CA2911712C - Polymerisation activee par pyrophosphorolyse (pap) - Google Patents

Abstract

Linvention concerne un nouveau procédé de polymérisation activée par pyrophosphorolyse (PAP). Dans la PAP, la pyrophosphorolyse et la polymérisation par lADN polymérase sont couplées en série pour chaque amplification au moyen dun oligonucléotide P* activable possédant un 3-désoxynucléotide non extensible à son extrémité 3. La PAP peut être appliquée pour une amplification exponentielle ou linéaire, ainsi que pour lamplification dun allèle rare dans un mélange avec un ou plusieurs types dallèle sauvage au moyen dun oligonucléotide P* activable, lequel, à son extrémité 3, correspond exactement à lallèle rare, mais présente un mésappariement au niveau de son extrémité 3, ou près de celle-ci, pour lallèle de type sauvage. La PAP est inhibée par un mésappariement de la séquence spécifique 3 située jusquà 16 nucléotides de lextrémité 3. La PAP peut augmenter considérablement la spécificité de détection dun allèle mutant extrêmement rare en présence de lallèle de type sauvage. La spécificité résulte aussi bien de la pyrophosphorolyse que de la polymérisation, puisquune amplification non spécifique importante requiert la combinaison de pyrophosphorolyse non appariée et dune mauvaise incorporation par lADN polymérase, ce qui est extrêmement rare. Lutilisation dADN polymérases génétiquement modifiées améliore considérablement lefficacité de la PAP.