Verfahren zur Herstellung von Chondroitin-polyschwefelsäureestern.
Es ist bekannt, dass durch Veresterung von Polysacchariden oder von Polyuron- säuren mit Sehwefelsäure Stoffe gewonnen werden können, welehe die Gerinnung des Blutes in vivo und in vitro hemmen und damit ähnliche Eigenschaften zeigen wie das physio- logisehe Antithrombin Heparin. Diese künst- lichen Produkte erreiehen zum Teil nahezu die gerinnungshemmende Alçtivität des Heparins.
Sie sind jedoeh durehwegs bedeutend giftiger als dieses, wodurch ihre Verwendbarkeit in der Therapie stark beeinträehtigt wird.
Die Herstellung dieser Sehwefelsäureester erfolgte bisher ausschliesslich durch Sulfatierung der (trundkorper mit Chlorsulfonsäure in Pyridin. Andere bekannte Sulfatierungs- methoden ergeben unwirksame Präparate. Die Sulfatierung muss so vorgenommen werden, dal3 ein hoher Schwefelgehalt erreieht wird, ohne dass gleiehzeitig eine wesentliehe Herab- setzung der Kettenlänge, ein Abbau des Polysaceharids oder der Polyuronsäure eintritt, denn es ist bekannt, dass Produkte mit niedri gem Sehweifelgenalt oder niedrigerem Mole- kulargewicht wenig wirksam sind und den Ablauf der Blutgerinnung kaum beeinflussen.
Die Sulfatierung mit Chlorsulfonsäure in Pyridin führt unter geegneten Versuchbse dingungen bei versehiedenen Polysaeehariden und Polyuronsäuren zu Produkten mit guter gerinnungshemmender Wirksamkeit. Solehe sind z. B. die Chondroitinpolyschwefelsäure- ester, welche erstmals von S. Bergström (Hoppe-Seylers Z. physiol. Chem. 238, 163 [1936] durch Sulfatierung von Chondroitinsehwefelsäure (Chondroitin-monoschwefel- säureester) auf diese Weise hergestellt wurden.
Das Verfahren wurde später von P. Karrer, H. König und Ed. Usteri (Helv. chim., Jeta 6. 1309 [1943]) für die Herstellung von Chondroitinpolysehwefelsäureestern weiter ausgearbeitet. Naeh ihren Angaben erhält man dabei Produkte, deren Sehwefelgehalt zwisehen 8, 5 und 11, 5 % variiert. Die Präpa- rate mit tieferem Sehwefelgehalt müssen vor der Aufarbeitung in einem zweiten Arbeitsgang der Naehsulfatierung unterworfen werden.
Bei der Bereitung ungiftiger, injizierbarer Präparate naeh diesem Verfahren muss besondere Mühe und Sorgfalt auf die Abtren- nung des ausserordentlieh toxischen Pyridins verwendet werden, welehes durch den Chon droitin-polyschwefelsäureester teils unter Salzbildung, teils aber infolge seines kolloidalen Charakters auch adsorptiv gebunden wird.
Zur Abtrennung dieser gefährliehen Kom- ponente müssen daher Operationen vorgenom- men werden, welche umständlich sind und ausserdem die Ausbeute an wirksamer Substanz beeinträchtigen. Es sind versehiedene Reinigungsmethoden angewendet worden, vor allem eine viel Zeit beanspruehende Dialyse und die Reinigung über das Bariumsalz und das Bruchsalz.
Es wurde nun gefunden, dass man Poly- schwefelsäureester des Chondroitins von hoher blutgerinnungshemmender Wirksamkeit und niedriger Toxizität herstellen kann, indem man Chondroitinschwefelsäure bei niedriger Temperatur in Formamid mit Chlorsulfonsäure, vorzugsweise mit einem vorher berei teten Gemisch von Chlorsulfonsäure und Formamid behandelt. Ein Teil des Formamids hildet hierbei mit der Chlorsulfonsäure eine Additionsverbindung, welche im Verlaufe der Reaktion wieder aufgespalten wird ; der Rest dient als Lösungsmittel.
Beim Eintragen von Chondroitinschwefelsäure in ein solches Ge- misch von geeigneter Zusammensetzung tritt bei Zimmertemperatur in wenigen Stunden eine weitgehende Veresterung ein, wobei direkt ein Produkt mit einem Schwefelgehalt von über 13 % entsteht, so dass eine Naehsulfatie- rung überflüssig wird. Das für die Sulfatierung verwendete Mischungsverhältnis von Chlorsulfonsäure zu Formamid ist für die Gesehwindigkeit der Reaktion und die Ausbeute an wirksamer Substanz von Bedeutung. Wird bei einer Reaktionstemperatur von 20 bis 25 gearbeitet, so erweisen sich Mischungsverhält- nisse von 18 zu 100 bis 22 zu 100 Volum- teilen als optimal, während z. B.
