CA2714185A1

CA2714185A1 - Method for functionalising the wall of a pore

Info

Publication number: CA2714185A1
Application number: CA2714185A
Authority: CA
Inventors: Aurelie Bouchet; Emeline Descamps; Pascal Mailley; Thierry Livache; Vincent Haguet; Francois Chatelain
Original assignee: Individual
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2008-02-05
Filing date: 2009-02-05
Publication date: 2009-09-11
Also published as: WO2009109727A1; EP2250122A1; US20110174629A1; JP2011511167A; FR2927169A1; FR2927169B1

Abstract

L'Invention est relative à un procédé de fonctionnalisation d'au moins une partie de la paroi d'au moins un pore d'un matériau support caractérisé en ce qu'il comporte : a) mettre en contact le pore avec une solution d'entités électroactivables et positionner deux électrodes dans ladite solution de manière à créer à l'intérieur du pore et lorsqu'un signal électrique est appliqué entre les deux électrodes, une chute de tension apte à générer un dépôt localisé sur ladite paroi. b) appliquer un signal électrique entre les deux électrodes pour activer les entités électroactivables et réaliser ladite fonctionnalisation.The invention relates to a process for functionalizing at least part of the wall of at least one pore of a support material, characterized in that it comprises: a) bringing the pore into contact with a solution of electro-activatable entities and position two electrodes in said solution so as to create inside the pore and when an electrical signal is applied between the two electrodes, a voltage drop capable of generating a deposit located on said wall. b) applying an electrical signal between the two electrodes to activate the electro-activatable entities and perform said functionalization.

Description

PROCEDE DE FONCTIONNALISATION DE LA PAROI D'UN PORE.
La présente invention a pour objet un procédé de fonctionnalisation et plus particulièrement de bio-fonctionnalisation d'au moins une partie de la paroi d'un pore.
Le terme pore (ou canal ou capillaire) désigne toute cavité
débouchante ou non d'un matériau.
La structure en trois dimensions d'un pore ou d'un canal ou d'un capillaire rend difficile sa fonctionnalisation. En effet, des techniques couramment utilisées pour la fonctionnalisation de surfaces planes, comme la io pulvérisation ou bien le "spotting" par exemple, deviennent difficiles, voire impossibles à mettre en pratique pour des pores, canaux ou capillaires, cela étant d'ailleurs d'autant plus vrai que leur dimension diminue.
D'une manière générale, les procédés de fabrication connus ne permettent pas ou permettent très difficilement de fonctionnaliser des pores de manière localisée.
Afin de fonctionnaliser un pore, il est courant d'utiliser des techniques classiques de fonctionnalisation de surface. Les plus courantes utilisent des propriétés d'auto-assemblage des molécules sur support.
La silanisation, tout d'abord, réalise le greffage covalent d'organosilanes à la surface de matériaux comme le verre ou le silicium. Ce procédé consiste le plus souvent à réaliser d'abord une fonctionnalisation par un groupement réactif qui permettra ensuite l'immobilisation de la molécule d'intérêt (Igbal, S. et collaborateurs, "Solid-State nanopore channels with DNA
selectivity", Nature Nanotechnology, 2007, 2: p. 243 et suivantes ; Karnik et collaborateurs, Nano-Letters, 2007, 7(3) : p. 547 et suivantes; Kim, Y. - R.
et collaborateurs, Biosensors & Bioelectronics, 2007. 22: p. 2926 et suivantes;
Wanunu, M. et collaborateurs, Nano-Letters, 2007, 7(6) : p. 1580 et suivantes). Malgré son usage courant, le processus de silanisation reste encore mal maîtrisé et réclame un contrôle des paramètres du matériau qui 3o est critique pour la fiabilité de la modification de surface et la stabilité du dépôt (nature des fonctions de surface, absence de contamination, rugosité
de la surface...).
La formation de monocouches auto-assemblées d'alcanes-thiols (Lee S. B. and Martin C. R., Chemistry of Materials, 2001, 13 (10) : p.
3236 et suivantes; Smuleac V. et collaborateurs, Chemistry of Materials, 2004, 16 (14) : p. 2762 et suivantes; Jagerski et collaborateurs, Nano-Letters, METHOD FOR FUNCTIONALIZING THE WALL OF A PORE
The present invention relates to a method of functionalization and more particularly of bio-functionalization from less part of the wall of a pore.
The term pore (or channel or capillary) refers to any cavity opening or not of a material.
The three-dimensional structure of a pore or channel or of a capillary makes it difficult to function. Indeed, techniques commonly used for the functionalization of flat surfaces, such as spraying or spotting, for example, become difficult, indeed impossible to put into practice for pores, channels or capillaries, this being moreover all the more true as their dimension diminishes.
In general, the known manufacturing processes do not allow or allow very difficult to functionalize pores in a localized way.
In order to functionalize a pore, it is common to use classical techniques of surface functionalization. The most common use self-assembling properties of the supported molecules.
Silanization, firstly, performs covalent grafting organosilanes on the surface of materials such as glass or silicon. This This process most often consists in first carrying out functionalization by a reactive group that will then allow the immobilization of the molecule of interest (Igbal, S. et al., "Solid-State Nanopore Channels with DNA
selectivity ", Nature Nanotechnology, 2007, 2: 243 et seq .;
Collaborators, Nano-Letters, 2007, 7 (3): p. 547 and following; Kim, Y. - R.
and Collaborators, Biosensors & Bioelectronics, 2007. 22: p. 2926 and following;
Wanunu, M. et al., Nano-Letters, 2007, 7 (6): p. 1580 and following). Despite its common use, the silanization process remains still poorly controlled and calls for a control of the parameters of the material 3o is critical for the reliability of the surface modification and the stability of deposit (nature of surface functions, absence of contamination, roughness from the surface ...).
The formation of self-assembled monolayers of alkanes-thiols (Lee SB and Martin CR, Chemistry of Materials, 2001, 13 (10): p.
3236 and following; Smuleac V. et al., Chemistry of Materials, 2004, 16 (14): p. 2762 and following; Jagerski and collaborators, Nano-Letters,

