Procédé de préparation de riboflavine par biosynthèse. Il est connu que certains micro-organismes, en particulier l'Lrémothécium Ashbyii, syn thétisent, de la riboflavine en quantités nota bles lorsqu'ils sont cultivés sur des milieux appropriés.
On n'avait obtenu jusqu'à présent aucun résultat sous ce rapport avec le micro organisme Ashbya gossypii; même après un long temps d'incubation, on n'a trouvé que des traces de riboflavine. Ashbya gosspii était donc considérée dans la littérature comme étant impropre à la synthèse de la riboflavine en quantités quelque peu importantes, bien que cet organisme croisse très bien dans une solu tion contenant de la thiamine, de l'inosite et de la biotine, comme facteurs de croissance, du glucose, du nitrate d'ammonium et des oligoéléments; dans ce milieu toutefois, il ne se forme que très peu de riboflavine.
On a trouvé maintenant. que Ashbya gossy- pii peut synthétiser la riboflavine en quantités telles que ce micro-organisme entre en consi dération pour la préparation de riboflavine. Suivant la présente invention, la préparation de riboflavine par biosynthèse est effectuée par culture d'Ashbya gossypii en conditions aérobies, dans un milieu qui contient un hydrate de carbone assimilable et une matière albuminoïde bruite d'origine naturelle ou les produits de dégradation partielle d'une telle matière brute, et séparation de la riboflavine produite.
Pour réaliser le procédé suivant l'inven tion, on peut procéder de la manière suivante: Le milieu est stérilisé et. ensuite ensemencé au moyen d'une culture active d'Ashbya gossypii. Pendant le développement, la culture est aérée ou agitée ou à la fois agitée et aérée. L'aération est effectuée de préférence par l'in sufflation directe d'air stérile dans la culture. Une bonne aération est favorisée par l'agita tion pendant l'insufflation d'air stérile dans la culture. Après une période d'environ 4 à 7 jours, la production de riboflavine atteint son maximum. La fermentation est alors inter rompue, tandis que la riboflavine est récu pérée d'une manière connue.
Les matières albuminoïdes brutes d'origine naturelle contiennent,. outre de l'albumine et les produits de dégradation de celle-ci, encore des facteurs qui favorisent la production de riboflavine par l'Ashbya gossypii. Dans quel ques-unes de ces substances alimentaires, les dits facteurs sont présents sous forme combi née; ils doivent être alors mis en liberté à l'aide d'acides, d'alcalis, d'enzymes ou par combinaison de ces moyens.
Les substances alimentaires peuvent. égale ment contenir des facteurs qui paralysent la production de la riboflavine bien qu'ils n'in fluencent pas la croissance. La présence de telles substances paralysantes en concentration quelque peu notable doit être évitée.
Pour réaliser les conditions optima, il est par conséquent nécessaire de choisir avec soin les différentes substances alimentaires et leur concentration, et d'adapter le milieu de faon à libérer les facteurs favorables à la produc tion de riboflavine et à éliminer ou rendre inactifs les facteurs paralysants. Pour le choix de nouvelles substances alimentaires ou pour l'emploi d'une nouvelle quantité d'iuse subs tance alimentaire déjà employée antérieure ment, il est donc à conseiller de faire quelques essais préalables.
L'albumine brute naturelle et, ses produits de dégradation partielle peuvent être d'ori gine animale ou végétale. Conviennent par exemple comme matières d'origine végétale: la levure, les produits de levure, les sous-pro duits de distillation et, avant tout la matière appelée corn steep liquor (eau de trempage de maïs concentrée), et comme matières d'ori gine animale: la peptone, le bouillon, la ma tière appelée animal stick liquor (extrait de viande concentré), le tankage (farine ani male) et les meat scraps (détritus de viande).
Le rendement en riboflavine est en général plus élevé lorsque ces produits natu rels sont hydrolysés au préalable; cela est vrai principalement pour les matières pre mières animales. A cet effet, outre les acides et les alcalis, les ferments comme la papaïne et la trypsine conviennent aussi, par exemple.
