Procédé de préparation d'un -nouvel antibiotique Le brevet principal a pour objet un procédé pour la préparation de tétracycline, dans lequel on ino cule et fait fermenter sous des conditions d'aérobiose un milieu nutritif aqueux renfermant des substances minérales et des matières qui fournissent, sous forme assimilable, du carbone et de l'azote, avec un micro organisme du genre Streptomyces capable de pro duire de la chlortétracycline dans un milieu nutritif contenant des ions chlorure,
ce procédé étant carac térisé en ce qu'on règle la teneur du milieu nutritif en ions chlorure de manière à obtenir un produit antibiotique renfermant en majeure partie de la tétra cycline.
Le présent brevet a pour objet un procédé pour la préparation de tétracycline selon la revendication du brevet principal, ce procédé étant caractérisé par le fait qu'on règle la teneur en ions chlorure du mi lieu nutritif en soumettant une solution aqueuse d'au moins un constituant hydrosoluble dudit milieu à un traitement préalable par une matière échangeuse d'ions pour en réduire la teneur en ions chlorure.
On poursuit le traitement par échange d'ions de préférence jusqu'à ce que la quantité des ions chlo rure dans ledit constituant soit réduite à une valeur telle que la teneur en ions chlorure du milieu nutritif global ne dépasse pas 17 parties pour 1 million de parties du milieu.
Les microorganismes utilisés comprennent des souches, des variantes ou des mutantes de Strepto myces aureofaciens, particulièrement celles qui don nent des rendements relativement élevés en tétracy cline, par exemple plus de 500 microgrammes par ce, dans la liqueur de fermentation. On peut citer comme exemple un organisme nom mé UV 8, qui est une mutante du microorganisme Texas. Cette mutante est une souche nouvelle, non décrite jusqu'à présent.
La souche UV-8, lorsqu'on la cultive sur l'agar-agar Waksman (Journal of Bacte- riology : 7 : 339-341, 1922), présente une forte pro duction de mycélium, d'abord blanchâtre, devenant jaune, et se couvrant graduellement d'un mycélium aérien blanc poudreux, qui sporule par la suite. Les vieilles cultures sont d'un noir de jais, avec de petites taches de mycélium blanc. Cette végétation noire est constituée par une masse de corps à chaînes courtes qui se rompent facilement. Ces corps sont de gran deur et de forme variables, allant approximativement de 0,5 à 4,5 microns, et leur forme peut varier de l'ovale à un globe sphérique légèrement angulaire.
La grandeur moyenne est un peu supérieure à celle trou vée chez le Streptomyces aureofaciens (NRRL-2209), et il y a une plus grande variété de grandeurs et de formes.
On a observé de nombreuses souches différentes de Streptomyces qui ont la faculté de produire à la fois de la chlorotétracycline et de la tétracycline, et l'on pense qu'elles peuvent toutes être raisonnable ment classées comme Streptomyces aureofaciens, mal gré des différences assez marquées dans leurs habi tudes de croissance et leurs besoins nutritifs, comme le signalent Duggar et al. dans Annals of the New York Academy of Sciences , volume 60, pages 71 à 101, publié le 29 octobre 1954 ;
pourtant, certains pourraient être portés, pour une raison ou pour une autre, à affirmer que leurs microorganismes produc teurs de tétracycline appartiennent à une espèce dif férente. Etant donné ce conflit possible de terminolo- gie, la titulaire désire inclure ici l'emploi de tous les microorganismes du genre Streptomyces qui présen tent les qualités de production de tétracycline indi quées ci-dessus.
On a constaté que les milieux de fermentation synthétiques, tels que décrits en page 3 de l'exposé du brevet principal sont très coûteux, et manquent de certains principes essentiels de métabolisme du pro cessus de fermentation permettant d'obtenir des ren dements élevés en tétracycline. Pour cette raison et pour d'autres imparfaitement connues, il est préféra ble d'utiliser dans la préparation des milieux de fer mentation, des matières de provenance naturelle, par exemple, liqueur de macération du maïs, caséine di gérée, etc.
Non seulement ces matières sont moins coûteuses que les matières synthétiques, mais elles donnent des rendements bien plus élevés en antibio tique désiré. Ces matières contenant des quantités appréciables d'ions chlorure, il faut les éliminer par échange d'ions avant de constituer le milieu nutritif.