2 2007, 7 (6) .: p. 1609 et suivantes) se base sur la chimisorption des groupements thiol sur différentes surfaces métalliques comme l'or (le plus utilisé), l'argent, le platine, le cuivre ... Cette stratégie a été mise en pratique afin de réaliser la fonctionnalisation des nanopores par des brins d'ADN
thiolés (Harrell, C. C. et collaborateurs, Journal of the American Chemical Society, 2004, 126, p. 15646 et suivantes).
Un des inconvénients majeurs des techniques énoncées précédemment est le fait que la fonctionnalisation concerne le plus souvent non seulement le pore mais également la surface plane réactive qui l'entoure, io partout où il y a un dépôt de solution contenant l'organosilane ou l'alcane-thiol, sans localisation. Dans le cas des alcanes-thiol, le support est nécessairement métallique.
Un article récent de Joakim Nilsson et collaborateurs, intitulé
"Localized Functionalization of Single Nanopores" (Advanced Materials, 2006, 18, p. 427 à 431) décrit l'utilisation d'un nano faisceau d'ions focalisé ou nanoFlB (FIB : "Focused Ion Beam") pour la création d'un pore dans une surface de nitrure de silicium. La gravure du pore, le dépôt d'une couche de dioxyde de silicium sous le faisceau du faisceau FIB et une silanisation conduisent à la création de fonctions réactives en surface permettant l'accrochage localisé de brins d'ADN. Cependant, ce procédé est multi-étapes et nécessite une silanisation préalable du support.
D'autres auteurs ont décrit l'immobilisation de polymères conducteurs sur des surfaces diélectriques par le biais d'une silanisation du support par un organosilane fonctionnalisé par un pyrrole. Des monomères pyrrole sont ensuite ajoutés dans le milieu et la polymérisation est amorcée grâce à un agent oxydant (Simon et collaborateurs, Journal of the American Chemical Society, 1982, 104 : p. 2031 et suivantes; Faverolle et collaborateurs, Chemistry of Materials, 1998. 10 : p. 740 et suivantes).
Il a également été décrit dans la littérature qu'il est possible de fonctionnaliser des pores, dans des membranes de polycarbonate par exemple, en faisant intervenir des entités polymérisables. Il est ainsi possible d'obtenir des tubes de polymère conducteur en réalisant la polymérisation dans un cadre confiné, délimité par des barrières physiques (pore, canal...) (Martin, C. R. et collaborateurs, Journal of the American Chemical Society, 1990, 112, p. 8976 et suivantes, Martin, C. R., Science, 1994, 266 (5193) : p.
1961 et suivantes) ou en présence d'agents externes qui structurent le milieu 2 2007, 7 (6): p. 1609 et seq.) Is based on the chemisorption of thiol groups on different metal surfaces such as gold (the most used), silver, platinum, copper ... This strategy has been implemented convenient in order to achieve the functionalization of nanopores by DNA strands Thiolates (Harrell, CC et al., Journal of the American Chemical Society, 2004, 126, p. 15646 and following).
One of the major drawbacks of the stated techniques previously is the fact that functionalization is more often than not not only the pore but also the reactive plane surface that surrounds it, wherever there is a deposit of solution containing the organosilane or the alkane-thiol, without localization. In the case of alkanes-thiol, the support is necessarily metallic.
A recent article by Joakim Nilsson and colleagues entitled "Localized Functionalization of Single Nanopores" (Advanced Materials, 2006, 18, p. 427 to 431) describes the use of a focused nano beam or nanoFlB (FIB: "Focused Ion Beam") for the creation of a pore in a silicon nitride surface. Engraving the pore, depositing a layer of silicon dioxide under the FIB beam bundle and silanization lead to the creation of reactive functions on the surface localized attachment of DNA strands. However, this process is multi-step and requires prior silanization of the support.
Other authors have described immobilization of polymers conductors on dielectric surfaces through silanization of the supported by an organosilane functionalized with a pyrrole. Monomers pyrrole are then added to the medium and the polymerization is initiated thanks to an oxidizing agent (Simon et al., Journal of the American Chemical Society, 1982, 104: p. 2031 and following; Faverolle and Collaborators, Chemistry of Materials, 1998. 10: p. 740 and following).
It has also been described in the literature that it is possible to functionalize pores, in polycarbonate membranes by example, by involving polymerizable entities. It is so possible to obtain conductive polymer tubes by carrying out the polymerization in a confined space, delimited by physical barriers (pore, canal ...) (Martin, CR et al., Journal of the American Chemical Society, 1990, 112, p. 8976 and following, Martin, CR, Science, 1994, 266 (5193): p.
1961 and following) or in the presence of external agents who structure the environment

3 de polymérisation de manière à ce qu'elle se fasse de façon orientée (Carswell et collaborateurs Journal of the American Chemical Society, 2003, 125 : p. 14793 et suivantes; Qu et collaborateurs, Journal of Polymer Science : Part A : Polymer Chemistry, 2004, 42: p. 3170 et suivantes).
L'application de ces structures est le plus souvent reliée à la connectique, ce qui conduit la plupart des auteurs, le cas échéant, à dissoudre la matrice après création des tubes de polymère. Le pore est ici seulement un "moule", créateur de la forme cylindrique des polymères générés, et n'a pas vocation à
être utilisé comme support actif.
Schématiquement, deux procédés différents sont connus et utilisés : la polymérisation chimique et l'électropolymérisation.
1) Polymérisation chimique (article précité de Martin, C.R., Science, 1994, 266 (5193) : p. 1961 et suivantes; Martin C.R., Advanced Materials, 1991, 3 : p. 457 et suivantes).
Un moyen d'obtenir des nanotubes de polymères est de réaliser une polymérisation dite "chimique" d'un monomère tel que le pyrrole couramment cité. La technique expérimentale consiste à placer une membrane poreuse (polycarbonate ....) entre deux solutions aqueuses : une solution contenant le monomère pyrrole et l'autre solution contenant un agent oxydant (comme FeCI3 par exemple) qui induit la polymérisation aux points de rencontre des deux solutions, c'est-à-dire dans les pores de la membrane.
2) Electropolymérisation (Menon, V. P. et collaborateurs, chemistry of Material, 1996, 8: p. 2382 et suivantes; Demoustier-Champagne et collaborateurs, European Polymer Journal, 1998, 34 (12) : p; 1767 et suivantes).
Il s'agit dans ce cas de déposer premièrement sur un côté
d'une membrane une couche d'adhésion (du chrome par exemple) et de déposer ensuite par-dessus une couche métallique (or). On peut alors procéder à l'électropolymérisation du pyrrole sur cette surface grâce à une cellule électrolytique à trois électrodes.
Ces procédés permettent d'obtenir, lors d'une des étapes, des pores fonctionnalisés par un polymère pour obtenir des structures organisées utilisant le pore comme "moule". Des fonctionnalisations par des biotines ont ainsi été réalisées par Sapp et Collaborateurs (Chemistry of Materials, 1999, 11: p. 1183 et suivantes) en réalisant la polymérisation électrochimique des 3 of polymerization so that it is done in a directed way (Carswell et al. Journal of the American Chemical Society, 2003, 125: p. 14793 and following; Qu et al, Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, 2004, 42: p. 3170 and following).
The application of these structures is most often connected to the connectors, this which leads most authors, if any, to dissolve the matrix after creation of the polymer tubes. The pore is here only a "mold", creator of the cylindrical form of the polymers generated, and is not intended to to be used as active support.
Schematically, two different processes are known and used: chemical polymerization and electropolymerization.
1) Chemical polymerization (aforementioned article by Martin, CR, Science, 1994, 266 (5193): p. 1961 and following; Martin CR, Advanced Materials, 1991, 3: p. 457 and following).
One way to obtain polymer nanotubes is to to carry out a so-called "chemical" polymerization of a monomer such as pyrrole commonly cited. The experimental technique consists in placing a porous membrane (polycarbonate ....) between two aqueous solutions: a solution containing the pyrrole monomer and the other solution containing an agent oxidant (such as FeCl3) which induces polymerization at the encounter of the two solutions, that is to say in the pores of the membrane.
2) Electropolymerization (Menon, VP and collaborators, Chemistry of Material, 1996, 8: p. 2382 and following; Demoustier-Champagne et al., European Polymer Journal, 1998, 34 (12): p; 1767 and following).
In this case it is a question of firstly laying on one side a membrane adhesion layer (eg chromium) and then deposit over a metal layer (gold). We can then proceed to the electropolymerization of pyrrole on this surface thanks to a electrolytic cell with three electrodes.
These methods make it possible to obtain, during one of the steps, pores functionalized by a polymer to obtain organized structures using the pore as "mold". Functionalisations with biotins have thus been carried out by Sapp and Collaborators (Chemistry of Materials, 1999, 11: p. 1183 et seq.) By carrying out the electrochemical polymerization of

