Verfahren zur Herstellung von 11-Oxy-steroiden Die Erfindung bezieht sich auf ein Ver fahren zur Herstellung von 11-Oxy-steroiden durch Oxydation von Steroiden, die in 11-Stel- lung eine Methylengruppe enthalten.
Dieses Verfahren besteht darin, dass man diese Steroide einer biochemischen Oxydation unter aeroben Bedingungen mittels Enzymen unterwirft, die von Pilzarten der Ordnung Mucorales erzeugt werden. Hierbei können die Ausgangssteroide der Einwirkung eines lebenden Stammes solcher Pilzarten oder der Einwirkung oxydierender Enzyme, welche aus diesen Pilzarten erhalten werden können, unterworfen werden.
Es ist bereits bekannt, Sauerstoff in die 11-Stellung eines Steroides einzuführen, jedoch wurde dies nur durch technisch hoch entwickelte organische Synthesen mit vielen Zwischenstufen erreicht. Demzufolge war die Gesamtausbeute von in der 11-Stellung oxy dierten Steroiden viel zu klein und die Un kosten einer solchen Erzeugung waren ausser ordentlich gross, wenn nicht vollkommen un tragbar.
Dies stellte ein unüberwindliches Hindernis für die Bestrebung der pharma zeutischen Chemiker dar, gewisse in der 11- Stellung oxydierte Steroide einem grösseren Kreis von Personen, welche an bestimmten Krankheiten leiden, zur Verfügung zu stellen, da diese Krankheiten nur von gewissen, in der 11-Stellung oxydierten Steroiden günstig beeinflusst werden können, deren hohe Her- stellungskosten jedoch und die unzulängliche Versorgung des Marktes eine allgemeine Ver breitung dieser Heilmittel verhinderten.
Unter den Medikamenten, welche aus in der 11-Stel- lung oxydierten Steroiden bestehen, seinen Corticosteron, 11-Dehydro-corticosteron, 11 Dehydro-17-Oxy-corticosteron (Compound E, Cortison) und 17-Oxy-corticosteron (Com- pound F) erwähnt.
Es ist daher von grösster Wichtigkeit, eine zufriedenstellendere Methode zu finden, um Steroide herzustellen, welche in der 11-Stellung eine Hydroxyl-(Oxy-)gruppe (-OH) enthalten, wie sie in vielen wert vollen Steroiden vorkommt und ausserdem leicht durch bekannte Oxydationsverfahren in eine Ketogruppe umwandelbar ist. Bisher konnte diesbezüglich trotz grösstem Aufwand an Mitteln und Zeit kein nennenswerter Er folg verzeichnet werden.
Die Erfindung ermöglicht nun auch die Herstellung solcher Steroide, welche zumin dest in der 11-Stellung des Steroidringsystems eine Hydroxylgruppe enthalten, in guter Aus beute. Die Oxydation der Steroide zumindest in der 11-Stellung kann vor allem durch Pilze der Familie Mucoraceae, welche der Ordnung Mucorales angehört, insbesondere der Gat tung Rhizopus oder durch sie erzeugte oxy dierende Enzyme stattfinden.
Ausserdem er möglicht das erfindungsgemässe Verfahren, Verbindungen herzustellen, welche durch kein anderes Verfahren erzeugt werden können und daher von sehr grossem Wert für die Her stellung von in 11-Stellung oxydierte Steroide enthaltenden Heilmitteln sind.
Es -wurde festgestellt, dass die genannten Ausgangssteroide, welche das Cyclopentano- poly hy drophenanthren-Ringsystem enthalten, insbesondere 10,13 - Dimethyl - cyclopentano- polyhydrophenanthren, leicht und mit hoher Ausbeute in die entsprechenden 11-Oxy- Steroide umgewandelt werden können, indem das Steroid der Einwirkung eines Pilzes der Ordnung Mucorales,
oder der von diesen Pil zen inner- oder ausserzellular gebildeten oxy dierenden Enzymen unterworfen wird. Dieses Verfahren bietet eine wirksame, wirtschaft- liehe und kommerziell zufriedenstellende Mög lichkeit zur Einführung der OH-Gruppe in die 11-Stellung eines Steroids der genannten Art.
Dadurch ist eine neue und einfache Her- stellungsmöglichkeit von in 11-Stellung eine Hydroxylgruppe enthaltenden Steroidheil- mitteln gegeben, welche, wie bereits erwähnt, für die Chemie, Pharmazie und Medizin, ins besondere für solche Patienten, die an physio logischen Veränderungen leiden, welche aus- sehliesslich durch derartige Heilmittel günstig beeinflusst werden können, von grösster Wich tigkeit ist.
In vereinzelten Fällen können auch andere Stellungen des Steroidmoleküls durch die Ein- wirkLing der Pilze oder deren Enzyme Ver änderungen erfahren, jedoch sind solche Um Wandlungen nicht immer als unerwünscht zu betrachten, da die Einführung von Sauer stoff in andere Stellungen des Steroidmoleküls wertvolle therapeutische Stoffe oder Zwischen produkte ergeben kann, z. B. solche, welche eine Hydroxylgruppe in 17-Stellung besitzen.
Im Falle, dass die Einführung solcher zusätz licher Gruppen nicht erwünscht ist, können dieselben nach bekannten Methoden leicht wieder entfernt werden. Hydroxylgruppen, welche im Steroidmolekül, das in der 11-Stel- lung oxydiert werden soll, schon vorhanden sind, können, im Falle, dass es wünschenswert ist, ausserordentlich hohe Ausbeuten von in der 11-Stellung oxydierten Steroiden anzu streben, durch Umwandlungen, wie, z.
B. mit- tels Verestern, Veräthern, Halogenierung oder dergleichen vor den verschiedenen Einwirkun gen, inbegriffen die Wirlulng der oxydieren den Pilze oder deren oxydierende Enzyme, geschützt werden, wobei die erhaltenen Grup pen sich in Hydroxylgruppen zurückverwan deln lassen müssen. Eine solche Vorbehand- lung ist aber nicht Vorbedingung, um Sauer stoff in die 11-Stellung von Steroiden mittels des erfindungsgemässen Verfahrens einführen zu können.
Die Steroide, auf welche das erfindungs gemässe Verfahren anwendbar ist, werden durch die Art oder Anzahl der in ihrem Mole kül anwesenden Substituenten nicht einge schränkt. Für die Herstellung von 11-Oxy- Steroiden ist die Anwendbarkeit der Steroide lediglich durch das Vorhandensein einer Me- thylengruppe in 11-Stellung bestimmt.
Der Grundkörper kann Substituenten oder Kom binationen von Substituenten in der 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16- und 17-Stellung haben, insbesondere 7.0,13-Dimethylgruppen, 3,7- oder 12-Keto-, Hydroxyl- oder Acyloxygriippen. Es können Seitenketten in 17-Stellung vorhanden sein, wovon die Progesteron- und Corticosteron- (Ketol-)Seitenketten besonders erwähnt wer den sollen.
In der 17-Stellung kann auch eine Ketogruppe vorhanden sein, oder es kann sich eine Hydroxylgruppe oder dergl. dort befin den. Ausserdem können Doppelbindungen an der 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 16(17)- und andern Stel lungen (ausser den 9(11)- und 11(12)-Stellun- gen) sowie Kombinationen von Doppelbindun gen im Ringsystem vorkommen. Auch Doppel bindungen, welche durch Anlagerung von Halogenen oder Halogenwasserstoffen abge- sättigt wurden, können vorhanden sein.
Ebenso können Additionsprodukte von dienophilen Verbindungen, wie etwa Maleinsäure, Malein- säureanhydrid oder Maleinsäureester mit Steroiden, welche eine konjugierte Doppelbin dung, z. B. an 5,7-Stellungen, besitzen, gebil det werden. Das Ringsystem kann auch andere Substituenten oder Kombinationen von Sub- stituenten mit Doppelbindungen usw. enthal ten, welche zu zahlreich sind, um gesondert erwähnt werden zu können und wovon viele bereits in der Steroidchemie bekannt sind.
Als Vertreter der Steroide, welche mittels dieses Verfahrens oxydiert werden können, seien z. B. folgende genannt: Progesteron, 17-Oxy-progesteron, Pregnenolon, Acyloxy- pregnenolone wie etwa Pregnenolonacetat, 1.1-Desoxy-corticosteron, 11- Desoxy-17 - oxy- corticosteron und Acyloxyderivate davon, wie etwa Acetoxyderivate, 21-Oxy-pregnenolon und 21-Acyl-, z.
B. Acylester davon 17,21- Dioxy-pregnenolon und dessen 17,21-Diacyl- oxyderivate, z. B. das Diaeetoxyderivat, Androstendion, Androstan-17-ol, 5-Androsten- 3-ol-17-on und - 3-Acyl-, z.
B. Acetylester davon, 5-Androsten-3-ol-17-on und 3-Acyl-, Acetylester davon; Ergosterin, Stigmasterin, Stigmastanol und 3-Acy 1-, z.
B: 3-Acetylester davon; Ergostenon, Stigmastenon, Stigmasta- non, Cholestenon, Cholsäure, Desoxychol- säure, Lithocholsäure, Cholansäure, Noreholan- säure, Bisnorcholansäure, Cholensäure, Nor- eholensäure,
Bisnorcholensäure und die 3-Oxy-, 3-Keto-, 3,7-Dioxy-, 3,7-Diketo-, 3,7,12-Trioxy-, 3,7,12-Triketo-Verbindungen, Ester, Thiolester und andere Derivate der vorher erwähnten Säuren und dergleichen.
Unter den zahlreichen Familien der Ord nung Mucorales, wie sie in dem Werk Mor- phology and Taxonomy of Fungi von Bessy, erschienen bei The Blachiston Company in Philadelphia im Jänner 1952 im 7.
Kapitel beschrieben ist, können die Gattungen der Familie Mucoraceae für die biochemische Oxydation am besten verwendet werden und von diesen wieder können die Rhizopus- und Mucorgattungen am besten gebraucht werden. Von den Arten dieser Gattungen seien z. B.
folgende erwähnt: die Rhizopusarten micro- sporus, circinans, oligosporus, arrhizus, cohnii, cryzae und nigricans, und synonyme Arten, welche mit den genannten Arten trotz anderer Benennung tatsächlich identisch sind und die typischen Mucorarten mucedo, griseocyanus, hiemalis,
hiemalis var. albus, rouxi, adven- titius, christianiensis, circinelloides, dubius, genevensis, javanicus, microsporus, parasiticus und dgl.
Während Arten der -Gattungen aus den Familien der Ordnung der Mikroorga nismen, welche alle zusammen nach dem ge nannten Werk als Mucorales bezeichnet wer den und insbesondere jene der Familie Muco- raceae als oxydierende Pilze im allgemeinen wirksam sind, können aus wirtschaftlichen und Produktivitätsgründen Arten der Gat tungen Rhizopus bevorzugt werden und von dieser Gattung kann die Art arrhizus, auf welche später des öfteren unter der Bezeich nung RI3-176 Bezug genommen werden wird, gewählt werden,
-um bei der Erzeugung von 1l.-Oxy-steroiden optimale Ausbeuten zu erhal ten, obwohl in manchen Fällen, unter beson deren Umständen, . andere Gattungen und andere Arten in vorteilhafter Weise benützt werden können. Arten der erwähnten Gattun gen sind besonders reichhaltig an oxydieren den Enzymen, wodurch sie bei entsprechender Zucht in der Lage sein können, die genannten Ausgangssteroide in der 11-Stellung in einem industriell in Frage kommenden Massstab zu oxydieren.
Trotzdem Arten gewisser Gattungen, der Rhzopusgattung insbesondere und der Mucor- gattung, welche beide der Familie 1VIucoraceae angehören, in den meisten Fällen für die Barzeugung im grossen von 11-Oxy-steroiden vorgezogen würden und Während wirtschaft liche Beweggründe sogar die praktischen Ver fahren auf die Anwendung gewisser Arten und Stämme, welche besonders physiologische Eigenschaften besitzen, einschränken können,
können andere Familien und Gattungen der Ordnung Mucorales ebenfalls zur Umwand lung von Steroiden der genannten Art in die entsprechenden 11-Oxy-steroide in einem in dustriell bedeutsamen Ausmass verwendet wer den.
Beispielsweise seien andere Gattungen der Familie Mucoraceae und ihnen angehörige Arten aus dem Buch von I3. Zycha Krypto- gamenflora der Mark Brandenburg , Band VIa, 1-264 (1934), zusammengestellt:
Parasitella (P. simplex), Zygorhynchus (Z. heterogamus), Circinella (C. spinosa), Actinomucor (A. repens), Pirella (P. circinans), Absidia (A. reflexa), Spinellus (S.
Sphaeresporus), Phycomyoes (Ph. Blakeslecanus), Sporodinia (Sp. grandis), Pilaira (P. anomala), Pilobolus (P. crystalliniis), Dicoccum (D. asperum).
Andere Familien der Ordnung Mucorales samt ihren Gattungen und sie vertretende Arten sind: Thamnidieae Thamnidium (Th. elegans), Dieranophora (D. fulva), Chaetostylum (C. Fresenii), Heliostylum (H. piriforme), Chaetocladium (Ch. Brefeldii); Choanephoreae:
Blakesleea (B. trispora), Choanephora (Ch. cucurbitarum), Rhopalomyces (Rh. elegäns), Cunninghamella (C. elegans), Thamnocephalis (Th. qLladritpedata); Cephalideae:
Piptocephalis (P. presenians), Syneephalis (S. reflexa), Spinalis (Sp. radians), Syncephalastrum (S. racemosLim), Dispira (D. cornuta), Coemansia (C. pectinata), Kickxella (K. alabastrina) ;
Mortierelleae Mortierella (M. pusilla), Haplosporangium (H. bisporale), Dissophora (D. decumbens);
Endogonaceae Endogone (E. reniformis), Seleroeystis (S. coromiodes), Glaziella (C. vesiculosa). 6 Unter den Arten der R.hizopusgattungen, welche wie erwähnt im erfindungsgemässen Verfahren bevorzugt angewendet werden kön nen, sind nach H. Zycha, Krypt. der Mark Brandenburg , Band VIa, 110-120 (1935) viele allgemein bekannte Arten synonym.
So ist Rhizopus microsporus auch unter Namen wie Rh. ininimus, Mucor speciosus, Rh. specio- sus und Rh. equinus bekannt;
Rhizopus circi- nans ist auch bekannt als Rh. reflextis; Rhizo- pus oligosporus ist auch bekannt als Rh. Dela- inar oder Rh. Tamari; Rhizopus arrhizus ist bekannt als Rh. nodosus, Rh. racemoses, Rh.
maydis, Miicor arrhizus, Mucor norvegicus, Rh. pusilltis, Rh. bovigus, Rh. Cambodja, Rh.
chinensis und Rh. tritici; Rhizopus Cohnii ist bekannt auch als Rh. suinus; Rhizopus Oryzae ist auch bekannt als Rh. japonicus oder Rh. toniknensis; Rzizopus nigricans ist auch be kannt als Mucor stolonifer, Rh. niger, Rh.
artocarpi, Mucor niger, Rh. nigricans var. minor oder Rh. nigricans var. luxurians; und Rhizopus echinatus wird als selbständige Art bezweifelt und dürfte mit Rhizoptis nigricans synonym sein.
Die Pilzorganismen können von bekannten Quellen, wie etwa von den Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, oder American Type Culture Collection, Washing ton, D. C., oder Centraalbureau voor Schimmel- cultur Baarn, Holland, bezogen werden. An dernfalls können auch natürliche, dem Mikro biologen bekannte Quellen verwendet werden.
Die Isolierung der Pilze von natürlichen Quellen kann nach dein Mikrobiologen be kannten Verfahren erfolgen. Sterile Nähr böden können aus verschiedenen Kohlehydra ten und Stickstoff enthaltenden Stoffen her gestellt lind mit 20/e Agar zu einem Gel ver festigt werden. Der Stickstoff kann verschie densten Ursprunges sein und kann z. B. aus organischen Nitraten, Amnioniumsalzen oder Proteinauszügen stammen. Die Nährböden können durch Dampfdruck oder im Auto klaven in mit Wattebausehen verschlossenen Kolben oder Reagenzgläseim sterilisiert wer den, um dann unter sterilen Bedingungen in Petrischalen umgefüllt z11 werden.
Diese kön nen entweder mit durch Pilze infizierten Steroidlösungen geimpft oder Staub bzw. offener Luft ausgesetzt werden. Auf diesen Platten entwickeln sich Pilze, unter welchen Kolonien von Mucorales, besonders die Mucor- aceae-Arten Mucor und Rhizopus, leicht durch einen geschulten Mikrobiologen erkannt werden können. Aus den Kolonien können die Organismen ausgesucht und entweder auf einen gleichen Nährboden in Reagenzgläsern oder auf irgendeinem andern, dem Wachstum der Pilze zuträglichen Nährboden übertragen werden.
Kräftige Lüftung wirkt unabhängig von der Nährbodenart fördernd auf ein starkes Wachstum der Organismen. Mit der Orga- nismenkultur, welche aus Sammlungen bezo gen oder natürlichen Ursprunges sein kann, kann nun ein das Wachstum der Pilze för dernder bakteriologischer Nährboden beschickt werden.