Ces matières naturelles, telles qu'une liqueur de macération du maïs, peuvent être diluées avec de l'eau jusqu'à une concentration appropriée pour les faire passer à travers une couche d'échangeurs d'ions et éliminer les ions chlorure dans la mesure néces saire. On peut alors ajouter, à la liqueur de macéra tion du maïs désionisée, les quantités supplémentai res d'azote, de carbone et d'éléments minéraux né cessaires au milieu de fermentation.
Les liqueurs de macération du maïs contiennent des quantités appré- ciables d'ions chlorure, de l'ordre de 0,15 à 0,5 % en poids.
La caséine, qui est une matière très utile pour préparer des liqueurs de fermentation, est suscepti ble de contenir de grandes quantités d'ions chlorure, suivant les méthodes de préparation. On rencontre fréquemment des quantités d'ions chlorure allant jus- qu'à 0,30 %. Les produits de digestion enzymatique de la caséine, utiles aussi pour la préparation des mi lieux de fermentation, peuvent contenir des concen trations encore plus élevées en ions chlorure.
La poudre de viande, et les poudres de poisson digérées, ainsi que diverses autres matières, particu lièrement d'origine animale, contiennent aussi de grandes quantités d'ions chlorure.
Les substances présentant une viscosité élevée ne traversent que difficilement les couches d'échangeurs d'ions, et par suite il convient de les diluer avec de l'eau jusqu'à une fluidité qui permette un écoulement suffisant à travers la couche.
Dans certains cas, où il faut ajouter également des matières insolubles au milieu de fermentation, on peut les laver avec de l'eau désionisée pour éliminer les ions chlorure avant d'ajouter ces matières au milieu de fermentation. Evidemment, la nature de la matière déterminera le traitement convenable.
Pour l'amidon cru par exemple, qui contient souvent des quantités considérables d'ions chlorure, on peut le laver à l'eau désionisée, l'ajouter au milieu de fermentation, et alors le faire cuire ou le traiter autrement pour le rendre assimilable pour le microorganisme de fermen tation. Par dilution convenable, on peut faire passer de l'amidon soluble à travers la couche d'échangeurs d'ions pour éliminer les ions chlorure.
La farine de soja contient souvent des quantités excessives d'ions chlorure pour la préparation de la tétracycline, et quand on utilise des matières de ce genre en quantités importantes, il faut aussi les trai ter par la technique d'échange d'ions comme décrit ci-dessus.
Les souches de Streptomyces aureofaciens pro ductrices de tétracycline qui produisent plus de 500 microgrammes d'antibiotique par cm3, sont préféra bles. En pareil cas, le milieu de fermentation peut contenir 10 parties par million d'ions chlorure, bien que des quantités inférieures soient préférables. D'au tre part, les perfectionnements apportés à la sélection des souches de Streptomyces productrices de tétracy cline ont amené des augmentations notables du ren dement en tétracycline, de sorte qu'il est maintenant possible d'obtenir facilement 5000 microgrammes de tétracycline par cm3, et même plus.
Si l'on utilise des souches de Streptomyces aureofaciens capables de produire des quantités de tétracycline supérieures à 500 mïcrogramrnes par em3, dans des milieux de fer mentation dont la teneur en ions chlorure a été ré duite, conformément au présent procédé, à une va leur aussi basse que possible, on peut obtenir des moûts de fermentation bruts dans lesquels une faible proportion seulement du produit antibiotique global est constituée par de la chlortétracycline.
La présence d'une proportion de chlortétiacycline représentant jusqu'à 10 % du poids du produit anti- biotique global présent dans le moût de fermenta tion ne gêne pas.
Un moût de fermentation conte nant 5000 microgrammes de tétracycline par cm3, pourrait donc renfermer jusqu'à 500 microgrammes par cors de chlortétracycline, ce cas se produisant, par exemple, lorsque le milieu nutritif contient de 40 à 50 parties d'ions chlorure pour 1 million de par ties et lorsqu'on utilise un microorganisme présen tant une forte affinité pour les ions chlorure.
Si le microorganisme utilisé pour la fermentation possède une affinité plus faible pour les ions chlorure et ne les consomme pas entièrement, on peut utiliser un mi lieu nutritif dont la teneur en ions chlorure est quel que peu plus élevée.