Il est fréquemment à recommander de prendre comme source d'albumine brute natu relle un mélange d'albumines brutes naturelles d'origines diverses, par exemple de la corn steep liquor et de la stick liquor et/ou du tankage .
L'invention est exposée plus en détail dans les exemples ci-dessous.
<I>Exemple I:</I> On met dans des fioles coniques de 500 em3 trois séries de milieux qui diffèrent de com position. Dans toutes ces séries, la teneur en glucose était de 4%. Dans la première série, on a utilisé 0,5 % de corn steep liquor , cal culé sur la matière sèche; la concentration en peptone variait de 0 à 2,0 %; le tout comme on l'a indiqué au tableau A.. Dans la seconde série, la concentration en peptone était de 0,51/o, tandis que la concentration des consti- tuants solides de la corn steep liquor variait de 0 à 2,0 0/0.
Dans la troisième série, on a ajouté des quantités égales de constituants so lides de corn steep liquor et de peptone et 5o cela en quantités qui variaient de 0 à 2,0 % de chaque constituant. Chaque fiole conique contenait 100 cm' de milieu, tandis qu'à l'aide d'hydroxyde de sodium le contenu de chaque fiole conique a été réglé à un<B>pH</B> de 6,5.
Toutes 5s les fioles coniques sont stérilisées par de la vapeur à 1,1 atm. de surpression pendant 30 minutes, après quoi elles sont refroidies et ensemencées au moyen de 1 % en volume d'une culture active d' Ashbya gossypii. Les fioles 6o coniques sont alors secouées mécaniquement pendant. 8 jours à 290 C. Tous les essais sont faits en double.
Les résultats qui sont rassem blés au tableau A sont des moyennes de ces déterminations doubles. 6s
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Les résultats réunis au tableau A font voir que, dans ce cas, l'emploi de peptone seule ou de corn steep liquor seule donnait un mi nime rendement en riboflavine.
Lorsque les deux substances sont employées ensemble, on a obtenu des résultats convenables avec 0,25 à 0,75 de peptone alors que la corn steep liquor avait une concentration de 0,51/o. Si on prenait. 0,25 à 0,75 % de corn steep liquor , le rendement,
était remarquable en cas d'em- ploi de 0,25 % de peptone. De phis grandes quantités de corn steep liquor ou de pep tone diminuaient le rendement en riboflavine dans une forte mesure.
Comme la peptone et la corn steep liquor du commerce sont su jettes à de fortes variations de composition, le rapport et la quantité des constituants qui sont nécessaires pour le rendement optimum en riboflavine devront varier. Ces valeurs doi vent être déterminées pour chaque nouvelle quantité de la matière.
On peut prendre d'autres matières conte nant de l'azote que la peptone, en particulier après qu'elles ont été traitées par des acides, des alcalis ou des enzymes.
Lors de la stérilisation, comme on l'a dé crit ci-dessus, on ne doit pas faire durer le traitement trop longtemps. On a en effet constaté qu'à une température de 1200 C, une durée de stérilisation plus longue que 30 mi nutes a la tendance de réduire le rendement en riboflavine parfois même dans une mesure considérable.
On peut naturellement stériliser le milieu alimentaire d'une autre manière, par exemple au moyen d'un filtre Seitz.
Exemple <I>II:</I> Dans chacune de 12 fioles coniques de 500 cm', on place 41/o de glucose et une quan tité telle de corn steep liquor que la teneur de celle-ci en matière sèche était de 0,5%. Dans une série de fioles coniques, on ajoute du tankage non traité en quantités variant de 0,25 à 0,75%, tandis que, pour les autres séries,
on employait du tankage qui a été au préalable hydrolysé à l'aide d'un acide; les quantités de celui-ci étaient les mêmes que dans la série précédente.
L'hydrolyse par un acide a été réalisée dans un autoclave par conservation de 10 g 5o tankage dans 50 cm' d'acide chlorhydrique 2 n pendant 30 minutes à 1200 C. Tous les milieux sont portés à un pH de 6,5, tandis que, dans chaque fiole conique, il y avait 100 cm' de milieu.
