die Chorion Allantois-Membranen von 30 Hühnereiern, die seit 12 befruchtet waren, entnommen. Die vereinigten Membranen werden dann dreimal abwechselnd auf 700 C gefroren und dann bei 37O C aufgetaut, worauf 30 cm einer N/l00 phosphatgepufferten Salzlösung zugesetzt wird. Nach Vermischung werden die Membranen 5 Minuten lang bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert und der über den Membranen befindliche Extrakt entfernt. Ein Muster dieses Extraktes wird auf seine Infektionsfähigkeit auf befruchtete Hühnereier geprüft.
Mengen von 1 cm3 infizieren bei einer Verdünnung von 10-6,2 50 /o dieser Eier, das heisst, der Extrakt enthält pro cm3 10-6,2 für 500/0 Eier ansteckende Dosen (E. 1. D50 egg infectivity doses). Zu einem Muster dieses Membranextraktes wird so viel N-Acetyl-äthylenimin zugesetzt, dass eine Endkonzentration von 1 Vol./Vol.o/o an Acetyl-äthylenimin erzielt wird und diese Mischung dann 4 Stunden lang bei 300 C eingelagert. Bei einer Verdünnung von 1:10 infiziert der so behandelte Extrakt von 10 mit 1 cm3 geimpften Eiern kein einziges Ei. Der unverdünnte Extrakt wirkt in Eiern toxisch.
Wenn aber das Virus durch Adsorption an die roten Blutkörperchen von Meerschweinchen abgetrennt wird und in eine 0, 85 loige Natriumchloridlösung ausgewaschen wird, so wird von 10 mit 1 cm3 geimpften Eiern keines infiziert. Wenn die unbehandelten und die mit Acetyläthylenimin behandelten Extrakte parallel durch die übliche Methode (Salk Mustertest) geprüft werden, so findet man, dass sie die gleiche Fähigkeit besitzen, die roten Blutkörperchen von Meerschweinchen zu agglutinieren.
(Die Hämoglutinintiter sind 101,0 und 102 95 Hämoglutinineinheiten pro cm3, welche bei der verwendeten Technik nicht wesentlich verschieden sind.) Wenn dieselben an dem gleichen Muster eines menschlichen Reconvalescentenserums geprüft werden, welches Antikörper zu dem löslichen Antigen von Influenza-A-Typus besitzt, so findet man wieder, dass die unbehandelten und die mit Acetyl äthylenimin behandelten Extrakte nicht zu unterscheidende Mengen an löslichen Antigen besitzen, gemessen an der Complement-Fixierung (103905 und resp. 103,2 lösliche Antigeneinheiten pro cm3).
Bei der Diagnose der menschlichen Influenzainfektion werden die Serum-Antikörper in bezug auf ihre Bindekraft mit dem Hämoglutinin oder mit dem löslichen Antigen des Influenzavirus gemessen.
Die nichtinfektiösen mit Acetyläthylenimin behandelten Influenzavirus-Präparate, die, wie oben beschrieben, erhalten werden, können für diesen Zweck gebraucht werden.
Process for making immunizing vaccines
This invention relates to a method of making immunizing vaccines.
It is known to produce vaccines by treating infectious microorganisms, e.g. B. infectious virus species, with partially inactivating agents, e.g. B.
Phenol, formaldehyde or hydrogen peroxide, or by subjecting them to the action of heat or ultraviolet light, thereby destroying their infectious properties while maintaining their antigenic properties. However, these inactivating agents have several disadvantages. They sometimes destroy the antigenic structure of the microorganisms, e.g. B. the virus species, too much and it is often difficult to ensure the complete destruction of the infectious properties of the microorganisms. It is also possible that certain infectious microorganisms, which are caused by treatment with an inactivating agent, e.g. B. formaldehyde, are inactivated, regain their infectious properties and become pathogenic agents again either during storage or after administration as a vaccine to a patient.