4 monomères thiophène et pyrrole porteurs d'une fonction amine permettant le greffage d'un dérivé de la biotine.
On notera par ailleurs que des monomères pyrrole porteurs de biomolécules sont connus en tant que tels (notamment Demandes de brevet français FR 2 703 359 et FR 2 720 832).
Les Demandes de Brevet FR 2 787 582 et FR 2 784 466 concernent une technique classique d'électro-polymérisation selon laquelle une électrode est disposée au fond d'une microcuvette tronconique non débouchante et une autre électrode dans un électrolyte, dans une position io non spécifiée. Il n'y a pas dans ce cas de fonctionnalisation de la surface de la microcuvette, mais seulement de l'électrode située au fond de celle-ci. En d'autres termes, cette technique connue ne permet de réaliser de dépôt que sur une des électrodes.
L'invention concerne un procédé permettant de réaliser une fonctionnalisation d'un pore localisée à sa surface, tout en simplifiant le procédé. L'idée de base de l'invention est de générer dans le pore un gradient de tension électrique apte à permettre un dépôt sur les parois du pore.
L'invention concerne ainsi un procédé de fonctionnalisation d'au moins une partie de la paroi d'au moins un pore d'un matériau support caractérisé en ce qu'il comporte :
a) mettre en contact le pore avec une solution d'entités électroactivables et positionner deux électrodes dans ladite solution, de part et d'autre du pore, de manière à créer à l'intérieur du pore et lorsqu'un signal électrique est appliqué entre les deux électrodes, une chute de tension, notamment supérieure à 1000 V/m, apte à générer un dépôt localisé sur ladite paroi.
b) appliquer un signal électrique, différence de potentiel ou courant, entre les deux électrodes pour réaliser ladite fonctionnalisation.
En générant un gradient de tension élevé entre les électrodes à l'intérieur du pore, on obtient un dépôt sur la paroi du ou des pores, et aussi de manière concommitante un dépôt sur l'électrode de polarisation anodique comme observé lors d'un dépôt par électro-polymérisation classique.
Dans le cas d'un pore non débouchant, une électrode est disposée au fond d'une cavité non débouchante ou au fond du pore. L'autre électrode est disposée à l'extrémité du pore (d = 0) ou à distance de l'extrémité du pore (d > 0), la chute de tension dans le pore étant suffisante pour permettre un dépôt sur les parois.
Dans le cas d'un pore débouchant, les électrodes sont disposées aux extrémités du pore (d = 0) et/ou à distance de cette extrémité 4 thiophene and pyrrole monomers carrying an amine function allowing the grafting of a derivative of biotin.
It should also be noted that pyrrole monomers carrying biomolecules are known as such (in particular Demands for French patent FR 2 703 359 and FR 2 720 832).
Patent Applications FR 2 787 582 and FR 2 784 466 relate to a conventional technique of electropolymerization according to which an electrode is disposed at the bottom of a non-frustoconical microcuvette outlet and another electrode in an electrolyte, in a position io not specified. In this case, there is no functionalization of the surface of the microcuvette, but only the electrode located at the bottom of it. In in other words, this known technique only makes it possible to deposit on one of the electrodes.
The invention relates to a method for carrying out a functionalization of a pore located on its surface, while simplifying the process. The basic idea of the invention is to generate in the pore a gradient electrical voltage capable of allowing a deposit on the walls of the pore.
The invention thus relates to a method of functionalization at least a part of the wall of at least one pore of a support material characterized in that it comprises:
a) bringing the pore into contact with a solution of entities electro-activatable and position two electrodes in said solution, from and other of the pore, so as to create inside the pore and when signal electric is applied between the two electrodes, a voltage drop, especially greater than 1000 V / m, capable of generating a deposit located on said wall.
b) apply an electrical signal, potential difference or current, between the two electrodes to perform said functionalization.
Generating a high voltage gradient between the electrodes inside the pore, a deposit is obtained on the wall of the pore (s), and as well concomitantly a deposit on the anodic polarization electrode as observed during a conventional electropolymerization deposition.
In the case of a non-emerging pore, an electrode is arranged at the bottom of a non-emergent cavity or at the bottom of the pore. The other electrode is disposed at the end of the pore (d = 0) or at a distance of the end of the pore (d> 0), the voltage drop in the pore being sufficient to allow a deposit on the walls.
In the case of a pore opening, the electrodes are arranged at the ends of the pore (d = 0) and / or at a distance from this end