Für diesen Zweck kann der Nähr boden von Peterson und Murray mit gutem Erfolg verwendet werden und im folgenden, in den Aufstellungen lind Beispielen wird, wenn nicht anders erwähnt, stets der Nähr boden von Peterson und Murray Anwendung finden. Ein solcher Nährboden enthält z. B.
auf einen Liter Leitungswasser, das dazu dient, um Spuren von Elementen und anorga nischen Salzen zu liefern, folgende Zusätze:- 5 5 ems 112aisquellwasser, 20 g im Handel erhält- lichen.Laetalbuminauszug Lind 50 mg im Han del erhältliche Dextrose. Der pH--#Vert dieses Nährbodens oder anderer, welche Verwendung finden können, kann gewöhnlich vor dem Ein impfen der Pilzorganismen auf ungefähr 5;5 bis 5,9 gestellt werden.
Erhitzen unter Druck von etwa 0,7 kg/em2 während 30 Minuten kann eine Erniedrigung des pi-I-Wertes von ungefähr 6,5 auf ungefähr 5,5 bis 5,9 bewir ken und diese Verminderung des pH-Wertes muss bei der Einstellung des PH-Wertes des Nährbodens vor der Erhitzung berVieksiehtigt werden, um nach Beendigung dieser Mass nahme optimale 1\rachstumsbedingungen zu erhalten. Nach 24 Stunden Pilzwachstum auf dem Nährboden kann man feststellen, dass der j)ri-'v#Tert des Nährbodens stark gesunken ist, gewöhnlich auf ungefähr 3,5 bis 4,2.
Vorzugs weise in diesem Wachstumsstadium der Pilze kann das zu oxydierende Steroid hinzugegeben, oder die Pilzfermentationsflüssigkeit, welche zur fermentativen Oxydation der Steroide be nützt wird, von den Pilzkulturen getrennt werden. Das Impfen des das Pilzwachstum erhal tenden Nährbodens mit ausgewählten Pilzen der Mucoralesordnungkann in irgendeiner entsprechenden, in der Mikrobiologie üblichen Weise erfolgen. Zum Beispiel kann das Imp fen in geeigneter Weise mit Sporen der Orga nismen erfolgen, jedoch wäre ein Impfen, bei welchem vegetatives Myzelium verwendet wird, ebenfalls erfolgreich.
Das Wachstum der Pilze kann Letter Aufrechterhaltung einer Incubationstemperatur, welche der Zimmer temperatur; z. B. 20 bis 25 C entspricht, gut gefördert werden, jedoch wäre auch ein rela tiv grosses Temperaturintervall möglich. Zum Beispiel wurden Temperaturen von ungefähr 1.5 C bis ungefähr 45 C für die Zucht der Pilzorganismen als zufriedenstellend befun den.
Die Zeitdauer des Pilzwachstums, welche notwendig ist, bevor das zu oxydierende Steroid der Pilzeinwirkung oder der Einwir kung der Pilzenzyme ausgesetzt wird, scheint nicht entscheidend zu sein. Beispielsweise kann das in der 11-Stellung zu oxydierende Steroid entweder gleichzeitig mit dem Impfen des Nährbodens mit ausgewählten Mucorales- arten oder zu irgendeiner Zeit, z. B. 24 Stun den später, zugeführt werden.
Bei der Aus übung des- Verfahrens wurde gefunden, dass das zu oxydierende Steroid ohne nachteilige Wirkung auf das erhaltene Ergebnis, sogar 5 Tage nach dem Impfen des Nährbodens mit ausgewählten Mucoralesarten zu den Pilzkul turen in der Nährbodenlösung hinzugefügt werden kann. Nach einer bevorzugten Arbeits weise kann man die Zugabe des Ausgangs- steroides zur Fermentationsflüssigkeit nach einer 16-24stündigen Zeitdauer des Pilz wachstums tätigen, da in diesem Stadium des Pilzwachstums die Enzymbildung voll ent wickelt zu sein scheint.
Auch im Falle, dass die Oxydation nur mittels der das oxydierende Enzym enthaltenden Fermentationsflüssigkeit vorgenommen werden soll, muss mindestens dieses Wachstumsstadium erreicht sein, ehe die Fermentationsflüssigkeit wie üblich und vor teilhaft abgetrennt wird. Die Art der Zugabe der zu oxydierenden Steroide zu den oxydierenden Pilzen, zum Pilznährboden oder zur Fermentationsflüssig- keit scheint nicht entscheidend zu sein.
Die Zugabe kann in irgendeiner entsprechenden Weise stattfinden, die einen innigen Kontakt der Steroide mit den Pilzen und/oder den Enzymen der Pilze herstellt, wie etwa durch Züchten der Pilzorganismen in Gegenwart von fein zerkleinerten Steroidkristallen, durch Dispergierung der Steroide in der ganzen Nährbodenflüssigkeit oder in sonst ähnlicher Weise. Zu diesem Zweck können oberflächen aktive Mittel, Dispersionsmittel oder Auf- sehwemmungsmittel, wie etwa käuflich erhält liche Mittel, wie z.
B. die Markenprodid"te Span , Tween , Aerozol , Nacconol oder dergleichen verwendet werden. Das Steroid kann jedoch vorzugsweise in der Form einer mit Wasser mischbaren organischen Lösung, wie etwa in Form einer Lösung in Aceton, Alkohol oder sogar einer Ätherlösung, welche sieh in Wasser nur wenig löst, den Pilzen, dem Nährboden oder der Fermentationsflüs- sigkeit hinzugefügt und sodann die Nähr bodenlösung mit dem Steroid gut durchmischt werden,
so dass sich eine Suspension oder Dispersion feiner Steroidteilchen bildet und eine sehr grosse Berührungsfläche des zu oxy dierenden Steroides mit den oxydierenden Pilzen oder deren Enzymen hergestellt wird. Es können entweder Submers- oder Ober flächenkulturmethoden gut verwendet wer den, Submerskulturen werden jedoch vorgezo gen. Für die Oxydation des Steroides bedarf es jedenfalls aerober Bedingungen.
Man kann auch die Fermentationsflüssigkeit einer Pilz zucht absondern, dem Steroid oder dessen Lösung beimischen und die Mischung aeroben Bedingungen unterwerfen, um die Oxydation der Steroide durchzuführen.
Die Temperatur, welche während der oxy dierenden Einwirkung der Pilze auf die Steroide eingehalten wird, braucht nicht not wendigerweise eine andere, als während der Zeit, wo die Steroide noch nicht zugemischt waren, zu sein. Sie soll sich lediglich inner halb solcher Grenzen bewegen, in welcher das Leben oder ein aktives Wachstum der Pilz organismen aufrechterhalten bleibt. Die Incu- bationstemperatur während der oxydierenden Einwirkung der Pilze auf die Steroide kann demzufolge z. B. zwischen ungefähr 15 C und ungefähr 45 C betragen, wobei Zimmertem peratur, z. B. 20 bis 25 C, wegen der hierbei auftretenden optimalen Wirkung der Pilz organismen oder deren Enzyme den Vorzug geniesst.
Die Pilzorganismen können vorzugsweise unter aeroben Bedingungen gezüchtet werden, wobei die Wachstumsstärke sich als von der Belüftungsstärke abhängig ergibt. Trotzdem jede Art einer aeroben Zucht zufriedenstel- lend ist, kann gewöhnlich eine starke Belüf tung, wie etwa durch Rühren und loder Durch blasen von Luft durch die Nährflüssigkeit vorgenommen werden, um maximales Pilz wachstum zu erlangen, wobei offenbar die Zeit, welche zur Bildung der 11-Oxy-steroide notwendig ist, vermindert wird.
Der Umwand lungsgrad des Ausgangssteroides in das ent sprechende 11-Oxy-steroid ergibt sieh somit als abhängig entweder von der Belüftungsstärke oder vom Ausmass des Pilzwachstums zur Zeit, wo das Steroid zugegeben wird, da festge stellt wurde, dass Umwandlungen, welche ent weder die Pilzkulturen oder die Fermenta- tionsflüssigkeit allein verwenden, schneller vor sich gehen, wenn die Belüftungsstärke grösser ist und auch dann, wenn der Pilz vor dem Zusatz des zu oxydierenden Steroides sich 16 bis 24 Stunden entwickeln konnte.
Dies deutet darauf hin, dass das oxydierende Enzymsystem nach 16- bis 24stündigem Wachstum. vollentwickelt ist und dass eine Belüftung entweder die Umwandlung bzw. die Umwandlungsgesehwindigkeit durch Ver grösserung der Wachstumsgeschwindigkeit der Pilzorganismen mit entsprechend besserer Entwicklung des oxydierenden Enzymsystems erhöht, oder dass die Belüftung lediglich durch Vergrösserung der Sauerstoffzufuhr die Oxy dation fördert.
Die vorhergehenden theore tischen Auslegungen sind nur als Erläuterun gen aufzufassen, ohne eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes zu beinhalten, da die Oberflächenkulturmethode ohne Rühren oder andere Belüftungsarten allein verwendbar ist und ausserdem das Steorid der mit dem Impfen mit Pilzorga nismen zugegeben werden kann, ohne die-Ver- wendbarkeit der Methode zu beeinträchtigen.
Wichtig ist nur, dass die biochemisehe Oxyda tion des Steroids unter aeroben Bedingungen stattfindet.
Die Zeit, welche zur Biooxydation des Steroids durch die oxydierenden Pilzorga nismen oder deren oxydierende Enzyme not wendig ist, kann nicht genau angegeben wer den, da verschiedene Umstände in Betracht gezogen werden müssen. Ungefähr 1 bis 72 Stunden wurden als hinreichend befunden, um durch Einwirkung von oxydierenden Pilzen oder deren oxydierenden Enzymen auf ein Steroid der genannten Art dasselbe in das entsprechende 11-Oxy-steroid umzuwandeln.
Es bestehen jedoch Anzeichen dafür, dass die Oxydation des Steroides im wesentlichen sofort nach der Zugabe desselben zur Fermen tationsflüssigkeit eines vollentwickelten oxy dierenden Pilzes oder dessen oxydierender Enzyme beginnt, wobei eine Pilzzucht nach 4- bis 24stündigem Wachstum als voll ent wickelt bezeichnet wird, was in gewissem' Masse auch von der Belüftungsstärke abhängt.
Wenn das Steroid zum Nährboden gleichzeitig mit dem Impfen mit den Pilzorganismen zu gegeben wird, ist zwecks hohen Umsetzungs-- grades der Ausgangssteroide eine längere Fer- mentationsdauer angezeigt, wobei, wie schon früher erwähnt, anzunehmen ist, däss dieser Umstand der Tatsache zuzuschreiben ist, dass das oxydierende Enzymsystem der Pilze erst nach einer gewissen Dauer des Pilzwachstums vollentwickelt ist.
Dementsprechend _werden, falls das Steroid gleichzeitig mit dem Impfen dem Nährboden zugegeben wird, gewöhnlich Fermentationszeiten von 8 bis 72 Stunden eingehalten, wobei die Länge der Fermenta- tionsdauer umgekehrt proportional der Be lüftungsstärke ist. Anderseits, falls das Steroid den Pilzen, dem Nährböden oder den Enzymen der Pilze in der Fermentationsflüssigkeit nach längerem Wachstum der Pilzorganismen, z. B.
nach 16 bis 24 Stunden ohne wesentliche Be lüftung oder nach 2 bis 4 Stunden bei starker Belüftung zugegeben wird, beginnt die Um wandlung des Ausgangssteroids in das ent sprechende 11-Oxy-steroid sofort, und im Laufe von 1 bis 72 Stunden oder je nach der Belüftungsstärke, sogar in kürzeren oder län geren Zeiten, werden hohe Ausbeuten erzielt. Es sei erwähnt, dass bei längerer Einwirkungs dauer der oxydierenden Pilze oder von deren Enzymen auf die Ausgangssteroide eine er höhte Umwandlung in mehrfach oxydierte Abkömmlinge stattfinden kann, dass das Steroid in der 11-Stellung jedoch auf jeden Fall oxydiert wird.
Nach der Vollendung der oxydierenden Fermentationsreaktion kann das gebildete 1.1.-Oxy-steroid vom Fermentationsreaktions- gemisch in irgendeiner zweekentsprechenden Weise abgetrennt werden.
Eine besonders vor teilhafte Art, die oxydierten Steroide abzu trennen, kann darin bestehen, das Gemisch der Fermentationsreaktion zu extrahieren, insbesondere die Fermentationsflüssigkeit und die 1Vlyzelien in den Fällen, wo das Steroid direkt zur Pilzkultur hinzugefügt würde, und zwar mittels mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie etwa halo- genierten Kohlenwasserstoffen, z. B. Methylen- chlorid, Äthylenchlorid oder Chloroform, ver schiedenen Ätherarten und dergleichen.
Die Extrakte können dann, nachdem sie zuerst mit N atriumbikarbonat und nachher mit destilliertem Wasser gewaschen worden sind, vereint werden, und zusammen durch einen Luftstrom, im Vakuum, oder auf eine ähn- liehe Weise getrocknet werden, um dann zwecks Auskristallisierung die festen Rück stände in etwas frischem organischem Lösungs mittel, z. B. iii Methylenchlorid oder andern, schon vorher erwähnten Lösungsmitteln, auf zunehmen. Eine zusätzliche Umkristallisierung kann, wenn erwünscht, aus organischen Lö sungsmitteln, z. B.
Methanol, stattfinden. Die kristalline Substanz kann mittels bekannter Methoden, wie etwa durch Elementaranalyse; durch den Schmelzpunkt, ein Infrarot- und Ultraviolettabsorptionsspektrum, - durch ein Röntgenbeugungsdiägramm, eine Mikrover brennung und andere Methoden identifiziert werden. Man kann auch das kristalline Mate rial oder Extrakte nicht kristallinen Materials, welche durch die Biooxydation hergestellt wurden, mittels der Papierchromatogramm- Methode nach Zaffaroni identifizieren.
Ein besonders brauchbares Verfahren zur Trennung von nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Oxydationsprodukten ist die Chromatographie der Extrakte oder festen Substanzen anhand einer aus Alumi niumoxyd (A1203) oder andern Substanzen bestehenden Adsorptionssäule, wobei z. B. Benzol als Lösungsmittel verwendet wird und verschiedene Lösungsmittel oder Mischungen davon zum Entwickeln des Chromatogramm.es dienen, wie aus den Chromatogrammen der Beispiele zu ersehen ist.
Die festen Substan zen werden durch Verdampfung der Extrak tionsflüssigkeit erhalten und können noch umkristallisiert werden. Diese Methode ist zur Identifizierung der durch die Oxydation ge bildeten Stoffe besonders geeignet, da, wenn erwünscht, jede Fraktion der Säule nach der Methode nach Zaffaroni geprüft werden kann.
Durch ein Papierchromatogramm nach Zaffa- roni können so kleine Mengen wie zehn bis vierzig y der Substanz geprüft, die chemischen Stoffe identifiziert und Fraktionen, die die gleichen chemischen Stoffe enthalten, vereint und die Verbindung aus den vereinten Frak tionen kristallisiert werden.
Die Methode von Zaffaroni, soweit sie in der Beschreibung erwähnt wird, ist eine ver hältnismässig neue, jedoch schon gut einge führte Methode zur Identifizierung gewisser organischer Stoffe, nämlich der den Neben- nierenrindenhormonen verwandten Verbin dungen, wobei diese analytische Methode zum Teil auf der Polarität der zu prüfenden Stoffe fusst. Die Literaturangaben zu dieser Arbeits methode sind folgende:
Burton, Zaffaroni und Keutmann, A New Analytical Method for Adrenal Cortical Hormones , Seience 110, 442 (1949);
und Zaffaroni, Burtön und Keut- mann, Seience 111,<B>6</B> (1950). An, diesen Stel- len können Einzelheiten über diese Methode nachgelesen werden.
Die folgenden Beispiele sollen lediglich als Erläuterungen gewertet werden.
<I>Beispiel 1</I> Oxydation von Progesteron Zu 4 Liter einer 32 bis 48 Stunden alten Zucht der Pilzkultur RII-1.76 wurde 1 g Progesteron, gelöst in 50 eins Aceton, hinzu gegeben und damit eine Suspension in der Nährbodenflüssigkeit der Kultur hergestellt. Die Kultur wurde dann bei Zimmertempera tur 48 Stunden lang unter Belüftung ausge brütet. Zu diesem Zweck wurde die 4 Liter umfassende, beimpfte Kulturflüssigkeit in einer 20-Literflasche, welche mithin 16 Liter Luft enthält, auf einer. Schüttelmaschine ge schüttelt.
Nach Verlauf dieser Zeit betrug der pH-Wert des Nährbodens ungefähr 3,5 und die Fermentationsflüssigkeit und das Myze lium wurden nacheinander dreimal mit einem Liter, einmal mit zwei Liter und einmal mit einem Liter Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchloridextrakte wurden vereinigt und zweimal mit je 400 cm3 einer 2 /aigen wässrigen Natriumbikarbonatlösung und drei mal mit je 500 cm3 destilliertem Wasser ge waschen.
Das Methylenchlorid wurde im Va- kuiim abdestilliert -Lind der trockene Rück stand in 50 eins Methylenehlorid aufgenom men. Die Lösung wurde in ein Becherglas von 100 cm3 gebracht und mittels eines Luft stromes verdampfen gelassen. Der feste Rück stand, welcher 1,585 g wog, wurde in 5 cm3 heissem Methanol aufgelöst und langsam auf Zimmertemperatur abgekühlt. Es fielen 75 mg Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 245 bis 249 C aus.
Diese Kristalle erhielten die Be zeichnung U-I. Die Kristalle wurden in 5 cm3 Methanol gelöst, in ein Zentrifugen glas filtriert, worauf nach Kühlung 23 mg U-I-Kristalle mit einem Schmp. von 246 bis 248 C ausfielen.