Ainsi qu'il est commun à d'autres processus de fermentation pour la production d'antibiotiques, les liqueurs de fermentation contiennent des sources de carbone, d'azote et de sels minéraux assimilables. Beaucoup de ces sources sont relativement exemptes d'ions chlorure, et on les utilise pour compléter les matières citées plus haut qui sont traitées par des échangeurs d'ions conformément à la présente inven tion.
Elles comprennent notamment le saccharose, le glucose, la dextrine, les alcools de sucres, l'acide ci trique, l'amidon, la farine de graine de coton, de maïs, de soja, d'arachide et d'autres substances car bonées et azotées qui sont utilisées en quantité varia- bles, à raison de 0,5 à 5 % en poids ou davantage par rapport au poids total du milieu de fermentation.
Pour accroitre le rendement et l'économie, on utilise souvent des mélanges de ces matières en même temps que les produits de provenance naturelle mentionnés plus haut, qui ont été traités par des échangeurs d'ions.
Des sels minéraux sont aussi ajoutés au milieu de fermentation, en quantités variables, pour favoriser la croissance du microorganisme et obtenir des ren dements élevés en tétracycline. Parmi ces sels, on peut mentionner le phosphate d'ammonium, le phos phate de potassium, le sulfate de magnésium, le car bonate de calcium, et divers oligo-éléments compre nant le cobalt, le cuivre, le zinc, le manganèse, le fer, le chrome, etc. L'usage de ces oligo-éléments pour favoriser la fermentation est bien connu du spécia liste.
Comme on le verra, lorsqu'on traite des solutions aqueuses contenant des matières nutritives destinées au processus de fermentation, pour en éliminer les ions chlorure, l'absorption non sélective d'anions par certains échangeurs d'anions, tend parfois à éliminer une partie des anions désirables contenus dans la liqueur de fermentation. Par exemple, dans certaines conditions les ions phosphates peuvent être éliminés de la solution. De même, l'anion sulfate peut aussi être éliminé. Pour éviter cette possibilité, et pour ré duire la charge imposée à la colonne d'échangeurs d'ions, il est préférable que la majeure partie des élé ments minéraux, par exemple les phosphates. et les sulfates, ainsi que les oligo-éléments, soient ajoutés après l'élimination des chlorures par le traitement d'échange d'ions.
Dans certaines conditions, il peut être désirable d'éliminer aussi certains cations avant la fermenta tion. En conséquence, on peut utiliser des couches mixtes qui éliminent à la fois des cations et des anions.
Les échangeurs d'ions peuvent être des résines synthétiques contenant des groupements amino libres, par exemple des condensais phénol-formaldéhyde- polyamine, des résines mélamine-guanidine-formaldé- hyde, et des résines polyalcoylène-polyamine.
Certaines couches d'échangeurs d'ions peuvent fonctionner de manière à éliminer seulement des anions de la solution. Dans d'autres, il peut y avoir remplacement. Par exemple, dans une résine échan- geuse d'ions fonctionnant sous la forme de sulfate, des ions chlorure sont éliminés et des ions sulfate sont libérés pour les remplacer dans la solution. Bien que ce ne soit habituellement pas nécessaire, ces ions sulfate peuvent être adsorbés par une deuxième cou che d'échangeurs d'ions, fonctionnant simultanément i avec la première.
Il peut en être de même en ce qui concerne d'autres ions qui peuvent être en cause. Pour ces raisons, il est important, après le traitement d'échange d'ions, d'ajuster les besoins anioniques des milieux nutritifs, spécialement en phosphate. Après avoir traité par des résines échangeuses d'ions certains des constituants des milieux de fer mentation, on peut ajouter au liquide traité les au tres matières nécessaires qui sont utilisées dans le processus de fermentation, stériliser le tout, et ense mencer avec des mocroorganismes producteurs de tétracycline. On conduit alors la fermentation suivant la manière usuelle.
La fermentation et l'isolement de la tétracycline peuvent être effectués comme indiqué en détail au brevet N 324085. <I>Exemple 1</I> On prend 17,8 kg d' Amberlite IR-4B , résine échangeuse faiblement anionique du type phénol- formaldéhyde-polyamine vendue par Rohm et Haas, on neutralise par l'acide sulfurique 1 N, on tasse dans une colonne de 15 cm jusqu'à une hauteur de 1,90 m, et on lave à l'eau jusqu'à ce que le pH du liquide d'écoulement soit de 2,0.