5 (d > 0), la chute de tension dans le pore étant suffisante pour permettre un dépôt sur sa paroi.
Par exemple, le champ peut atteindre 106 V/m, voire plus.
Le signal électrique peut être constant ou bien modulé en fonction du temps (périodique ou non, pulsé, modulé en amplitude ou en io fréquence, en escalier, en rampe, etc...).
Le support n'est pas nécessairement conducteur. Nul besoin de tapisser l'intérieur des pores d'une couche conductrice comme décrit pour l'électropolymérisation, ce qui simplifie grandement la démarche expérimentale. L'électropolymérisation est réalisée "à distance" avec des électrodes situées de part et d'autre de la surface à fonctionnaliser. On comprendra que l'expression "de part et d'autre du pore" inclut le cas où d =
0. Le support, constitué de matériau organique ou inorganique, peut être de nature isolante, semi-conductrice ou conductrice.
L'électropolymérisation à distance ne nécessite pas la présence d'un agent chimique oxydant.
Le procédé d'électropolymérisation à distance est réalisable en une seule étape de manipulation.
La formation préférentielle du polymère sur tout ou partie de la paroi du pore peut s'expliquer par le fait que, un signal électrique étant appliqué de part et d'autre du pore, la chute de tension qu'il produit est principalement localisée à l'intérieur du pore d'où un fort gradient de potentiel induisant une formation préférentielle du polymère.
Le procédé peut comporter au moins une itération de a et de b avec une deuxième solution d'entités électroactivables. Ces entités peuvent être les mêmes ou avantageusement des entités différentes, ce qui permet notamment de disposer des couches déposées les unes sur les autres ou côte à côte.
Selon une première variante, le pore est ouvert à ses deux extrémités et une solution est placée dans deux compartiments dans chacun desquels débouche une extrémité du pore, au moins un des deux compartiments contenant lesdites entités électroactivables. 5 (d> 0), the voltage drop in the pore being sufficient to allow a deposit on its wall.
For example, the field can reach 106 V / m or more.
The electrical signal can be constant or modulated in function of time (periodic or not, pulsed, modulated in amplitude or in frequency, stairway, ramp, etc ...).
The support is not necessarily conductive. No need to line the interior of the pores with a conductive layer as described for electropolymerization, which greatly simplifies the process Experimental. Electropolymerization is carried out "remotely" with electrodes located on either side of the surface to be functionalized. We will understand that the expression "on either side of the pore" includes the case where d =
0. The support, consisting of organic or inorganic material, may be insulating nature, semiconductor or conductive.
Remote electropolymerization does not require the presence of an oxidizing chemical agent.
Remote electropolymerization process is feasible in a single handling step.
The preferential formation of the polymer on all or part of the wall of the pore can be explained by the fact that, an electrical signal being applied on either side of the pore, the voltage drop that it produces is mainly located inside the pore, hence a strong gradient of potential inducing preferential formation of the polymer.
The method may comprise at least one iteration of a and b with a second solution of electro-activatable entities. These entities may be the same or advantageously different entities, which allows in particular to have the layers deposited on one another or side by side.
According to a first variant, the pore is open to both ends and a solution is placed in two compartments in each from which one end of the pore opens, at least one of the two compartments containing said electro-activatable entities.

6 Selon une deuxième variante, le pore présente une seule extrémité débouchante et une des deux électrodes est placée au fond du pore, l'autre électrode étant placée dans un compartiment en communication avec l'extrémité débouchante du pore.
Après b, il peut être prévu un rinçage.
Le matériau support peut être à base de silicium.
Les entités électroactivables peuvent être des monomères électropolymérisables, notamment des monomères conducteurs pi-conjugués, de préférence un pyrrole, ou bien être porteuses de fonctions io électrogreffables, notamment les groupements de diazonium, ou bien encore être choisies parmi les métaux, les oxydes métalliques, les particules catalytiques, les sels et les complexes métalliques ou être constituées par une peinture électrophorétique.
La solution d'entités électroactivables peut comporter des ligands.
La solution d'entités électroactivables peut comporter un mélange d'entités électroactivables, notamment un monomère électropolymérisable et desdites entités électroactivables couplées à des ligands, par exemple greffées avec un oligonucléotide.
En particulier, la solution peut présenter une sonde oligonucléotidique (pyrrole-oligonucléotide), ou plus généralement du pyrrole couplé à une biomolécule.
La solution d'entités électroactivables peut inclure des ions dopants d'intérêt, notamment l'héparine et/ou la chondroitine..
Le matériau support peut être à base de silicium.
Le signal électrique peut être une tension comprise entre 10 mV et 500 V et de préférence entre 100 mV et 10 V. Le critère à respecter est que le champ à l'intérieur du pore soit suffisant pour générer un dépôt sur sa paroi. La différence de tension peut être appliquée pendant une durée comprise entre 10 s et 100 s et plus particulièrement entre 10 ms et 100 s, par exemple sous forme d'une d'impulsion. Le temps d'application de la tension détermine l'épaisseur du dépôt.
La concentration en entités électroactivables peut s'étendre dans une large gamme, à savoir entre 1 nM et 500 mM.
Le procédé peut présenter une étape de détachement des entités électroactivables du support, par exemple par destruction de ce WO 2009/109726 According to a second variant, the pore has only one end and one of the two electrodes is placed at the bottom of the pore, the other electrode being placed in a compartment in communication with the open end of the pore.
After b, it can be provided a rinse.
The support material may be silicon-based.
Electro-activatable entities can be monomers electropolymerizable materials, in particular lead conducting monomers conjugates, preferably a pyrrole, or carry functions electrografting, in particular the diazonium groups, or else be chosen from metals, metal oxides, particles catalysts, salts and metal complexes or be constituted by an electrophoretic painting.
The electro-activatable entity solution may include ligands.
The electro-activatable entity solution may include a mixture of electro-activatable entities, in particular a monomer electropolymerizable and electro-activatable entities coupled with ligands, for example grafted with an oligonucleotide.
In particular, the solution may have a probe oligonucleotide (pyrrole-oligonucleotide), or more generally pyrrole coupled to a biomolecule.
The electro-activatable entity solution can include ions dopants of interest, including heparin and / or chondroitin.
The support material may be silicon-based.
The electrical signal can be a voltage between 10 mV and 500 V and preferably between 100 mV and 10 V. The criterion to be respected is that the field inside the pore is enough to generate a deposit sure its wall. The voltage difference can be applied for a duration between 10 s and 100 s and more particularly between 10 ms and 100 s, for example in the form of a pulse. The application time of the voltage determines the thickness of the deposit.
The concentration of electro-activatable entities can extend in a wide range, namely between 1 nM and 500 mM.
The method may have a detachment step of electro-activatable entities of the support, for example by destruction of this WO 2009/10972

