CA2817105A1

CA2817105A1 - Product and method for the removal of biofilms

Info

Publication number: CA2817105A1
Application number: CA2817105A
Authority: CA
Inventors: Gauthier Boels; Gordon Blackman; Sebastien Fastrez
Original assignee: Sa Realco
Current assignee: Sa Realco
Priority date: 2010-10-15
Filing date: 2010-10-15
Publication date: 2012-04-19
Also published as: EP2627752A1; WO2012048757A1

Abstract

Composition pour l'élimination des biofilms présents sur un substrat caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un composant détergent comprenant au moins un agent séquestrant et un agent simultanément mouillant et dispersant,et au moins un composant enzymatique contenant au moins une protéase, au moins une laccase et au moins une polysaccharidase, son procédé d'élimination des biofilms et son utilisation.Composition for the elimination of biofilms present on a substrate characterized in that it comprises at least one detergent component comprising at least one sequestering agent and one simultaneously wetting and dispersing agent, and at least one enzymatic component containing at least one protease, at least minus one laccase and at least one polysaccharidase, its method of removing biofilms and its use.

Description

"PRODUIT ET PROCEDE D'ELIMINATION DES BIOFILMS"
L'invention se rapporte au domaine de l'élimination des biofilms. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à une composition et un procédé pour éliminer des biofilms.
L'hygiène prend une importance croissante dans l'industrie alimentaire, dans les hôpitaux, et en particulier dans la sphère chirurgicale, dans les installations de potabilisation et de désalinisation d'eau, dans le traitement des eaux de procédé, et en particulier dans les eaux utilisées dans les tours de refroidissement et dans les nécessités de la vie courante, par exemple les lentilles de contact. On observe fréquemment que, lors de la circulation d'eau sur un support, des microorganismes circulant librement dans l'eau peuvent adhérer à la surface. Ces microorganismes peuvent alors développer une matrice extracellulaire adhésive composée de substances polymères. Une communauté de microorganismes adhérés à une surface et englobée dans une telle matrice est appelée un biofilm. Généralement ces biofilms sont composés de bactéries.
On observe malheureusement que cette matrice est très résistante, et peut constituer une barrière pour des agents qui agiraient contre les microorganismes. Les traitements classiques à base de soude et/ou comportant différents biocides n'agissent pas de manière suffisamment efficace car ils ne pénètrent pas le biofilm sur toute son épaisseur ou sont inhibés par certaines molécules composant cette matrice. Le traitement n'est alors que partiellement efficace sur la surface supérieure du biofilm. En outre, ce dernier peut également piéger d'autres microorganismes, pathogènes notamment, que celui qui s'est installé initialement.
On connaît par W098/26807 un procédé de traitement enzymatique d'un film biologique. Dans ce procédé, on met en contact le "PRODUCT AND METHOD FOR REMOVING BIOFILMS"
The invention relates to the field of the elimination of biofilms. More particularly, the invention relates to a composition and a method for removing biofilms.
Hygiene is becoming increasingly important in the industry in hospitals, and in particular in the sphere of surgical, in water purification and desalination plants water, in the treatment of process water, and in particular in water used in cooling towers and in the necessities of everyday life, for example contact lenses. We observe frequently, when water is circulated on a support, microorganisms circulating freely in water may adhere to the area. These microorganisms can then develop a matrix extracellular adhesive composed of polymeric substances. A
community of microorganisms adhered to a surface and encompassed in such a matrix is called a biofilm. Generally these biofilms are composed of bacteria.
Unfortunately, this matrix is very resistant, and may constitute a barrier for agents acting against microorganisms. Traditional soda treatments and / or with different biocides do not act effective enough because they do not penetrate the biofilm all over its thickness or are inhibited by some molecules that make up this matrix. The treatment is then only partially effective on the upper surface of the biofilm. In addition, the latter can also to trap other microorganisms, especially pathogens, than the one initially installed.
WO98 / 26807 discloses a method of treatment enzymatic of a biological film. In this process, the

2 biofilm avec une composition de nettoyage comportant une ou plusieurs hydrolases pour éliminer ou libérer la couche de biofilm de la surface.
Dans une seconde étape le biofilm est mis en contact avec une composition désinfectante bactéricide pour détruire les cellules bactériennes présentes dans le film. Cependant, l'utilisation simultanée de ces deux compositions est à l'origine d'un degré d'inactivation de certaines enzymes dans le mélange final. La rapidité et l'efficacité du nettoyage peuvent donc être améliorées en utilisant une composition où
l'inactivation des enzymes est absente.
On connaît également du document US2003/0205247 une utilisation de solutions aqueuses contenant des enzymes pour le nettoyage de cuves de stockage ou de fermentation, contenant une ou plusieurs enzymes choisies parmi les suivantes : laccases, peroxydases, oxydoréductases, transférases, isomérases, lyases ou ligases et un agent épaississant avec un amplificateur de mousse. Le domaine d'action des solutions précitées est relativement étroit, propre à la brasserie, puisque les enzymes choisies et illustrées sont particulièrement connues pour être actives sur des polyphénols qui constituent principalement les résidus de fermentation, tannins et analogues. L'agent épaississant est un agent modifiant la viscosité et la thixotropie de la solution utilisée dans le but de permettre une meilleure adhérence de la solution et/ou de la mousse, sur les surfaces à traiter des cuves. Ces solutions ne conviennent pas pour le nettoyage d'installations différentes de cuves ou réservoirs (comprenant par exemple de nombreuses tubulures) et ne conviennent pas pour l'élimination d'autres types de microorganismes.et donc pas pour une large gamme de biofilms.
Le document WO 92/13807 divulgue l'utilisation d'une composition permettant l'élimination de la biomasse et de biofilm sur des substrats dans des systèmes aqueux, c'est-à-dire dans des systèmes 2 biofilm with a cleaning composition comprising one or more hydrolases to remove or release the biofilm layer from the surface.
In a second step the biofilm is brought into contact with a disinfectant bactericidal composition to destroy cells bacterial present in the film. However, simultaneous use of these two compositions is at the origin of a degree of inactivation of some enzymes in the final mix. The speed and efficiency of the cleaning can therefore be improved by using a composition where inactivation of enzymes is absent.
Document US2003 / 0205247 is also known use of aqueous solutions containing enzymes for the cleaning of storage or fermentation tanks, containing one or several enzymes selected from the following: laccases, peroxidases, oxidoreductases, transferases, isomerases, lyases or ligases and a thickening agent with a foam booster. The domain of the aforementioned solutions is relatively narrow, peculiar to the brewery, since the enzymes chosen and illustrated are particularly known to be active on polyphenols which mainly constitute fermentation residues, tannins and like. The thickening agent is a viscosity modifying agent and the thixotropy of the solution used in order to allow better adhesion of the solution and / or foam to the surfaces to be treated vats. These solutions are not suitable for cleaning different installations of tanks or tanks (including by example of many tubings) and are not suitable for the elimination of other types of microorganisms.and therefore not for a wide range of biofilms.
WO 92/13807 discloses the use of a composition for the removal of biomass and biofilm from substrates in aqueous systems, i.e.

3 dans lesquels de l'eau est mise en circulation ou entreposée. Ce type de système souffre de la présence de biomasse et de biofilms alcalins ou acides dus au type d'organisme généralement présent dans ce type d'installation.
Pour résoudre ce problème, le document WO 92/13807 prévoit l'utilisation de polysaccharidases et/ou de protéases et de tensioactifs anioniques tels que du SDS ou DBS (respectivement du dodécylsulfate de sodium et de l'acide dodécylbenzènesulfonique) pour l'élimination de la biomasse et des biofilms.
Malheureusement, ce type de composition ne sera pas efficace pour une large gamme de biofilms provoqués par divers microorganismes et présentera une efficacité limitée pour l'élimination de biofilms.
Comme on peut le constater de ce qui précède, ces compositions sont toujours ciblées pour un type de biofilm ou un microorganisme ciblé et/ou pour une application particulière.
Il existe donc un besoin pour une composition et un procédé capable d'éliminer des biofilms, qui soient efficaces dans un délai raisonnable, agissent sur une large classe de biofilms produits par une large classe de microorganismes ou de groupes de microorganismes, qui ne soient pas nuisibles pour le support du biofilm, et agissent tant pour prévenir le développement de biofilms que sur des biofilms constitués depuis longtemps, et ayant atteint un stade de cohésion et de résistance important.
Pour résoudre ce problème, la présente invention procure une composition pour l'élimination des biofilms présents sur un substrat caractérisée en ce qu'elle comprend :
- au moins un composant détergent comprenant un agent séquestrant ainsi qu'un agent simultanément mouillant et dispersant, 3 in which water is circulated or stored. This kind of system suffers from the presence of biomass and alkaline biofilms or acids due to the type of organism generally present in this type installation.
To solve this problem, WO 92/13807 provides for the use of polysaccharidases and / or proteases and anionic surfactants such as SDS or DBS (respectively sodium dodecyl sulphate and dodecylbenzene sulphonic acid) for the elimination of biomass and biofilms.
Unfortunately, this type of composition will not be effective for a wide range of biofilms caused by various microorganisms and will have limited efficacy in the elimination of biofilms.
As can be seen from the foregoing, these compositions are always targeted for a type of biofilm or a targeted microorganism and / or for a particular application.
There is therefore a need for a composition and a process capable of eliminating biofilms, which are effective in a reasonable time, act on a broad class of biofilms produced by a large class of microorganisms or groups of microorganisms, which are not harmful to the support of the biofilm, and act both to prevent the development of biofilms and to biofilms that have been established for a long time and have reached a cohesion and significant resistance.
To solve this problem, the present invention provides a composition for the removal of biofilms present on a substrate characterized in that it comprises:
- at least a detergent component comprising an agent sequestering agent as well as an agent simultaneously wetting and dispersant,