On dilue 15,0 kg de liqueur de macération du maïs avec 45 litres d'eau, et on filtre à 500 C. On lave le tourteau avec 15 litres d'eau. On fait passer la solution de là liqueur de ma cération du maïs à travers la colonne à raison de 40 litres par heure. On obtient un test de chlorure posi tif dans le liquide d'élution après avoir traité l'équi valent de 13,5 kg. de liqueur. On ajuste la liqueur traitée, exempte de chlorures à pH 4,0, avec de l'hydroxyde d'ammonium concentré, et elle est alors prête à l'usage.
On prépare un milieu de fermentation avec les constituants suivants Liqueur de macération du maïs traitée par les rési nes : 20 g/1 (solides)
EMI0003.0052
Amidon <SEP> de <SEP> mais, <SEP> <SEP> fluidifié <SEP> <SEP> par <SEP> traitement <SEP> à <SEP> l'acide
<tb> sulfurique:
<SEP> 55 <SEP> g/1
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> <B>......</B> <SEP> 8,0 <SEP> g/1
<tb> Farine <SEP> de <SEP> graines <SEP> de <SEP> coton <SEP> . <SEP> . <SEP> 3,5 <SEP> g/1
<tb> Sulfate <SEP> d'ammonium, <SEP> spécial
<tb> à <SEP> faible <SEP> teneur <SEP> en <SEP> chlorures <SEP> 6,0 <SEP> g/1
<tb> Acide <SEP> phosphorique <SEP> (850/0 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,24 <SEP> g/1
<tb> Huile <SEP> de <SEP> saindoux <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,0 <SEP> 'o/o <SEP> (envol.)
<tb> Oligo-éléments <SEP> S04Fe.2H20 <SEP> . <SEP> . <SEP> 41 <SEP> mg/1
<tb> S04Zn.7H20 <SEP> .. <SEP> 100 <SEP> mg/1
<tb> S04Mn.4Hz0.. <SEP> 50 <SEP> mg/1
<tb> Eau <SEP> du <SEP> robinet, <SEP> q.s. <SEP> pour <SEP> . <SEP> .
<SEP> 1000 <SEP> cm3 On stérilise le milieu pendant 15 minutes à 125o C et on dilue alors avec 3 volumes d'eau du ro binet. Ce milieu contient approximativement 24 par ties par million d'ions chlorures.
On l'inocule alors avec 2'% de son volume d'un inoculum de Strepto- myces aureofaciens (souche S-77), contenant (calculés en poids sous forme solide) 1 'O/o de liqueur de ma- cération du maïs, 3 1% de dextrine,
0,625% de car- bonate de calcium et 0,2 % de sulfate d'ammonium. On conduit la fermentation à 26-270 C pendant 112 heures sous agitation mécanique et aération, à rai son d'environ 0,5 volume d'air par volume de milieu et par minute.
A la récolte, on trouve que le moût fermenté con tient plus de 5000 microgrammes de tétracycline par cm3, avec une quantité de chlorotétracycline infé rieure à 5 n/o de cette quantité.
Pour régénérer la colonne, on fait passer à tra vers celle-ci de l'acide sulfurique 1N, à raison de 100 1/h, jusqu'à ce que le liquide d'écoulement ne contienne plus d'ions chlorure (il faut 2001 d'acide). On fait passer de l'eau à raison de 1001/h jusqu'à ce que le pn s'élève au-dessus de 2,0. Il faut 450 litres d'eau. .La colonne est alors prête à resservir. On peut réutiliser cette colonne quinze fois sans diminution de sa capacité d'élimination d'ions chlorure, ni dimi nution de la valeur nutritive de la liqueur de macé ration du maïs traitée.
<I>Exemple 2</I> On opère exactement comme à l'exemple 1, sauf qu'on utilise une colonne d' Amberlite, IRA-400 , résine échangeuse d'ions fortement anionique du type phénol-formaldéhyde-polyamine, fabriquée par Rohm et Haas. Le milieu de fermentation contient alors en viron 18 parties par million d'ions chlorure.
Quand on fait la récolte du moût, on trouve qu'il contient 3510 mcg/cm3 de tétracycline, et 255 micro- grammes de chlorotétracycline par cm3. <I>Exemple- 3</I> On prépare une couche mixte de résine échan- geuse cationique-anionique, avec des parties égales d' Amberlite IRA-400 et IR-120 ,
cette der nière étant une résine échangeuse fortement cationi- que du type acide sulfonique vendue par Rohm et Haas, et on traite par le sulfate d'ammonium 1N de façon similaire à celle indiquée pour la préparation de la colonne dans l'exemple 1.