7 PCT/FR2009/000133 dernier ou sous l'action d'ultrasons. Le support peut présenter au moins une région de fonctionnalisation évasée (comportant ou non des paliers) qui prolonge la paroi d'un pore.
Les entités électroactivables peuvent comporter des molécules sondes, et le procédé peut comporter une étape d'association par reconnaissance notamment d'hybridation avec des molécules cibles complémentaires.
Le procédé peut ensuite comporter une étape de dénaturation de ladite association par reconnaissance, éventuellement suivie d'une étape io de nouvelle association par reconnaissance, notamment de réhybridation.
Le procédé permet ainsi l'association par affinité d'une entité
d'intérêt et permet la fabrication d'assemblages moléculaires.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture de la description ci-après, en liaison avec les dessins dans lesquels :
- la figure 1 est un schéma de principe illustrant le procédé
selon l'invention, - les figures 2a à 2c représentent une cellule destinée à
recevoir une puce présentant un pore (montage a), - les figures 3 et 4 illustrent un montage adopté à une puce multi-pores, la figure 4 en étant un détail relatif au pore Pl dans les conditions d'expérience, - la figure 5 illustre le format du test de fluorescence utilisé
pour valider la fonctionnalisation des pores - les figures 6, 7, 8a et 8b représentent différents profils de pores mis en oeuvre dans les exemples.
- et les figures 9a et 9b représentent deux exemples de profils de pores non débouchants.
La présente invention est relative à un procédé de fonctionnalisation de la surface d'un pore par une entité organique ou inorganique, en particulier par un polymère, qui a été générée électriquement grâce à l'application d'un signal électrique, notamment une différence de potentiel électrique de part et d'autre du pore. Il permet de réaliser une fonctionnalisation de pores ou de canaux quelle que soit leur taille (par exemple de diamètre compris entre 1 nm et 5 mm), en particulier des pores ou des canaux de dimension micrométrique et/ou nanométrique, par : 7 PCT / FR2009 / 000133 last or under the action of ultrasound. The support may have at least one Flared functionalization region (with or without bearings) extends the wall of a pore.
Electro-activatable entities may include molecules, and the method may comprise a step of association by recognition including hybridization with target molecules complementary.
The process may then comprise a denaturing step of said association by recognition, possibly followed by a step io new association by recognition, including rehybridization.
The method thus allows the affinity association of an entity of interest and allows the manufacture of molecular assemblies.
Other features and advantages of the invention will appear better on reading the description below, in connection with the drawings in which:
FIG. 1 is a block diagram illustrating the method according to the invention, FIGS. 2a to 2c represent a cell intended to receive a chip with a pore (assembly a), FIGS. 3 and 4 illustrate an arrangement adopted on a chip multi-pores, FIG. 4 being a detail relating to the pore P1 in the terms experience, FIG. 5 illustrates the format of the fluorescence test used to validate the functionalization of the pores FIGS. 6, 7, 8a and 8b represent different profiles of pores implemented in the examples.
and FIGS. 9a and 9b show two examples of profiles non-emerging pores.
The present invention relates to a method of functionalization of the surface of a pore by an organic entity or inorganic, in particular by a polymer, which has been electrically generated thanks to the application of an electrical signal, in particular a difference of electrical potential on both sides of the pore. It allows to realize a functionalization of pores or channels regardless of their size (by example of diameter between 1 nm and 5 mm), in particular pores or channels of micrometric and / or nanometric size, by:

8 - des groupements actifs permettant des interactions de faible énergie comme par exemple :
. des charges de surface .des groupements de reconnaissance moléculaire ou biomoléculaire, tels que par exemple des biomolécules, des groupements chimiques réactifs ou encore des chélateurs d'ions.
- des entités organiques ou inorganiques notamment dans le but de réduire le diamètre d'ouverture du pore.
On entend par le terme "pore" ou "canal" ou "capillaire" toute io cavité, débouchante ou non, se trouvant dans un matériau. Leur distribution spatiale sur le support peut être définie (cas d'une membrane usinée par exemple) ou statistique (cas typique d'un fritté). L'invention concerne toute taille de pore.
Un pore 1 (figure 1) est placé entre deux compartiments 3 et 4 étanches contenant une solution 2 d'entités électroactivables qui baigne également le pore 1. Une différence de potentiel par exemple 2 V est appliquée par une source de tension 5 entre deux électrodes 6 et 7 disposées de part et d'autre du pore 1, à une distance de quelques millimètres l'une de l'autre.
L'entité électroactivable peut être choisie notamment parmi :
- Des monomères électropolymérisables tels les pyrroles, les thiophènes, les indoles, les anilines, les azines, les phénylènevinylènes, les phénylènes, les pyrènes, les furanes, les sélénophènes, les pyrridazines, les carbazoles, les acrylates, les méthacrylates et leurs dérivés. De préférence, le motif électropolymérisable est un pyrrole. Ce monomère est facilement fonctionnalisable par une entité d'intérêt. De plus, le polypyrrole est un polymère biocompatible, stable à l'air et en solution à pH physiologique, ce qui constitue un atout dans le cadre d'une application dans le domaine des biocapteurs, - Des dérivés porteurs de fonctions électrogreffables telles les groupements diazonium, - Les métaux et oxydes métalliques, par exemple l'oxyde d'iridium, les particules catalytiques, les sels et les complexes métalliques - Les peintures électrophorétiques.
Le support poreux peut être de nature organique et/ou inorganique et indifféremment conducteur, semi-conducteur ou isolant 8 active groups allowing weak interactions energy like for example:
. surface charges molecular recognition groups or biomolecular, such as for example biomolecules, clusters reactive chemicals or ion chelators.
organic or inorganic entities, especially in the to reduce the pore opening diameter.
The term "pore" or "canal" or "capillary" is understood to mean any cavity, open or not, being in a material. Their distribution space on the support can be defined (case of a membrane machined by example) or statistical (typical case of a sintered). The invention relates to pore size.
A pore 1 (FIG. 1) is placed between two compartments 3 and 4 watertight containing a solution 2 of electro-activatable entities that bathes also the pore 1. A potential difference for example 2 V is applied by a voltage source 5 between two electrodes 6 and 7 arranged on either side of the pore 1, at a distance of a few millimeters one of the other.
The electro-activatable entity may be chosen in particular from:
Electropolymerizable monomers such as pyrroles, thiophenes, indoles, anilines, azines, phenylenevinylenes, phenylenes, pyrenes, furans, selenophenes, pyrridazines, carbazoles, acrylates, methacrylates and their derivatives. Preferably, the Electropolymerizable pattern is a pyrrole. This monomer is easily functionalizable by an entity of interest. In addition, polypyrrole is a biocompatible polymer, stable in air and in solution at physiological pH, this which is an asset in the context of an application in the field of biosensors, Derivatives carrying electrograftable functions such as diazonium groups, - Metals and metal oxides, for example oxide of iridium, catalytic particles, salts and metal complexes - Electrophoretic paints.
The porous support may be organic in nature and / or inorganic and indifferently conductive, semiconducting or insulating