Le contenu des fioles coniques a été 5s stérilisé de la manière indiquée à l'exemple I, refroidi et ensemencé au moyen de 1% en vo- lume d'une culture active d'Ashbya gossypii. Après secouement pendant 8 jours à 290 C, on a déterminé le rendement en riboflavine. Tous 6o les essais sont faits en double.
Les résultats du tableau B donnent les moyennes des détermi nations doubles. Ces résultats font voir la va leur du tankage et également l'élévation de la valeur par le traitement préalable au moyen 6s d'un acide. Une hydrolyse conforme avec de l'hydroxyde de sodium ou de la papaïne donne également une amélioration notable du tan- kage , de même que d'autres substances ali mentaires brutes contenant.de l'azote.<B>70</B>
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Il est, à remarquer ici de façon expresse que les essais qui précèdent possèdent seule ment une valeur comparative. Avec des ingré dients d'une autre origine, on obtient non seulement des rendements absolus différents, mais toute l'image peut changer.
Ainsi, il est parfois possible avec, par exemple, de la coin steep liquor seule à côté du glucose d'arriver à des rendements remarquables. Comme on l'a déjà dit, des essais préalables sont tou jours désirés avant qu'on puisse appliquer en grand des substances alimentaires détermi nées.
Bien que dans l'exemple qui précède on ait pris 4% de glucose, on peut employer des hydrates de carbone à une concentration de 0,5 et plus; il faut à ce sujet. conserver toute fois à l'esprit qu'en cas de petites quantités de glucose, celui-ci sert principalement à la croissance de.l'organisme. D'une manière gé nérale, le rendement en riboflavine croît d'abord avec la concentration de glucose et cela jusqu'à environ 311/o de glucose.
Il n'est en règle générale pas raisonnable de prendre plus de 4 à 5 % de glucose. Les chiffres men- tionnés ci-dessus peuvent subir des modifica tions par changement de l'aération; un rende ment tout à fait intéressant peut même être obtenu pour une concentration de glucose de 1 ou 211/o. On peut donc dire qu'il est indiqué de maintenir la concentration de glucose entre 1 à 2 et 4 à 5%.
En dehors du glucose, on peut employer aussi d'autres sucres assimi lables, comme le saccharose et le maltose.
D'autres substances alimentaires qui favo risent la synthèse de la riboflavine par Ashbya gossypii sont les substances lipoïdes.
Différents sels inorganiques comme le car bonate de calcium et le chlorure de calcium en quantités de 0,1-1% et le phosphate monopotassique à peu près dans les mêmes quantités élèvent également le rendement en riboflavine. Il en est de même avec des oligo éléments tels que le cuivre, le fer, le manga nèse et le zinc. Toutes ces substances peuvent être ajoutées lorsque les substances alimen taires employées ne les contiennent pas ou pas en quantités suffisantes.
L'aération est effectuée avantageusement par de l'air stérile envoyé dans le mélange. Il est à recommander de répartir l'air fine ment, par exemple à l'aide de pierres poreuses, de carborundum ou de tuyaux perforés. Il est préférable également de secouer ou d'agiter pendant l'aération. Le volume d'air peut va- rier de 10 à 100 % de celui du milieu par minute.
On donne la préférence à une quantité d'air d'environ 40 % par minute du volume de la solution alimentaire.
La production de riboflavine peut avoir lieu pour des pH du milieu de culture qui sont compris entre environ 4 et 7 ou 7,5. Pour les bas pH, la production était trop minime; elle commence dans une mesure remarquable lorsqu'on règle le pH initial du milieu à envi ron 5,5 ou plus. On commence avantageuse ment avec un pH d'environ 6,5. Au commence ment, le pH descend jusqu'à environ 4,5 lors qu'on commence avec un pH supérieur à celui-ci; dans la suite, le pH s'élève progressi vement jusqu'à ce qu'une valeur finale entre 6,5 et 8 et même un peu plus soit atteinte.