Bei Anwendung der schon erwähnten Papierchromatogramm - Methode nach Zaffaroni, unter Benützung von Di- äth#Tlenglykolmonoäthyläther als stationäre Phase und Methyleyelohexan als bewegliche Phase, erzeugten diese Kristalle eine einzige Spur, welche stärker polar als Progesteron war. Mikroverbrennungen zeigten die Auf nahme zweier Sauerstoffatome in das Proge- steronmolekül an, wie aus folgendem ersicht lich ist:
Analyse
EMI0009.0004
Berechnet <SEP> für <SEP> Progesteron <SEP> C <SEP> 80,23 <SEP> H <SEP> 9,55
<tb> Berechnet <SEP> für <SEP> Dioxyprogesteron <SEP> C <SEP> 72,8 <SEP> H <SEP> 8;7
<tb> Gefunden <SEP> für <SEP> U-1 <SEP> C <SEP> 72,8 <SEP> H <SEP> 8,6 Der Stoff U-I zeigte bei Infrarotanaly se mehr als eine Hydroxylgruppe auf, behielt anderseits die ursprüngliche 3-Keto-, d4- und 20-Keto-Struktur des Progesterons, wie aus der Infrarotanalyse ersichtlich war, bei.
Die Acetylierung des Stoffes U-I, bei welcher 0,3 eins Pyridin und 0,3 cm3 Essig säureanhydrid für 9,0 mg U-I verwendet wurden, das.
Ganze 16 Stunden bei Zimmer temperatur verweilte, 12,5 eins Wasser zuge setzt bekam und nach abermals einer Stunde Verweilzeit bei Zimmertemperatur und zwecks Auskristallisierung abgekühlt wurde, ergab 6,7 mg kristallisierten Diacetats mit einem Schmp. 154-1550 C, welches mit U-II be zeichnet wird. Infrarotuntersuchungen dieses Stoffes zeigten die Abwesenheit der Ilydroxyl- gruppen und die Anwesenheit neuer Acetoxy- gruppen an.
Die Mutterlauge des ersten kristallinen Stoffes U-I, welcher 1,5 g wog, wurde durch Lüftung vom Lösungsmittel befreit, in 50 eins Benzol .gelöst und über A1203 chromatogra- phiert, wie aus Tabelle I zu- ersehen ist. 50 g mit Säure gewaschenen Aluminiumoxyds, ge trocknet bei 450 C, wurden als Adsorbens ver wendet und die Säule wurde mit Teilen von je 100 eins Lösungsmittel entwickelt.
Auf Grund von Untersuchungen mittels Papier ehromatograminen nach Zaffaroni wurde ge funden, dass die Fraktion A nur eine Spur ergab, welche stärker polar als Progesteron, jedoch weniger polar als ein zweiter Stoff, nämlich U-I, war und in den Fraktionen 21 bis 33 auftrat. Die Fraktion A wurde in 2 eins heissem 11Iethanol gelöst und filtriert. Nach Auskühlen über Nacht wurden 171 mg Kristalle eines Stoffes, welcher mit U-III bezeichnet wurde und einen Schmp. von<B>166-1670</B> C besass, erhalten.
Nach einer Umkristallisierung in 3 cms Methanol erhielt man 98;7 mg von U-III mit Schmp. 166-1670 C und einer spezi fischen Drehung des polarisierten Lichtes von [a]D = + 1759 (C = 1,0127 in Chloroform). Mikroverbrennungen liessen auf die Aufnahme eines Sauerstoffatoms in das Progesteron molekül schliessen.
Analyse Berechnet für Monooxyprogesteron
EMI0009.0051
C <SEP> 76,4 <SEP> H <SEP> 9,10
<tb> U-III <SEP> gefunden <SEP> C <SEP> 76,66 <SEP> H <SEP> 8,92 Infrarotuntersuchungen von LT-III zeigten die Anwesenheit einer Hydroxylgruppe am ur sprünglichen Progesteronmolekül.
EMI0009.0056
<I>Tabelle <SEP> Z</I>
<tb> Gewicht <SEP> des
<tb> Fraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> Rückstandes <SEP> Papierchromatogrammuntersuchung
<tb> Nr.
<SEP> in <SEP> mg
<tb> 1 <SEP> Benzol <SEP> 0 <SEP> Keine <SEP> Spur
<tb> 2 <SEP> Benzol <SEP> 1.82,0
<tb> 3 <SEP> Benzol <SEP> + <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Äther <SEP> 123,0
<tb> 4 <SEP> Benzol <SEP> + <SEP> 5 <SEP> <B>%</B> <SEP> Äther <SEP> 246,6 <SEP> Keine <SEP> Spur
<tb> 5 <SEP> Benzol <SEP> + <SEP> 10 <SEP> 'Ihm <SEP> Äther <SEP> 162,9
<tb> 6 <SEP> Benzol <SEP> + <SEP> 10 <SEP> /m <SEP> Äther <SEP> 18,0
EMI0010.0001
Die Hydroxylgruppe in U-III liegt in 11-Stellung, wie durch Oxydation einer Lö sung von 30 mg des Stoffes U-III in 0,5 cm3 Eisessig mit 5 mg Chromoxyd (Cr03)
in 1 cm3 Eisessig und 5 mm3 Wasser, das man. dann eine Stunde bei Zimmertemperatur stehenliess, festgestellt wurde. Einige Trop fen Methanol wurden dann hinzugefügt und nach 10 Minuten wurde das Methanol auf 45 cm3 mit Wasser verdünnt, die Lösung drei- mal mit je 15 cm3 Methylenchlorid extrahiert und schliesslich das Methylenehlorid abge dampft.
Der Rest wurde aus 0,5 emj hIethanol mit einer Ausbeute von 19 mg umkristalli siert und das so erhaltene Triketon U-VI be sitzt einen Sclunp. von 172-175 C und eine spezifische Drehung von [a125 = + 227 in Chloroform. Die Struktur wurde durch Infra- rotuntersuchungen festgestellt, wobei sich, her ausstellte, dass die neuen Ketogruppen sich lediglich in 1-, 7-, 11- und 12-Stellung befin den können. Es ist kein natürliches oder syn thetisches 1-Ketosteroid bekannt.
Die physi kalischen Konstanten des Oxyprogesterons U-II stimmen mit jenen des 12-cu-Oxyproge- sterons nicht überein [Schmp. 200-203 C; [a117 = -1- 205 (C =1,0 in Aceton), Wett stein, Helv. Chim. Acta, 31, 1963 (1945) ], oder mit 12-f-Oxyprogesteron [Schmp.164-167 C, nach Abkühlen Wiederschmelzen bei 195 bis 198 C, [a]17 = -I- 205 (C = 0,502 in Aceton), sseichstein, C.
A. 36, 2261 (1942) ], somit kom men nur noch die 7- und 11-Stellung für die neue Ketogruppe des Stoffes U-VI in Frage.
Ein Vergleich der physikalischen Konstan ten deutet darauf hin, dass das Triketon (Stoff U-VI) ein 11-Keto-progesteron ist. [Schmp. 172-175 C; [a]17 = -I- 238 (C = 0;9 in Aceton), Reichstein, Helv. Chim. Acta, 23, 684 (1940); und ebenda 26, 721 (1942) ].
Ein Vergleich mit reinem 11-Keto-progesteron mittels Infrarotanalyse, Röntgenbeugungs- diagramm Papierchromatographien nach Zaffaroni und Schmelzpunktbestimmungen ergaben, dass der Stoff U-VI mit reinem 11- Keto-progesteron identisch ist.
Die physikalischen Konstanten des Stoffes U-III stimmen mit denjenigen von 11ss-Oxy- progesteron (Schmp. 187-188 C; [a]17 = -h 222-225 (C = 1,75 in Aceton), Shapples und Reich stein, C. A. 36 2261 (1940) ] nicht -überein. Demzufolge muss U-III ein 11a-Oxy-proge- steron sein, da U-VI zeigt, dass sich das ein geführte Sauerstoffatom in der 11-Stellung befindet.
20 mg des Stoffes U-III wurden mit 0,6 cm3 Essigsäureanhydrid in 0,6 ems Pyridin acetyliert. Nach 16stündigem Stehen bei Zimmertemperatur wurden 25 em3 Wasser hinzugefügt. Nach einer Stunde wurde die Mischung zwecks Kristallisation gekühlt. Die entstandenen Kristalle wurden mit Wasser gewaschen und getrocknet; die Ausbeute be trug 16,1 mg des Monoacetates U-V mit einem Sehmp. von 175-177 C.
Die Infrarotanalyse zeigte die Abwesenheit der Hydroxylgruppe und die Anwesenheit einer neuen Acetoxy- gruppe an.
Mikroelementaranalyse Berechnet für Monoacetoxyprogesteron
EMI0011.0067
C <SEP> 74,0 <SEP> H <SEP> 8,85
<tb> Gefunden <SEP> C <SEP> 74,33 <SEP> H <SEP> 8,78 <I>Beispiel 2</I> Oxydation von Progesteron Einer 24 Stunden alten Zucht der Pilz kultur RH-176- in 4 Liter Nährbodenlösung- wurde 1 g Progesteron, gelöst in 50 em3 Aceton hinzugefügt. Nach 24stündigem Aus brüten und Schütteln in Gegenwart-von Luft wurde die Fermentationsflüssigkeit, wie in Beispiel 1 beschrieben, extrahiert.
Die Methy- lenchloridauszüge wurden zweimal mit je 300 cm3 2 1/aiger Natriumbikarbonatlösung und zweimal mit je 500 cms destilliertem Wasser gewaschen, die zusammengelegten Auszüge mit möglichst wenig wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und 6 ems dieser Lösung, welche 2 mg des ursprünglichen Progesteron entsprechen, wurden für Papier- chromatogrammuntersuchungen nach Zaffa- roni, unter Benützung derselben Lösungs mittel wie in Beispiel 1,
verwendet. Die Unter suchungen wiesen auf einen hohen Umwand lungsgrad in 11a Oxy-progesteron hin. Der restliche Methylenchloridatiszug wurde in einem Luftstrom zur Trockene abgedampft. Die festen Rückstände (1,584 g) wurden in 100 cm3 Benzol gelöst, und ein unlöslicher Anteil von 145 mg abfiltriert. Der Schmelz punkt dieses Stoffes betrug 190-230 C.
Durch - Auflösen des unlöslichen Anteils (145 mg) unter Erwärmung in 20 em3 Aceton, Eindampfen der Lösung auf 10 cm3 und Ab kühlung wurden 90 mg des Stoffes U-I, Schmp. 230-240 C, erhalten. Durch ein Pa- pierchromatogramm nach Zaffaroni und die Schmelzpunktbestimmung wurden die gebilde ten Kristalle als eine Dioxyverbindung, der Stoff U-I, identifiziert.
Das Filtrat, welches 1,439 g feste: Körper enthielt, würde über eine A1203 Säule (Tabelle II) in-der in Bei- spiel 1 angegebenen Weise chromatographiert, wobei Teile von je 100 cm3 Lösungsmittel zum Entwickeln der Säule verwendet wurden.
Die Fraktion B der chromatographischen Trennung (Tabelle II), welche 571 mg Ila.- Oxy-progesteron (Stoff U-III) enthielt, wurde in 20 em3 Methanol gelöst, 20 eins Wasser hinzugefügt, erwärmt und im Kühl schrank abgekühlt. Nach Zusatz von weiteren 20 em3 Wasser wurde weiter gekühlt.
Durch die Auskristalli- sation erhielt man 11a-Oxy-progesteron (Stoff U-III) mit Schmp. 165-166 C, welches trok- ken ein Gewicht von 300 mg aufwies.
Eine Zusammenstellung einiger Biooxy- dationsergebnisse ist in Tabelle III (l. Teil und 2. Teil) angegeben.
EMI0012.0023
EMI0013.0001
<I>Tabelle <SEP> 1I</I> <SEP> -(Fortsetzung)
<tb> Gewicht <SEP> des
<tb> hraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> Rückstandes <SEP> Papierchromatokrammuntersuchung
<tb> Nr. <SEP> in <SEP> mg <SEP> 30 <SEP> Aceton <SEP> -h <SEP> 10 <SEP> % <SEP> MeOH <SEP> 0
<tb> 31 <SEP> Aceton <SEP> -h <SEP> 50 <SEP> 1/a <SEP> Me0H <SEP> 1
<tb> 32 <SEP> Aceton <SEP> -f- <SEP> 50 <SEP> 1/o <SEP> MeOH <SEP> 23
<tb> 33 <SEP> Me0H <SEP> 9
EMI0013.0002
<I>Tabelle <SEP> III</I> <SEP> (1. <SEP> Teil)
<tb> Fermentation
<tb> Progesteron <SEP> Vol.
<SEP> der <SEP> Brutdauer
<tb> Versuch <SEP> zugefügt <SEP> Nährbodenlösung <SEP> Stunden
<tb> mg <SEP> Liter
<tb> 26611CM179 <SEP> 1000 <SEP> 4 <SEP> 48
<tb> 266HCM195 <SEP> 1200 <SEP> 4 <SEP> 67
<tb> 266HCM206PA <SEP> 1000 <SEP> 4 <SEP> 24
<tb> 266HCM206PB <SEP> 1000 <SEP> 4 <SEP> 30
<tb> 2661ICM212 <SEP> 3000 <SEP> 10 <SEP> 24
EMI0013.0003
<I>Tabelle <SEP> III</I> <SEP> (2.
<SEP> Teil)
<tb> Fraktionen <SEP> auf <SEP> der <SEP> <B>A1203</B> <SEP> Säule <SEP> enthalten
<tb> lla-Oxy- <SEP> Dioxy- <SEP> Andere
<tb> Versuch <SEP> Progesteron <SEP> progesteron <SEP> progesteron <SEP> Umwandlungs- mg <SEP> [U-IIIl <SEP> [U-I<B>]</B> <SEP> produkte
<tb> mg <SEP> mg
<tb> 266HCM179 <SEP> 0 <SEP> 391 <SEP> 142 <SEP> 18
<tb> 266HCM195 <SEP> 0 <SEP> 507 <SEP> 222 <SEP> 95
<tb> 2661-ICM206PA <SEP> 0 <SEP> 571 <SEP> 225 <SEP> 94
<tb> 266HCM206PB <SEP> 0 <SEP> 471. <SEP> 265 <SEP> 120
<tb> 266HCM212 <SEP> 1520 <SEP> 1260 <SEP> 76 <I>Beispiel 3</I> Oxydation von Progesteron Eine 1-em3-Aufschwemmung von Sporen.
(coinidia) einer 5 Tage alten '10-cm3-Kultur des Pilzes Rhizopus arrhizus in einer Nähr bodenplatte, bestehend aus Malz, Agar und Edamine , in einer sterilen physiologischen Salzlösung wurde zum Impfen von 150 em3 einer sterilen Nährbodenlösung, bestehend aus 21/o Edamine , 5'% Dextrose und 0,5 /o Maisquellwasser in Leitungswasser, verwen det.
Diese, 150 cms einnehmende Pilzkultur, -wurde 24 Stunden lang geschüttelt und einer Lüftung unterworfen, wodurch ein starkes vegetatives Wachstum gefördert wurde. 100 cm3 dieser vegetativen Pilzzucht wurde zu 4 Liter steriler Nährlösung hinzugefügt, dieselbe 24 Stunden geschüttelt und belüftet, dann wurde 4 g Progesteron, gelöst in 40 cm. Methanol, zugefügt und die Belüftung fort gesetzt.
Nach 24 Stünden 45 Minuten wurde die Nährlösung mittels Extraktion mit Me- thylenchlorid, wie in Beispiel 1, abgesondert, wobei insgesamt 4 Liter Methylenchlorid wer- wendet wurden. Die Methylenchlöridlösung wurde aufgearbeitet und konzentriert, wobei 4,38g Rückstände erhalten wurden.
Dieses 'Material wurde nach der in Beispiel 1 be schriebenen Weise chromatographiert und ergab folgende Fraktionen:
EMI0014.0006
Fraktionen <SEP> Zusammensetzung <SEP> Gewicht <SEP> (g)
<tb> Benzol <SEP> unlöslich <SEP> Dioxy-progesteron <SEP> [U-I] <SEP> 0,635
<tb> 14-16 <SEP> Progesteron <SEP> 0,694
<tb> 20-22 <SEP> 11a-Oxy-progesteron <SEP> [U-III <SEP> ] <SEP> 1,994
<tb> 23-25 <SEP> Nachzügler <SEP> (Mono <SEP> -f- <SEP> Dioxy stoffe) <SEP> 0,437 Die das 11a-Oxy-progesteron enthaltende Fraktion wurde in 15 cm3 warmem Methanol gelöst, 2 cm3 Wasser hinzufügt und die Lö sung filtriert.
Nach Abkühlen über Nacht irden 1,15 g eines kristallinen Stoffes mit Schmp. 163-166 C erhalten. Die Ausbeute an kristallinischem 11a-Oxy-progesteron be trug 29,1/a. Ein kleiner zusätzlicher Ertrag wurde auch noch erhalten.
<I>Beispiel 4</I> Oxydation von 11-Desoxy-17-oxy-corticosteron (Stoff S) in der 11-Stellung Eine 16 Stunden alte Pilzkultur RH-176, welcher 1 g des Stoffes S, gelöst in 50 cm3 Jllethanol, zugegeben wurde, wurde 4 Stunden bei Zimmertemperatur unter Luftzutritt be brütet.