4 - au moins un composant enzymatique contenant au moins une protéase, au moins une laccase et au moins une polysaccharidase.
La constitution d'une composition comprenant un composant détergent et un composant enzymatique contenant au moins une protéase, au moins une laccase et au moins une polysaccharidase permet, de manière surprenante, d'améliorer significativement la rapidité
et l'efficacité de l'élimination d'un biofilm tout en pouvant attaquer divers types de biofilms. Cette composition permet d'éliminer la totalité ou la quasi-totalité du biofilm et peut agir sur des biofilms même matures ou ayant un cycle de développement plus précoce et développés par de multiples espèces ou microorganismes différents.
A ce jour, il faut savoir qu'aucune composition efficace ne permet d'assurer l'élimination complète des biofilms présents dans les installations. Par exemple, dans le domaine de l'industrie alimentaire, les biofilms se forment de manière inévitable (au vu de la richesse du milieu environnant). Les biofilms présentent une activité de croissance cyclique comprenant une phase de croissance durant laquelle se produit l'accumulation des microorganismes et une phase de détachement durant laquelle des morceaux entiers de biofilms se détachent par érosion et sous l'effet de leur propre poids. Lorsqu'un industriel est confronté à ce phénomène, il devrait en réalité arrêter sa chaîne de production et effectuer différents cycles de lavages alternés à la soude, et avec de nombreux détergents et ou nettoyants chimiques et/ou enzymatiques puisqu'il n'existe pas de composition polyvalente. Or ceci représente de nombreuses heures de travail et de perte de rendement de l'installation.
Par conséquent, en pratique, la production n'est pas arrêtée et lorsque le biofilm est en phase de rupture, les lots produits sont contaminés et écartés jusqu'à ce que le niveau de contamination par les microorganismes des aliments produits soient à nouveau acceptable au vu des normes en vigueur. En outre, il n'est pas envisageable pour les industriels d'avoir en stock une solution détergente ou enzymatique particulière pour chaque microorganisme 4 - at least an enzyme component containing at least a protease, at least one laccase and at least one polysaccharidase.
The constitution of a composition comprising a detergent component and an enzymatic component containing at least a protease, at least one laccase and at least one polysaccharidase allows, surprisingly, to significantly improve the speed and the efficiency of the elimination of a biofilm while being able to attack various types of biofilms. This composition makes it possible to eliminate all or almost all of the biofilm and can act on even mature biofilms or having an earlier development cycle and developed by multiple species or microorganisms.
To date, it must be known that no effective composition ensures the complete elimination of biofilms present in facilities. For example, in the field of the food industry, biofilms are inevitably formed (given the richness of the environment surrounding). Biofilms show cyclical growth activity including a growth phase during which occurs the accumulation of microorganisms and a phase of detachment during which whole pieces of biofilms come off by erosion and under the influence of their own weight. When an industrialist is confronted with this phenomenon, he should actually stop his chain of production and carry out different washing cycles alternate with soda, and with many chemical detergents and / or cleaners and / or enzymatic since there is no polyvalent composition. Now this represents many hours of work and loss of performance of the installation.
Therefore, in practice, production is not stopped and when the biofilm is in a break-up phase, the batches produced are contaminated and discarded until the level of contamination by the microorganisms of the foods produced be again acceptable in view of the standards in force. In addition, it is not possible for manufacturers to have in stock a solution detergent or enzymatic particular for each microorganism

5 susceptible de contaminer sa chaîne de production.
C'est donc de manière très surprenante que la présente invention permet la mise à disposition d'une composition détergente parfaitement polyvalente qui permet d'éliminer un large spectre de biofilms, dans divers types d'installation et ne nécessitant pas de précaution particulières d'emploi. Le détergent élimine une partie superficielle du biofilm et mouille et gonfle les structures organiques du biofilm grâce au caractère dispersant et au caractère mouillant de l'agent simultanément mouillant et dispersant présent dans le composant détergent. Ceci favorise donc l'accessibilité du composant enzymatique qui fragilise et dégrade la matrice du biofilm. Cette action combinée des trois types d'enzyme et du composant détergent favorise l'accessibilité à
la composition des couches plus profondes et permet un détachement optimal de tout type de biofilm tout en préservant le substrat.
Ce type d'agent simultanément mouillant et dispersant réduit en outre l'apport de composés extérieurs dans les installations lors de l'étape de nettoyage et simplifie donc les procédures de validation des étapes de nettoyage.
Dans un forme de réalisation particulière selon l'invention, la composition est une solution de nettoyage aqueuse présentant un pH
compris entre approximativement 8 et 11, préférentiellement compris approximativement entre 9,5 et 10,5 et plus préférentiellement compris approximativement entre 9,5 et 10. La valeur du pH de ladite composition influence de manière importante son efficacité vis-à-vis du biofilm. Une solution de ladite composition dont le pH est compris approximativement entre 8 et 11 permet donc d'éliminer de manière 5 likely to contaminate its production chain.
It is therefore very surprising that this invention allows the provision of a detergent composition perfectly versatile which eliminates a wide spectrum of biofilms, in various types of installation and not requiring special precautions for use. Detergent removes part superficial biofilm and wets and swells the organic structures of the biofilm thanks to the dispersing nature and the wetting character of the agent simultaneously wetting and dispersing present in the component detergent. This therefore promotes the accessibility of the enzymatic component which weakens and degrades the matrix of the biofilm. This combined action of three types of enzyme and detergent component promotes accessibility to the composition of the deeper layers and allows detachment optimal of any type of biofilm while preserving the substrate.
This type of agent simultaneously wetting and dispersing further reduces the input of external compounds into the facilities during of the cleaning step and thus simplifies the validation procedures cleaning steps.
In a particular embodiment according to the invention, the composition is an aqueous cleaning solution having a pH
between approximately 8 and 11, preferentially understood approximately between 9.5 and 10.5 and more preferably included approximately between 9.5 and 10. The pH value of the composition significantly influences its effectiveness vis-à-vis the biofilm. A solution of said composition whose pH is included approximately between 8 and 11 therefore eliminates

6 surprenante la totalité ou la quasi-totalité du biofilm.
Alternativement, ladite composition peut être sous forme solide puis être dissoute dans un solvant avant utilisation afin d'obtenir par dilution dans une phase aqueuse, une solution de nettoyage dont le pH est compris approximativement entre 8 et 11.
Dans une variante avantageuse selon l'invention, la composition est une solution liquide qui être ensuite diluée dans une phase aqueuse pour obtenir une solution de nettoyage aqueuse présentant un pH compris entre 6,5 et 7,5, plus particulièrement autour de 7. De cette façon, le pH de la composition est particulièrement approprié à l'action du composant enzymatique, en particulier de la laccase. En outre, il est prévu selon l'invention d'augmenter le pH dans une phase ultérieure d'application de la composition selon l'invention de manière à obtenir un pH alcalin particulièrement approprié à l'élimination du biofilm comme mentionné ci-dessus tout en gardant l'optimum d'efficacité du composant enzymatique.
Alternativement, ladite composition peut être sous forme solide puis être dissoute dans un solvant avant utilisation avant d'être diluée dans une phase aqueuse afin d'obtenir une solution de nettoyage dont le pH est compris approximativement entre 6,5 et 7,5.
De préférence, ledit au moins un composant enzymatique comprend une proportion en protéase(s) comprise entre 10 et 50%, une proportion en laccase(s) comprise entre 5 et 35% et une proportion de polysaccharidase(s) comprise entre 5 et 20% en poids par rapport au poids du composant enzymatique, un excipient ou solvant conventionnel étant éventuellement ajouté pour atteindre 100% en poids du composant enzymatique, par exemple un alcool.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le composant enzymatique peut contenir entre 1 et 10 protéases, préférentiellement entre 1 et 5 protéases, plus préférentiellement peut WO 2012/048756 surprisingly all or almost all of the biofilm.
Alternatively, said composition can be in the form solid and then dissolve in a solvent before use to obtain by dilution in an aqueous phase, a cleaning solution whose pH is approximately between 8 and 11.
In an advantageous variant according to the invention, the composition is a liquid solution which is then diluted in a aqueous phase to obtain an aqueous cleaning solution having a pH of between 6.5 and 7.5, more particularly around of 7. In this way, the pH of the composition is particularly appropriate for the action of the enzymatic component, in particular the laccase. In addition, it is intended according to the invention to increase the pH in a subsequent phase of application of the composition according to the invention of to obtain an alkaline pH particularly suitable for elimination biofilm as mentioned above while keeping the optimum efficiency of the enzyme component.
Alternatively, said composition can be in the form solid and then dissolve in a solvent before use before being diluted in an aqueous phase to obtain a cleaning solution whose pH is approximately 6.5 to 7.5.
Preferably, said at least one enzymatic component comprises a proportion of protease (s) of between 10 and 50%, a proportion in laccase (s) between 5 and 35% and a proportion of polysaccharidase (s) of between 5 and 20% by weight relative to weight of the enzymatic component, a conventional excipient or solvent being optionally added to reach 100% by weight of the component enzymatic, for example an alcohol.
According to a preferred embodiment of the invention, the enzymatic component can contain between 1 and 10 proteases, preferentially between 1 and 5 proteases, more preferably WO 2012/04875