9 électrique. On utilise de préférence des matériaux semi-conducteurs comme le silicium ou ses dérivés oxyde et nitrure.
Dans l'exemple I ci-après, le monomère utilisé est le pyrrole.
En effet, le polypyrrole est un polymère qui présente l'avantage d'être biocompatible et est donc très intéressant pour élaborer des biocapteurs. Il possède également l'atout d'être stable dans les conditions de manipulation des tests biochimiques (pH physiologique, tampons aqueux, présence d'oxygène ...). Il s'agit également d'un polymère conducteur qui présente un caractère hydrophile permettant son utilisation dans des systèmes io biologiques. De plus chimiquement, la synthèse de conjugués pyrrole-biomolécule est très bien maîtrisée et se fait avec un bon rendement.
Le polypyrrole, le polycarbazole, la polyaniline, le PEDOT, le polyindole, et le polythiophène appartiennent au groupe des polymères conducteurs pi-conjugués.
II est connu que les monomères correspondants sont électropolymérisables, à savoir qu'ils conduisent à la formation d'un polymère sous l'effet de l'application d'un potentiel anodique à la surface d'une électrode. Ces entités se comportent donc de la même manière en tenant compte de conditions de solvant et d'oxydation qui ne sont pas identiques d'une entité à une autre.
POLYPYRROLE - MISE EN OEUVRE DES EXEMPLES
1. - Matériel A) Réactifs et consommables :
Le pyrrole est aliquoté à une concentration de 1 M en solvant acétonitrile puis conservé à -20 C. Le pyrrole porteur d'un oligonucléotide a été préparé selon le protocole décrit dans la Demande de Brevet FR 2 703 359.
Les séquences ADN utilisées sont les suivantes :
Py-sondeZip6: Py5'-(T)1o- GAC CGG TAT GCG ACC TGG TAT GCG3' (Py-SEQ ID NO. 1) . Cible-Zip6-bio: biotine-5' CGC ATA CCA GGT CGC ATA CCG GTCY
(biotine-SEQ ID NO. 2) Les puces utilisées sont des membranes d'oxyde de silicium ou de nitrure de silicium. Elles comportent neuf pores de taille micrométrique répartis sur une surface de 2x2 cm2.

B) Tampons utilisés (donnés à titre indicatif) :
. Tampon d'électropolymérisation : 6g/L Na2HPO4/NaH2PO4, 2,9 g/L NaCI, 10 % v/v glycérol, 2% v/v acétonitrile (v/v = en volume).
. Tampon d'hybridation: 0,02 M Na2HPO4/NaH2PO4,1,1 M
5 NaCI, 5,4 mM KCI, 4% v/v 50X Denhardt , 0,2% v/v ADN de sperme de saumon, 0,3% v/v Tween 20 à pH 7,4 . Tampon de rinçage : PBS 5 comprimés/L, NaCI 23.375 g/L, Tween 20 0.15% v/v.
C) Montages expérimentaux pour l'électropolymérisation à
1o distance :
Deux montages expérimentaux ont été validés.
a) Cellule d'électropolymérisation (voir figure 2a à 2c) :
Le matériau de cette cellule C est du "Delrin" (marque déposée) polyoxyméthylène dit "Delrin POM". La cellule est scindée en deux compartiments étanches 3 et 4 en introduisant dans son réceptacle rectangulaire 34 une pièce support 8 comportant un ou plusieurs pores 1. Des fils de platine par exemple peuvent être introduits dans chacun des compartiments 3 et 4 à travers les ouvertures 91 et 92 du couvercle 9 pour former les électrodes. 93 et 94 désignent les ouvertures de fixation du couvercle 9 sur la cellule C, et 95 et 96 les trous de fixation des vis sur la cellule C.
b) Montage sur puce "multipores"
Si on souhaite fonctionnaliser de manière différente chacun des pores d'une puce, il convient de travailler en parallèle avec une source de tension multivoies ou plusieurs sources de tension monovoie, par exemple un potentiostat multi-voies, ou plusieurs potentiostats mono-voie.
Dans le montage décrit en relation avec la figure 3, la puce 10 présente 9 pores P1..... Pg. Chaque pore est isolé entre deux compartiments étanches (31, 41 ; 32, 42 ; .... 39, 49). Autrement dit, il est possible de mettre chacun des neuf pores Pl, P2...... P9 qui ont ou non le même diamètre en contact avec une solution différente Si, S2...... S9 d'entités électroactivables.
Chacun de ces compartiments est équipé d'électrodes auxquelles est appliquée une différence de potentiel électrique donnée et qui sont disposées à une distance d de l'extrémité de chaque pore. La distance d peut être ou non la même pour les deux électrodes d'un même pore. Elle peut être différente d'un pore à l'autre selon les nécessités de la fonctionnalisation.
Il y a ainsi neuf électrodes de travail Et,, Et2,... Et3... Et9 qui sont reliées ou non au même potentiostat (ou plus généralement à la même source de tension) et neuf contre-électrodes qui peuvent être couplés à des électrodes de référence Eai, Ea2,..... Ea9. Les solutions S1, S2,..... S9 peuvent être ou non les mêmes. Un potentiostat PT "multi-voies"permet d'appliquer ces tensions simultanément (même si les valeurs en sont différentes).
Chaque pore (Pl, ... P9) d'une puce 10 est positionné entre deux compartiments étanches 31, 41,... ; 39, 49 qui ont ici un volume de 10 l.
Le montage comporte un ou deux circuits imprimés 21, 22 (Fig. 4) ayant une électrode circulaire intégrée 23, 28 reliable à un potentiostat extérieur. Dans au moins une des électrodes sont percés deux trous 26, 27 permettant d'introduire et d'évacuer du liquide via des capillaires en polytétrafluoroéthylène. Deux compartiments étanches 31 et 41 sont créés entre la puce 10 et les circuits imprimés 21 et 22 grâce à des joints toriques 24 et 25 (Figure 4). Afin de réaliser l'électropolymérisation de manière à
obtenir un dépôt localisé 30 sur les parois des pores, on utilise :
- soit les électrodes intégrées aux circuits imprimés - soit des électrodes (fils métalliques non représentés) introduites dans des capillaires de part et d'autre du pore, - soit des électrodes trempant directement dans un compartiment. Dans ce cas, une carte plastique (non représentée) est utilisée à la place du circuit imprimé.
II) MISE EN OEUVRE
A) Préparation du substrat :
a) Nettoyage :
Dans un premier temps, la puce subit un nettoyage (67%
acide sulfurique, 33% peroxyde d'hydrogène v/v) en salle blanche afin d'éliminer tout contaminant d'origine organique. La puce est trempée 10 min dans la solution puis rincée grâce à une circulation d'eau jusqu'à obtenir une 3o résistivité de 9 MQ.m. La puce est ensuite séchée dans une étuve à 180 C
pendant 10 min. Elle peut ensuite être stockée à température ambiante.
b) Augmentation de l'hydrophilie de la surface grâce à
l'application d'un plasma oxygène :
Cette étape permet de rendre la surface hydrophile, ce qui est avantageux dans l'objectif de remplir le pore, quel que soit sa taille, par une solution majoritairement aqueuse. La puce est ainsi placée pendant 45 secondes dans un plasma 02 à une puissance de 100 W.
c) Dépôt de polypyrrole :
Une solution de polymérisation contenant 20 mM de pyrrole et 5 M de py-sondeZip6 en Tampon d'électropolymérisation a été utilisée pour réaliser des dépôts de polymère dans les pores.
Les deux montages (a et b ci-dessus) ont été utilisés.
Dans chaque cas, la puce comprenant des pores débouchants est introduite de manière à se trouver entre deux 1o compartiments. La solution de polymérisation est introduite dans les deux compartiments. Une électrode est insérée dans chaque compartiment et une différence de potentiel égale à 2 V est appliquée. On notera qu'en pratique, on peut utiliser une tension comprise entre 10 mV et 500 V et de préférence entre 100 mV et 10V selon la dimension des pores, le but poursuivi étant l'obtention d'un champ suffisamment élevé à l'intérieur du pore pour que le dépôt ait lieu sur sa paroi. Le suivi du déroulement du dépôt se fait en traçant la courbe de l'évolution de l'intensité du courant en fonction du temps :
l'allure de cette courbe (présence ou absence de signal électrique) permet de voir si le liquide a pénétré à l'intérieur du pore (contact électrique) ou non (absence de signal électrique). La puce est ensuite retirée du montage puis rincée à
l'eau, séchée à l'air comprimé et conservée sèche à 4 C.
d) Vérification de la fonctionnalisation par microscopie de fluorescence Afin de vérifier la formation d'un dépôt de polypyrrole, on utilise la microscopie de fluorescence. Le format du test utilisé est illustré
à la figure 5. Il est réalisé en déposant des gouttes de 15 I de liquide sur un pore.
Le pore est tout d'abord saturé en Tampon d'hybridation (5 min à température ambiante). Puis une goutte de cible biotinylée à 100 nM en Tampon d'hybridation est ajoutée (15 min, température ambiante). La puce est ensuite 3o rincée abondamment avec le Tampon de rinçage. Chaque pore est ensuite incubé dans une solution de streptavidine-phycoérythrine (SAPE) à 10%
(v/v = en volume) en Tampon de rinçage (15 min. à température ambiante).
La puce est ensuite placée entre lame et lamelle pour être observée en microscopie de fluorescence à 530 nm, longueur d'onde d'émission de la phycoérythrine.