Die Fermentationsflüssigkeit, welche einen. pH-'\Vert von 3,8 besass, wurde zuerst mit 2 Liter Methylenchlorid und dann noch dreimal mit<B>je</B> einem Liter Methylenehlorid extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und je zweimal mit 500 cm3 einer 2 a/oigen Na triumbikarbonatlösung gewaschen. Die Aus züge wurden vereinigt und dann zweimal mit je 500 cm3 destilliertem Wasser ge waschen. Die gewaschenen Methvjenchlorid- auszüge wurden mit möglichst wenig wasser freiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Luftstrom verdampft.
Ein kleiner aliquo- ter Teil des Rückstandes wurde Papier- ehromatogrammimtersuehungen unterworfen, wobei sich herausstellte, dass eine neue, lang sam wandernde Spur neben einer andern er schien. Der -gesamte feste Rückstand, der 1,5286g wog, wurde in Benzol gelöst und über A1203 chromatographiert, wie aus Ta belle IV zu ersehen ist.
Eine der langsam wandernden Spuren bildet den Hauptanteil der Fraktion C des Chromatogrammes und diese wurde daher zur Gewinniuig des Stoffes verwendet, der sich von der Ausgangs substanz, der Verbindung S, unterschied. Die Fraktion C, welche 376,5 mg wog, wurde in 2 em3 heissem Methanol gelöst und filtriert. Mittels eines Stickstoffstromes wurde das Volumen auf 1,5 cm3 vermindert, wonach Kri stalle ausfielen.
Diese wogen 152 mg und besassen einen Schmp. von 198-210 C. Nach Umkristalli- sierung in 1 cm3 heissem Methanol erhielt man 35,6 mg Substanz mit Schmp: 223-226 C. Nochmaliges Umkristallisieren der letzten Sub stanz ergab reine Kristalle mit Schmp. 222 bis 225 C. Diese Verbindung enthielt Sauer stoff in der 11-Stellung des Steroidring- systems und war mit 11a,17a,21-Trioxy-4- pregnen-3,20-dion identisch.
Analyse Berechnet für 17-Oxy-corticosteron
EMI0014.0057
C <SEP> 69,5 <SEP> H <SEP> 8,28
<tb> Gefunden <SEP> C <SEP> 69;66 <SEP> 11 <SEP> 8,20
EMI0015.0001
<I>Beispiel 5</I> Oxydation der 11-Stellung von 17a-Oxy- progesteron Eine 24 Stunden alte Pilzkultur RH-176, welcher 1,0 g 17a-Oxy-progesteron, gelöst in 50 cm3 Methanol, zugegeben wurden, wurde 48 Stunden bei Zimmertemperatur unter Luft- zutritt unter Bedingungen, wie sie in Bei spiel 1 angegeben sind, bebrütet. .
Die Fermentationsflüssigkeit (pH = 3,6) wurde zuerst mit zwei Liter Methylenchlorid und dann noch dreimal mit' je 1 Liter dessel ben Lösungsmittels extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und zweimal .mit. 500 cm3 2 obiger Natriumbikarbonatlösung gewaschen. Die- Auszüge- wurden-- vereinigt und zweimal mit je 500 cm3 destilliertem Wasser gewaschen.
Der gewaschene Methylenchloridauszug wurde sodann zeit möglichst wenig wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Methylen- chlorid unter Vakuum abdestilliert. Ein klei ner aliquoter Teil des Rückstandes zeigte bei Papierchromatogrammuntersuchungen das Vorhandensein von drei Spuren an, welche nicht dem 17a-Oxy-progesteron zugeordnet werden konnten.
Der gesamte feste Rück stand, welcher 1,8849g wog, wurde in Benzol gelöst und über A1203 chromatographiert, wie aus Tabelle V zu ersehen ist. Ein die eine Spur ergebender Stoff überwog in Fraktion B, woraus 307 mg feste Substanz aus 1 em3 heissem Methanol auskristallisiert wurden. Nach Abkühlung wurden 61 mg Kristalle mit einem Schmp. von 178-210 C erhalten. Eine Umkristallisierung aus 0,5 em3 Methanol ergab 25 mg Kristalle mit Sehmp. 2.19-222 C.
Nochmaliges Umkristallisieren lieferte reine Kristalle, welche einen Schmp. von 220 bis 223 C besassen. Diese Verbindung enthielt Sauerstoff in der 11-Stellung des Steroidring- systems und wurde als 11a,17a-Dioxy-proge- steron identifiziert.
Analyse; Berechnet für 11a,17a-Dioxy-progesteron
EMI0016.0036
C <SEP> 72,8 <SEP> H <SEP> 8,60
<tb> Gefunden <SEP> C <SEP> 73,01 <SEP> H <SEP> 8,65
EMI0016.0037
EMI0017.0001
<I>Beispiel 6</I> Oxydation von 11-Desoxy-corticosteron Eine 64 Stunden alte Pilzkultur RH-176,. welcher 1,0 g 11-Desoxy-corticosteron in 4 Liter Nährsubstrat zugegeben wurden, wurde 54 Stunden bei Zimmertemperatur unter Bedin gungen, wie in Beispiel 1 angegeben, bebrütet.
Die Fermentationsflüssigkeit samt Myzelium wurde zuerst einmal mit 2 Liter Methylen- chlorid und dann dreimal mit je 1 Liter Methylenchlorid extrahiert. Die Methylen- ehloridauszüge wurden vereinigt, zweimal mit je 500 cms 2'%iger Natriumbikarbonatlösung und schliesslich zweimal mit je 500 ems destil liertem Wasser gewaschen.
Der Methylen- chloridauszug wurde mittels eines Luftstromes zur Trockne verdampft und der feste Rück stand in 50 cm3 Methylenchlorid aufgenom men. Die Lösung wurde in ein 100 ems fassen des Becherglas umgeleert und im Luftstrom verdampft. Die festen Rückstände, welche 1,4218g wogen, wurden in Benzol gelöst und über A120, chromatographiert, wie aus Ta belle VI ersichtlich ist.
Die Fraktion B liess auf die Bildung dreier langsam wandernder Verbindungen schliessen, wobei eine Spur die stärkste war. Ein Teil dieser Fraktion besass eine biologische Wirksamkeit, welche eine un- gefähr 5 %ige Umwandlung in bezug auf Corticosteron anzeigte, gewertet nach der Rattenleberglykogenprobe von Papst und Mit arbeitern, Endocrinology, 41, 55 (1947).
Die restliche Substanz, 200 mg, wurde aus 1. em3 Methanol umkristallisiert und lieferte 26 mg Kristalle mit Sehmp: 180-189 C. Zweimaliges Umkristallisieren dieser Substanz ergab 8 mg Kristalle mit Schmp. 190-192 C. Infrarotuntersuchungen liessen auf die Ein führung einer neuen Hydroxylgruppe in '11-Desoxy-corticosteron durch die Einwirkung der Pilzorganismen RH-176 schliessen. Das Endprodukt wurde als das 11a,21-Dioxy-4- pregnen-3,20-dion erkannt.
EMI0017.0050
EMI0018.0001
<I>Beispiel</I> Oxydation von Progesteron 150 mg Progesteron, gelöst in ungefähr 3 em3 Aceton, wurde zu 150 cm3 Nährboden lösung (wie vorher beschrieben), welche 60 mg Markenprodukt Tween 40 enthielt, gleich zeitig mit dem Impfen des Nährbodens mit RH-176 hinzugegeben. Das beimpfte Nährsub strat wurde, -wie in ...
Beispiel 1 angegeben, unter Schütteln bQlüftet, wobei eine 1-Liter- flasche verwendet wurde. 1NTach 72 Stunden hatte die vollständige Umwandlung des Proge- sterons stattgefunden und eine 30 %ige Um- wandlung in 11a-Oxy-progesteron (Stoff U-III)
wurde durch ein Papierchromatogramin festgestellt, wobei ein Carbitol-Methylcyclo- hexan-Lösungsmittelsystem zum Nachweis der Progesteronausnützung und ein Toluol-Pro- pylenglycol-System zur Feststellung des Um- wandlungsgrades und der erhaltenen Verbin dungstypen verwendet wurden.
<I>Beispiel 8</I> Oxydation von Progesteron Eine 5 Tage alte aerobische Zucht von RH-176 in 150 cm3 Nährbodenlösung wurde nach Zugabe von 150 mg Progesteron, gelöst in..3._cm3 Aceton, unter Belüftungsbedingun- gen, wie sie in Beispiel 7 beschrieben sind, be brütet, wobei die Konzentration 1 mg je cm3 betrug.
Nach 32 Stunden war kein Proge steron mehr nachweisbar, die Umwandlung in die Stoffe U-I und U-III war vollständig, und dabei betrug die Umwandlung in U-III, 11a-Oxy-progesteron ungefähr 501/o, wie durch ein Papierchromatogramm festgestellt werden konnte, wobei ein Carbitol-Methyl- eyclohexan-Lösungsmittelsystem zum Nach- weis der Progesteronausnützung und ein Toluol-Propylenglykolsystem zur Feststellung des Umwandlungsgrades und der erhaltenen Verbindungstypen verwendet wurden.
Beispiel <I>9</I> - Oxydation von Progesteron In ähnlicher Weise wurde eine 41 Stun den alte, 2 Liter umfassende Pilzzucht von RH-176, welcher 1 g Progesteron, gelöst in 40 ems Aceton, zugemischt waren, 30 Stunden lang einer Lüftung unterworfen. Die Lüftung erfolgte in der Weise, dass ein Luftstrom von 0,1. Liter pro Minute unter heftigem Rühren mit einem Rührer (etwa 250 U/min) durch die Nährflüssigkeit hindurchgeleitet wurde.
Es wurde 11a-Oxy-progesteron (Stoff U-III) mit einer Ausbeute von 47'%- durch Extra- hierung der. Fermentationsflüssigkeit und des ,Myzeliums erhalten. Die Ausbeute an der.
Dioxyverbindung (Stoff U-I) betrug unge fähr 26,5'0/a, wobei die Ausbeute nach ehro- matographischer Trennung mittels einer Alu miniumoxydsäule und vor der Umkristallisie- rung bestimmt -wurde. Die erhaltenen Sub stanzen wurden in der in Beispiel 1 angege benen Weise mit guter Ausbeute umkristalli siert.
<I>Beispiel ZO</I> Oxydation von Progesteron Zu 150 em3 einer 24 Stunden @ alten RI-I- 176-Kultur wurden 30 mg Progesteron, gelöst in 3 cm3 Aceton, hinzugegeben und unter den in Beispiel 7 angegebenen Bedingungen 24 Stunden belüftet.
Die Umwandlung von Progesteron in 11a-Oxy-progesteron (Stoff U-III) betrug ungefähr 60%, korrigiert in bezug auf nicht umgewandeltes Progesteron durch ein Papierchromatogrämm, bei einer Gesamtausbeute von ungefähr 37%,
wobei ein Carbitol-Methylcyclohexan-Lösungsmittel- svstem zum Nachweis von Progesteron und ein Toluol-Propylenglykolsystem zur Differenzie rung der Umwandlungsprodukte verwendet wurden.
Beispiel <I>11</I> Oxydation von Progesteron Das obige Beispiel wurde mit 150 ems Nährbodenlösung wiederholt, wobei wieder mit RH-176 geimpft wurde und 300 mg Progesteron, in 3 cm3 Aceton gelöst, hinzu gegeben wurde. Die Konzentration betrug 2 g Progesteron auf 1 Liter Nährboden. Auch nach 72 Stunden konnte mittels Papierehro- matogramm-und Beobachtung des Pilzwachs tums nachgewiesen werden, dass ein hinzu gefügtes Progesteron noch immer umgewan delt werden kann, jedoch waren die Ausbeu ten von U-III und U-I kleiner als üblich.
In ähnlicher Weise wurde Progesteron zum Nährboden a) gleichzeitig - mit dem Impfen des Nährbodens mit RH-176, b) 24 Stunden nach dem Impfen und e) 5 Tage nach dem Impfen des Nährbodens hinzugefügt und jeweils gemäss Beispiel 1 belüftet, ohne dabei eine wesentliche Änderung der Arten der ge bildeten Stoffe feststellen zu können; und zwar waren immer Dibxy-progesteron (U-I) und 11a-Oxy-progesteron (U-III) vorhanden.
<I>Beispiel 12</I> Oxydation von 11-Desoxy-corticosteron Der Arbeitsgang von Beispiel'1 wurde mit einer 24 Stunden alten Kultur von RH-176 wiederholt und einige neue, in 11-Stellung oxydierte Verbindungen 'wurden hergestellt, wie aus einem Papierehromatogramm nach Zäffaroni mit Diäthylenglykolmonoäthyläther- als stationäre Phase und Methylcyelohexan als bewegliche Phase ersichtlich war.
Bei der Identifizierung erwies sieh eine davon als 11-epi-Corticosteron mit einem Schmp. von 159 (korr); [a,] 20 = -f- 149 (in Essigester).
<I>Beispiel 13</I> Oxydation der 11-Stellung von 3-Oxy- pregnan-20-on In der gleichen Weise wie bei der oben angegebenen Oxydation der 11-Stellung des Steroidringsystems von 17a-Oxy-progesteron wird 3-Oxy-pregnan-20-on in der 11-Stellung des Ringsystems durch Einwirkung einer Kultur von RH-176 oxydiert, wobei 3a,11a- . Dioxy-pregnan-20-on erhalten wird. .
<I>Beispiel</I> 14 Oxydation von Steroiden in der 11-Stellung 300 cm.3 der üblichen, aus 2'%. Edamine , 5% Dextrose.--und-Maisquellwasser bestehen- den Nährbodenlösung mit einem pH von 6,5 wurde mit Sporen der Organismen RH-176 geimpft und 24 Stunden unter Lüftung ge schüttelt.
Von diesem Nährboden wurden An teile von je 20 cm3 in sterile, 100 cm3 fassende Kolben gefüllt und .jedem Kolben wurden ungefähr je 6 mg folgender Steroidsubstan- zen, gelöst .in höchstens 0,3 cm3 Aceton, hin zugefügt, wobei eine feine Suspension der Steroide in der Nährbodenflüssigkeit erzeugt wird. Die Kolben wurden mit ihrem Inhalt 24 Stunden geschüttelt und sodann der Inhalt extrahiert, um die Änderungen mittels eines PapierchromatogTammes bestimmen zu kön nen.
In der folgenden Tabelle VII sind die behandelten Steroide, der px-Endwert und die Endstoffe angegeben.
EMI0020.0015
<I>Tabelle <SEP> VII</I>
<tb> Steroide <SEP> P$ <SEP> Endwert' <SEP> Endstoffe
<tb> 1. <SEP> Androstendion <SEP> 3,75 <SEP> lla-Oxy-androstendion
<tb> 2. <SEP> Cholestenon <SEP> 4,12 <SEP> lla-Oxy-cholestenon
<tb> 3. <SEP> Ergosteron <SEP> 3,9 <SEP> lla-Oxy-ergosteron
<tb> 4. <SEP> Pregnenolonacetat <SEP> 3,9 <SEP> 7,11-Dioxy-pregnenolon
<tb> 5.
<SEP> Stigmastadienon <SEP> 3,0 <SEP> Ila-Oxy-stigmastadienon
<tb> Knapp <SEP> vor <SEP> der <SEP> Extraktion Alle diese Verbindungen sind in der 11- Stellung des Steroidringsystems durch die Einwirkung von RH-176 oxydiert. <I>Beispiel 15</I> Oxydation der 11-Stellung in Progesteron Zum Impfen von 150 cms eines üblichen, aus Edamine , Ghikose, Maisquellwasser und Leitungswasser bestehenden Nährbodens wurde 1 cms einer aus 10 em3 bestehenden Koch..
salzlösungsaüfschwemmung von Sporen einer Schrägkultur von RH-176 aus der Sammlung verwendet. Nach 24stündigem Schütteln wur den 5 cm3 davon verwendet, um 150 cms eines sterilen Nährbodens folgender Zusam mensetzung zu impfen: 0,3 g primäres Kaliilm- phosphat (KH2P04), 1,5 g Ammoniiunnitrat (NH4N03), 0,25g Magnesiumsulfatheptahydrat (l-TgS04. 7I320) mit Leitungswasser auf 1 Liter gebracht.
Nach Sterilisierung des Nährbodens bei 120 betrug der pil-Wert des Nährbodens 4,3.
Nach einer 24stündigen Lüftungsdauer, wodurch ein starkes Wachstum hervorgerufen würde, kam eine Lösung von 60 mg Proge steron in 3 cm3 Methanol zur Pilzkultur dazu. Nach weiteren 24 Stunden Lüftung wurde die Fermentationsflüssigkeit mit Methylenchlorid extrahiert. Wie aus papierchromatographi- schen Untersuchungen ersichtlich werde, war der UmwandlungsgTad in lla-Oxy-progesteron. (U-III) und weiter oxydierten Derivaten hoch.
Die extrahierte Substanz (U-III) war kristal lin und schwächer gefärbt als bei komplizier ter zusammengesetzten Nährböden. <I>Beispiel 16</I> Oxydation von Steroiden in der 11-Stellung Die verwendeten Organismen wurden in einer Nährbodenlösung folgender Zusammen setzung gezüchtet: 20 g Edamine , 5 cm?, Maisquellwasser, 50 g Dextrose, mit Leitungs wasser auf 1 Liter aufgefüllt, auf PH 6,5 ein gestellt und dann auf 120 C 20 Minuten lang sterilisiert.