7 contenir 2, 3, 4 ou 5 protéases.
Des exemples non limitatifs d'enzymes protéases appartenant à la classe EC 3.4 et susceptibles d'être utilisées dans l'invention sont les amino-peptidases (EC 3.4.11), les dipeptidases (EC
3.4.13), les dipeptidyl-peptidases et tripeptidyl-peptidases (EC 3.4.14), les peptidyl-dipeptidases (EC 3.4.15), les sérine carboxypeptidases (EC
3.4.16), les métallo carboxypeptidases (EC 3.4.17), les cystéine carboxypeptidases (EC 3.4.18), les oméga peptidases (EC 3.4.19), les sérine endopeptidases (EC 3.4.21), les cystéine endopeptidases (EC
3.4.22), les aspartique endopeptidases (EC 3.4.23), les métallo endopeptidases (EC 3.4.24), les thréonine endopeptidases ((EC 3.4.25), et les endopeptidases appartenant à la classe EC 3.4.99.
Préférentiellement, les protéases appartiennent à la classe EC 3.4.21. Les protéases sont disponibles commercialement et sous différentes formes incluant les poudres, les granulés, les suspensions, les solutions liquides.
Les laccases utilisées dans l'invention appartiennent à la classe EC 1.10.3.2. Les laccases sont des enzymes contenant du cuivre et ont pour fonction d'oxyder un substrat en présence d'oxygène. Plus spécifiquement, les laccases sont des oxydoréductases qui fonctionnent avec l'oxygène moléculaire comme accepteur d'électrons.
La au moins une polysaccharidase utilisée dans l'invention est une enzyme ayant pour fonction de briser des liaisons au sein des polysaccharides. Préférentiellement, la au moins une polysaccharidase peut être une alpha-amylase, cellulase, hemi-cellulase, glucosidase, beta-glucanase ou pectinase.
Plus préférentiellement, la au moins une polysaccharidase peut être une alpha-amylase appartenant à la classe EC 3.2.1.1, ayant pour fonction de briser des liens (1-4)-alpha-glycosidiques dans des polysaccharides contenant trois unités ou plus alpha-(1-4)-D-glucose. 7 contain 2, 3, 4 or 5 proteases.
Non-limiting examples of protease enzymes belonging to class EC 3.4 and likely to be used in the invention are amino peptidases (EC 3.4.11), dipeptidases (EC
3.4.13), dipeptidyl peptidases and tripeptidyl peptidases (EC 3.4.14), peptidyl-dipeptidases (EC 3.4.15), serine carboxypeptidases (EC
3.4.16), metallo carboxypeptidases (EC 3.4.17), cysteine carboxypeptidases (EC 3.4.18), omega peptidases (EC 3.4.19), serine endopeptidases (EC 3.4.21), cysteine endopeptidases (EC
3.4.22), aspartic endopeptidases (EC 3.4.23), metalloids endopeptidases (EC 3.4.24), threonine endopeptidases ((EC 3.4.25), and endopeptidases belonging to class EC 3.4.99.
Preferably, the proteases belong to the class EC 3.4.21. Proteases are commercially available and under different forms including powders, granules, suspensions, liquid solutions.
The laccases used in the invention belong to the EC class 1.10.3.2. Laccases are enzymes containing copper and have the function of oxidizing a substrate in the presence of oxygen. More specifically, laccases are oxidoreductases that work with molecular oxygen as an electron acceptor.
The at least one polysaccharidase used in the invention is an enzyme whose function is to break bonds within polysaccharides. Preferably, the at least one polysaccharidase can be alpha-amylase, cellulase, hemi-cellulase, glucosidase, beta-glucanase or pectinase.
More preferably, the at least one polysaccharidase may be an alpha-amylase belonging to class EC 3.2.1.1, having function to break (1-4) -alpha-glycosidic bonds in polysaccharides containing three or more alpha- (1-4) -D-glucose units.

8 Préférentiellement, le composant enzymatique peut comprendre une proportion de laccase(s) d'approximativement de 30%, une proportion de protéase(s) d'approximativement 30%, une proportion en alpha-amylase(s) d'approximativement 10% en poids par rapport au poids du composant enzymatique, un excipient ou un solvant conventionnel étant éventuellement ajouté pour atteindre 100% en poids du composant enzymatique.
Selon un autre mode de réalisation préféré, si le composant enzymatique comprend 2 protéases, la proportion de laccase(s) peut être d'approximativement 30%, la proportion totale de protéases d'approximativement 30%, la proportion d'alpha-amylase(s) d'approximativement 10% en poids par rapport au poids du composant enzymatique, un excipient ou solvant conventionnel étant éventuellement ajouté pour atteindre 100% en poids du composant enzymatique.
Selon un autre mode de réalisation préféré, si le composant enzymatique comprend 2 protéases, la proportion en laccase peut être de 30%, la proportion totale en protéases de 30%, la proportion en alpha-amylase de 10% en poids par rapport au poids du composant enzymatique, un excipient ou solvant conventionnel étant éventuellement ajouté pour atteindre 100% en poids du composant enzymatique.
Par exemple, le rapport entre chaque protéases peut être compris entre 1:2 et 2:1, préférentiellement le rapport entre chaque protéases peut être de 1:1. Les enzymes présentes dans le composant enzymatique ont une action complémentaire sur le biofilm. Par exemple, la laccase présente une grande efficacité sur les souillures non attaquées par l'alpha-amylase ou les protéases.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le composant enzymatique peut être une solution ou sous forme solide. 8 Preferably, the enzyme component can include a proportion of laccase (s) of approximately 30%, a proportion of protease (s) of approximately 30%, a proportion in alpha-amylase (s) of approximately 10% by weight with respect to weight of the enzymatic component, excipient or solvent Conventional possibly being added to reach 100% by weight of the enzymatic component.
According to another preferred embodiment, if the component enzymatic comprises 2 proteases, the proportion of laccase (s) can to be approximately 30%, the total proportion of proteases approximately 30%, the proportion of alpha-amylase (s) approximately 10% by weight based on the weight of the component enzymatic, a conventional excipient or solvent being optionally added to reach 100% by weight of the component enzyme.
According to another preferred embodiment, if the component enzymatic comprises 2 proteases, the proportion in laccase can be 30%, the total proportion of proteases by 30%, the proportion alpha-amylase of 10% by weight based on the weight of the component enzymatic, a conventional excipient or solvent being optionally added to reach 100% by weight of the component enzyme.
For example, the ratio between each protease can be between 1: 2 and 2: 1, preferably the ratio between each proteases can be 1: 1. The enzymes present in the component enzymatic have a complementary action on the biofilm. For example, laccase is highly effective on non-contaminated soil attacked by alpha-amylase or proteases.
According to a preferred embodiment of the invention, the Enzymatic component can be a solution or in solid form.

9 Préférentiellement, le composant enzymatique est une solution dont le pH peut être compris entre 8 et 10. Préférentiellement, le composant enzymatique est une solution aqueuse dont le pH peut être compris entre 8,5 et 9,5; plus préférentiellement le pH peut être approximativement de 9,0.
Alternativement, le composant enzymatique peut être sous forme solide tel que par exemple sous forme d'un lyophilisat, de poudres, de granulés ou sous tout autre forme permettant la solubilisation dudit composant dans un solvant, puis il sera ultérieurement dissous dans un solvant. Le solvant peut être de l'eau ou une solution aqueuse, acide, alcoolique, basique, tamponnée ou neutre.
Le composant enzymatique solubilisé pourra alors dans ce cas être ultérieurement dilué dans une solution aqueuse contenant éventuellement un ou plusieurs composés tels que par exemple des détergents pour former la solution de nettoyage.
Dans une forme de réalisation avantageuse selon l'invention, ledit au moins un composant détergent comprend une proportion d'agent séquestrant comprise entre 1 et 10% en poids par rapport au poids total du composant détergent, ce qui représente un optimum entre efficacité, stabilité et coût.
L'agent séquestrant est une substance chimique ayant la capacité à former des complexes avec des ions minéraux qu'il fixe sous une forme empêchant leur précipitation par les réactions habituelles. A
titre d'exemple, l'agent séquestrant peut être l'acide éthylène-diamine-tétraacétique, le glucono-delta-lactone, le gluconate de sodium, le gluconate de potassium, le gluconate de calcium, l'acide citrique, l'acide phosphorique, l'acide tartrique, l'acétate de sodium, le sorbitol, un composé comportant un atome de phosphore. Préférentiellement, l'agent séquestrant peut être un oxyde de phosphore tel qu'un phosphonate, un phosphinate ou un phosphate ou leur mélange, ou un sel de celui-ci, une amine ou un oxyde d'amine portant au moins, dans sa structure, un groupement fonctionnel phosphine, oxyde de phosphine, phophinite, phosphonite, phosphite, phosphonate, phosphinate ou phosphate, seul ou en combinaison, ou un sel de ceux-ci.
5 Plus préférentiellement l'agent séquestrant peut être un phosphonate ou un sel de celui-ci, une amine ou un oxyde d'amine comportant au moins, dans sa structure, un groupement fonctionnel phosphine, oxyde de phosphine, phosphinite, phosphonite, phosphite, phosphonate, phosphinate ou phosphate, seul ou en combinaison ou un 9 Preferably, the enzymatic component is a solution whose pH may be between 8 and 10. Preferably, the enzymatic component is an aqueous solution whose pH can be between 8.5 and 9.5; more preferably the pH can be approximately 9.0.
Alternatively, the enzymatic component may be under solid form such as, for example, in the form of a lyophilisate, powders, granules or any other form solubilizing said component in a solvent, then it will be subsequently dissolved in a solvent. The solvent can be water or an aqueous, acidic, alcoholic, basic, buffered or neutral solution.
The solubilized enzymatic component can then in this case be subsequently diluted in an aqueous solution containing optionally one or more compounds such as for example detergents to form the cleaning solution.
In an advantageous embodiment according to the invention, said at least one detergent component comprises a proportion of sequestering agent of between 1 and 10% by weight per in relation to the total weight of the detergent component, which represents a optimum between efficiency, stability and cost.
The sequestering agent is a chemical substance having the ability to form complexes with mineral ions that it sets under a form preventing their precipitation by the usual reactions. AT
For example, the sequestering agent may be ethylene diamine tetraacetic acid, glucono-delta-lactone, sodium gluconate, potassium gluconate, calcium gluconate, citric acid, acid phosphoric acid, tartaric acid, sodium acetate, sorbitol, a compound having a phosphorus atom. Preferably, the agent sequestering agent may be a phosphorus oxide such as a phosphonate, a phosphinate or a phosphate or a mixture thereof, or a salt thereof, a amine or an amine oxide bearing at least, in its structure, a phosphine functional group, phosphine oxide, phophinite, phosphonite, phosphite, phosphonate, phosphinate or phosphate, alone or in combination, or a salt thereof.
More preferably, the sequestering agent may be a phosphonate or a salt thereof, an amine or an amine oxide having at least, in its structure, a functional group phosphine, phosphine oxide, phosphinite, phosphonite, phosphite, phosphonate, phosphinate or phosphate, alone or in combination or