Mischungen von 15 zu 100 oder 25 zu 100 Volumteilen bereits niedrigere Ausbeuten ergeben. Die Menge des Chlorsulfonsäure-Formamidgemisches wird zweckmässig so gewählt, dass Chondroitin- schwefelsäure bzw.-polysehwefelsäureester darin gelöst sind und ein homogenes Reak- tionsgemisch entsteht.
Die Isolierung des Chondroitinpolyscliwe- felsäureesters kann in einfaeher Weise, z. B. dureh Eingiessen des Reaktionsgemisehes in Alkohol, vorgenommen werden. Dabei iällt der Ester aus und kann druch Filtration abgetrennt und gewaschen werden. Man erreieht damit bereits eine praktiseh vollständige Abtrennung der übrigen Bestandteile des Reaktiongsemisches. Weitere Bemühungen zum Zweeke der Entfernung von adsorptiv gebeundenen Begleitstoffen erübrigen sich, weil diese harmlos und in den in Frage kommenden geringen Mengen für die Toxizität der Reak tionsprodukte bedeutungslos sind.
Es hat sich gezeigt, dass die nach dem neuen Verfahren hergestellten Sehwefelsäureester des Chondroitins bzw. ihre Natriumsalze gleiche gerinnungshemmende Wirksamkeit besitzen wie die besten in der Literatur besehrie- benen, durch Sulfatierung in Pyridin bereiteten Präparate, dass sie jedoch bedeutend weniger giftig sind. Bei intravenöser Ver abreichung beträgt die D.1. 50 (Maus) der naeh dem vorliegenden Verfahren hergestellten Präparate etwa 1, 0 g ; kg. während der ent sprechende Wert bei den bisher bekannten Präparaten bei 0,25 g/kg liegt.
Das neue Verfahren stellt somit nicht llUl' eine wesentliche Vereinfachung gegenüber der bisherigen Arbeitsweise besonders in der Auf- arbeitung dar, sondern liefert darüberhinaus überrasehenderweise auch Verfahrensprodukte von stark verminderter Giftigkeit bei gleicher Wirksamkeit, welche in ihren toxikologischen und gerinnungsphysiologiselien Eigenschaften den in der Therapie verwendeten Heparin- präparaten sehr nahe kommen.
Es ist anzunehmen, dass die vorliegenden Verfahrensprodukte nur solche Chondroitin- polyschwefelsäureester enthalten, die auch in den bei der Sulfatierung von Chondroitin- sehwefelsäure mittels Chlorsulfonsäure nach bisher bekannten Verfahren anfallenden Estergemisehen zugegen sind, und somit die besseren pharmakologischen Eigenschaften auf die verschiedene quantitative Zusammenset- zung und die grössere Reinheit zurüekzufüh- ren sind.
Das nachfolgende Beispiel soll zur näheren Erläuterung der Erfindung dienen.
Beispiel:
100 Volumteile Formamid werden in cinem Kolben mit Rührwerk unter Eiskühlung mit 20 Volumteilen Chlorsulfonsäure versetzt.
Dann gibt man 10 Gewiehtsteile Chondroltin- schwefelsäure in Form des Natriumsalzes zu und hält die Temperatur auf 20 bis 25 C Nach 6 Stunden giesst man das Gemisch in 500 Volumteile Methanol und filtriert den ausgefällten Sehwefelsäureester des Chondroitins ab, der mit Methanol und Äther gewaschen wird. Man erhält etwa 12 Gewiehts- teile Ester von sehneeweisser Farbe und mit einem Schwefelgehalt von 13%. Durch Umsetzung mit Alkalien können daraus in bekannter AVeise Salze bereitet werden, welche sirli in Wasser gut und mit neutraler Reak- tion lösen und geringe Toxizität besitzen.
Process for the production of chondroitin polysulfuric acid esters.
It is known that by esterifying polysaccharides or polyuronic acids with sulfuric acid substances can be obtained which inhibit the coagulation of the blood in vivo and in vitro and thus show properties similar to the physiological antithrombin heparin. Some of these artificial products almost achieve the anticoagulant activity of heparin.
However, they are always significantly more toxic than this, which severely affects their usability in therapy.
The production of these sulfuric acid esters has hitherto been carried out exclusively by sulfating the (round body with chlorosulfonic acid in pyridine. Other known sulfating methods result in ineffective preparations. The sulfation must be carried out in such a way that a high sulfur content is achieved without at the same time a significant reduction in the chain length , a degradation of the polysacharide or the polyuronic acid occurs, because it is known that products with a low visual age or a lower molecular weight are not very effective and hardly affect the blood coagulation process.