It is also possible that inactivating agents, such as. B. formaldehyde or the action of ultraviolet light give rise to the formation of aggregates of microorganisms and such aggregates retain untreated particles of infectious microorganisms.
It has now been found that these disadvantages are overcome by using a certain class of compounds as inactivating agents in the manufacture of immunizing vaccines.
The process according to the invention for the preparation of immunizing vaccines consists in that a compound of formula 1:
EMI1.1
where R is a methyl, ethyl, n-propyl or isopropyl radical, allows infectious microorganisms and / or their antigens to act.
Infectious microorganisms such. B.
Virus types such as B. the equine encephalomyelitis virus, the Lansing (adapted to mice) poliomyelitis virus, rickettsiae, such as e.g. B. Burnetti, and bacteria such. B. Staphylococcus albus, in question.
The infectious microorganisms serving as starting material and / or antigens thereof can be contained in an aqueous suspension which contains protective agents such as buffers, e.g. B. sodium hydrogen phosphate, or with animal tissue, such as. B.
Guinea pigs or mice brain mass or spinal cord material, mixed, are present.
A particularly suitable compound according to formula I is, for. B. the N-acetyl-ethylene imine mentioned.
This compound is usually associated with the infectious microorganisms or their antigens, which are preferably supplied as an aqueous suspension at low temperature, e.g. B. between about 0 and about 370 C, are added. A product is thus obtained which gives a high yield of non-infectious, non-toxic antigenic substance. It is also possible to work at higher temperatures, but this reduces the yield.
The time it takes to suppress the infectious ability of the infectious microorganisms or the toxicity of their antigens depends on various circumstances, such as: B. on the nature of the microorganisms used or their antigens, on the concentration of the compound according to formula I, on the initial concentration of the infectious microorganisms or antigens used, on the concentration of the animal tissue which may be present and on the temperature at which the inventive method is carried out.
The usual starting material is a 20 w / v 0/o suspension of infectious microorganisms and animal tissue in sterile aqueous saline solution. The compound according to formula I, e.g. B. N-acetylethyleneimine, is usually used in the form of a solution in sterile, distilled water. The concentration of this compound is preferably between the limits of about 0.005 v / v o / o and about 1 v / v o / o with respect to the combined volume of the aqueous suspension of the microorganisms or their antigen and the solution of the compound .
Under the above conditions, the time necessary to cause inactivation with respect to the infectious ability of the infectious microorganisms or with respect to the toxicity of their antigens at a temperature between about 18 to about 22 or 37 ° C is generally on the order of about one hour to about 12 hours.
The aqueous preparations thus obtained, which contain the non-infectious and non-toxic antigen material, can be subjected to freeze-drying. This gives a dry preparation which is stable and can be stored under vacuum. A sterile aqueous sucrose solution, preferably in about 5 w / v o / o, can also be admixed with the aqueous preparations, and the mixtures thus obtained can be subjected to freeze-drying and then stored under vacuum. The dry preparations retain their antigenic properties during storage and are ready for use as a vaccine after adding sterile, distilled water or sterile saline solution.
Preparations produced according to the invention, e.g. Poliomyelitis or influenza virus treated with N-acetyl-ethyleneimine can be used for medical, veterinary or diagnostic purposes.
example 1
Guinea pig brain infected with equine encephalomyelitis virus (New Jersey strain) is comminuted with sterile sand under sterile conditions and then converted into a 20% by weight / volume / volume suspension by adding a sterile 0.85% weight / volume volume / sodium chloride solution clogs. The suspension obtained in this way is centrifuged for 15 minutes at 4000 revolutions per minute, and the supernatant liquid is carefully removed. The liquid thus obtained is centrifuged for a further 5 minutes at 4000 revolutions per minute and the supernatant liquid is carefully removed.
This supernatant liquid is mixed with an equal volume of 2- vol./vol.o/oiger sterile solution of N-acetyl-ethyleneimine in chilled, distilled water and the mixture obtained in this way, with occasional, gentle shaking, for 90 minutes to about 18-22 C held.