10 sel de ceux-ci. A titre d'exemple non limitatif, le phosphonate peut être de formule générale R1(R20)(R30)P=0 dans lequel R1, R2 et R3 représentent indépendamment un groupe hydrogène, alkyle, alkyle substitué, alkyle-amino substitué ou non, aminoalkyl substitué ou non, aryle ou aryle substitué. A titre d'exemple non limitatif, l'amine ou l'oxyde d'amine peuvent comporter un, deux ou trois substituant(s) de formule générale CR4R5W dans laquelle R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe hydrogène, alkyle, alkyle substitué, alkyle-amino substitué ou non, aminoalkyl substitué ou non, aryle ou aryle substitué, et W représente un groupe phosphonate, phosphinate ou phosphate. L'agent séquestrant peut être sous la forme d'un sel de sodium, calcium, lithium, magnésium ou potassium ; préférentiellement, l'agent séquestrant peut être sous la forme d'un sel de sodium, calcium, ou potassium.
Dans une forme de réalisation avantageuse selon l'invention, la proportion d'agent simultanément mouillant et dispersant comprise entre 15 et 50% en poids par rapport au poids total du composant détergent, de préférence de 20 à 30 %, ce qui représente un compromis entre efficacité, stabilité et prix.
Un agent simultanément mouillant et dispersant est une substance chimique amphiphile, qui modifie la tension superficielle entre 10 salt thereof. By way of non-limiting example, the phosphonate may to be of general formula R1 (R20) (R30) P = 0 in which R1, R2 and R3 independently represent a hydrogen, alkyl, alkyl group substituted, substituted or unsubstituted alkylamino, substituted or unsubstituted aminoalkyl, aryl or substituted aryl. By way of non-limiting example, the amine or the oxide of amine may contain one, two or three substituents of the formula general CR4R5W in which R4 and R5 represent independently hydrogen, alkyl, substituted alkyl, alkyl-substituted or unsubstituted amino, substituted or unsubstituted aminoalkyl, aryl or aryl substituted, and W represents a phosphonate, phosphinate or phosphate. The sequestering agent may be in the form of a salt of sodium, calcium, lithium, magnesium or potassium; preferably, the sequestering agent may be in the form of a sodium salt, calcium, or potassium.
In an advantageous embodiment according to the invention, the proportion of agent simultaneously wetting and dispersing between 15 and 50% by weight relative to the total weight of the detergent component, preferably from 20 to 30%, which represents a compromise between efficiency, stability and price.
A simultaneously wetting and dispersing agent is a amphiphilic chemical substance that modifies the surface tension between

11 deux surfaces qui a pour avantage de favoriser l'étalement d'un liquide sur un solide (anionique, cationique, non-ionique ou zwitterionique) tout en présentant un caractère dispersant, c'est-à-dire ayant la capacité
d'améliorer la séparation des particules d'une suspension afin de prévenir l'agglutination, l'agrégation et/ou la décantation.
Avantageusement, ledit agent simultanément mouillant et dispersant est choisi dans le groupe constitué des agents mouillants non moussants à chaud et comprend de préférence un alkylglucoside en Cg à
010, de préférence en Cg, issu de matière premières renouvelables et éventuellement un alcool éthoxylé.
L'agent mouillant et dispersant est de préférence une préparation comportant un alcool éthoxylé et un alkylpolyglucoside (en particulier un octyl glucoside) issu de matières premières renouvelables.
Comme on peut le constater, cet agent simultanément mouillant et dispersant permet des performances tensioactives et émulsionnantes particulièrement élevées sans déstabiliser les enzymes présentes dans la composition selon l'invention puisque cet agent simultanément mouillant et dispersant est un agent anionique qui présente une charge globale nette faible de façon à ne pas interférer avec les échanges d'ions entre les enzymes et substrats de ces dernières. Les agents simultanément mouillants et dispersants issus des matières premières renouvelables sont particulièrement appropriés et agissent synergiquement avec les enzymes en ne les déstabilisant pas par rapport aux tensioactifs courant d'origine pétrolière (à plus longue chaîne carbonnée). En outre, selon la présente invention, l'agent simultanément mouillant et dispersant peut être anionique, cationique ou non ionique, mais dans tous les cas, il présentera une charge globale ionique faible pour être compatible et ne pas déstabiliser les enzymes.
De plus, l'agent simultanément mouillant et dispersant selon l'invention comprenant un alcool éthoxylé et un alkylpolyglucoside 11 two surfaces which has the advantage of promoting the spreading of a liquid on a solid (anionic, cationic, nonionic or zwitterionic) all by having a dispersing character, that is to say having the capacity to improve the separation of particles from a suspension in order to prevent agglutination, aggregation and / or decantation.
Advantageously, said agent simultaneously wetting and dispersant is selected from the group consisting of non-wetting agents foaming agents and preferably comprises a C 8 alkylglucoside 010, preferably Cg, from renewable raw materials and optionally an ethoxylated alcohol.
The wetting and dispersing agent is preferably a preparation comprising an ethoxylated alcohol and an alkylpolyglucoside (in particularly an octyl glucoside) derived from renewable raw materials.
As can be seen, this agent simultaneously wetting and dispersant allows surfactant and emulsifying performance particularly high levels without destabilizing the enzymes present in the composition according to the invention since this agent simultaneously wetting and dispersing is an anionic agent that presents a charge net overall low so as not to interfere with trade ions between the enzymes and substrates of the latter. The agents simultaneously wetting and dispersing from raw materials renewable energies are particularly appropriate and synergistically with the enzymes by not destabilizing them by compared to current surfactants of petroleum origin (at longer carbon chain). In addition, according to the present invention, the agent simultaneously wetting and dispersing can be anionic, cationic or non-ionic, but in any case, it will present a global charge ionic weak to be compatible and not destabilize enzymes.
In addition, the agent simultaneously wetting and dispersing according to the invention comprising an ethoxylated alcohol and an alkylpolyglucoside

12 est particulièrement polyvalent en ce qu'il est compatible avec une large gamme de pH, avec la présence de nombreux acides ou bases et de builders, tout en étant non moussant à chaud.
Le fait que l'agent simultanément mouillant et dispersant soit un agent mouillant, non moussant à chaud permet une utilisation polyvalente, que ce soit dans des cuves et surfaces ou dans les installations comportant de nombreuses tubulures et tuyaux, évitant de cette façon la formation de mousse, sans altérer, bien au contraire les performances tensioactives et/ou émulsionnantes de la composition selon l'invention. En outre, comme on l'a déjà mentionné ci-avant, la présence d'un agent simultanément dispersant et mouillant limite l'apport de substance polymère dans les installations, par exemple, dans les installations de circulation ou traitement d'eau. Il est bien entendu que l'apport d'une solution détergente efficace sans génération de mousse limite les étapes de rinçage, ce qui est particulièrement souhaitable, surtout dans les installations à tubulures ou tuyaux multiples.
D'autres formes de réalisation de la composition selon l'invention sont mentionnées dans les revendications annexées.
L'invention a aussi pour objet un procédé pour l'élimination des biofilms présents sur un substrat caractérisée en ce qu'elle comporte les étapes suivantes de :
- a) mise à disposition d'un composant détergent comprenant un agent séquestrant ainsi qu'un agent mouillant et un agent dispersant et d'un composant enzymatique contenant au moins une protéase, au moins une laccase, et au moins une polysaccharidase, - b) mise en solution du composant détergent dans une phase aqueuse, - c) mise en solution du composant enzymatique dans la solution formée à l'étape b) pour former la solution de ladite composition selon l'invention ou b') mise en solution du composant enzymatique dans une phase aqueuse, 12 is particularly versatile in that it is compatible with a wide pH range, with the presence of many acids or bases and builders, while being non-foaming hot.
The fact that the agent simultaneously wetting and dispersing either a wetting agent, not hot foaming allows use versatile, whether in tanks and surfaces or in installations with many tubing and pipes, avoiding this way the formation of foam, without altering, on the contrary the surfactant and / or emulsifying performance of the composition according to the invention. In addition, as already mentioned above, the the presence of a simultaneously dispersing and wetting agent of polymeric substance in installations, for example in circulation facilities or water treatment. It is understood that providing an effective detergent solution without foam generation limits the rinsing steps, which is particularly desirable, especially in tubing or multiple pipe installations.
Other embodiments of the composition according to the invention are mentioned in the appended claims.
The subject of the invention is also a process for the elimination biofilms present on a substrate characterized in that it comprises the following steps of:
- a) providing a detergent component comprising an agent sequestering agent as well as a wetting agent and a dispersing agent and a enzymatic component containing at least one protease, at least a laccase, and at least one polysaccharidase, b) dissolving the detergent component in an aqueous phase, c) dissolving the enzymatic component in the formed solution in step b) to form the solution of said composition according to the invention or b ') dissolving the enzymatic component in a phase aqueous,