Die Kulturen wurden mittels stark sporen- beladener Schrägkulturen beimpft,- die 10 % getrockneten Malzextrakt und 211-/o. Agar ent hielten. Alle Kolben enthielten durchschnitt lich je 30 em3 des Nährbodens.
Die Kolben würden unter Luftzutritt 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur ge schüttelt. Eine gewisse Menge der Steroide wurde in Form einer 2 1/oigen Acetonlösung (Substanzgewicht je Volumteile - Lösungs mittel) hinzugefügt und der Kolben weitere 24 Stunden bei Zimmertemperatur geschüttelt. Auf 30 cm-' kamen 6 mg Steroide.
Das Fermentationsgemisch, bestehend aus Nährbodenlösung, dem Steroid und den Orga nismen wurde dreimal mit Methylenchlorid extrahiert, und zwar mit Lösungsmittelvolu- men, welche gleich gross wie das Volumen der wässrigen Lösung waren.
Der Aaszug wurde in einem Scheidetrichter von der- wässrigen Lösung getrennt und mit 2% Natriumbikar- bonatlösung und destilliertem Wasser ge waschen. Das Lösungsmittel wurde bis zur Trockene abgedampft und der Rückstand durch Papierchromatographie geprüft.
In der nachfolgenden Tabelle VIII sind die verwendeten Organismen und die Steroid substanz angegeben.
EMI0021.0022
<I>Tabelle <SEP> VIII</I>
<tb> Steroid <SEP> : <SEP> Progesteron
<tb> Organismen <SEP> American <SEP> Type <SEP> Culture
<tb> Collection <SEP> Nr.
<tb> 1. <SEP> Mucor <SEP> rouxi. <SEP> 4857
<tb> 2. <SEP> Mucor <SEP> griseocyanus <SEP> (-I-) <SEP> 1207a
<tb> 3. <SEP> Mucor <SEP> griseocyanus <SEP> (-) <SEP> 1207b
<tb> 4. <SEP> Mucor <SEP> hiemalis <SEP> var. <SEP> albus <SEP> 6800
<tb> 5. <SEP> Mucor <SEP> hiemalis <SEP> 8690
<tb> 6. <SEP> Mucor <SEP> mucedo <SEP> 9836
<tb> 7. <SEP> Mucor <SEP> mucedo <SEP> 9635
<tb> B. <SEP> Mucor <SEP> mucedo <SEP> 7941
<tb> 9. <SEP> Mucor <SEP> nigricans <SEP> 10404
<tb> 10. <SEP> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> 7577
<tb> 1.1.
<SEP> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> (-f-) <SEP> 6227a
<tb> 12. <SEP> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> (-) <SEP> 6227b
<tb> 13. <SEP> Rhizopus <SEP> chnensis <SEP> (-) <SEP> 1227b
<tb> 14. <SEP> Rhizopus <SEP> japonicus <SEP> 8446
<tb> 15. <SEP> R.hizopus <SEP> oryzae <SEP> 10260
<tb> 16. <SEP> Rhizopus <SEP> oxyzae <SEP> 9363
<tb> Steroid <SEP> :
<SEP> 11-Desoxy-17a-oxy-corticosteron
<tb> 17. <SEP> Mucor <SEP> rouxi <SEP> 4857
<tb> 18. <SEP> Mucor <SEP> griseocyanus <SEP> (-i-) <SEP> 1207a
<tb> 19. <SEP> Mizeor <SEP> griseocyanus <SEP> (-) <SEP> 1207b Versuche über die Einwirkung der in der Tabelle VIII angegebenen Organismen auf 11-Desoxy-corticosteron, 17-Oxy-progesteron und 11-Desoxy-17-oxy-corticosteron ergaben ähnliche Resultate, nämlich die Einführung einer Hydroxylgruppe in die 11-Stellung 'des Steroidringsystems.
In ähnlicher Weise wird bei Einwirkung der im folgenden aufgezählten Pilzorganismen auf Progesteron, 11-Desoxy-corticosteron, 11- Desoxy -17 - oxy-corticosteron und 17-Oxy- progesteron dasselbe Ergebnis erhalten:
Mucor_ genevensis, plumbeus, parasiticus, dubius, javanicus, adventitius, microsporus, roucianus, racem.osus; Rhizopus reflexus, shanghaiensis, tritici, schnii, delamar, tonkinensis, kazanensis;
Phycomyces blakeslecanus, theobromatus; Ab- sidia gläuca; Zygorhynchus moelleri,
hererö- gamus und Syncephalis nodosa. <I>Beispiel 17 ' -</I> Oxydation von Progesteron unter Verwendung von Filtraten der Fermentationsflüssigkeit von RH-176 Eine 72 Stunden alte Kultur wurde fil triert und daraus 160 em3 Filtrat der Fermen tationsflüssigkeit mit einem PH-Wert von 4,1 erhalten.
Das Myzelium wurde in einem Waring -Mischer unter Zusatz einer 0,9 /oigen Kochsalzlösung 15 Minuten lang zerkleinert und abzentrifngiert, wobei 100 cm3 Flüssigkeit abgetrennt wurden und welche in zwei gleiche Teile geteilt wurde. Ein Teil wurde bei pH 4,65- belassen, der andere mit halbmolarer Na2HP04 Lösung auf pH 6,76 gestellt.
Der Myzeliumrückstand wurde zu, sammen mit etwas zugegebener Kochsalzlösung in einen eigenen Kolben geschüttet. Zu jedem Kolben wurde Progesteron (30 mg je cms Aceton) in der im folgenden angegebenen.
Weise hinzugegeben
EMI0022.0021
Fraktion <SEP> Progesteron menge
<tb> S <SEP> I <SEP> = <SEP> überstehende <SEP> Flüssigkeit
<tb> pg <SEP> 6,76 <SEP> 30 <SEP> mg
<tb> S <SEP> II <SEP> = <SEP> überstehende <SEP> Flüssigkeit
<tb> pa <SEP> 4,65 <SEP> 30- <SEP> mg
<tb> R <SEP> = <SEP> Myzeliumrückstände <SEP> 60 <SEP> mg
<tb> BF <SEP> - <SEP> unverdünnte <SEP> Fermenta tionsflüssigkeit <SEP> pa. <SEP> 4,1 <SEP> 30 <SEP> mg Die mit Wattebauschen verschlossenen Kol ben wurden 17 -Stunden lang bei Zimmer temperatur geschüttelt und in der in Bei spiel 1 angeführten Weise mit Methylen- chlorid extrahiert.
Papierchromatogramme mit aliquoten, 300 y wiegenden Mengen von Steroiden zeigten, bei Verwendung eines Carbitol -, Methylcyclohexan-Lösungsmittel- sy stems, dass S I eine sehr geringe Umwand- hLug in höher oxydierte Substanzen ergab, S II eine beachtliche und BF eine noch grössere Umwandlung hervorriefen, dass aber die Myzeliumrückstände eine vollständige Um wandhing ergaben.
<I>Beispiel' 18</I> Oxydation von 11-Desoxy-corticosteronacetat In einem 5 Liter fassenden, mit Rührwerk versehenen Glasfermenter wurden 3 Liter Nährboden (Dextrose 50 g, Maisquellwasser, Caseinpepton 20 g, dest. Wasser 1000 cm') mit Sporen des Pilzes Rhizopus nigricans Ehrenberg (bestimmt nach H. Zycha, Krypto- gamenflora der Mark Brandenburg, Band VIa (Pilze, II,
Mucorineae) Leipzig, 1939 und G. Lindau, Die mikroskopischen Pilze , Ber lin, 1922) geimpft. Die Ausgangskulturen für die Impfung waren jeweils 5 Tage alt und wurden auf Malzextrakt mit Maisquellwasser (Schrägagar) vorgezüchtet. Durch den be- impften. .Nährboden wurde bei 24 C unter Rührung sterile Luft mit einer Geschwindig keit von 500 Liter/min. geleitet. Zur Schaum verhütung wurden 6 cm3 Spermöl zugegeben.
Naeh 24stündigem Wachstum wurden 1,5 g Desoxycorticosteronacetat, gelöst in 7,5 cm3 Benzylalkohol zugegeben, und es wurde da nach weitere 24 Stunden bei gleicher Belüf tung gerührt. Zur Gewinnung des Reaktions produktes wird der Inhalt des Fermenters dreimal mit insgesamt 4 Liter Methylen- chlorid ausgeschüttelt. Das Methylenchlorid wird zweimal mit jeweils 500 cm3 2 o/oiger Natriumbicarbonatlösung und danach zwei mal mit je 1 Liter Wasser gewaschen.
Es wird nun einer Destillation unterworfen, wobei ein öliger Rückstand zurückbleibt. Um Wasser reste zu entfernen, wird der Destillations- rückstand nochmals mit Methylenchlorid ver setzt und letzteres wieder abdestilliert.
Zur Bestimmung der Ausbeute der Reak tionsprodukte wurde der Gesamtrückstand ge wogen. Ein abgewogener Teil wurde in einem bekannten Volumen Chloroform aufgelöst. Ein aliquoter Teil wird mit einer Mikrometer- Syringe auf Propylenglykol-getränktes Papier (Schleicher & Schüll Nr. 2043b) aufgetragen und mit Toluol einer absteigenden Papier chromatographie unterworfen. Das unver änderte Desoxy-corticosteronacetat wandert.
auf dem Papier sehr schnell aus (etwa an der Toluolgrenze), während Oxydationsprodukte sehr nahe dem Ausgangsfleck verbleiben. Die Sichtbarmachung und Bestimmung der Sub stanzen in den Flecken erfolgte durch Be handlung des getrockneten Papiers mit alka lischem Triphenyltetrazoliumchlorid (2 ohige Lösung mit gleichem Volumen ln-Natron- lauge) und nachfolgendem Erwärmen bei 45 C Trockenschrank. Danach wird das Pa pier mit Wasser gespült und wieder getrock net.
Die sich mit reduzierenden Substanzen bildenden roten Flecke können nun heraus geschnitten, mit Methylglykol eluiert und kolorimetriert werden. Zum Vergleich wurde eine Eichkurve mit Desoxy-corticosteronacetat in der Weise aufgenommen, dass verschiedene Mengen dieser Substanz auf Papier aufgetra- men und der gleichen Behandlung unterworfen wurden, wie das Papier mit der Analyse.
Die Extinktion von Flecken, die mit Corticosteron erhalten wurden, war etwa die gleiche wie die des Desoxy-corticosteronacetates, deshalb ge nügte es, Desoxy-corticosteronacetat als Eich substanz zu verwenden. Zur Sicherheit wurde jedes Papierchromatogramm dreimal gemacht und der Mittelwert aus den Ergebnissen ge nommen.
Nach dieser Methode vorgenommene Be stimmungen des oxydierten Produktes ergaben eine Ausbeute von 60-70 % des verwendeten Desoxy-corticosteronacetates.
Die Reaktionsprodukte wurden nun präpa- rativ isoliert. Zu diesem Zwecke wurde das erhaltene Öl mit einem Gemisch von Benzol- Petroläther \(1 :1) gelöst und die Lösung an 25 g saurem A1203 chromatographiert. Mit Benzol, Äther und Chloroform als Elutions- mittel wurden in üblicher Weise die einzelnen Fraktionen isoliert.
Die Hauptfraktion befand sich in den. Chloroformlösungen. Das Rohprodukt war bereits kristallisiert und wog rund 0,6 g; daraus liess sich durch Kristallisation aus Essig ester und Äther (1,5:5) das 11-Epi-cortico- steron isolieren. Schmelzpunkt 159 (korr.) ; [alD = -f- i49 (in Essigester).
Die Substanz gab keine Schmelzpunktdepression mit synthe tisch hergestelltem Epi-corticosteron.. Die Ultrarotspektren beider Substanzen wären identisch.
Process for the production of 11-oxy-steroids The invention relates to a process for the production of 11-oxy-steroids by oxidation of steroids which contain a methylene group in the 11-position.
This procedure consists in subjecting these steroids to biochemical oxidation under aerobic conditions using enzymes produced by species of fungi of the order Mucorales. Here, the starting steroids can be subjected to the action of a living strain of such types of fungus or to the action of oxidizing enzymes which can be obtained from these types of fungus.
It is already known to introduce oxygen into the 11-position of a steroid, but this has only been achieved through highly developed organic syntheses with many intermediate stages. As a result, the total yield of steroids oxidized in the 11-position was far too small and the costs of such production were extremely large, if not completely unacceptable.
This represented an insurmountable obstacle to the endeavors of the pharmaceutical chemists to make certain steroids oxidized in the 11-position available to a larger group of people who suffer from certain diseases, since these diseases only occur from certain in the 11-position. The position of oxidized steroids can be favorably influenced, but their high production costs and the inadequate supply of the market prevented a general spread of these remedies.
Among the drugs which consist of steroids oxidized in the 11-position, its corticosterone, 11-dehydro-corticosterone, 11-dehydro-17-oxy-corticosterone (Compound E, cortisone) and 17-oxy-corticosterone (Compound F) mentioned.
It is therefore of the utmost importance to find a more satisfactory method of producing steroids which contain a hydroxyl (oxy) group (-OH) in the 11-position, as is found in many valuable steroids and also easily by known ones Oxidation process is convertible into a keto group. So far, no notable success has been recorded in this regard, despite the greatest expenditure of resources and time.
The invention now also enables the production of such steroids which at least contain a hydroxyl group in the 11-position of the steroid ring system, in good yield. The oxidation of the steroids at least in the 11-position can take place primarily through fungi of the Mucoraceae family, which belongs to the Mucorales order, in particular the Rhizopus genus, or oxidizing enzymes produced by them.
In addition, it enables the method according to the invention to produce compounds which cannot be produced by any other method and are therefore of very great value for the production of medicaments containing steroids oxidized in the 11-position.
It was found that the starting steroids mentioned, which contain the cyclopentano-poly hy drophenanthrene ring system, in particular 10.13 - dimethyl - cyclopentano-polyhydrophenanthrene, can be converted easily and with high yield into the corresponding 11-oxy steroids by the steroid of the action of a fungus of the order Mucorales,
or the oxidizing enzymes formed internally or extracellularly by these fungi. This method offers an effective, economical and commercially satisfactory way of introducing the OH group into the 11-position of a steroid of the type mentioned.
This provides a new and simple way of producing steroid drugs containing a hydroxyl group in the 11-position, which, as already mentioned, is used in chemistry, pharmacy and medicine, in particular for those patients who suffer from physiological changes can only be positively influenced by such remedies is of the greatest importance.
In isolated cases, other positions of the steroid molecule can also experience changes due to the action of the fungi or their enzymes, but such changes are not always to be regarded as undesirable, since the introduction of oxygen into other positions of the steroid molecule is valuable therapeutic substances or Between products can result, for. B. those which have a hydroxyl group in the 17-position.
In the event that the introduction of such additional groups is not desired, they can easily be removed again using known methods. Hydroxyl groups, which are already present in the steroid molecule that is to be oxidized in the 11-position, can, in the event that it is desirable to aim for extraordinarily high yields of steroids oxidized in the 11-position, by conversions, such as , e.g.
B. by means of esterification, etherification, halogenation or the like from the various effects, including the swirling of the oxidizing fungi or their oxidizing enzymes, are protected, it must be possible to convert the groups obtained back into hydroxyl groups. However, such a pretreatment is not a prerequisite for introducing oxygen into the 11-position of steroids by means of the method according to the invention.
The steroids to which the process according to the invention can be applied are not restricted by the type or number of substituents present in their mole. For the production of 11-oxy steroids, the applicability of the steroids is only determined by the presence of a methylene group in the 11-position.
The base body can have substituents or combinations of substituents in the 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16- and 17-positions, in particular 7,0,13-dimethyl groups, 3,7- or 12-keto, hydroxyl or acyloxy groups. There may be side chains in the 17 position, of which the progesterone and corticosterone (ketol) side chains should be mentioned in particular.
A keto group can also be present in the 17-position, or a hydroxyl group or the like can be present there. In addition, double bonds at the 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 16 (17) and other positions (except for the 9 (11) and 11 (12) positions) and combinations of Double bonds occur in the ring system. Double bonds which have been saturated by the addition of halogens or hydrogen halides can also be present.
Addition products of dienophilic compounds such as maleic acid, maleic anhydride or maleic acid esters with steroids which have a conjugated double bond, e.g. B. at 5.7 positions, have, gebil det. The ring system can also contain other substituents or combinations of substituents with double bonds, etc., which are too numerous to be mentioned separately and many of which are already known in steroid chemistry.
Representatives of the steroids that can be oxidized using this process are, for. The following are mentioned, for example: progesterone, 17-oxy-progesterone, pregnenolone, acyloxy-pregnenolone such as pregnenolone acetate, 1,1-deoxy-corticosterone, 11-deoxy-17-oxycorticosterone and acyloxy derivatives thereof, such as acetoxy derivatives, 21-oxy-pregnenolone and 21-acyl, e.g.
B. acyl esters thereof 17,21-dioxy-pregnenolone and its 17,21-diacyl oxyderivate, z. B. the diaeetoxy derivative, androstenedione, androstan-17-ol, 5-androsten-3-ol-17-one and -3-acyl-, e.g.
B. acetyl esters thereof, 5-androsten-3-ol-17-one and 3-acyl, acetyl esters thereof; Ergosterol, stigmasterol, stigmastanol and 3-acy 1-, e.g.