A sample of the preparation thus obtained was inoculated intracerebrally into 12 mice (0.03 cm per mouse) to check for the presence of live virus; all mice remained healthy. The preparation obtained can be used with 1j4 part by volume of a 5 wt. 1% sterile sucrose solution by volume is added and the mixture, divided into 2 cm3 portions in ampoules, is subjected to freeze-drying for 24 hours. The dry ampoules are then stored at 20 ° C. For use, 2 cm3 of sterile, distilled water are added, with rapid dissolution occurring with the formation of a clear liquid.
Samples of this can be tested for infectivity and toxicity by injecting 20 mice with 0.5 cm 3 intraperitoneally in 3 separate experiments, so that each mouse receives a total of 1.5 cm 3 in a period of 7 days between each injection. It has been found that there is no infectivity and toxicity; all mice survive and are still in good health after 4 months.
A second group of 20 mice receives the vaccine and is then tested with live virus using the following technique. Twenty recently weaned mice with an average weight of 12-15 g are each injected 0.5 cm3 of the vaccine intraperitoneally in three separate experiments so that each mouse receives a total of 1.5 cm and there are 7 days between each injection. 7 days after the last treatment with vaccine, the mice are inoculated intracerebrally with live virus, the amount of the dose being such that it is 30 times the amount which, when administered intracerebrally, leads to 100010 μg death in mice. 40 / e of the mice are found to survive this live virus infection.
In a control experiment using mice not treated with vaccine, the lethality is 100%.
Example 2
The procedure described in Example 1 is repeated, with a 0.5 vol. / Vol. 0 / o solution of N-acetyl in place of a 2- vol./vol.0/o solution of N-acetyl-ethyleneimine ethyleneimine is used. The resulting mixture is kept at about 18-22 "C for 3 hours with occasional, gentle shaking.
A sample of the preparation obtained in this way is inoculated intracerebrally into 12 mice (0.03 cm3 per mouse) in order to check for the presence of live virus. No live virus is found as all mice survive the experiment in good health. ¸ part by volume of a 5% by weight / volume 0/o igen sterile, aqueous sucrose solution can be added to the preparation. The mixture thus obtained is divided into ampoules in portions of 2 cm3 each, subjected to freeze-drying for 24 hours and then closed under vacuum. The vaccine preparations are stored at 20 ° C.
When used, 2 cm3 of sterile distilled water is added, causing rapid dissolution to form a clear liquid. Samples of this fluid are tested for infectivity and toxicity by injecting each 20 mice with 0.5 cm3 intraperitoneally in three separate experiments, so that each mouse receives a total of 1.5 cm3 in a period of 7 days between each injection. It is found that there is no infectivity and toxicity.
A second group of 20 mice receives the vaccine and is then tested with live virus using the following technique. Twenty recently weaned mice with an average weight of 12-15 g are injected intraperitoneally with 0.5 cm of the vaccine in three separate experiments, so that each mouse receives a total of 1.5 cm 3 and there are 7 days between each injection. 7 days after the last vaccine treatment, the mice are vaccinated intracerebrally with a 30-fold LDloo of live virus. It is found that 50% of the mice survive this infection. In a control experiment using mice not treated with vaccine, the lethality is 1000%.
Example 3
The procedure described in Example 1 is repeated by using a 0.25 vol. / Vol. 0 / o solution of N-acetyl-ethylenimine instead of a 2vol./vol.'/oigen solution and the mixture under Occasional, gentle shaking, holds at 370 ° C for 3 hours.
The preparation obtained in this way no longer contains any live virus, as can be shown by intracerebral inoculation of a sample of the preparation in mice. As described in Examples 1 and 2, a dry ampoule preparation can be produced and its effectiveness can be tested on mice.