13 - c') mise en solution du composant détergent dans la solution formée à
l'étape b') pour former la solution de ladite composition selon l'invention - d) application de la solution de ladite la composition formée à l'étape c) ou c') sur le substrat pendant une période de temps prédéterminées, en particulier comprise entre 15 minutes et 4 heures.
Par les termes mise en solution, on entend au sens de la présente invention soit une mise en solution d'un composé solide dans une phase liquide, soit une dilution d'un composé liquide dans une phase liquide dans lequel le composé liquide est miscible.
Alternativement, les étapes b) et c), ou b') et c'), peuvent être effectuées de manière simultanée pour former une solution de ladite composition selon l'invention.
Préférentiellement, la méthode comporte les étapes suivantes de :
a) mise à disposition d'un composant détergent contenant un agent séquestrant ainsi qu'un agent mouillant et un agent dispersant; et d'un composant enzymatique contenant au moins une protéase, au moins une laccase, et au moins une polysaccharidase, b) mise en solution du composant détergent dans l'eau, c) mise en solution du composant enzymatique dans la solution formée à
l'étape b) pour former la solution de ladite composition selon l'invention, d) application de la solution de ladite la composition formée à l'étape c) sur le substrat pendant une période de temps prédéterminée, de préférence comprise entre 15 minutes et 4 heures.
Avantageusement, le pH de la solution de ladite composition formée à l'étape c) ou c') est compris entre 8 et 11, préférentiellement compris approximativement entre 9,5 et 10,5 et plus préférentiellement compris entre 9,5 et 10.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le pH de la solution formée lors de l'étape b) est compris approximativement entre 13 c) dissolving the detergent component in the solution formed in step b ') for forming the solution of said composition according to the invention d) applying the solution of said composition formed in step vs) or c ') on the substrate for a predetermined period of time, between 15 minutes and 4 hours.
By the terms solution, for the purposes of this invention is a dissolution of a solid compound in a phase liquid, ie a dilution of a liquid compound in a liquid phase wherein the liquid compound is miscible.
Alternatively, steps b) and c), or b ') and c'), can be performed simultaneously to form a solution of the said composition according to the invention.
Preferably, the method comprises the steps following of:
a) providing a detergent component containing an agent sequestering agent and a wetting agent and a dispersing agent; and a enzymatic component containing at least one protease, at least a laccase, and at least one polysaccharidase, b) dissolving the detergent component in the water, c) dissolving the enzymatic component in the solution formed in step b) to form the solution of said composition according to the invention, d) applying the solution of said composition formed in step c) on the substrate for a predetermined period of time, preferably between 15 minutes and 4 hours.
Advantageously, the pH of the solution of said composition formed in step c) or c ') is between 8 and 11, preferentially approximately between 9.5 and 10.5 and more preferably between 9.5 and 10.
According to a preferred embodiment of the invention, the pH of the solution formed during step b) is approximately between

14 11,0 et 14,0, préférentiellement compris approximativement entre 12,0 et 14,0 et plus préférentiellement compris entre 12,8 et 13,8.
Dans une variante selon l'invention, le pH de la solution de ladite composition formée à l'étape c) ou c') est compris entre 6,5 et 7,5 et une solution basique est ajoutée après ladite application d) de la solution de ladite composition sur ledit substrat pendant ladite période de temps prédéterminée, de façon à effectuer un saut de pH jusqu'à environ 8 à 9.
De cette façon, lorsque la composition selon l'invention est appliquée sur le substrat, le pH régnant est compris entre 6,5 et 7,5, ce qui permet à la laccase d'être dans des conditions optimales d'activité. Ensuite, le fait d'effectuer un saut de pH jusqu'à environ 8 à 9 permet aux autres enzymes d'avoir à leur tour leur efficacité optimale. De cette façon, elles auront aussi à leur tour des conditions d'activité optimales, ce qui a pour résultat que le biofilm sera éliminé de manière particulièrement avantageuse puisque chaque enzyme présente aura des conditions optimales pour effectuer son action et le biofilm sera détaché et éliminé complètement. En outre, puisque les composants basiques sont généralement utilisés dans les installations dans lesquelles un biofilm peut se former, il n'y a pas d'ajout de composant exogène qui pourrait être problématique pour valider l'étape de nettoyage. Par exemple, pour sanitiser une installation, il est courant d'appliquer de la soude et donc, l'apport de substance de nature différente est limité dans le cadre de la présente invention.
De préférence, la température de la solution du composant détergent formée lors de l'étape b) ou c') peut être comprise entre approximativement 35 C et 50 C.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la composition selon l'invention est appliquée sur un substrat couvert d'un biofilm pendant approximativement 30 à 50 minutes, ce qui représente un temps d'application relativement court pour une telle efficacité.

Préférentiellement, le composant détergent comprend une proportion de séquestrant comprise entre 1 et 10%, une proportion de dispersant simultanément mouillant comprise entre 15 et 50%, un excipient conventionnel comme de l'eau est éventuellement ajouté pour atteindre les 5 100% en poids du composant détergent.
Préférentiellement, le composant enzymatique comprend une proportion en protéase(s) comprise entre 10 et 50%, une proportion de laccase(s) comprise entre 5 et 35% et une proportion de polysaccharidase(s) comprise entre 5 et 20%. Plus préférentiellement, la au 10 moins une polysaccharidase peut être une alpha-amylase. Un excipient ou solvant conventionnel est éventuellement ajouté pour atteindre 100% en poids du composant enzymatique, comme par exemple un alcool.
La présente méthode permet d'éliminer efficacement la totalité ou la quasi-totalité du biofilm, ne laissant alors sur le substrat que 14 11.0 and 14.0, preferably approximately between 12.0 and 14.0 and more preferably between 12.8 and 13.8.
In a variant according to the invention, the pH of the solution of said composition formed in step c) or c ') is between 6.5 and 7.5 and a basic solution is added after said application d) of the solution of said composition on said substrate during said period of time predetermined, so as to perform a pH jump up to about 8 to 9.
In this way, when the composition according to the invention is applied on the substrate, the prevailing pH is between 6.5 and 7.5, which allows the laccase to be in optimal conditions of activity. Then, the fact of performing a pH jump up to about 8 to 9 allows others enzymes to have in turn their optimal efficiency. In this way, they will in turn have optimal activity conditions, which result that the biofilm will be eliminated in a particularly advantageous way since each enzyme present will have optimal conditions for perform its action and the biofilm will be detached and eliminated completely. In Moreover, since the basic components are generally used in facilities in which a biofilm can be formed, there is no addition of exogenous component that could be problematic to validate the step of cleaning. For example, to sanitize an installation, it is common to apply soda and therefore, the intake of substance of different nature is limited in the context of the present invention.
Preferably, the temperature of the solution of the component detergent formed in step b) or c ') may be between approximately 35 C and 50 C.
According to a preferred embodiment of the invention, the composition according to the invention is applied to a substrate covered with a biofilm for approximately 30 to 50 minutes, which represents a relatively short application time for such efficiency.

Preferably, the detergent component comprises a proportion of sequestrant between 1 and 10%, a proportion of dispersant simultaneously wetting between 15 and 50%, an excipient conventional as water is eventually added to achieve the 100% by weight of the detergent component.
Preferably, the enzymatic component comprises a proportion of protease (s) between 10 and 50%, a proportion of laccase (s) between 5 and 35% and a proportion of polysaccharidase (s) of between 5 and 20%. More preferably, the at At least one polysaccharidase may be alpha-amylase. An excipient or conventional solvent is optionally added to achieve 100%
weight of the enzymatic component, such as an alcohol.
This method effectively eliminates the all or almost all of the biofilm, leaving then on the substrate than

15 des cellules isolées sans protection de la matrice. L'action postérieure d'un biocide permet de détruire la souche microbienne. Une phase de désinfection ultérieure sera donc beaucoup plus efficace suite à l'application d'une solution de la composition selon l'invention que suite à l'application d'une phase de nettoyage conventionnelle ne permettant pas cette élimination totale de la matrice.
Ainsi, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la méthode comprend en outre une étape ultérieure d'application d'un biocide.
Par exemple, les biocides peuvent être, de manière non limitative, de type oxydant tel que l'acide peracétique, le peroxyde d'hydrogène, le monopersulfate de potassium, l'hypochlorite de soude. Selon l'invention, l'application d'un biocide doit être postérieure à l'application de la composition selon l'invention pour éviter la désactivation des enzymes présentes dans ladite composition par les biocides.
D'autres formes de réalisation du procédé selon l'invention sont mentionnées dans les revendications annexées. Isolated cells without protection of the matrix. Posterior action a biocide destroys the microbial strain. A phase of Subsequent disinfection will therefore be much more effective following the application of a solution of the composition according to the invention that following the application of a conventional cleaning phase that does not allow this total elimination of the matrix.
Thus, according to a preferred embodiment of the invention, the method further comprises a subsequent step of applying a biocide.
For example, the biocides may be, without limitation, of the type oxidant such as peracetic acid, hydrogen peroxide, potassium monopersulfate, sodium hypochlorite. According to the invention, the application of a biocide must be after the application of the composition according to the invention to prevent the deactivation of enzymes present in said composition by the biocides.
Other embodiments of the method according to the invention are mentioned in the appended claims.

16 L'invention se rapporte aussi à une utilisation d'une composition selon l'invention pour l'élimination de biofilms présents sur un substrat, en particulier pour le nettoyage des sols et des surfaces, pour le nettoyage en place ou le trempage. La composition peut s'utiliser dans des installations fermées ou par trempage. Le nettoyage par trempage est notamment utilisé pour nettoyer du matériel chirurgical, les lentilles de contact. La composition selon l'invention peut être utilisée pour le nettoyage de circuit d'eau technique et de process, les systèmes d'échangeurs de conditionnement d'air ou dans l'industrie alimentaire.
D'autres formes d'utilisation selon l'invention sont mentionnées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte également à une trousse pour l'élimination de biofilms présents sur un substrat caractérisée en ce qu'elle comprend - au moins un échantillon de composant détergent en solution ou sous forme solide, contenant un agent séquestrant, un agent simultanément mouillant et dispersant, et - au moins un échantillon de composant enzymatique en solution ou sous forme solide contenant au moins une protéase, au moins une laccase et au moins une polysaccharidase.
Préférentiellement, la au moins une polysaccharidase peut être une alpha-amylase.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'échantillon du composant enzymatique peut contenir entre 1 et 10 protéases, préférentiellement entre 1 et 5 protéases, plus préférentiellement peut contenir 2, 3, 4 ou 5 protéases.
Selon un autre mode de réalisation préféré, l'échantillon du composant enzymatique contenu dans la trousse peut comprendre 2 protéases. Préférentiellement, si l'échantillon du composant enzymatique comprend 2 protéases, la proportion en laccase peut être 16 The invention also relates to a use of a composition according to the invention for the elimination of biofilms present on a substrate, in particular for cleaning floors and surfaces, for cleaning in place or soaking. The composition can be used in closed or soaking facilities. Cleaning by dipping is especially used to clean surgical equipment, contact lenses. The composition according to the invention can be used for the cleaning of technical and process water circuits, the systems air conditioning exchangers or in the food industry.
Other forms of use according to the invention are mentioned in the appended claims.
The present invention also relates to a kit for the removal of biofilms present on a substrate characterized in that that she understands - at least one sample of detergent component in solution or under solid form, containing a sequestering agent, an agent simultaneously wetting and dispersing, and at least one sample of enzymatic component in solution or in solid form containing at least one protease, at least one laccase and at least one polysaccharidase.
Preferably, the at least one polysaccharidase may be an alpha-amylase.
According to a preferred embodiment of the invention, the sample of the enzymatic component may contain between 1 and 10 proteases, preferably between 1 and 5 proteases, more preferentially may contain 2, 3, 4 or 5 proteases.
According to another preferred embodiment, the sample of Enzymatic component contained in the kit may include 2 proteases. Preferably, if the sample of the enzymatic component comprises 2 proteases, the proportion in laccase can be