Ashbya gossypii croît et synthétise la ribo flavine à des températures comprises - glo balement - entre 20 et<B>350</B> C, mais la tem pérature maximum pour la synthèse est. en dessous de celle pour la croissance. On ob tient le rendement le plus élevé en règle gé nérale pour les températures comprises entre 24 et 300 C. On maintient de préférence la température à environ 26-300 C. Pour des températures plus élevées, le rendement en riboflavine diminue; des températures plus basses ont moins d'influence sur le rendement, mais alors les temps qui sont nécessaires pour obtenir les mêmes rendements deviennent plus longs.
Le temps qui est nécessaire pour atteindre une production optima de riboflavine varie avec la température, la quantité et la nature de la matière d'ensemencement, le degré d'aération et la nature et la concentration des substances alimentaires. En règle générale, la quantité la plus grande de riboflavine se forme après 96-144 heures.
La matière d'ensemencement peut être une culture liquide en quantités de 0,5 à 101/o en volume; la préférence est donnée à 0,5 ou 1,0 à 2,0 0/0; par application de plus grandes quantités, le rendement a une tendance à di minuer. La vieillesse de la matière d'ense mencement peut varier de un à plusieurs jours. Cette vieillesse n'a pas beaucoup d'influence sur le temps qui est nécessaire pour faire commen- cer la synthèse de la riboflavine, mais bien sur l'allure de celle-ci. Des cultures plus vieilles sont moins actives et agissent également pen dant un temps plus court que les cultures jeunes. L'expérience a montré que le mieux est d'employer une culture vieille d'au plus trois jours et de préférence vieille d'un jour.
Les chiffres mentionnés dans les exemples font voir l'influence de quelques facteurs sur la production de riboflavine par Ashbya gossypii. Les rendements mentionnés ne sont toutefois pas susceptibles d'être atteints de faon optima. En tenant compte des modifi cations indiquées dans la description pour l'aération, la vieillesse de la matière d'ense mencement, etc., on a obtenu par exemple les rendements suivants en riboflavine; le temps était de 7 jours.
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Process for the preparation of riboflavin by biosynthesis. It is known that certain microorganisms, in particular Remothecium Ashbyii, synthesize riboflavin in significant amounts when cultured on appropriate media.
No results have so far been obtained in this connection with the microorganism Ashbya gossypii; even after a long incubation time, only traces of riboflavin were found. Ashbya gosspii was therefore considered in the literature to be unsuitable for the synthesis of riboflavin in somewhat large quantities, although this organism grows very well in a solution containing thiamine, inosite and biotin, as factors. growth, glucose, ammonium nitrate and trace elements; in this medium, however, very little riboflavin is formed.
We have found it now. that Ashbya gossypi can synthesize riboflavin in such quantities that this microorganism is considered for the preparation of riboflavin. According to the present invention, the preparation of riboflavin by biosynthesis is carried out by culturing Ashbya gossypii under aerobic conditions, in a medium which contains an assimilable carbohydrate and a noisy albuminoid material of natural origin or the products of partial degradation of such crude material, and separation of the riboflavin produced.
To carry out the process according to the invention, one can proceed as follows: The medium is sterilized and. then inoculated with an active culture of Ashbya gossypii. During development, the culture is aerated or agitated or both agitated and aerated. Aeration is preferably effected by direct sufflation of sterile air into the culture. Good aeration is promoted by agitation during the insufflation of sterile air into the culture. After a period of about 4 to 7 days, riboflavin production peaks. The fermentation is then interrupted, while the riboflavin is recovered in a known manner.
Crude albuminoid materials of natural origin contain ,. besides albumin and its degradation products, there are also factors which promote the production of riboflavin by Ashbya gossypii. In some of these food substances, the said factors are present in combined form; they must then be set free with the aid of acids, alkalis, enzymes or by a combination of these means.
Food substances can. also contain factors which paralyze the production of riboflavin although they do not influence growth. The presence of such paralyzing substances in somewhat significant concentration should be avoided.