Pour tout le reste, on opère comme à l'exemple 1. Le milieu de fermentation, au début de la fermen tation, contient environ 28 parties par million d'ions chlorure.
On trouve que le moût fermenté contient 4670 microgrammes de tétracycline par cm-9 et 390 microgrammes de chlorotétracycline par cm3. <I>Exemple 4</I> Dans des essais en flacons agitateurs, en utilisant le milieu de fermentation de l'exemple 1 additionné de 200 mg/1 d'acide phosphorique;
on obtient 2830 microgrammes par cm3 de tétracycline et 210 micro- grammes par cm3 de chlorotétracycline.
Quand, à titre comparatif, on conduit la fermen tation comme dans le paragraphe précédent, en uti lisant de la liqueur de macération du maïs non traitée à raison de 1 % de solides totaux,
on trouve que le moût fermenté contient environ 1600 microgrammes de tétracycline par cm3 et 1600 microgrammes de chlorotétracychne par cm3,
ce qui montre que l'utili sation de l'ion chlorure disponible dans la liqueur de macération du maïs produit des proportions plus éle vées de chlorotétracycline. <I>Exemple 5</I> La résine échangeuse anionique peut fonction ner sous diverses formes, telles que sulfate, nitrate, hydroxyde, etc.
Quand on répète le processus décrit à l'exemple 1 avec la résine échangeuse d'ions sous forme de nitrate, préparé par traitement avec de l'acide nitrique 1N au lieu d'acide sulfurique, deux opérations différentes donnent 3590 microgrammes de tétracycline par cm3et 210 microgrammes de chlo- rotétracycline par cm3 dans une première opération,
et 4460 microgrammes de tétracycline par cm3 et 230 microgrammes de chlorotétracycline par cm3 dans une deuxième opération.
Dans les deux opérations qui précèdent, la liqueur de fermentation contient de 15 à 30 parties environ par million d'ions chlorure et ceux-ci sont pleine ment utilisés par le microorganisme Streptomyces aureofaciens pour produire toute la chlorotétracycline possible, compte tenu de la teneur du milieu en chlo rures.
Mais étant donné les rendements élevés d'anti biotique obtenus, on observe que la proportion de chlorotétracycline dans ces opérations, dans lesquelles on utilise des résines échangeuses d'ions pour traiter la liqueur de macération du maïs, est inférieure à 8'% dans tous les cas.
Process for the preparation of a new antibiotic The main patent relates to a process for the preparation of tetracycline, in which an aqueous nutrient medium is inoculated and fermented under aerobic conditions containing mineral substances and materials which provide , in assimilable form, carbon and nitrogen, with a microorganism of the genus Streptomyces capable of producing chlortetracycline in a nutrient medium containing chloride ions,
this process being charac terized in that the content of the nutrient medium in chloride ions is regulated so as to obtain an antibiotic product containing mainly tetra cyclin.
The present patent relates to a process for the preparation of tetracycline according to the claim of the main patent, this process being characterized in that the content of chloride ions in the nutrient medium is regulated by subjecting an aqueous solution of at least one water-soluble constituent of said medium to prior treatment with an ion exchange material to reduce the content of chloride ions.
The ion exchange treatment is continued preferably until the amount of chloride ions in said component is reduced to a value such that the content of chloride ions in the overall nutrient medium does not exceed 17 parts per million. middle parts.
The microorganisms used include strains, variants or mutants of Streptomyces aureofaciens, particularly those which give relatively high yields of tetracycline, for example more than 500 micrograms per gram, in the fermentation liquor. As an example, mention may be made of an organism called me UV 8, which is a mutant of the Texas microorganism. This mutant is a new strain, not described until now.
Strain UV-8, when grown on Waksman agar (Journal of Bacte- riology: 7: 339-341, 1922), shows a strong production of mycelium, initially whitish, turning yellow, and gradually becoming covered with a powdery white aerial mycelium, which subsequently sporulates. Old cultures are jet black with small patches of white mycelium. This black vegetation is made up of a mass of bodies with short chains which break easily. These bodies vary in size and shape, ranging from approximately 0.5 to 4.5 microns, and can vary in shape from an oval to a slightly angular spherical globe.
The average size is somewhat greater than that found in Streptomyces aureofaciens (NRRL-2209), and there is a greater variety of sizes and shapes.