BIO FONCTIONNALISATION D'UN PORE PAR DES
ACIDES NUCLEIQUES
EXEMPLE I - (Montage a) i) Création d'un dépôt de polypyrrole Une puce multi-pores comportant des pores de rapport de forme variables (rapport de forme Rf = diamètre du pore / épaisseur de la membrane dans laquelle il est percé) et ayant subi un traitement plasma est introduite dans la cellule bi-compartiments "Delrin POM" décrite ci-dessus. La solution de polymérisation est introduite successivement dans les deux 1o compartiments de la cellule. Elle est constituée de 20 mM de pyrrole et 5 M
de pyrrole-sonde Zip6 (py-sonde Zip 6) en tampon d'électropolymérisation.
Puis, deux fils de platine sont introduits, un de chaque côté de la puce. Le premier est relié à la contre-électrode couplée à l'électrode de référence du potentiostat et le second à l'électrode de travail. Un potentiel de 2 V est appliqué pendant une durée donnée (entre 100 ms et 1 s) entre les deux électrodes (électrode de travail et contre-électrode). La puce est ensuite retirée de la cellule, abondamment rincée à l'eau puis séchée à l'air comprimé
et stockée à 4 C.
L'efficacité de la fonctionnalisation est vérifiée par microscopie de fluorescence selon le procédé décrit ci-dessus.
ii) Résultats La manipulation a été réalisée avec des pores présentant différents rapports de forme :
. Rf = 35: pore de 70 m de diamètre dans une membrane de 2 gm d'épaisseur et de 500 .xm de côté (voir figure 6).
On observe une émission de fluorescence sous la forme d'un cercle lumineux présent de chaque côté de la puce. Ses dimensions correspondent à celles du contour du pore, ce qui permet de déduire que la technique de fonctionnalisation est efficace et permet un dépôt de polymère localisé sur les parois d'un pore de taille micrométrique.
Les clichés de microscopie électronique à balayage montrent une fine couche de dépôt - de l'ordre de 30 nm - sur le contour d'un pore. Ce dépôt est absent d'un pore non fonctionnalisé.
. Rf = 1 avec un pore circulaire de 18 m de diamètre dans une membrane de 20 m d'épaisseur : cas d'un pore percé dans une membrane carrée de 50 m de côté et de 20 m d'épaisseur. Le dépôt est réalisé à une tension de 2 V appliquée pendant 100 millisecondes (figure 7).
La réalisation du test de fluorescence exposé ci-dessus conduit à la présence d'anneaux lumineux de chaque côté du pore qui certifie de la fonctionnalisation efficace et localisée du pore par un polymère porteur d'oligonucléotides.
. Rf = 0,25 pore de diamètre 2 pm dans une membrane de 8 m d'épaisseur. Le pore d'une taille de 2 m se trouve au fond d'un cône de plus grand diamètre égal à 10 m. L'environnement du pore est dit de type entonnoir (figures 8a et 8b).
Les clichés de microscopie de fluorescence montrent que la paroi du pore a été fonctionnalisée de manière localisée, ainsi que le contour du haut du cône (de dimension 10 m).
Cela constitue un résultat qui laisse la possibilité de contrôler le lieu de la fonctionnalisation selon la morphologie de l'environnement du pore.
EXEMPLE Il (montage b) :
i) Création d'un dépôt de polypyrrole Une puce multi-pores comportant des pores de rapports de forme Rf variables et ayant subi un traitement plasma 02 est placée au sein du montage b décrit ci-dessus (figures 3 et 4). La solution de polymérisation est introduite successivement dans les deux compartiments. Elle est constituée de 20 mM de pyrrole et 5 M de pyrrole-sonde-Zip6 en Tampon d'électropolymérisation. Puis, deux électrodes sont positionnées de chaque côté de la puce. La première est reliée aux électrodes auxiliaires et de référence du potentiostat et la seconde à l'électrode de travail. Un potentiel de 2V est appliqué pendant 100 ms entre les deux électrodes. La puce est ensuite retirée de la cellule, abondamment rincée à l'eau puis séchée à l'air comprimé et stockée à 4 C.
ii) Résultats L'efficacité de la fonctionnalisation a été vérifiée par microscopie de fluorescence selon le procédé décrit ci-dessus. Chacun des 9 pores de la puce multi-pores peut être étudié indépendamment, éventuellement avec une fonctionnalisation spécifique pour chaque pore.
. Rf = 1 pore de 18 m de diamètre dans une membrane de 18 m d'épaisseur.