Example 4
The procedure described in Example 1 is repeated using instead of a 2-vol./vol. s / o igen N-acetyl-ethyleneimine solution a 0.1 -vol./vol ./o ige solution thereof is used. The mixture thus obtained is kept at 37 ° C. for 4 hours with occasional gentle shaking. The preparation obtained in this way can, as described above, be subjected to freeze-drying and the dried product can be refilled with sterile, distilled water in order to obtain a vaccine.
When this vaccine is inoculated into mice which are then treated with live virus according to the technique described in Examples 1 and 2, it is found that 100ovo of the mice survive infection with the live virus. In a control experiment with mice that have not received vaccine treatment, the lethality is 1000/0.
Example 5
With Lansing (adapted to mice) poliomyelitis virus infected brain and spinal cord are comminuted with sterile sand under sterile conditions and then by adding a 0.85 wt / vol. Brought / o sterile aqueous sodium chloride solution in the form of a 20 wt / vol 0 / o suspension.
The resulting 20% by weight / volume solution is centrifuged at 4000 revolutions per minute for 30 minutes and the supernatant liquid is carefully removed. The supernatant liquid thus obtained is centrifuged for a further 5 minutes at 4000 revolutions per minute and the supernatant liquid is carefully removed. This is with an equal volume of a 2-vol./vol. Mixed / oigen sterile solution of N-acetyl-ethyleneimine in chilled, distilled water, and the mixture thus obtained was kept at about 18 to 220 ° C. for 2 hours with occasional, gentle shaking.
The preparation obtained can, as described in Examples 1 and 2, be transferred into a dry ampoule preparation and the effectiveness can be tested on mice.
Example 6
The procedure described in Example 5 is repeated, instead of a 2-volume / volume-per-volume solution of N-acetyl-ethyleneimine, a 0.5 volume / volume / volume solution thereof is used. The mixture thus obtained is for 6 hours with occasional. Maintained at approximately 1820C with gentle shaking.
The preparation obtained can be lyophilized and the effectiveness of the preparation can be tested on mice.
Example 7
The procedure described in Example 5 is repeated, but instead of a 2vol./vol. / o N-acetylethyleneimine solution is such of 0.25 vol / vol. / o used. The mixture thus obtained is kept at about 37 ° C. for 4 hours with occasional gentle shaking.
The preparation obtained in this way no longer contains any living virus and it can be dried while making it lyophilized. The dried material thus obtained can be made ready for use by adding sterile distilled water. When the clear liquid thus obtained is injected intraperitoneally into mice, it is found to be free from the possibility of infection and toxicity since all the mice survive in good health several months later.
Example 8
The procedure described in Example 5 is repeated using a solution of 0.1 vol / vol o / o instead of a 2 vol.lvol.olcuigen N-acetylethyleneimine solution. The resulting mixture is kept at 37 ° C. for 4 hours with occasional gentle shaking.
As described in Examples 1 and 2, the preparation can be transferred to a dry ampoule preparation and its effectiveness can be tested on mice.
Example 9
The procedure described in Example 5 is repeated, instead of the 2- vol./vol.o/oigen N-acetyl ethyleneimine solution, a solution of 0.05 vol./vol.01o is used. The mixture thus obtained is kept at 37 ° C. for 12 hours with occasional gentle shaking.
The preparation obtained can, as described in Examples 1 and 2, be transferred into a dry ampoule preparation and its effectiveness can be tested on mice.
Example 10
The procedure described in Example 5 is repeated using a solution of 0.025 vol./vol.o/o instead of a 2vol./vol.o/oigen solution of N-acetylethyleneimine. This mixture is kept at 37O C for 12 hours with occasional gentle shaking.
The preparation obtained in this way can, as described in Examples 1 and 2, be transferred to a dry ampoule preparation and its effectiveness can be tested on mice.
Example 11
A full-grown culture of Staphylococcus albus originally isolated from human skin is centrifuged. The bacterial cells are suspended in sterile 0.85% by weight / volume 6% sodium chloride solution, centrifuged and then again suspended in sterile 0.85% by weight / volume 0% aqueous sodium chloride solution, so that a cell suspension of optimal A density of 1.6 is obtained when a sample is examined in a 1-em spectrophotometer cell in light with a wavelength of 5800 Å.