Many different strains of Streptomyces have been observed which have the ability to produce both chlorotetracycline and tetracycline, and it is believed that they can all be reasonably classified as Streptomyces aureofaciens, despite the rather marked differences. in their growth habits and nutrient requirements, as Duggar et al. in Annals of the New York Academy of Sciences, volume 60, pages 71-101, published October 29, 1954;
yet some might, for one reason or another, say that their tetracycline-producing microorganisms belong to a different species. In view of this possible conflict of terminology, the licensee wishes to include here the use of all microorganisms of the genus Streptomyces which exhibit the qualities of tetracycline production indicated above.
It has been found that synthetic fermentation media, as described on page 3 of the disclosure of the main patent, are very expensive, and lack certain essential principles of metabolism of the fermentation process which make it possible to obtain high yields of tetracycline. . For this reason and for others which are imperfectly known, it is preferable to use in the preparation of fermentation media, materials of natural origin, for example, maize maceration liquor, di managed casein, etc.
Not only are these materials less expensive than plastics, but they give much higher yields of the desired antibiotic. Since these materials contain appreciable quantities of chloride ions, they must be removed by ion exchange before constituting the nutrient medium.
These natural materials, such as corn maceration liquor, can be diluted with water to an appropriate concentration to pass them through a layer of ion exchangers and remove chloride ions as necessary. The additional quantities of nitrogen, carbon and mineral elements required for the fermentation medium can then be added to the deionized corn maceration liquor.
Corn maceration liquors contain appreciable amounts of chloride ions, in the range of 0.15 to 0.5% by weight.
Casein, which is a very useful material for preparing fermentation liquors, is likely to contain large amounts of chloride ions, depending on the methods of preparation. Frequently, amounts of chloride ions of up to 0.30% are encountered. The enzymatic digestion products of casein, which are also useful for the preparation of fermentation media, may contain even higher concentrations of chloride ions.
Meat powder, and digested fish powders, as well as various other materials, particularly of animal origin, also contain large amounts of chloride ions.
Substances with a high viscosity only pass through the ion exchanger layers with difficulty, and therefore they should be diluted with water to a fluidity which allows sufficient flow through the layer.
In some cases where insoluble materials must also be added to the fermentation medium, they can be washed with deionized water to remove chloride ions before adding these materials to the fermentation medium. Obviously, the nature of the material will determine the suitable treatment.
For raw starch, for example, which often contains considerable amounts of chloride ions, it can be washed in deionized water, added to the fermentation medium, and then cooked or otherwise treated to make it assimilable. for the fermentation microorganism. By proper dilution, soluble starch can be passed through the ion exchanger layer to remove chloride ions.
Soybean meal often contains excessive amounts of chloride ions for the preparation of tetracycline, and when such materials are used in large amounts, they must also be treated by the ion exchange technique as described. above.
Tetracycline-producing strains of Streptomyces aureofaciens which produce more than 500 micrograms of antibiotic per cm3 are preferred. In this case, the fermentation medium may contain 10 parts per million chloride ions, although smaller amounts are preferable. On the other hand, the improvements made to the selection of Streptomyces strains producing tetracycline have led to notable increases in the yield of tetracycline, so that it is now possible to easily obtain 5000 micrograms of tetracycline per cm3, and even more.
If strains of Streptomyces aureofaciens capable of producing quantities of tetracycline greater than 500 micrograms per em3 are used, in fermentation media the chloride ion content of which has been reduced, in accordance with the present method, to a value. As low as possible, crude fermentation musts can be obtained in which only a small proportion of the overall antibiotic product is chlortetracycline.
The presence of a proportion of chlortetiacycline representing up to 10% of the weight of the overall antibiotic product present in the fermentation wort is not a problem.
A fermentation wort containing 5000 micrograms of tetracycline per cm3 could therefore contain up to 500 micrograms per corns of chlortetracycline, this case occurring, for example, when the nutrient medium contains 40 to 50 parts of chloride ions per 1 million parts and when a microorganism has a strong affinity for chloride ions.
If the microorganism used for fermentation has a lower affinity for chloride ions and does not completely consume them, a nutrient medium can be used, the chloride ion content of which is somewhat higher.
As is common in other fermentation processes for the production of antibiotics, fermentation liquors contain sources of available carbon, nitrogen and mineral salts. Many of these sources are relatively free from chloride ions, and are used to supplement the above-mentioned materials which are treated by ion exchangers according to the present invention.