The sulfation with chlorosulfonic acid in pyridine leads to products with good anticoagulant activity under suitable test conditions with various polysacid and polyuronic acids. Sole marriage are z. B. the chondroitin polysulphuric acid esters, which were first produced in this way by S. Bergström (Hoppe-Seylers Z. physiol. Chem. 238, 163 [1936]) by sulphating chondroitin sulphuric acid (chondroitin monosulphuric acid ester).
The process was later developed by P. Karrer, H. König and Ed. Usteri (Helv. Chim., Jeta 6. 1309 [1943]) for the production of chondroitin polysulfuric acid esters. According to their information, products are obtained whose sulfur content varies between 8, 5 and 11, 5%. The preparations with a lower sulfur content must be subjected to Naehsulfation in a second step before processing.
When preparing non-toxic, injectable preparations according to this procedure, special effort and care must be taken in separating the extremely toxic pyridine, which is bound by the chondroitin-polysulfuric acid ester partly with salt formation, but partly also adsorptively due to its colloidal character.
In order to separate this dangerous component, operations must therefore be carried out which are cumbersome and also impair the yield of active substance. Various cleaning methods have been used, most notably a time-consuming dialysis and cleaning using the barium salt and the broken salt.
It has now been found that polysulfuric acid esters of chondroitin of high anticoagulant activity and low toxicity can be produced by treating chondroitin sulfuric acid at low temperature in formamide with chlorosulfonic acid, preferably with a previously prepared mixture of chlorosulfonic acid and formamide. Part of the formamide forms an addition compound with the chlorosulfonic acid, which is split up again in the course of the reaction; the rest serves as a solvent.
When chondroitin sulfuric acid is added to such a mixture of suitable composition, extensive esterification occurs within a few hours at room temperature, with a product with a sulfur content of over 13% being formed, so that Naehsulfation is superfluous. The mixing ratio of chlorosulfonic acid to formamide used for the sulfation is important for the speed of the reaction and the yield of active substance. If a reaction temperature of 20 to 25 is used, mixing ratios of 18 to 100 to 22 to 100 parts by volume prove to be optimal. B.
Mixtures of 15 to 100 or 25 to 100 parts by volume already give lower yields. The amount of the chlorosulfonic acid-formamide mixture is expediently chosen so that chondroitin-sulfuric acid or polysulfuric acid ester is dissolved in it and a homogeneous reaction mixture is formed.
The isolation of the chondroitin polyslic acid ester can be carried out in a simple manner, for. B. by pouring the reaction mixture into alcohol. The ester precipitates and can be separated off and washed by filtration. A practically complete separation of the remaining constituents of the reaction mixture is thus achieved. Further efforts for the purpose of removing adsorptively bound accompanying substances are unnecessary because these are harmless and in the small amounts in question for the toxicity of the reaction products are meaningless.
It has been shown that the sulfuric acid esters of chondroitin or their sodium salts produced by the new process have the same anticoagulant effectiveness as the best preparations described in the literature and prepared by sulfation in pyridine, but that they are significantly less toxic. For intravenous administration, the D.1 is. 50 (mouse) of the preparations produced according to the present process about 1.0 g; kg. while the corresponding value for the previously known preparations is 0.25 g / kg.
The new process does not therefore represent a substantial simplification compared to the previous procedure, especially in the work-up, but also surprisingly provides process products of greatly reduced toxicity with the same effectiveness, which in their toxicological and coagulation-physiological properties the heparin used in the therapy - preparations come very close.
It can be assumed that the present process products contain only those chondroitin polysulphuric acid esters which are also present in the ester mixtures obtained during the sulphation of chondroitin sulphuric acid by means of chlorosulphonic acid according to previously known processes, and thus the better pharmacological properties for the various quantitative composition and the greater purity can be attributed to it.
The following example is intended to explain the invention in greater detail.
Example:
100 parts by volume of formamide are mixed with 20 parts by volume of chlorosulfonic acid in a flask equipped with a stirrer while cooling with ice.
Then 10 parts by weight of chondroltin sulfuric acid in the form of the sodium salt are added and the temperature is kept at 20 to 25 C. After 6 hours, the mixture is poured into 500 parts by volume of methanol and the precipitated sulfuric acid ester of chondroitin is filtered off, which is washed with methanol and ether. About 12 parts by weight of ester of tendon-white color and a sulfur content of 13% are obtained. By reacting with alkalis, salts can be prepared therefrom in the known way, which dissolve well in water with a neutral reaction and have low toxicity.