B: 3-acetyl ester thereof; Ergostenone, Stigmastenon, Stigmastanone, Cholestenone, Cholic Acid, Deoxycholic Acid, Lithocholic Acid, Cholanic Acid, Noreholanic Acid, Bisnorcholanic Acid, Cholenic Acid, Nor- eholenic Acid,
Bisnorcholenic acid and the 3-oxy, 3-keto, 3,7-dioxy, 3,7-diketo, 3,7,12-trioxy, 3,7,12-triketo compounds, esters, thiolesters and other derivatives of the aforementioned acids and the like.
Among the numerous families of the Mucorales order, as they are in the work Morphology and Taxonomy of Fungi by Bessy, published by The Blachiston Company in Philadelphia in January 1952 on the 7th
Chapter is described, the genera of the family Mucoraceae can best be used for biochemical oxidation and of these again the Rhizopus and Mucor genera can be best used. Of the species of these genera are z. B.
the following mentioned: the Rhizopus species microsporus, circinans, oligosporus, arrhizus, cohnii, cryzae and nigricans, and synonymous species, which are actually identical to the named species despite different names and the typical Mucor species mucedo, griseocyanus, hiemalis,
hiemalis var. albus, rouxi, adven- titius, christianiensis, circinelloides, dubius, genevensis, javanicus, microsporus, parasiticus and the like.
While species of the genera from the families of the order of the microorganisms, all of which are referred to as Mucorales after the work mentioned, and especially those of the family Muco- raceae are generally effective as oxidizing fungi, species of the can for economic and productivity reasons Genera Rhizopus are preferred and from this genus the species arrhizus, which will later be referred to frequently under the designation RI3-176, can be selected.
-To obtain optimal yields in the production of 1l-oxy-steroids, although in some cases, under special circumstances,. other genera and other species can be used to advantage. Species of the genus mentioned are particularly rich in oxidizing enzymes, which means that, with appropriate breeding, they may be able to oxidize the aforementioned starting steroids in the 11-position on an industrially relevant scale.
Nevertheless species of certain genera, the Rhzopus genus in particular and the Mucor genus, which both belong to the family 1VIucoraceae, would in most cases be preferred for cash production in large numbers of 11-oxy-steroids and while economic reasons even the practical procedures on the May restrict the use of certain species and strains that have particularly physiological properties,
Other families and genera of the order Mucorales can also be used to convert steroids of the type mentioned into the corresponding 11-oxy-steroids to an industrially important extent.
For example, consider other genera of the Mucoraceae family and their related species from the book of I3. Zycha Kryptogamenflora der Mark Brandenburg, Volume VIa, 1-264 (1934), compiled:
Parasitella (P. simplex), Zygorhynchus (Z. heterogamus), Circinella (C. spinosa), Actinomucor (A. repens), Pirella (P. circinans), Absidia (A. reflexa), Spinellus (S.
Sphaeresporus), Phycomyoes (Ph. Blakeslecanus), Sporodinia (Sp. Grandis), Pilaira (P. anomala), Pilobolus (P. crystalliniis), Dicoccum (D. asperum).
Other families of the order Mucorales including their genera and species representing them are: Thamnidieae Thamnidium (Th. Elegans), Dieranophora (D. fulva), Chaetostylum (C. Fresenii), Heliostylum (H. piriforme), Chaetocladium (Ch. Brefeldii); Choanephoreae:
Blakesleea (B. trispora), Choanephora (Ch. Cucurbitarum), Rhopalomyces (Rh. Elegäns), Cunninghamella (C. elegans), Thamnocephalis (Th. QLladritpedata); Cephalideae:
Piptocephalis (P. presenians), Syneephalis (S. reflexa), Spinalis (Sp. Radians), Syncephalastrum (S. racemosLim), Dispira (D. cornuta), Coemansia (C. pectinata), Kickxella (K. alabastrina);
Mortierelleae Mortierella (M. pusilla), Haplosporangium (H. bisporale), Dissophora (D. decumbens);
Endogonaceae Endogone (E. reniformis), Seleroeystis (S. coromiodes), Glaziella (C. vesiculosa). 6 Among the species of the R. hizopus genera which, as mentioned, can be used with preference in the method according to the invention, are, according to H. Zycha, Krypt. der Mark Brandenburg, Volume VIa, 110-120 (1935) many generally known species synonymous.
Thus Rhizopus microsporus is also known by names such as Rh. Ininimus, Mucor speciosus, Rh. Speciosus and Rh. Equinus;
Rhizopus circinans is also known as Rh. Reflextis; Rhizopus oligosporus is also known as Rh. Dela- inar or Rh. Tamari; Rhizopus arrhizus is known as Rh. Nodosus, Rh. Racemoses, Rh.
maydis, Miicor arrhizus, Mucor norvegicus, Rh. pusilltis, Rh. bovigus, Rh. Cambodja, Rh.
chinensis and Rh. tritici; Rhizopus Cohnii is also known as Rh. Suinus; Rhizopus Oryzae is also known as Rh. Japonicus or Rh. Toniknensis; Rzizopus nigricans is also known as Mucor stolonifer, Rh. Niger, Rh.
artocarpi, Mucor niger, Rh. nigricans var. minor or Rh. nigricans var. luxurians; and Rhizopus echinatus is doubted as an independent species and should be synonymous with Rhizoptis nigricans.
The fungal organisms can be obtained from known sources such as the Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, or American Type Culture Collection, Washington, D.C., or Centraalbureau voor Schimmelcultur Baarn, Holland. Otherwise, natural sources known to the microbiologist can also be used.
The isolation of the mushrooms from natural sources can be done according to your microbiologist's known methods. Sterile culture media can be made from various carbohydrates and substances containing nitrogen and solidified to a gel with 20% agar. The nitrogen can be of various origins and can be, for. B. come from organic nitrates, amnionium salts or protein extracts. The culture media can be sterilized by steam pressure or in an autoclave in flasks or test tubes sealed with cotton wool, and then transferred to Petri dishes under sterile conditions.
These can either be inoculated with steroid solutions infected by fungi or exposed to dust or open air. Fungi develop on these plates, among which colonies of Mucorales, especially the Mucoraceae species Mucor and Rhizopus, can easily be recognized by a trained microbiologist. The organisms can be selected from the colonies and transferred either to the same culture medium in test tubes or to any other medium conducive to the growth of the fungi.
Irrespective of the type of nutrient medium, strong ventilation promotes strong growth of the organisms. With the organism culture, which can be obtained from collections or of natural origin, a bacteriological culture medium that promotes the growth of the fungi can now be fed.
For this purpose, the culture medium from Peterson and Murray can be used with good success and in the following, in the lists and examples, unless otherwise mentioned, the culture medium from Peterson and Murray will always be used. Such a medium contains z. B.
For one liter of tap water, which is used to provide traces of elements and inorganic salts, the following additives: - 5 5 ems 112ais spring water, 20 g commercially available. Laetalbumin extract and 50 mg commercially available dextrose. The pH of this medium or other which can be used can usually be adjusted to about 5.5 to 5.9 prior to inoculation of the fungal organisms.
Heating under pressure of about 0.7 kg / cm 2 for 30 minutes can bring about a decrease in the pi-I value from about 6.5 to about 5.5 to 5.9, and this decrease in pH must be taken into account when adjusting the pH value of the nutrient medium must be taken into account before heating, in order to obtain optimal growth conditions after completion of this measure. After 24 hours of fungus growth on the medium, it can be seen that the j) ri-'v # Tert of the medium has dropped sharply, usually to around 3.5 to 4.2.
Preferably, in this growth stage of the fungi, the steroid to be oxidized can be added, or the fungal fermentation liquid, which is used for the fermentative oxidation of the steroids, can be separated from the fungal cultures. The inoculation of the nutrient medium which maintains the fungal growth with selected fungi of the Mucorales order can be carried out in any appropriate manner customary in microbiology. For example, inoculation can be suitably done with spores of the organisms, but inoculation using vegetative mycelium would also be successful.
The growth of mushrooms can Letter maintain an incubation temperature, which is the room temperature; z. B. corresponds to 20 to 25 C, are well promoted, but a rela tively large temperature interval would be possible. For example, temperatures of about 1.5 C to about 45 C have been found to be satisfactory for the cultivation of the fungal organisms.
The length of time required for fungal growth before the steroid to be oxidized is exposed to the fungal action or the action of the fungal enzymes does not appear to be critical. For example, the steroid to be oxidized in the 11-position can be used either at the same time as inoculating the medium with selected Mucorales species or at any time, e.g. B. 24 hours later to be supplied.
In practicing the method, it was found that the steroid to be oxidized can be added to the fungal cultures in the nutrient solution without any adverse effect on the result obtained, even 5 days after inoculating the nutrient medium with selected Mucoralesarten. According to a preferred working method, the starting steroid can be added to the fermentation liquid after the fungus has grown for 16-24 hours, since the enzyme formation appears to be fully developed at this stage of the fungus growth.
Even in the event that the oxidation is to be carried out only by means of the fermentation liquid containing the oxidizing enzyme, at least this growth stage must be reached before the fermentation liquid is separated off as usual and before geous. The manner in which the steroids to be oxidized are added to the oxidizing mushrooms, to the mushroom culture medium or to the fermentation liquid does not seem to be decisive.
The addition can take place in any appropriate manner that creates an intimate contact of the steroids with the fungi and / or the enzymes of the fungi, such as by cultivating the fungal organisms in the presence of finely divided steroid crystals, by dispersing the steroids in the whole culture medium liquid or in otherwise similar. For this purpose, surface-active agents, dispersants or suspension agents, such as commercially available agents, such as.
The brand names Span, Tween, Aerozol, Nacconol, or the like may be used. However, the steroid may preferably be in the form of a water-miscible organic solution, such as a solution in acetone, alcohol, or even an ethereal solution, see Dissolve only a little in water, add the mushrooms, the culture medium or the fermentation liquid and then mix the culture medium solution well with the steroid,
so that a suspension or dispersion of fine steroid particles is formed and a very large contact area of the steroid to be oxidized with the oxidizing fungi or their enzymes is produced. Either submerged or surface culture methods can be used well, but submerged cultures are preferred. In any case, aerobic conditions are required for the oxidation of the steroid.
It is also possible to separate the fermentation liquor from a mushroom culture, add it to the steroid or its solution and subject the mixture to aerobic conditions in order to carry out the oxidation of the steroids.
The temperature which is maintained during the oxidizing action of the fungi on the steroids does not necessarily need to be different from that during the time when the steroids were not yet mixed in. It should only move within limits within which the life or active growth of the fungal organisms is maintained. The incubation temperature during the oxidizing action of the fungi on the steroids can therefore z. B. between about 15 C and about 45 C, with room temperature, z. B. 20 to 25 C, because of the resulting optimal action of the fungal organisms or their enzymes is preferred.
The fungal organisms can preferably be grown under aerobic conditions, the growth rate being dependent on the ventilation rate. Although any type of aerobic culture is satisfactory, strong aeration, such as stirring and / or bubbling air through the nutrient fluid, can usually be used to obtain maximum fungal growth, apparently reducing the time it takes for the 11-oxy-steroids necessary is decreased.
The degree of conversion of the starting steroid into the corresponding 11-oxy-steroid is therefore dependent on either the ventilation strength or the extent of the fungal growth at the time the steroid is added, since it has been established that conversions affect either the fungal cultures or use the fermentation liquid alone, go faster if the ventilation is greater and also if the fungus was able to develop for 16 to 24 hours before the addition of the steroid to be oxidized.
This suggests that the oxidizing enzyme system after 16 to 24 hours of growth. is fully developed and that aeration either increases the conversion or the conversion rate by increasing the growth rate of the fungal organisms with a correspondingly better development of the oxidizing enzyme system, or that the aeration promotes the oxidation only by increasing the oxygen supply.
The preceding theoretical interpretations are only to be understood as explanations, without restricting the subject matter of the invention, since the surface culture method can be used alone without stirring or other types of ventilation and, moreover, the steroid which can be added with the inoculation of fungal organisms without the -ver - impair the applicability of the method.
It is only important that the biochemical oxidation of the steroid takes place under aerobic conditions.
The time it takes for the steroids to bio-oxidize by the oxidizing fungal organisms or their oxidizing enzymes cannot be specified precisely because various circumstances must be taken into account. Approximately 1 to 72 hours was found to be sufficient to convert a steroid of the type mentioned to the corresponding 11-oxy-steroid by the action of oxidizing fungi or their oxidizing enzymes.
However, there are indications that the oxidation of the steroid begins essentially immediately after the addition of the same to the fermentation fluid of a fully developed oxidizing fungus or its oxidizing enzymes, with a mushroom cultivation after 4 to 24 hours of growth being referred to as fully developed, which in to a certain extent also depends on the ventilation strength.
If the steroid is added to the culture medium at the same time as the inoculation with the fungal organisms, a longer fermentation period is indicated for the purpose of a high degree of conversion of the starting steroids, whereby, as mentioned earlier, it is to be assumed that this circumstance is due to the fact that the oxidizing enzyme system of the fungi is only fully developed after a certain period of fungus growth.
Correspondingly, if the steroid is added to the medium at the same time as inoculation, fermentation times of 8 to 72 hours are usually observed, the length of the fermentation time being inversely proportional to the ventilation strength. On the other hand, if the steroid is the fungi, the nutrient media or the enzymes of the fungi in the fermentation liquid after prolonged growth of the fungal organisms, e.g. B.
is added after 16 to 24 hours without significant ventilation or after 2 to 4 hours with strong ventilation, the conversion of the parent steroid into the corresponding 11-oxy-steroid begins immediately, and over the course of 1 to 72 hours or depending on the Ventilation strength, even in shorter or longer times, high yields are achieved. It should be mentioned that if the oxidizing fungi or their enzymes are exposed to the initial steroids for a longer period of time, an increased conversion into multiply oxidized derivatives can take place, but that the steroid in the 11-position is definitely oxidized.
After completion of the oxidizing fermentation reaction, the 1.1.-oxy-steroid formed can be separated from the fermentation reaction mixture in any two-way manner.
A particularly advantageous way of separating off the oxidized steroids can be to extract the mixture of the fermentation reaction, especially the fermentation liquid and the 1Vlycelia in those cases where the steroid would be added directly to the fungal culture, using water-immiscible organic Solvents such as halogenated hydrocarbons, e.g. B. methylene chloride, ethylene chloride or chloroform, ver different types of ether and the like.
The extracts can then, after being washed first with sodium bicarbonate and then with distilled water, be combined and dried together by a stream of air, in vacuo, or in a similar way, in order to then crystallize out the solid residues medium in some fresh organic solvent, z. B. iii methylene chloride or other, previously mentioned solvents to increase. An additional recrystallization can, if desired, solvents from organic Lö, z. B.
Methanol, take place. The crystalline substance can be determined by known methods such as elemental analysis; Identified by melting point, infrared and ultraviolet absorption spectrum, X-ray diffraction diagram, microcombustion and other methods. The crystalline material or extracts of non-crystalline material produced by bio-oxidation can also be identified using the Zaffaroni paper chromatogram method.
A particularly useful method for separating oxidation products prepared by the process according to the invention is the chromatography of the extracts or solid substances using an adsorption column consisting of aluminum oxide (A1203) or other substances, with z. B. benzene is used as the solvent and various solvents or mixtures thereof are used to develop the Chromatogramm.es, as can be seen from the chromatograms of the examples.
The solid substances are obtained by evaporation of the extraction liquid and can still be recrystallized. This method is particularly suitable for identifying the substances formed by the oxidation, since, if desired, each fraction of the column can be tested using the Zaffaroni method.
Using a paper chromatogram according to Zaffaroni, amounts as small as ten to forty y of the substance can be tested, the chemical substances identified and fractions containing the same chemical substances combined and the compound crystallized from the combined fractions.
The method of Zaffaroni, insofar as it is mentioned in the description, is a relatively new, but already well established method for the identification of certain organic substances, namely the compounds related to the adrenal cortex hormones, this analytical method being partly based on polarity of the substances to be tested. The literature references for this working method are as follows:
Burton, Zaffaroni and Keutmann, A New Analytical Method for Adrenal Cortical Hormones, Seience 110, 442 (1949);
and Zaffaroni, Burtön and Keutmann, Seience 111, <B> 6 </B> (1950). Details about this method can be found at these points.
The following examples are only intended to be used as explanations.
<I> Example 1 </I> Oxidation of progesterone To 4 liters of a 32 to 48 hour old cultivation of the mushroom culture RII-1.76, 1 g of progesterone, dissolved in 50% acetone, was added and a suspension in the culture medium liquid was produced . The culture was then incubated at room temperature for 48 hours with aeration. For this purpose, the 4 liter inoculated culture liquid in a 20 liter bottle, which therefore contains 16 liters of air, on a. Shaking machine shaken.
After this time, the pH of the nutrient medium was approximately 3.5 and the fermentation liquid and the mycelium were extracted successively three times with one liter, once with two liters and once with one liter of methylene chloride. The methylene chloride extracts were combined and washed twice with 400 cm3 each of a 2 / ai aqueous sodium bicarbonate solution and three times with 500 cm3 of distilled water each time.
The methylene chloride was distilled off in vacuo, and the dry residue was taken up in 50 units of methylene chloride. The solution was placed in a 100 cm3 beaker and allowed to evaporate using a stream of air. The solid residue, which weighed 1.585 g, was dissolved in 5 cm3 of hot methanol and slowly cooled to room temperature. 75 mg of crystals with a melting point of 245 to 249 ° C. precipitated out.
These crystals were given the designation U-I. The crystals were dissolved in 5 cm3 of methanol, filtered into a centrifuge glass, whereupon 23 mg of U-I crystals with a melting point of 246 to 248 ° C. precipitated.