17 approximativement de 30%, la proportion totale en protéases peut être approximativement de 30%, la proportion en alpha-amylase peut être approximativement de 10% en poids par rapport au poids total de l'échantillon du composant enzymatique, un excipient ou sovlant conventionnel étant ajouté pour atteindre 100% en poids du composant enzymatique.
Préférentiellement, si l'échantillon du composant enzymatique comprend 2 protéases, la proportion en laccase(s) peut être de 30%, la proportion totale en protéases peut être de 30%, la proportion en alpha-amylase(s) peut être de 10%. Par exemple, le rapport entre chaque protéase peut être compris entre 1:2 et 2:1, préférentiellement le rapport entre chaque protéase peut être de 1:1.
Si l'échantillon du composant enzymatique contenu dans la trousse est une solution, le pH de celle-ci peut être compris entre 8 et 10, préférentiellement, le pH peut être compris entre 8,5 et 9,5, plus préférentiellement le pH peut être approximativement de 9,0.
Préférentiellement, l'échantillon du composant détergent comprend une proportion de séquestrant comprise approximativement entre 1 et 10%, une proportion d'agent simultanément mouillant et dispersant de 15 à 50% en poids par rapport au poids total du composant détergent, les 100% étant éventuellement atteint à l'aide d'un excipient conventionnel, comme par exemple de l'eau.
A titre d'exemple, l'agent séquestrant peut être l'acide éthylène-diamine-tétraacétique, le glucono-delta-lactone, le gluconate de sodium, le gluconate de potassium, le gluconate de calcium, l'acide citrique, l'acide phosphorique, l'acide tartrique, l'acétate de sodium, le sorbitol, un composé comportant un atome de phosphore.
Préférentiellement, l'agent séquestrant peut être un oxyde de phosphore tel que phosphonate, phosphinate ou phosphate, ou un sel de celui-ci, une amine ou un oxyde d'amine, ou un sel de ceux-ci portant au moins, 17 approximately 30%, the total proportion of proteases can be approximately 30%, the proportion of alpha-amylase may be approximately 10% by weight relative to the total weight of the sample of the enzymatic component, an excipient or sovlant Conventional being added to achieve 100% by weight of the component enzyme.
Preferably, if the sample of the component enzyme contains 2 proteases, the proportion in laccase (s) can 30%, the total proportion of proteases can be 30%, the proportion of alpha-amylase (s) can be 10%. For example, the ratio between each protease can be between 1: 2 and 2: 1, preferably the ratio between each protease may be 1: 1.
If the sample of the enzymatic component contained in the kit is a solution, the pH of it can be between 8 and 10, preferentially, the pH may be between 8.5 and 9.5, more preferentially the pH may be approximately 9.0.
Preferably, the sample of the detergent component includes a proportion of sequestrant approximately between 1 and 10%, a proportion of agent simultaneously wetting and dispersant from 15 to 50% by weight relative to the total weight of the detergent component, the 100% being eventually achieved with the aid of a conventional excipient, such as water.
For example, the sequestering agent may be the acid ethylene-diamine-tetraacetic acid, glucono-delta-lactone, gluconate sodium, potassium gluconate, calcium gluconate, acid citric acid, phosphoric acid, tartaric acid, sodium acetate, sorbitol, a compound having a phosphorus atom.
Preferably, the sequestering agent may be a phosphorus oxide such as phosphonate, phosphinate or phosphate, or a salt thereof, an amine or an amine oxide, or a salt thereof bearing at least

18 dans sa structure, un groupement fonctionnel phosphine, oxyde de phosphine, phophinite, phosphonite, phosphite, phosphonate, phosphinate ou phosphate.
Plus préférentiellement, l'agent séquestrant peut être un phosphonate ou un sel de celui-ci, une amine ou un oxyde d'amine, ou un sel de ceux-ci, comportant au moins, dans sa structure, un groupement fonctionnel phosphine, oxyde de phosphine, phosphinite, phosphonite, phosphite, phosphonate, phosphinate ou phosphate. A titre d'exemple non limitatif, le phosphonate peut être de formule générale R1(R20)(R30)P=0 dans lequel R1, R2 et R3 sont indépendamment sélectionnés parmi le groupe hydrogène, alkyle, alkyle substitué, alkyle-amino substitué ou non, aminoalkyl substitué ou non, aryle ou aryle substitué. A titre d'exemple non limitatif, l'amine ou l'oxyde d'amine peuvent comporter un, deux ou trois substituant(s) de formule générale CR4R5W dans laquelle R4 et R5 sont indépendamment sélectionnés parmi le groupe hydrogène, alkyle, alkyle substitué, alkyle-amino substitué ou non, aminoalkyl substitué ou non, aryle ou aryle substitué, et W est sélectionné parmi le groupe phosphonate, phosphinate ou phosphate. L'agent séquestrant peut être sous la forme d'un sel de sodium, calcium, lithium, magnésium ou potassium ; préférentiellement, l'agent séquestrant peut être sous la forme d'un sel de sodium, calcium, ou potassium.
Avantageusement, ledit agent simultanément mouillant et dispersant est choisi dans le groupe constitué des agents mouillants non moussants à chaud et comprend de préférence un alkylglucoside Cg à
010, de préférence en Cg, issu de matière premières renouvelables et éventuellement un alcool éthoxylé.
L'agent mouillant et dispersant est de préférence une préparation comportant un alcool éthoxylé et un alkylpolyglucoside (en particulier un octyl glucoside) issu de matières premières renouvelables. 18 in its structure, a functional group phosphine, oxide of phosphine, phophinite, phosphonite, phosphite, phosphonate, phosphinate or phosphate.
More preferably, the sequestering agent may be a phosphonate or a salt thereof, an amine or an amine oxide, or a salt thereof, comprising at least, in its structure, a phosphine functional group, phosphine oxide, phosphinite, phosphonite, phosphite, phosphonate, phosphinate or phosphate. As of non-limiting example, the phosphonate may be of general formula R1 (R20) (R30) P = 0 in which R1, R2 and R3 are independently selected from hydrogen, alkyl, substituted alkyl, alkyl-substituted or unsubstituted amino, substituted or unsubstituted aminoalkyl, aryl or aryl substituted. By way of non-limiting example, amine or amine oxide may have one, two or three substituents of the general formula CR4R5W in which R4 and R5 are independently selected among the group hydrogen, alkyl, substituted alkyl, alkyl-amino substituted or unsubstituted, substituted or unsubstituted aminoalkyl, aryl or substituted aryl, and W is selected from the group phosphonate, phosphinate or phosphate. The sequestering agent may be in the form of a salt of sodium, calcium, lithium, magnesium or potassium; preferably, the sequestering agent may be in the form of a sodium salt, calcium, or potassium.
Advantageously, said agent simultaneously wetting and dispersant is selected from the group consisting of non-wetting agents foaming agents and preferably comprises an alkylglucoside Cg to 010, preferably Cg, from renewable raw materials and optionally an ethoxylated alcohol.
The wetting and dispersing agent is preferably a preparation comprising an ethoxylated alcohol and an alkylpolyglucoside (in particularly an octyl glucoside) derived from renewable raw materials.