They include, in particular, sucrose, glucose, dextrin, sugar alcohols, citric acid, starch, cottonseed, corn, soybean, peanut flour and other beneficial substances. and nitrogenous which are used in varying amounts, from 0.5 to 5% by weight or more based on the total weight of the fermentation medium.
To increase efficiency and economy, mixtures of these materials are often used along with the naturally sourced products mentioned above, which have been treated with ion exchangers.
Inorganic salts are also added to the fermentation medium, in varying amounts, to promote the growth of the microorganism and obtain high yields of tetracycline. Among these salts, we can mention ammonium phosphate, potassium phosphate, magnesium sulphate, calcium carbonate, and various trace elements including cobalt, copper, zinc, manganese, iron, chrome, etc. The use of these trace elements to promote fermentation is well known to the specialist.
As will be seen, when treating aqueous solutions containing nutrients intended for the fermentation process to remove chloride ions therefrom, the non-selective absorption of anions by some anion exchangers sometimes tends to eliminate a part. desirable anions contained in the fermentation liquor. For example, under certain conditions phosphate ions can be removed from solution. Likewise, the sulfate anion can also be removed. To avoid this possibility, and to reduce the load imposed on the ion exchanger column, it is preferable that the major part of the mineral elements, for example the phosphates. and sulphates, as well as trace elements, are added after the removal of chlorides by the ion exchange treatment.
Under certain conditions it may be desirable to remove some cations also prior to fermentation. Accordingly, mixed layers can be used which remove both cations and anions.
The ion exchangers can be synthetic resins containing free amino groups, for example phenol-formaldehyde-polyamine condensates, melamine-guanidine-formaldehyde resins, and polyalkylene-polyamine resins.
Some layers of ion exchangers may function to remove only anions from the solution. In others, there may be replacement. For example, in an ion exchange resin operating in the form of sulfate, chloride ions are removed and sulfate ions are released to replace them in solution. Although usually not necessary, these sulfate ions can be adsorbed by a second layer of ion exchangers, operating simultaneously with the first.
The same may be true of other ions which may be involved. For these reasons, it is important, after the ion exchange treatment, to adjust the anionic requirements of the nutrient media, especially phosphate. After having treated with ion exchange resins some of the constituents of the fermentation media, one can add to the treated liquid the other necessary materials which are used in the fermentation process, sterilize the whole, and start with producing mocroorganisms. tetracycline. The fermentation is then carried out in the usual manner.
Fermentation and isolation of tetracycline can be carried out as detailed in patent No. 324085. <I> Example 1 </I> 17.8 kg of Amberlite IR-4B, a weakly anionic exchange resin of the phenol type is taken. - formaldehyde-polyamine sold by Rohm and Haas, neutralized with 1 N sulfuric acid, packed in a 15 cm column to a height of 1.90 m, and washed with water until that the pH of the flowing liquid is 2.0.
15.0 kg of corn maceration liquor is diluted with 45 liters of water, and filtered at 500 ° C. The cake is washed with 15 liters of water. The solution of the corn ceration liquor is passed through the column at a rate of 40 liters per hour. A positive chloride test in the eluting liquid is obtained after treating the equivalent of 13.5 kg. of liquor. The treated, chloride-free liquor to pH 4.0 is adjusted with concentrated ammonium hydroxide and is then ready for use.
A fermentation medium is prepared with the following constituents Corn maceration liquor treated with the resins: 20 g / 1 (solids)
EMI0003.0052
Starch <SEP> from <SEP> corn, <SEP> <SEP> fluidized <SEP> <SEP> by <SEP> treatment <SEP> to <SEP> acid
<tb> sulfuric:
<SEP> 55 <SEP> g / 1
<tb> Calcium <SEP> <SEP> <SEP> <B> ...... </B> <SEP> 8,0 <SEP> g / 1
<tb> Flour <SEP> of <SEP> seeds <SEP> of <SEP> cotton <SEP>. <SEP>. <SEP> 3.5 <SEP> g / 1
<tb> Ammonium <SEP> sulphate, special <SEP>
<tb> to <SEP> low <SEP> content <SEP> in <SEP> chlorides <SEP> 6,0 <SEP> g / 1
<tb> Phosphoric acid <SEP> <SEP> (850/0 <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.24 <SEP> g / 1
<tb> Lard <SEP> oil <SEP> <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 1,0 <SEP> 'o / o <SEP> (flight)
<tb> Trace elements <SEP> S04Fe.2H20 <SEP>. <SEP>. <SEP> 41 <SEP> mg / 1
<tb> S04Zn.7H20 <SEP> .. <SEP> 100 <SEP> mg / 1
<tb> S04Mn.4Hz0 .. <SEP> 50 <SEP> mg / 1
<tb> <SEP> water from <SEP> tap, <SEP> q.s. <SEP> for <SEP>. <SEP>.