When using the paper chromatogram method according to Zaffaroni, already mentioned, using diethyltlene glycol monoethyl ether as the stationary phase and methyleyelohexane as the mobile phase, these crystals produced a single trace which was more polar than progesterone. Microburns indicated the inclusion of two oxygen atoms in the progesterone molecule, as can be seen from the following:
analysis
EMI0009.0004
Calculates <SEP> for <SEP> Progesterone <SEP> C <SEP> 80.23 <SEP> H <SEP> 9.55
<tb> Calculates <SEP> for <SEP> dioxyprogesterone <SEP> C <SEP> 72.8 <SEP> H <SEP> 8; 7
<tb> Found <SEP> for <SEP> U-1 <SEP> C <SEP> 72.8 <SEP> H <SEP> 8.6 The substance UI showed more than one hydroxyl group in infrared analysis, but retained that original 3-keto, d4 and 20-keto structure of progesterone as seen from infrared analysis.
The acetylation of the substance U-I, in which 0.3 one pyridine and 0.3 cm3 acetic anhydride were used for 9.0 mg U-I, the.
Whole 16 hours lingered at room temperature, 12.5 units of water was added and after another one hour dwell time at room temperature and was cooled for the purpose of crystallization, gave 6.7 mg of crystallized diacetate with a melting point 154-1550 C, which with U- II is designated. Infrared examinations of this substance indicated the absence of the ilydroxyl groups and the presence of new acetoxy groups.
The mother liquor of the first crystalline substance U-I, which weighed 1.5 g, was freed from the solvent by ventilation, dissolved in 50% benzene and chromatographed on A1203, as can be seen from Table I. 50 g of acid-washed aluminum oxide, dried at 450 ° C., were used as an adsorbent and the column was developed with 100 parts of a solvent.
On the basis of studies using paper Ehromatograminen according to Zaffaroni, it was found that fraction A only gave a trace, which was more polar than progesterone, but less polar than a second substance, namely U-I, and occurred in fractions 21 to 33. Fraction A was dissolved in 2 liters of hot ethanol and filtered. After cooling down overnight, 171 mg of crystals of a substance which was designated U-III and had a melting point of 166-1670 C were obtained.
After recrystallization in 3 cms of methanol, 98.7 mg of U-III with melting point 166-1670 ° C. and a specific rotation of the polarized light of [a] D = + 1759 (C = 1.0127 in chloroform) were obtained. Microburns indicated the absorption of an oxygen atom in the progesterone molecule.
Analysis calculated for monooxyprogesterone
EMI0009.0051
C <SEP> 76.4 <SEP> H <SEP> 9.10
<tb> U-III <SEP> found <SEP> C <SEP> 76.66 <SEP> H <SEP> 8.92 Infrared examinations of LT-III showed the presence of a hydroxyl group on the original progesterone molecule.
EMI0009.0056
<I> Table <SEP> Z </I>
<tb> Weight <SEP> of the
<tb> fraction <SEP> solvent <SEP> residue <SEP> paper chromatogram analysis
<tb> No.
<SEP> in <SEP> mg
<tb> 1 <SEP> Benzene <SEP> 0 <SEP> No <SEP> trace
<tb> 2 <SEP> Benzene <SEP> 1.82.0
<tb> 3 <SEP> benzene <SEP> + <SEP> 5 <SEP>% <SEP> ether <SEP> 123.0
<tb> 4 <SEP> Benzene <SEP> + <SEP> 5 <SEP> <B>% </B> <SEP> Ether <SEP> 246.6 <SEP> No <SEP> trace
<tb> 5 <SEP> Benzene <SEP> + <SEP> 10 <SEP> 'Him <SEP> ether <SEP> 162.9
<tb> 6 <SEP> benzene <SEP> + <SEP> 10 <SEP> / m <SEP> ether <SEP> 18.0
EMI0010.0001
The hydroxyl group in U-III is in the 11-position, as by oxidation of a solution of 30 mg of the substance U-III in 0.5 cm3 glacial acetic acid with 5 mg chromium oxide (Cr03)
in 1 cm3 of glacial acetic acid and 5 mm3 of water that you. then left to stand for one hour at room temperature, was determined. A few drops of methanol were then added and after 10 minutes the methanol was diluted to 45 cm3 with water, the solution was extracted three times with 15 cm3 of methylene chloride each time and finally the methylene chloride was evaporated.
The remainder was recrystallized from 0.5 emj ethanol with a yield of 19 mg and the triketone U-VI obtained in this way had a spillover. of 172-175 C and a specific rotation of [a125 = + 227 in chloroform. The structure was determined by infrared examinations, whereby it turned out that the new keto groups can only be in the 1-, 7-, 11- and 12-positions. There is no known natural or synthetic 1-ketosteroid.
The physical constants of oxyprogesterone U-II do not agree with those of 12-cu-oxyprogesterone [mp. 200-203 C; [a117 = -1-205 (C = 1.0 in acetone), Wettstein, Helv. Chim. Acta, 31, 1963 (1945)], or with 12-f-oxyprogesterone [melting point 164-167 C, after cooling remelting at 195 to 198 C, [a] 17 = -I- 205 (C = 0.502 in acetone) , sseichstein, C.
A. 36, 2261 (1942)], so only the 7- and 11-positions are possible for the new keto group of the substance U-VI.
A comparison of the physical constants indicates that the triketone (substance U-VI) is an 11-keto-progesterone. [Mp 172-175 C; [a] 17 = -I- 238 (C = 0; 9 in acetone), Reichstein, Helv. Chim. Acta, 23, 684 (1940); and ibid. 26, 721 (1942)].
A comparison with pure 11-keto-progesterone by means of infrared analysis, X-ray diffraction diagram, paper chromatography according to Zaffaroni and melting point determinations showed that the substance U-VI is identical to pure 11-keto-progesterone.
The physical constants of the substance U-III agree with those of 11ss-oxy-progesterone (melting point 187-188 C; [a] 17 = -h 222-225 (C = 1.75 in acetone), Shapples and Reichstein, CA 36 2261 (1940)]. Accordingly, U-III must be an 11a-oxy-progesterone, since U-VI shows that the one oxygen atom carried is in the 11-position.
20 mg of the substance U-III were acetylated with 0.6 cm3 acetic anhydride in 0.6 ems pyridine. After standing at room temperature for 16 hours, 25 cubic meters of water were added. After one hour the mixture was cooled to allow crystallization. The resulting crystals were washed with water and dried; the yield be 16.1 mg of the monoacetate U-V with a Sehmp. from 175-177 C.
Infrared analysis indicated the absence of the hydroxyl group and the presence of a new acetoxy group.
Elemental microanalysis Calculated for monoacetoxyprogesterone
EMI0011.0067
C <SEP> 74.0 <SEP> H <SEP> 8.85
<tb> Found <SEP> C <SEP> 74.33 <SEP> H <SEP> 8.78 <I> Example 2 </I> Oxidation of progesterone from a 24-hour-old cultivation of the mushroom culture RH-176- in 4 Liter of nutrient medium solution - 1 g of progesterone dissolved in 50 cubic meters of acetone was added. After incubating for 24 hours and shaking in the presence of air, the fermentation liquid was extracted as described in Example 1.
The methylene chloride extracts were washed twice with 300 cm3 of 2 l / a sodium bicarbonate solution each and twice with 500 cms of distilled water each time, the combined extracts were dried with as little anhydrous sodium sulfate as possible and 6 ems of this solution, which correspond to 2 mg of the original progesterone, were used for Paper chromatogram examinations according to Zaffaroni, using the same solvents as in Example 1,
used. The tests indicated a high degree of conversion into 11a oxy-progesterone. The remaining methylene chloride feed was evaporated to dryness in a stream of air. The solid residues (1.584 g) were dissolved in 100 cm3 of benzene and an insoluble portion of 145 mg was filtered off. The melting point of this substance was 190-230 C.
By dissolving the insoluble fraction (145 mg) with heating in 20 em3 acetone, evaporating the solution to 10 cm3 and cooling down, 90 mg of the substance U-I, melting point 230-240 C, were obtained. The crystals formed were identified as a dioxy compound, the substance U-I, by means of a Zaffaroni paper chromatogram and the determination of the melting point.
The filtrate, which contained 1.439 g of solid: body, was chromatographed over an A1203 column (Table II) in the manner indicated in Example 1, parts of 100 cm3 of solvent each being used to develop the column.
Fraction B of the chromatographic separation (Table II), which contained 571 mg of Ila.-oxy-progesterone (substance U-III), was dissolved in 20 cubic meters of methanol, 20 liters of water were added, heated and cooled in the refrigerator. After adding a further 20 cubic meters of water, cooling was continued.
The crystallization gave 11a-oxy-progesterone (substance U-III) with melting point 165-166 ° C., which had a dry weight of 300 mg.
A compilation of some biooxidation results is given in Table III (1st part and 2nd part).
EMI0012.0023
EMI0013.0001
<I> Table <SEP> 1I </I> <SEP> - (continued)
<tb> Weight <SEP> of the
<tb> hraktion <SEP> solvent <SEP> residue <SEP> paper chromatography examination
<tb> No. <SEP> in <SEP> mg <SEP> 30 <SEP> Acetone <SEP> -h <SEP> 10 <SEP>% <SEP> MeOH <SEP> 0
<tb> 31 <SEP> acetone <SEP> -h <SEP> 50 <SEP> 1 / a <SEP> Me0H <SEP> 1
<tb> 32 <SEP> acetone <SEP> -f- <SEP> 50 <SEP> 1 / o <SEP> MeOH <SEP> 23
<tb> 33 <SEP> Me0H <SEP> 9
EMI0013.0002
<I> Table <SEP> III </I> <SEP> (1st <SEP> part)
<tb> fermentation
<tb> Progesterone <SEP> Vol.
<SEP> the <SEP> incubation period
<tb> Trial <SEP> added <SEP> culture medium solution <SEP> hours
<tb> mg <SEP> liter
<tb> 26611CM179 <SEP> 1000 <SEP> 4 <SEP> 48
<tb> 266HCM195 <SEP> 1200 <SEP> 4 <SEP> 67
<tb> 266HCM206PA <SEP> 1000 <SEP> 4 <SEP> 24
<tb> 266HCM206PB <SEP> 1000 <SEP> 4 <SEP> 30
<tb> 2661ICM212 <SEP> 3000 <SEP> 10 <SEP> 24
EMI0013.0003
<I> Table <SEP> III </I> <SEP> (2.
<SEP> part)
<tb> Fractions <SEP> contained on <SEP> of <SEP> <B> A1203 </B> <SEP> pillar <SEP>
<tb> lla-Oxy- <SEP> Dioxy- <SEP> Others
<tb> Trial <SEP> progesterone <SEP> progesterone <SEP> progesterone <SEP> conversion mg <SEP> [U-IIIl <SEP> [U-I <B>] </B> <SEP> products
<tb> mg <SEP> mg
<tb> 266HCM179 <SEP> 0 <SEP> 391 <SEP> 142 <SEP> 18
<tb> 266HCM195 <SEP> 0 <SEP> 507 <SEP> 222 <SEP> 95
<tb> 2661-ICM206PA <SEP> 0 <SEP> 571 <SEP> 225 <SEP> 94
<tb> 266HCM206PB <SEP> 0 <SEP> 471. <SEP> 265 <SEP> 120
<tb> 266HCM212 <SEP> 1520 <SEP> 1260 <SEP> 76 <I> Example 3 </I> Oxidation of progesterone A 1-em3 suspension of spores.
(coinidia) of a 5-day-old 10 cm3 culture of the fungus Rhizopus arrhizus in a nutrient medium plate, consisting of malt, agar and edamine, in a sterile physiological salt solution was inoculated to inoculate 150 em3 of a sterile nutrient medium solution consisting of 21 / o Edamine, 5% dextrose and 0.5% corn steep water in tap water are used.
This fungal culture, occupying 150 cms, was shaken and ventilated for 24 hours, thereby promoting vigorous vegetative growth. 100 cm3 of this vegetative mushroom cultivation were added to 4 liters of sterile nutrient solution, the same was shaken and aerated for 24 hours, then 4 g of progesterone was dissolved in 40 cm. Methanol, added and aeration continued.
After 24 hours and 45 minutes, the nutrient solution was extracted by means of extraction with methylene chloride, as in Example 1, a total of 4 liters of methylene chloride being used. The methylene chloride solution was worked up and concentrated to give 4.38 g of residues.
This' material was chromatographed in the manner described in Example 1 and gave the following fractions:
EMI0014.0006
Fractions <SEP> Composition <SEP> Weight <SEP> (g)
<tb> Benzene <SEP> insoluble <SEP> Dioxy-progesterone <SEP> [U-I] <SEP> 0.635
<tb> 14-16 <SEP> Progesterone <SEP> 0.694
<tb> 20-22 <SEP> 11a-Oxy-progesterone <SEP> [U-III <SEP>] <SEP> 1.994
<tb> 23-25 <SEP> stragglers <SEP> (Mono <SEP> -f- <SEP> Dioxy materials) <SEP> 0.437 The fraction containing the 11a-oxy-progesterone was dissolved in 15 cm3 of warm methanol, 2 cm3 Add water and filter the solution.
After cooling overnight, 1.15 g of a crystalline material with a melting point of 163-166 ° C. are obtained. The yield of crystalline 11a-oxy-progesterone was 29.1 / a. A small additional yield was also obtained.
<I> Example 4 </I> Oxidation of 11-deoxy-17-oxy-corticosterone (substance S) in the 11-position A 16-hour-old fungal culture RH-176, which contains 1 g of substance S, dissolved in 50 cm3 of ethanol , was added, was incubated for 4 hours at room temperature with access to air.
The fermentation liquid, which one. pH - '\ Vert of 3.8 was extracted first with 2 liters of methylene chloride and then three more times with one liter of methylene chloride each time. The extracts were combined and each washed twice with 500 cm3 of a 2 a / o strength sodium bicarbonate solution. The extracts were combined and then washed twice with 500 cm3 of distilled water each time. The washed methane chloride extracts were dried with as little anhydrous sodium sulfate as possible and then evaporated in a stream of air.
A small aliquot of the residue was subjected to paper chromatogram inspections, and it was found that a new, slowly moving track appeared next to another. The total solid residue, which weighed 1.5286 g, was dissolved in benzene and chromatographed over A1203, as can be seen from Table IV.
One of the slowly moving traces forms the main part of fraction C of the chromatogram and this was therefore used to obtain the substance that differed from the starting substance, compound S. Fraction C, which weighed 376.5 mg, was dissolved in 2 cubic meters of hot methanol and filtered. The volume was reduced to 1.5 cm3 by means of a stream of nitrogen, after which crystals precipitated.
These weighed 152 mg and had a melting point of 198-210 C. After recrystallization in 1 cm3 of hot methanol, 35.6 mg of substance with a melting point of 223-226 C. were obtained. Repeated recrystallization of the last substance gave pure crystals with melting point 222 to 225 C. This compound contained oxygen in the 11-position of the steroid ring system and was identical to 11a, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione.
Analysis calculated for 17-oxy-corticosterone
EMI0014.0057
C <SEP> 69.5 <SEP> H <SEP> 8.28
<tb> Found <SEP> C <SEP> 69; 66 <SEP> 11 <SEP> 8.20
EMI0015.0001
<I> Example 5 </I> Oxidation of the 11-position of 17a-oxy-progesterone A 24-hour old fungal culture RH-176, to which 1.0 g of 17a-oxy-progesterone, dissolved in 50 cm 3 of methanol, was added Incubated for 48 hours at room temperature with access to air under conditions as specified in Example 1. .
The fermentation liquid (pH = 3.6) was extracted first with two liters of methylene chloride and then three times with 1 liter of the same solvent each time. The extracts were combined and twice .mit. 500 cm3 2 of the above sodium bicarbonate solution. The extracts were combined and washed twice with 500 cm3 of distilled water each time.
The washed methylene chloride extract was then dried using as little anhydrous sodium sulfate as possible and the methylene chloride was distilled off under reduced pressure. A small aliquot of the residue showed in paper chromatogram investigations the presence of three traces which could not be assigned to 17a-oxy-progesterone.
All of the solid residue, which weighed 1.8849 g, was dissolved in benzene and chromatographed over A1203, as can be seen from Table V. A substance which resulted in a trace predominated in fraction B, from which 307 mg of solid substance were crystallized from 1 em3 of hot methanol. After cooling, 61 mg of crystals with a melting point of 178-210 ° C. were obtained. Recrystallization from 0.5 em3 methanol gave 25 mg crystals with Sehmp. 2.19-222 C.
Another recrystallization gave pure crystals which had a melting point of 220 to 223.degree. This compound contained oxygen in the 11-position of the steroid ring system and was identified as 11a, 17a-dioxy-progesterone.
Analysis; Calculated for 11a, 17a-dioxy-progesterone
EMI0016.0036
C <SEP> 72.8 <SEP> H <SEP> 8.60
<tb> Found <SEP> C <SEP> 73.01 <SEP> H <SEP> 8.65
EMI0016.0037
EMI0017.0001
<I> Example 6 </I> Oxidation of 11-deoxy-corticosterone A 64-hour old fungal culture RH-176. which 1.0 g of 11-deoxy-corticosterone in 4 liters of nutrient substrate were added, was 54 hours at room temperature under conditions as specified in Example 1, incubated.
The fermentation liquid including the mycelium was extracted first once with 2 liters of methylene chloride and then three times with 1 liter of methylene chloride each time. The methylene chloride extracts were combined, washed twice with 500 cms each of 2% strength sodium bicarbonate solution and finally twice with 500 cms each of distilled water.