19 Comme on peut le constater, cet agent simultanément mouillant et dispersant permet des performances tensioactives et émulsionnantes particulièrement élevées sans déstabiliser les enzymes présentes dans la composition selon l'invention puisque cet agent simultanément mouillant et dispersant est un agent anionique qui présente une charge globale nette faible de façon à ne pas interférer avec les échanges d'ions entre les enzymes et substrats de ces dernières. Les agents simultanément mouillants et dispersants issus des matières premières renouvelables sont particulièrement appropriés et agissent synergiquement avec les enzymes en ne les déstabilisant pas par rapport aux tensioactifs courant d'origine pétrolière (à plus longue chaîne carbonnée). En outre, selon la présente invention, l'agent simultanément mouillant et dispersant peut être anionique, cationique ou non ionique, mais dans tous les cas, il présentera une charge globale ionique faible pour être compatible et ne pas déstabiliser les enzymes.
De plus, l'agent simultanément mouillant et dispersant selon l'invention comprenant un alcool éthoxylé et un alkylpolyglucoside est particulièrement polyvalent en ce qu'il est compatible avec une large gamme de pH, avec la présence de nombreux acides ou bases et de builders, tout en étant non moussant à chaud.
Avantageusement, dans la trousse selon l'invention l'échantillon du composant enzymatique est une solution aqueuse dont le pH est compris entre 8 et 10.
Si l'échantillon du composant détergent est une solution, le pH de celle-ci est compris entre 8,5 et 14,0.
Si la solution de nettoyage formée par dilution dans une phase aqueuse du composant détergent et du composant enzymatique doit avoir un pH entre 6,5 et 7,5, alors le composant détergent, s'il est sous la forme d'une solution présentera un pH compris entre 9 et 10. La mise en solution dans la phase aqueuse des deux composés, par exemple grâce à la présence de tampons dans l'un ou l'autre composant ou à l'effet de dilution aura pour effet de diminuer le pH de la solution de nettoyage pour qu'il soit optimal au fonctionnement des laccases.
Si la solution de nettoyage formée par dilution dans une 5 phase aqueuse du composant détergent et du composant enzymatique doit avoir un pH d'environ 10, alors le composant détergent, s'il est sous la forme d'une solution présentera un pH préférentiellement compris entre 12,0 et 14,0, plus préférentiellement entre 12,8 et 13,8. La mise en solution dans la phase aqueuse des deux composésaura pour effet 10 d'amener le pH de la solution de nettoyage à environ 9,5 à 10,5. Par exemple, les composant peuvent contenir en outre des composés alcalin à cet effet.
De préférence, la trousse selon l'invention comprend en outre un biocide.
15 D'autres formes de réalisation de la trousse selon l'invention sont mentionnées dans les revendications annexées.
D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront de la description donnée ci-après, à titre non limitatif et en faisant référence aux dessins annexés et aux exemples. 19 As can be seen, this agent simultaneously wetting and dispersant allows surfactant and emulsifying performance particularly high levels without destabilizing the enzymes present in the composition according to the invention since this agent simultaneously wetting and dispersing is an anionic agent that presents a charge net overall low so as not to interfere with trade ions between the enzymes and substrates of the latter. The agents simultaneously wetting and dispersing from raw materials renewable energies are particularly appropriate and synergistically with the enzymes by not destabilizing them by compared to current surfactants of petroleum origin (at longer carbon chain). In addition, according to the present invention, the agent simultaneously wetting and dispersing can be anionic, cationic or non-ionic, but in any case, it will present a global charge ionic weak to be compatible and not destabilize enzymes.
In addition, the agent simultaneously wetting and dispersing according to the invention comprising an ethoxylated alcohol and an alkylpolyglucoside is particularly versatile in that it is compatible with a wide pH range, with the presence of many acids or bases and builders, while being non-foaming hot.
Advantageously, in the kit according to the invention the sample of the enzymatic component is an aqueous solution the pH is between 8 and 10.
If the sample of the detergent component is a solution, the pH thereof is between 8.5 and 14.0.
If the cleaning solution formed by dilution in a aqueous phase of the detergent component and the enzymatic component must have a pH between 6.5 and 7.5, so the detergent component, if it is in the form of a solution will have a pH of between 9 and 10.
dissolved in the aqueous phase of the two compounds, by example thanks to the presence of buffers in one or the other component or the dilution effect will have the effect of decreasing the pH of the solution of cleaning so that it is optimal for the operation of laccases.
If the cleaning solution formed by dilution in a Aqueous phase of the detergent component and the enzymatic component must have a pH of about 10, so the detergent component, if it is under the form of a solution will have a pH that is preferentially understood between 12.0 and 14.0, more preferably between 12.8 and 13.8. Setting solution in the aqueous phase of both compounds will effect Bringing the pH of the cleaning solution to about 9.5 to 10.5. By For example, the components may further contain alkaline compounds for this purpose.
Preferably, the kit according to the invention comprises in besides a biocide.
Other embodiments of the kit according to the invention are mentioned in the appended claims.
Other features, details and benefits of the invention will emerge from the description given below, as a non and with reference to the accompanying drawings and examples.

20 La figure 1 illustre les résultats de tests comparant l'efficacité de la composition suivant l'invention avec de la soude La figure 2 illustre les résultats de tests comparant l'efficacité de la composition suivant l'invention avec d'autres compositions détergentes La figure 3 illustre les résultats de tests comparant l'efficacité de la composition suivant l'invention avec d'autres compositions détergentes en effectuant un saut de pH.
Exemple 1.-Un essai permettant de comparer l'efficacité de la composition suivant l'invention à un rinçage à l'eau et au NaOH a été Figure 1 illustrates the test results comparing the effectiveness of the composition according to the invention with sodium hydroxide Figure 2 illustrates the test results comparing the effectiveness of the composition according to the invention with other detergent compositions Figure 3 illustrates the test results comparing the effectiveness of the composition according to the invention with other detergent compositions by performing a pH jump.
Example 1.-An attempt to compare the effectiveness of the composition according to the invention to a rinsing with water and NaOH has been

21 effectué.
Des biofilms sont développés sur des membranes à
osmose inverse utilisée dans des installations de dessalement.. Un inoculum bactérien (Pseudomonas aeruginosa) est préparé par culture durant 16h dans un milieu TSB 10% (tryptone soy broth). Cette préculture est diluée pour obtenir une densité optique (DO) de 0,05 à
600nm et 500 pl de cette solution ont été étalés sur chaque membrane.
Les coupons sont incubés durant 48h dans des boîtes de pétri maintenues humides et placées en étuve à 30 C. Après 2 heures, la solution bactérienne est remplacée par 500 pl de milieu frais, TSB 10%.
Après 24h, ce milieu de culture est renouvelé.
Les coupons sont ensuite nettoyés et sont placés dans les solutions de nettoyage. Les membranes sont laissées à tremper dans les solutions de nettoyage susdites pendant un temps total de 120 minutes à
200 rpm, à 35 C.
Les solutions de nettoyages sont les suivantes :
1. Eau 2. NaOH liquide à 0,5 %
3. Composition suivant l'invention à pH 7.
Les résultats de cet essai sont présentés au tableau 1 .-Tableau 1.-Solution 1 Solution 2 Solution 3 Etat visuel Des grands Environ 50 % La plupart des des sillons de des sallisures sallisures présentes membranes sallisures sont ont disparu à la surface de la encore présents membrane ont sur la disparu membrane Ces résultats sont également présentés à la figure 1 qui illustre de gauche à droite la membrane après traitement à l'eau, au 21 made.
Biofilms are developed on membranes with reverse osmosis used in desalination plants.
bacterial inoculum (Pseudomonas aeruginosa) is prepared by culture during 16h in a medium TSB 10% (tryptone soy broth). This preculture is diluted to obtain an optical density (OD) of 0.05 to 600nm and 500 μl of this solution were spread on each membrane.
Coupons are incubated for 48 hours in petri dishes kept moist and placed in an oven at 30 C. After 2 hours, the Bacterial solution is replaced by 500 μl of fresh medium, TSB 10%.
After 24 hours, this culture medium is renewed.
The coupons are then cleaned and placed in the cleaning solutions. The membranes are left to soak in the cleaning solutions for a total of 120 minutes 200 rpm, at 35 C.
Cleaning solutions are as follows:
1. Water 2. 0.5% liquid NaOH
3. Composition according to the invention at pH 7.
The results of this test are shown in Table 1 .-Table 1.-Solution 1 Solution 2 Solution 3 Visual state Of the big About 50% Most furrows of sallisures sallisures present sallisure membranes are disappeared to the surface of the still present membrane have on the disappeared membrane These results are also presented in Figure 1 which illustrates from left to right the membrane after treatment with water,

22 NaOH liquide et à la composition suivant l'invention à pH 7.
Comme on peut le voir, seule la composition suivant l'invention permet une élimination substantielle du biofilm.
Exemple 2.-Un essai permettant de comparer l'efficacité de la composition suivant l'invention à d'autres composition détergentes a été
effectué. La procédure est identique à celle de l'exemple 1 à l'exception des solutions de nettoyage qui sont les suivantes:
1. Composition contenant 3 agents différents, à savoir un agent séquestrant, un agent mouillant, et un agent dispersant et un composant enzymatique contenant au moins une laccase, une protéase et une polysaccharidase.
2. Composition contenant deux agents différents à savoir un agent séquestrant et un agent simultanément mouillant et dispersant et un composant enzymatique similaire au point 1 à pH 7 3. Composition contenant deux agents différents à savoir un agent séquestrant et un agent simultanément mouillant et dispersant et un composant enzymatique similaire au point 1 à pH 10.
Les résultats sont présentés au tableau 2 et à la figure 2.
Tableau 2.-Solution 1 Solution 2 Solution 3 Etat visuel quelques sillons Presque tous La plupart des des de sallisures les sillons des sallisures présentes membranes sont encore sallisures ont à la surface de la présents sur la disparu membrane ont membrane disparu (25% par rapport au départ) Ces résultats sont également présentés à la figure 2 qui 22 Liquid NaOH and the composition according to the invention at pH 7.
As can be seen, only the following composition the invention allows a substantial elimination of the biofilm.
Example 2.-An attempt to compare the effectiveness of the composition according to the invention to other detergent compositions has been made. The procedure is identical to that of example 1 except cleaning solutions that are:
1. Composition containing 3 different agents, namely an agent sequestering agent, a wetting agent, and a dispersing agent and a component enzyme containing at least one laccase, a protease and a polysaccharidase.
2. Composition containing two different agents, namely an agent sequestering agent and a simultaneously wetting and dispersing agent and a enzymatic component similar to point 1 at pH 7 3. Composition containing two different agents, namely an agent sequestering agent and a simultaneously wetting and dispersing agent and a enzymatic component similar to item 1 at pH 10.
The results are shown in Table 2 and Figure 2.
Table 2.-Solution 1 Solution 2 Solution 3 Visual status some furrows Almost all Most of sallisures the grooves of the present sallisures membranes are still sallisures have to the surface of the present on the missing membrane have disappeared membrane (25% per report to departure) These results are also presented in Figure 2 which