To achieve optimum conditions, it is therefore necessary to carefully choose the various food substances and their concentration, and to adapt the medium in such a way as to release the factors favorable to the production of riboflavin and to eliminate or render inactive the factors. paralyzing. For the choice of new food substances or for the use of a new quantity of food substance already used previously, it is therefore advisable to carry out some preliminary tests.
The natural crude albumin and its partial degradation products can be of animal or vegetable origin. Suitable materials of vegetable origin, for example: yeast, yeast products, distillation by-products and, above all, the material called corn steep liquor (concentrated corn steep liquor), and as original materials. animal genetics: peptone, broth, the material called animal stick liquor (concentrated meat extract), tankage (animal meal) and meat scraps (meat detritus).
The riboflavin yield is generally higher when these natural products are hydrolyzed beforehand; this is mainly true for animal raw materials. For this purpose, besides acids and alkalis, ferments such as papain and trypsin are also suitable, for example.
It is frequently recommended to take as a source of natural crude albumin a mixture of natural crude albumins of various origins, for example corn steep liquor and stick liquor and / or tankage.
The invention is explained in more detail in the examples below.
<I> Example I: </I> Three sets of media which differ in composition are placed in conical flasks of 500 em3. In all these series, the glucose content was 4%. In the first series, 0.5% corn steep liquor was used, calculated on the dry matter; the peptone concentration varied from 0 to 2.0%; all as indicated in Table A .. In the second series, the peptone concentration was 0.51 / o, while the concentration of the solid constituents of the corn steep liquor varied from 0 to 2, 0 0/0.
In the third series, equal amounts of solid corn steep liquor and peptone components were added and in amounts which varied from 0 to 2.0% of each component. Each conical flask contained 100 cm 3 of medium, while using sodium hydroxide the contents of each conical flask were adjusted to a <B> pH </B> of 6.5.
All of the conical flasks are sterilized with steam at 1.1 atm. of overpressure for 30 minutes, after which they are cooled and inoculated with 1 volume% of an active culture of Ashbya gossypii. The 6o conical vials are then shaken mechanically during. 8 days at 290 C. All tests are done in duplicate.
The results which are collated in Table A are averages of these duplicate determinations. 6s
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The results gathered in Table A show that, in this case, the use of peptone alone or of corn steep liquor alone gave a minimal yield of riboflavin.
When the two substances are used together, suitable results have been obtained with 0.25 to 0.75 peptone while the corn steep liquor had a concentration of 0.51%. If we took. 0.25 to 0.75% corn steep liquor, the yield,
was remarkable when 0.25% peptone was used. Very large amounts of corn steep liquor or pep tone decreased the yield of riboflavin to a great extent.
As commercial peptone and corn steep liquor are subject to wide variations in composition, the ratio and amount of constituents which are required for optimum riboflavin yield will have to vary. These values must be determined for each new quantity of the material.
Other nitrogen containing materials than peptone can be taken, especially after they have been treated with acids, alkalis or enzymes.
During sterilization, as described above, the treatment should not be prolonged too long. It has in fact been observed that at a temperature of 1200 ° C., a sterilization period longer than 30 minutes tends to reduce the yield of riboflavin sometimes even to a considerable extent.
The food medium can of course be sterilized in another way, for example by means of a Seitz filter.
Example <I> II: </I> In each of 12 conical flasks of 500 cm ', 41% of glucose and an amount of corn steep liquor are placed in each case that the dry matter content thereof was 0 , 5%. In a series of conical flasks, untreated tankage is added in quantities varying from 0.25 to 0.75%, while, for the other series,
tankage was used which had previously been hydrolyzed using an acid; the quantities of it were the same as in the previous series.
The hydrolysis with an acid was carried out in an autoclave by storing 10 g 5o tankage in 50 cm 3 of 2 n hydrochloric acid for 30 minutes at 1200 C. All the media are brought to a pH of 6.5, while that in each conical flask there was 100 cm 'of medium.