The methylene chloride extract was evaporated to dryness using a stream of air and the solid residue was taken up in 50 cm3 of methylene chloride. The solution was poured into a 100 ems volume beaker and evaporated in a stream of air. The solid residues, which weighed 1.4218 g, were dissolved in benzene and chromatographed on A120, as can be seen from Table VI.
Fraction B suggested the formation of three slowly migrating compounds, one trace being the strongest. Part of this fraction had a biological activity which indicated an approximately 5% conversion with respect to corticosterone, as assessed according to the rat liver glycogen test by Pope et al., Endocrinology, 41, 55 (1947).
The remaining substance, 200 mg, was recrystallized from 1. em3 methanol and gave 26 mg crystals with Sehmp: 180-189 C. Twice recrystallization of this substance gave 8 mg crystals with melting point 190-192 C. Infrared investigations indicated the introduction of a close new hydroxyl group in '11 -deoxy-corticosterone by the action of the fungal organisms RH-176. The final product was recognized as the 11a, 21-dioxy-4-pregnen-3,20-dione.
EMI0017.0050
EMI0018.0001
<I> Example </I> Oxidation of progesterone 150 mg of progesterone, dissolved in approximately 3 em3 acetone, was added to 150 cm3 nutrient medium solution (as previously described), which contained 60 mg of the branded product Tween 40, at the same time as the inoculation of the nutrient medium RH-176 added. The inoculated nutrient substrate was, -as in ...
Example 1 given, ventilated with shaking bQ, a 1 liter bottle was used. 1N After 72 hours, the complete conversion of the progesterone had taken place and a 30% conversion to 11a-oxy-progesterone (substance U-III)
was determined by a paper chromatogram, a carbitol-methylcyclohexane solvent system being used to detect the use of progesterone and a toluene-propylene glycol system to determine the degree of conversion and the types of compound obtained.
<I> Example 8 </I> Oxidation of Progesterone A 5-day-old aerobic cultivation of RH-176 in 150 cm3 nutrient medium solution was after addition of 150 mg of progesterone, dissolved in .3._cm3 acetone, under ventilation conditions like them are described in Example 7, be incubated, the concentration being 1 mg per cm3.
After 32 hours progesterone was no longer detectable, the conversion into the substances UI and U-III was complete, and the conversion into U-III, 11a-oxy-progesterone was about 501 / o, as could be determined by a paper chromatogram A carbitol-methyl-cyclohexane solvent system was used to demonstrate the utilization of progesterone and a toluene-propylene glycol system was used to determine the degree of conversion and the types of compounds obtained.
Example <I> 9 </I> - Oxidation of Progesterone In a similar manner, a 41 hour old, 2 liter mushroom cultivation of RH-176, to which 1 g of progesterone dissolved in 40 ems acetone had been admixed, was one for 30 hours Subject to ventilation. The ventilation was carried out in such a way that an air flow of 0.1. Liters per minute with vigorous stirring with a stirrer (about 250 rpm) was passed through the nutrient liquid.
It was 11a-Oxy-progesterone (substance U-III) with a yield of 47% - by extracting the. Fermentation liquid and des, mycelium obtained. The yield of the.
Dioxy compound (substance U-I) was approximately 26.5% / a, the yield being determined after chromatographic separation using an aluminum oxide column and before recrystallization. The substances obtained were recrystallized in the manner indicated in Example 1 with good yield.
<I> Example ZO </I> Oxidation of progesterone 30 mg of progesterone, dissolved in 3 cm3 of acetone, were added to 150 cm3 of a 24-hour RI-I-176 culture and aerated for 24 hours under the conditions given in Example 7 .
The conversion of progesterone to 11a-oxy-progesterone (substance U-III) was about 60%, corrected for unconverted progesterone by a paper chromatogram, with a total yield of about 37%,
a carbitol-methylcyclohexane solvent system was used to detect progesterone and a toluene-propylene glycol system to differentiate the conversion products.
Example <I> 11 </I> Oxidation of progesterone The above example was repeated with 150 ems nutrient medium solution, inoculation again with RH-176 and 300 mg of progesterone, dissolved in 3 cm3 of acetone, being added. The concentration was 2 g of progesterone per 1 liter of medium. Even after 72 hours, it was possible to demonstrate by means of paper chromatography and observation of the fungal growth that an added progesterone can still be converted, but the yields of U-III and U-I were smaller than usual.
In a similar way, progesterone was added to the nutrient medium a) at the same time - with the inoculation of the nutrient medium with RH-176, b) 24 hours after inoculation and e) 5 days after inoculation of the nutrient medium and in each case aerated according to Example 1, without any significant To be able to detect changes in the types of substances formed; dibxy-progesterone (U-I) and 11a-oxy-progesterone (U-III) were always present.
<I> Example 12 </I> Oxidation of 11-deoxy-corticosterone The procedure of Example '1 was repeated with a 24 hour old culture of RH-176 and some new compounds oxidized in the 11-position were prepared, as in FIG a paper chromatogram according to Gäffaroni with diethylene glycol monoethyl ether as the stationary phase and methylcyelohexane as the mobile phase was evident.
Upon identification, one of them was found to be 11-epi-corticosterone with a m.p. of 159 (corr); [a,] 20 = -f- 149 (in ethyl acetate).
<I> Example 13 </I> Oxidation of the 11-position of 3-oxy-pregnan-20-one In the same manner as in the above-mentioned oxidation of the 11-position of the steroid ring system of 17a-oxy-progesterone becomes 3-oxy -pregnan-20-one in the 11-position of the ring system is oxidized by the action of a culture of RH-176, with 3a, 11a-. Dioxy-pregnan-20-one is obtained. .
<I> Example </I> 14 Oxidation of steroids in the 11 position 300 cm. 3 of the usual, from 2%. Edamine, nutrient medium solution consisting of 5% dextrose and corn steep water with a pH of 6.5 was inoculated with spores of the organisms RH-176 and shaken for 24 hours with ventilation.
From this culture medium, portions of 20 cm3 each were filled into sterile, 100 cm3 flasks and approximately 6 mg of the following steroid substances, dissolved in a maximum of 0.3 cm3 of acetone, were added to each flask, a fine suspension of the Steroids are produced in the culture medium. The flasks and their contents were shaken for 24 hours and then the contents were extracted in order to be able to determine the changes using a paper chromatographic strainer.
In the following Table VII the treated steroids, the final px value and the final substances are given.
EMI0020.0015
<I> Table <SEP> VII </I>
<tb> Steroids <SEP> P $ <SEP> End value '<SEP> End substances
<tb> 1. <SEP> Androstenedione <SEP> 3.75 <SEP> lla-Oxy-androstenedione
<tb> 2. <SEP> Cholestenone <SEP> 4.12 <SEP> lla-oxy-cholestenone
<tb> 3. <SEP> ergosterone <SEP> 3,9 <SEP> lla-oxy-ergosterone
<tb> 4. <SEP> pregnenolone acetate <SEP> 3,9 <SEP> 7,11-dioxy-pregnenolone
<tb> 5.
<SEP> Stigmastadienon <SEP> 3.0 <SEP> Ila-Oxy-stigmastadienon
<tb> Shortly <SEP> before <SEP> the <SEP> extraction. All these compounds are oxidized in the 11-position of the steroid ring system by the action of RH-176. <I> Example 15 </I> Oxidation of the 11-position in progesterone For inoculating 150 cms of a conventional culture medium consisting of edamine, ghikose, corn steep water and tap water, 1 cms of a 10 em3 cook.
saline solution flooding of spores from a slant culture of RH-176 from the collection used. After shaking for 24 hours, 5 cm3 of it was used to inoculate 150 cms of a sterile culture medium with the following composition: 0.3 g primary potassium phosphate (KH2P04), 1.5 g ammonium nitrate (NH4N03), 0.25 g magnesium sulfate heptahydrate (l- TgS04.7I320) brought to 1 liter with tap water.
After sterilization of the nutrient medium at 120, the pil value of the nutrient medium was 4.3.
After 24 hours of ventilation, which would induce strong growth, a solution of 60 mg progesterone in 3 cm3 of methanol was added to the fungus culture. After a further 24 hours of ventilation, the fermentation liquor was extracted with methylene chloride. As can be seen from paper chromatographic examinations, the conversion rate to Ila-oxy-progesterone was. (U-III) and further oxidized derivatives high.
The extracted substance (U-III) was crystalline and less colored than in the case of more complicated nutrient media. <I> Example 16 </I> Oxidation of steroids in the 11 position The organisms used were cultured in a nutrient medium solution of the following composition: 20 g Edamine, 5 cm ?, corn steep water, 50 g dextrose, made up to 1 liter with tap water , set to pH 6.5 and then sterilized at 120 C for 20 minutes.
The cultures were inoculated using heavily spore-laden sloping cultures, - the 10% dried malt extract and 211- / o. Contained agar. All flasks each contained an average of 30 cubic meters of the culture medium.
The flasks were shaken for 24 hours at room temperature with admission of air. A certain amount of the steroids was added in the form of a 2% acetone solution (substance weight per part by volume - solvent) and the flask was shaken for a further 24 hours at room temperature. For every 30 cm- 'there were 6 mg of steroids.
The fermentation mixture, consisting of the culture medium solution, the steroid and the organisms, was extracted three times with methylene chloride, specifically with a volume of solvent which was the same as the volume of the aqueous solution.
The extraction was separated from the aqueous solution in a separating funnel and washed with 2% sodium bicarbonate solution and distilled water. The solvent was evaporated to dryness and the residue checked by paper chromatography.
The organisms used and the steroid substance are given in Table VIII below.
EMI0021.0022
<I> Table <SEP> VIII </I>
<tb> Steroid <SEP>: <SEP> Progesterone
<tb> Organisms <SEP> American <SEP> Type <SEP> Culture
<tb> Collection <SEP> No.
<tb> 1. <SEP> Mucor <SEP> rouxi. <SEP> 4857
<tb> 2. <SEP> Mucor <SEP> griseocyanus <SEP> (-I-) <SEP> 1207a
<tb> 3. <SEP> Mucor <SEP> griseocyanus <SEP> (-) <SEP> 1207b
<tb> 4. <SEP> Mucor <SEP> hiemalis <SEP> var. <SEP> albus <SEP> 6800
<tb> 5. <SEP> Mucor <SEP> hiemalis <SEP> 8690
<tb> 6. <SEP> Mucor <SEP> mucedo <SEP> 9836
<tb> 7. <SEP> Mucor <SEP> mucedo <SEP> 9635
<tb> B. <SEP> Mucor <SEP> mucedo <SEP> 7941
<tb> 9. <SEP> Mucor <SEP> nigricans <SEP> 10404
<tb> 10. <SEP> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> 7577
<tb> 1.1.
<SEP> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> (-f-) <SEP> 6227a
<tb> 12. <SEP> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> (-) <SEP> 6227b
<tb> 13. <SEP> Rhizopus <SEP> chnensis <SEP> (-) <SEP> 1227b
<tb> 14. <SEP> Rhizopus <SEP> japonicus <SEP> 8446
<tb> 15. <SEP> R.hizopus <SEP> oryzae <SEP> 10260
<tb> 16. <SEP> Rhizopus <SEP> oxyzae <SEP> 9363
<tb> Steroid <SEP>:
<SEP> 11-deoxy-17a-oxy-corticosterone
<tb> 17. <SEP> Mucor <SEP> rouxi <SEP> 4857
<tb> 18. <SEP> Mucor <SEP> griseocyanus <SEP> (-i-) <SEP> 1207a
<tb> 19. <SEP> Mizeor <SEP> griseocyanus <SEP> (-) <SEP> 1207b Experiments on the action of the organisms listed in Table VIII on 11-deoxy-corticosterone, 17-oxy-progesterone and 11-deoxy -17-oxy-corticosterone gave similar results, namely the introduction of a hydroxyl group in the 11-position of the steroid ring system.
Similarly, when the fungal organisms listed below act on progesterone, 11-deoxy-corticosterone, 11-deoxy-17-oxy-corticosterone and 17-oxy-progesterone, the same result is obtained:
Mucor_ genevensis, plumbeus, parasiticus, dubius, javanicus, adventitius, microsporus, roucianus, racem.osus; Rhizopus reflexus, shanghaiensis, tritici, schnii, delamar, tonkinensis, kazanensis;
Phycomyces blakeslecanus, theobromatus; Absidia gläuca; Zygorhynchus moelleri,
herero- gamus and Syncephalis nodosa. <I> Example 17 '- </I> Oxidation of progesterone using filtrates from the fermentation liquor from RH-176 A 72 hour old culture was filtered and 160 cubic meters of filtrate from the fermentation liquor with a pH of 4.1 were obtained therefrom .
The mycelium was comminuted and centrifuged in a Waring® mixer with the addition of a 0.9% saline solution for 15 minutes, 100 cm3 of liquid being separated off and which was divided into two equal parts. One part was left at pH 4.65, the other was adjusted to pH 6.76 with half-molar Na2HPO4 solution.
The mycelium residue was poured into a separate flask together with a little added saline solution. Progesterone (30 mg per cms of acetone) was added to each flask in the manner indicated below.
Way added
EMI0022.0021
Fraction <SEP> progesterone amount
<tb> S <SEP> I <SEP> = <SEP> protruding <SEP> liquid
<tb> pg <SEP> 6.76 <SEP> 30 <SEP> mg
<tb> S <SEP> II <SEP> = <SEP> protruding <SEP> liquid
<tb> pa <SEP> 4.65 <SEP> 30- <SEP> mg
<tb> R <SEP> = <SEP> Mycelium residues <SEP> 60 <SEP> mg
<tb> BF <SEP> - <SEP> undiluted <SEP> fermentation liquid <SEP> pa. <SEP> 4.1 <SEP> 30 <SEP> mg The flasks closed with cotton balls were kept at room temperature for 17 hours shaken and extracted in the manner mentioned in Example 1 with methylene chloride.
Paper chromatograms with aliquots weighing 300 y of steroids showed, when a carbitol, methylcyclohexane solvent system was used, that SI resulted in a very low conversion to more highly oxidized substances, S II a considerable and BF an even greater conversion but that the mycelium residues resulted in a complete conversion.
<I> Example '18 </I> Oxidation of 11-deoxy-corticosterone acetate In a 5-liter glass fermenter equipped with a stirrer, 3 liters of nutrient medium (dextrose 50 g, corn steep liquor, casein peptone 20 g, dist. Water 1000 cm') were added Spores of the fungus Rhizopus nigricans Ehrenberg (determined according to H. Zycha, cryptogam flora of the Mark Brandenburg, volume VIa (mushrooms, II,
Mucorineae) Leipzig, 1939 and G. Lindau, Die microscopic mushrooms, Berlin, 1922) vaccinated. The starting cultures for the vaccination were each 5 days old and were pre-grown on malt extract with corn steep water (agar slant). By the inoculated. . The nutrient medium was sterile air at 24 C with stirring at a speed of 500 liters / min. directed. To prevent foam, 6 cm3 of sperm oil were added.
After 24 hours of growth, 1.5 g of deoxycorticosterone acetate, dissolved in 7.5 cm3 of benzyl alcohol, were added, and after a further 24 hours the mixture was stirred with the same ventilation. To obtain the reaction product, the contents of the fermenter are extracted three times with a total of 4 liters of methylene chloride. The methylene chloride is washed twice with 500 cm3 of 2% sodium bicarbonate solution each time and then twice with 1 liter of water each time.
It is then subjected to distillation, an oily residue remaining. In order to remove water residues, the distillation residue is mixed again with methylene chloride and the latter is distilled off again.
The total residue was weighed to determine the yield of the reaction products. A weighed portion was dissolved in a known volume of chloroform. An aliquot part is applied to propylene glycol-soaked paper (Schleicher & Schull No. 2043b) with a micrometer syringe and subjected to descending paper chromatography with toluene. The unchanged deoxy-corticosterone acetate migrates.
on the paper very quickly (around the toluene limit), while oxidation products remain very close to the original spot. The visualization and determination of the substances in the stains was carried out by treating the dried paper with alkaline triphenyltetrazolium chloride (2-oh solution with the same volume of sodium hydroxide solution) and subsequent heating at 45 ° C. drying cabinet. The paper is then rinsed with water and dried again.
The red spots that form with reducing substances can now be cut out, eluted with methylglycol and colorimetrated. For comparison, a calibration curve with deoxycorticosterone acetate was recorded in such a way that different amounts of this substance were drawn onto paper and subjected to the same treatment as the paper with the analysis.
The absorbance of stains obtained with corticosterone was about the same as that of deoxy-corticosterone acetate, so it was sufficient to use deoxy-corticosterone acetate as the calibration substance. To be on the safe side, each paper chromatogram was run three times and the mean value was taken from the results.
Determinations of the oxidized product made by this method gave a yield of 60-70% of the deoxy-corticosterone acetate used.
The reaction products were then isolated preparatively. For this purpose, the oil obtained was dissolved with a mixture of benzene and petroleum ether (1: 1) and the solution was chromatographed on 25 g of acidic A1203. The individual fractions were isolated in the usual way with benzene, ether and chloroform as eluents.
The main faction was in the. Chloroform solutions. The crude product had already crystallized and weighed around 0.6 g; the 11-epi-corticosterone could be isolated from this by crystallization from ethyl acetate and ether (1.5: 5). Melting point 159 (corr.); [alD = -f- i49 (in ethyl acetate).
The substance gave no melting point depression with synthetically produced epicorticosterone. The ultrared spectra of both substances would be identical.