1 part of a 1-volume / volume 9% solution of N-acetyl-ethyleneimine in ice water is added to 4 parts of the cell suspension obtained in this way, and the mixture obtained is kept at 37 ° C. for 24 hours with occasional gentle shaking.
A sample of the preparation thus obtained is inoculated into a bacterial nutrient solution and also into a bacterial agar-agar nutrient medium in a culture dish. No living bacteria are found, as evidenced in each case by the lack of bacterial growth at 370 C within 6 days.
14 volume part of a 5- wt./vol. / o igen aqueous sucrose solution is added and the mixture is distributed in portions of 2 cm in ampoules, lyophilized within 18 hours and then sealed under vacuum.
The vaccine preparation is stored at 18-22 "C.
Each ampoule is made ready for use by adding 2 cm3 of sterile distilled water, which quickly dissolves. Samples of this material are tested for the presence of live virus by injecting them into a bacterial nutrient solution, which is then incubated at 37 ° C for 6 days. The absence of viable bacteria is evidenced by the fact that no bacterial growth occurs under these conditions. The ready-to-use vaccine is injected subcutaneously into rabbits. In no case do they show any toxic symptoms. Two vaccine injections of 0.5 cc per rabbit are given in the first week and two injections of 1.0 cc per rabbit are given in the second week.
The serum of these rabbits as well as rabbits that have not received vaccine treatment is collected. The antibody titer of the serum is estimated by the agglutination reaction with a suspension of the same living bacteria. A significant increase in antibody agglutination is found compared to the non-vaccine treated rabbit serum.
Example 12
Twenty-four hours after infection with small amounts of influenza A virus, the chorionic allantoic membranes are removed from 30 chicken eggs that have been fertilized since 12. The combined membranes are then alternately frozen three times to 700 ° C. and then thawed at 370 ° C., after which 30 cm of a N / 100 phosphate-buffered saline solution is added. After mixing, the membranes are centrifuged for 5 minutes at 3000 revolutions per minute and the extract located above the membranes is removed. A sample of this extract is tested for its ability to infect fertilized chicken eggs.
Quantities of 1 cm3 infect with a dilution of 10-6.2 50 / o of these eggs, i.e. the extract contains 10-6.2 for 500/0 eggs per cm3 of infectious doses (E. 1. D50 egg infectivity doses) . Sufficient N-acetyl-ethyleneimine is added to a sample of this membrane extract so that a final concentration of 1 v / v o / o of acetyl-ethyleneimine is achieved and this mixture is then stored at 300 ° C. for 4 hours. When diluted 1:10, the extract treated in this way from 10 eggs vaccinated with 1 cm3 does not infect a single egg. The undiluted extract is toxic in eggs.
If, however, the virus is separated off by adsorption on the red blood cells of guinea pigs and washed out in a 0.85 solution of sodium chloride, none of 10 eggs vaccinated with 1 cm3 are infected. If the untreated extracts and the extracts treated with acetylethyleneimine are tested in parallel by the usual method (Salk pattern test), it is found that they have the same ability to agglutinate the red blood cells of guinea pigs.
(The hemoglutinin titers are 101.0 and 102.95 hemoglutinin units per cm3, which are not significantly different in the technique used.) When tested on the same sample of human convalescent serum which has antibodies to the soluble antigen of influenza A type , one finds again that the untreated and the acetylethyleneimine-treated extracts have indistinguishable amounts of soluble antigen, measured by the complement fixation (103905 and 103.2 soluble antigen units per cm3, respectively).
In the diagnosis of human influenza infection, the serum antibodies are measured for their binding force with the hemoglutinin or with the soluble antigen of the influenza virus.
The non-infectious acetylethyleneimine-treated influenza virus preparations obtained as described above can be used for this purpose.