The contents of the conical flasks were sterilized as in Example I, cooled and seeded with 1% by volume of active culture of Ashbya gossypii. After shaking for 8 days at 290 C, the yield of riboflavin was determined. All 6o tests are done in duplicate.
The results in Table B give the means of the double determinations. These results show the value of tankage and also the increase in value by the prior treatment with 6s of an acid. Compliant hydrolysis with sodium hydroxide or papain also gives a noticeable improvement in tanning, as do other crude feedstuffs containing nitrogen. <B> 70 </B>
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It should be expressly noted here that the preceding tests have only a comparative value. With ingredients from another source not only different absolute yields are obtained, but the whole picture can change.
Thus, it is sometimes possible with, for example, wedge steep liquor alone alongside glucose to achieve remarkable yields. As has already been said, preliminary tests are always desired before one can apply specific food substances on a large scale.
Although in the above example 4% glucose was taken, carbohydrates at a concentration of 0.5 and above can be used; it takes about it. keep in mind, however, that in case of small amounts of glucose, it is mainly used for the growth of the body. In general, the yield of riboflavin first increases with the concentration of glucose and this up to about 311% of glucose.
It is generally not reasonable to take more than 4 to 5% glucose. The figures mentioned above may be modified by changing the ventilation; a quite interesting yield can even be obtained for a glucose concentration of 1 or 211 / o. We can therefore say that it is indicated to maintain the concentration of glucose between 1 to 2 and 4 to 5%.
Apart from glucose, other assimilable sugars can also be used, such as sucrose and maltose.
Other food substances which promote the synthesis of riboflavin by Ashbya gossypii are lipoid substances.
Different inorganic salts like calcium car bonate and calcium chloride in amounts of 0.1-1% and monopotassium phosphate in roughly the same amounts also increase the yield of riboflavin. It is the same with trace elements such as copper, iron, manganese and zinc. All these substances can be added when the food substances used do not or do not contain them in sufficient quantities.
The aeration is advantageously carried out with sterile air sent into the mixture. It is recommended to distribute the air finely, for example with porous stones, carborundum or perforated pipes. It is also best to shake or agitate during aeration. The air volume can vary from 10 to 100% of that of the medium per minute.
Preference is given to an amount of air of about 40% per minute of the volume of the food solution.
The production of riboflavin can take place at pH values of the culture medium which are between about 4 and 7 or 7.5. For low pH, the production was too low; it begins to a remarkable extent when the initial pH of the medium is adjusted to about 5.5 or more. It is advantageous to start with a pH of about 6.5. Initially, the pH drops to about 4.5 when starting with a pH greater than this; thereafter, the pH gradually rises until a final value between 6.5 and 8 and even a little higher is reached.
Ashbya gossypii grows and synthesizes riboflavin at temperatures ranging - overall - between 20 and <B> 350 </B> C, but the maximum temperature for synthesis is. below that for growth. The highest yield is generally obtained for temperatures between 24 and 300 C. The temperature is preferably maintained at about 26-300 C. For higher temperatures, the yield of riboflavin decreases; lower temperatures have less influence on the yield, but then the times which are required to achieve the same yields become longer.
The time which is required to achieve optimum riboflavin production will vary with temperature, the amount and nature of the seed material, the degree of aeration and the nature and concentration of the feed material. Typically, the greatest amount of riboflavin is formed after 96-144 hours.
The seed material can be a liquid culture in amounts of 0.5-101% by volume; preference is given to 0.5 or 1.0 to 2.0%; on application of larger amounts the yield tends to decrease. The age of the seed material can vary from one to several days. This old age does not have much influence on the time which is necessary for the synthesis of riboflavin to begin, but on the rate of this one. Older crops are less active and also act for a shorter time than younger crops. Experience has shown that it is best to use a culture not more than three days old and preferably one day old.
The figures given in the examples show the influence of some factors on the production of riboflavin by Ashbya gossypii. The stated yields are not, however, likely to be optimally achieved. Taking into account the modifications given in the description for aeration, aging of the seed material, etc., the following yields of riboflavin, for example, were obtained; the time was 7 days.
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