23 illustre de gauche à droite la membrane après traitement par la solution 1, la solution 3 et la solution 2.
Comme on peut le voir, seule la composition suivant l'invention à pH 7 ou 10 permet une élimination substantielle du biofilm.
Exemple 3.-Des coupons en acier ont été traité par une composition semblable à la composition 1 de l'exemple 2 et par une composition suivant l'invention initialement à pH 7 avec un saut de pH à 10 après 15 minutes suivnat le protocole ci-dessous.
Les biofilms sont développés sur des coupons en inox préalablement lavés et stérélisés. Un inoculum bactérien (Pseudomonas aeruginosa) est préparé par culture durant 16h dans un milieu TSB 10%
(tryptone soy broth). Cette préculture est diluée pour obtenir une densité
optique (DO) de 0,05 à 600nm et 500 pl de cette solution ont été étalés sur chaque coupon. Les coupons sont incubés durant 48h dans des boîtes de pétri maintenues humides et placées en étuve à 30 C. Après 2 heures, la solution bactérienne est remplacée par 500 pl de milieu frais, TSB 10%. Après 24h, ce milieu de culture est renouvelé.
Les coupons ont ensuite été placés dans des tubes à essai contenant 10 ml d'une solution TSB + 0,5% Tween 80 pour le comptage des bactéries. Les tubes à essai ont été incubés pendant 5 minutes sur la table avant d'être soniques pendant 2 minutes trente et vortexés pendant 30 secondes. Les étapes d'incubation, sonication et vortex ont été répétées.
Les coupons ont ensuite été récupérés et le milieu comprenant la solution TSB + 0,5 % de tween a fait l'objet de dilutions sérielles en utilisant de l'eau peptonée (Eau peptonée exempte d'indole:
préparer 10 ml d'une dissolution à 15g/I. Puis diluer 1m1 de cette solution dans 1 litre d'eau stérile) et a ensuite été étalé sur boîte de pétri et incubé à 30 C pendant une nuit avant comptage. 23 illustrates from left to right the membrane after treatment with the solution 1, solution 3 and solution 2.
As can be seen, only the following composition the invention at pH 7 or 10 allows substantial removal of the biofilm.
Example 3.-Steel coupons were processed by a composition similar to composition 1 of example 2 and by a composition according to the invention initially at pH 7 with a pH jump to 10 after 15 minutes following the protocol below.
Biofilms are developed on stainless steel coupons previously washed and sterilized. A bacterial inoculum (Pseudomonas aeruginosa) is prepared by culturing for 16 hours in 10% TSB medium (tryptone soy broth). This preculture is diluted to obtain a density optics (OD) of 0.05 to 600nm and 500 μl of this solution were on each coupon. Coupons are incubated for 48 hours in petri dishes kept moist and placed in an oven at 30 C. After 2 hours, the bacterial solution is replaced by 500 μl of fresh medium, TSB 10%. After 24 hours, this culture medium is renewed.
The coupons were then placed in test tubes containing 10 ml of a TSB + 0.5% Tween 80 solution for counting bacteria. The test tubes were incubated for 5 minutes on the table before being sonic for 2 minutes and 30 vortexed for 30 seconds. The stages of incubation, sonication and vortex have have been repeated.
The coupons were then recovered and the middle including the TSB solution + 0.5% tween has been diluted Serials using peptone water (peptone water with no indole:
prepare 10 ml of a 15 g / l solution. Then dilute 1m1 of this solution in 1 liter of sterile water) and was then spread on a petri dish and incubated at 30 C overnight before counting.

24 Le biofilm a également été coloré de la manière suivante:
les coupons sont égouttés et plongés dans la solution de coloration durant 10 minutes sélectif pour les protéines de la matrice du biofilm.
Ensuite, les coupons sont plongés dans les différentes solutions de nettoyage 1 et 2 mentionnées ci-dessous pendant deux fois 10 minutes (les solutions de nettoyage sont remplacées entre les deux étrapes de nettoyage).avant de sécher à l'air libre.
Composition de nettoyage:
1. Composition contenant 3 agents différents, à savoir un agent séquestrant, un agent mouillant, et un agent dispersant et un composant enzymatique contenant au moins une laccase, une protéase et une polysaccharidase.
2. Composition contenant deux agents différents à savoir un agent séquestrant et un agent simultanément mouillant et dispersant et un composant enzymatique similaire au point 1 à pH 7 et ensuite à pH 10 Résultats :
Dans 1/3 des boîtes de Petri (4 sur 12) correspondant aux coupons nettoyés avec la composition n 1, des bactéries ont poussé (moyenne>
109 CFU).
Les bactéries ne se sont pas développées sur les boîtes de Pétri correspondant aux coupons nettoyés avec la composition selon l'invention.
La figure 3 illustre les résultats des colorations des biofilms.
La figure 3 A illustre les témoins avant nettoyage tandis que la figure B
illustre les coupons d'acier après nettoyage par la solutions 1 à différents pH et la figure C illustre les coupons d'acier après nettoyage par la composition suivant l'invention.. Comme on peut le voir, les coupons après le nettoyage avec la composition suivant l'invention présentent un aspect plus propre que ceux nettoyés avec la composition n 1, et ne présentent pas de bactéries accrochées à leur surfaces alors que du biofilm est détecté pour 1/3 des coupons nettoyés avec la composition n 1.
D'autres caractéristiques, détails et avantages de 5 l'invention ressortiront de la description donnée ci-après, à titre non limitatif et en faisant référence aux dessins annexés et aux exemples. 24 The biofilm was also colored as follows:
the coupons are drained and immersed in the coloring solution during 10 minutes selective for the proteins of the biofilm matrix.
Then the coupons are plunged into the different solutions of cleaning 1 and 2 mentioned below for two times 10 minutes (Cleaning solutions are replaced between the two brackets of cleaning). before drying in the open air.
Cleaning composition:
1. Composition containing 3 different agents, namely an agent sequestering agent, a wetting agent, and a dispersing agent and a component enzyme containing at least one laccase, a protease and a polysaccharidase.
2. Composition containing two different agents, namely an agent sequestering agent and a simultaneously wetting and dispersing agent and a enzymatic component similar to point 1 at pH 7 and then at pH 10 Results:
In 1/3 of the Petri dishes (4 of 12) corresponding to the coupons cleaned with the composition n 1, bacteria have grown (average>
109 CFU).
Bacteria did not grow on Petri dishes corresponding to the coupons cleaned with the composition according to the invention.
Figure 3 illustrates the results of staining of biofilms.
Figure 3A illustrates the indicators before cleaning while Figure B
illustrates the steel coupons after cleaning by the solutions 1 to different pH and Figure C illustrates the steel coupons after cleaning by the composition of the invention. As can be seen, the coupons after cleaning with the composition according to the invention exhibit a aspect cleaner than those cleaned with the composition n 1, and not have no bacteria on their surfaces while biofilm is detected for 1/3 of the coupons cleaned with the composition n 1.
Other features, details and benefits of The invention will emerge from the description given below, no and with reference to the accompanying drawings and examples.

Claims

1. Composition for the removal of biofilms present on a substrate characterized in that it comprises:
at least one detergent component comprising at least one agent sequestering agent and a simultaneously wetting and dispersing agent, at least one enzymatic component containing at least one protease, at least one laccase and at least one polysaccharidase.

2. Composition according to claim 1, characterized in that the composition is a solution with a pH between approximately 8 and 11.

3. Composition according to claim 1, characterized in that the composition is a solution having a pH of between 6.5 and 7.5, more particularly around 7.

4. Composition according to any one of claims 1 to 3, in said at least one enzymatic component comprises a proportion of protease (s) between 10 and 50%, a proportion in laccase (s) between 5 and 35% and a proportion of polysaccharidase (s) of between 5 and 20% by weight relative to weight of the enzymatic component, an excipient or solvent Conventional possibly being added to reach 100%.

5. Composition according to any one of claims 1 to 4, characterized in that said at least one polysaccharidase includes an alpha-amylase.

6. Composition according to any one of claims 1 to 5õ
characterized in that said at least one detergent component comprises a sequestering agent proportion of between 1 and 10% by weight relative to the total weight of the detergent component.

7. Composition according to any one of claims 1 to 6, comprising a proportion of agent simultaneously wetting and dispersant between 15 and 50% by weight, relative to the weight total detergent component

8. Composition according to any one of claims 1 to 7, in which said agent simultaneously wetting and dispersing is chosen in the group consisting of non-foaming wetting agents to and preferably comprises a C6 to C10 alkylglucoside, preferably C8, from renewable raw materials and optionally an ethoxylated alcohol.

9. Method for the removal of biofilms present on a substrate characterized in that it comprises the following steps of:
(a) provision of a detergent component containing at least a sequestering agent and a simultaneously wetting agent and dispersant and an enzymatic component containing at least one protease, at least one laccase, and at least one polysaccharidase, b) dissolving the detergent component in a phase aqueous, c) dissolving the enzymatic component in the solution formed in step b) to form the solution of said composition according to any one of claims 1 to 8, or b ') dissolving the enzymatic component in a aqueous phase, c ') dissolving the detergent component in the solution formed in step b ') to form the solution of said composition according to any one of claims 1 to 8, d) applying the solution of said composition formed to step c) or c ') on the substrate for a period of time predetermined, in particular between 15 minutes and 4 hours

10. Method according to claim 9, characterized in that the method further comprises a subsequent step of applying a biocide on the substrate.

11. Method according to claim 9 or 10, characterized in that the pH of the solution of said composition is between 8 and 11.

The method of claim 9 or 10, wherein, the pH of the solution of said composition is between 6.5 and 7.5 and in which a basic solution is added after said application d) of the solution of said composition on said substrate during said predetermined period of time, so as to make a jump of pH up to about 8 to 9.

13. Use of a composition according to claims 1 to 8 for the elimination of biofilms present on a substrate.

14. Use according to claim 13, of a composition according to claims 1 to 8 for cleaning floors and surfaces, for cleaning in place or soaking.

15.
Use according to claim 14, wherein said Soaking cleansing is used to clean surgical equipment.

16. Kit for the removal of biofilms on a substrate characterized in that it includes at least one sample of detergent component in solution or in solid form comprising at least a first agent sequestering and at least one agent simultaneously wetting and dispersant, at least one sample of enzymatic component in solution or in solid form containing at least one protease, at least one laccase and at least one polysaccharidase.

Kit according to claim 16, characterized in that the sample of the enzymatic component is an aqueous solution whose pH is between 8 and 10.

Kit according to claim 16 or 17, characterized in that the sample of the detergent component is an aqueous solution the pH is between 8.5 and 14.

Kit according to any one of claims 16 to 18, further comprising a biocide.