<SEP> 1000 <SEP> cm3 The medium is sterilized for 15 minutes at 125o C and then diluted with 3 volumes of tap water. This medium contains approximately 24 parts per million chloride ions.
It is then inoculated with 2% of its volume of an inoculum of Streptomyces aureofaciens (strain S-77), containing (calculated by weight in solid form) 1% of maize liquor. , 3 1% dextrin,
0.625% calcium carbonate and 0.2% ammonium sulfate. The fermentation is carried out at 26-270 C for 112 hours with mechanical stirring and aeration, at a rate of approximately 0.5 volume of air per volume of medium and per minute.
At harvest, the fermented wort was found to contain more than 5000 micrograms of tetracycline per cm3, with an amount of chlorotetracycline less than 5 n / o of this amount.
To regenerate the column, 1N sulfuric acid is passed through it, at a rate of 100 l / h, until the flow liquid no longer contains chloride ions (2001 acid). Water is passed at 1001 / hr until the pn rises above 2.0. It takes 450 liters of water. The column is then ready to serve again. This column can be reused fifteen times without reducing its ability to remove chloride ions, or reducing the nutritional value of the treated corn maceration liquor.
<I> Example 2 </I> The procedure is exactly as in Example 1, except that a column of Amberlite, IRA-400, a strongly anionic ion exchange resin of the phenol-formaldehyde-polyamine type, produced is used. by Rohm and Haas. The fermentation medium then contains about 18 parts per million chloride ions.
When harvesting the wort it is found to contain 3510 mcg / cm3 of tetracycline, and 255 micrograms of chlorotetracycline per cm3. <I> Example- 3 </I> A mixed layer of cationic-anionic exchange resin is prepared, with equal parts of Amberlite IRA-400 and IR-120,
the latter being a strongly cationic exchange resin of the sulphonic acid type sold by Rohm and Haas, and treated with 1N ammonium sulphate in a manner similar to that indicated for the preparation of the column in Example 1.
For everything else, the procedure is as in Example 1. The fermentation medium, at the start of fermentation, contains approximately 28 parts per million chloride ions.
Fermented wort is found to contain 4670 micrograms of tetracycline per cm-9 and 390 micrograms of chlorotetracycline per cm3. <I> Example 4 </I> In shaker flask tests, using the fermentation medium from Example 1 supplemented with 200 mg / l of phosphoric acid;
2830 micrograms per cm3 of tetracycline and 210 micrograms per cm3 of chlorotetracycline are obtained.
When, for comparison, the fermentation is carried out as in the previous paragraph, using untreated maize maceration liquor at a rate of 1% of total solids,
fermented wort is found to contain approximately 1600 micrograms of tetracycline per cm3 and 1600 micrograms of chlorotetracychne per cm3,
which shows that the use of the chloride ion available in the corn maceration liquor produces higher proportions of chlorotetracycline. <I> Example 5 </I> The anion exchange resin can function in various forms, such as sulfate, nitrate, hydroxide, etc.
When the procedure described in Example 1 is repeated with the ion exchange resin in nitrate form, prepared by treatment with 1N nitric acid instead of sulfuric acid, two different operations give 3590 micrograms of tetracycline per cm3 and 210 micrograms of chlorotetracycline per cm3 in a first operation,
and 4460 micrograms of tetracycline per cm3 and 230 micrograms of chlorotetracycline per cm3 in a second run.
In the two preceding operations, the fermentation liquor contains about 15 to 30 parts per million chloride ions and these are fully utilized by the microorganism Streptomyces aureofaciens to produce all the chlorotetracycline possible, taking into account the content of the chloride. middle in chlorides.
However, given the high yields of anti-biotic obtained, it is observed that the proportion of chlorotetracycline in these operations, in which ion exchange resins are used to treat the maize maceration liquor, is less than 8% in all cases.