La microscopie à fluorescence confirme que le procédé de fonctionnalisation de surface fonctionne également pour toutes les valeurs précitées de Rf en utilisant ce montage (présence d'un anneau fluorescent).
Des témoins ont été réalisés pour établir la spécificité de 5 l'interaction biochimique aboutissant à la fonctionnalisation caractérisée par l'émission de fluorescence. Ces contrôles ont été réalisés sur les pores de 18.tm de diamètre (Rf= 1) d'une puce multi-pores :
a) Potentiel électrique Pour ce faire, 15 l d'une solution de polymérisation lo composée de 20 mM de pyrrole et 5 .iM de pyrrole-sonde-Zip6 en tampon d'électropolymérisation sont déposés sur un pore et laissés en contact avec la surface pendant 5 min. La puce est ensuite rincée à l'eau et séchée à l'air comprimé (procédure identique à celle réalisée après une électropolymérisation à distance). La puce est conservée à 4 C puis elle subit 15 la procédure du test de fluorescence décrit précédemment. Aucune fluorescence n'a pu être observée, preuve que l'application d'un potentiel électrique est nécessaire pour la fonctionnalisation du pore.
b) Adsorption de conjugué pyrrole-oligonucléotide Un autre contrôle a été réalisé dans le but d'étudier si l'application d'un potentiel favorise l'adsorption d'ADN à la surface du support.
Pour ce faire, une solution de py-SondeZip6 à 5 M en Tampon d'électropolymérisation a été utilisée (pas de pyrrole dans ce cas), puis une différence de potentiel électrique a été appliquée selon le même protocole que celui utilisé pour le copolymère pyrrole/py-SondeZip6. L'absence de fluorescence montre que dans les conditions de travail, l'adsorption non spécifique de conjugué pyrrole-oligonucléotide est négligeable.
c) Adsorption non spécifique lors de la procédure de révélation i) Sur un pore non fonctionnalisé et n'ayant pas été en contact 3o avec la solution de polymérisation, on réalise la procédure d'hybridation et de révélation décrite précédemment, la première étape étant la saturation du pore en Tampon d'hybridation. Il n'y a pas, dans les conditions opératoires, de fluorescence parasite liée à l'adsorption non spécifique de la cible ADN
biotinylée.
ii) Sur un pore non fonctionnalisé et n'ayant pas été en contact avec la solution de polymérisation, on réalise la procédure de révélation décrite précédemment, la première étape étant la saturation du pore en tampon d'hybridation suivie par une incubation de 15 minutes en tampon d'hybridation seul (sans la cible correspondante). La SAPE diluée en tampon de rinçage est ensuite ajoutée selon le protocole décrit ci-dessus (II.
A, d). Le cliché de microscopie de fluorescence confirme que dans les conditions opératoires testées, la SAPE ne s'adsorbe pas sur la surface du support.
d) Dénaturation de l'hybridation Sur un pore fonctionnalisé et ayant subi la procédure de 1o révélation en fluorescence décrite précédemment, on effectue un rinçage avec une solution de NaOH à 0,2 M pendant 2 s puis un rinçage abondant à
l'eau et un séchage à l'air comprimé. On observe ensuite le pore en microscopie de fluorescence à la longueur d'onde habituelle et avec les mêmes paramètres de sensibilité de la caméra (luminosité, contraste). On observe la disparition de la fluorescence après dénaturation de l'hybridation.
Cela montre la spécificité de l'émission de fluorescence observée dans le cas d'une hybridation complémentaire.
e) Fluorescence après réhybridation La fluorescence d'un pore ayant subi une dénaturation via l'ajout de NaOH (d) réapparaît après réhybridation des sondes ADN par leur cible complémentaire. La démarche expérimentale suivie pour cette deuxième hybridation et sa révélation en fluorescence est exactement la même que celle précédemment décrite pour l'hybridation.
EXEMPLE III : FONCTIONNALISATION PAR DE L'OXYDE
D'IRIDIUM :
i) Création d'un dépôt d'oxyde d'iridium Une solution d'oxalate d'iridium est préparée selon le protocole suivant (décrit dans l'article de A. M. Marsouk, Analytical Chemistry, 2003, 75 : p.1258 et suivantes) : 75 mg d'IrCl4 monohydrate sont dissous 3o dans 50 mL d'eau distillée ; sont ajoutés ensuite 0.5 ml de peroxyde d'hydrogène à 30 %, 365 mg d'oxalate de potassium hydraté et du carbonate de potassium anhydre pour ajuster le pH à 10.5. Une agitation de 10 minutes est requise entre chaque ajout de produit. La solution est ensuite chauffée à
90 C pendant quelques minutes, jusqu'à atteindre une couleur finale bleu nuit caractéristique de la forme complexée de l'Iridium (IV). La solution peut ensuite être stockée plusieurs mois à 4 C.

Une puce multi-pores comportant des pores de rapport de forme Rf = 1 et ayant subi un traitement plasma 02 est placée au sein du montage b décrit ci-dessus (figures 3 et 4).
La solution d'oxalate d'iridium est introduite successivement dans les deux compartiments. Puis, deux électrodes sont positionnées de chaque côté de la puce. La première est reliée aux électrodes auxiliaire et de référence du potentiostat et l'autre à l'électrode de travail. Un potentiel de 0.80 V ou 0.85 V ou 0.90 V est appliqué pendant une durée de 5 s ou 10 s.
De la même manière que pour les dépôts de polypyrrole, le suivi du dépôt se 1o fait par chronoampérométrie afin de vérifier le bon contact électrique au travers du pore.
La puce est ensuite retirée de la cellule, abondamment rincée à l'eau puis séchée à l'air comprimé et stockée à 4 C.
ii) Résultats ls L'efficacité de la fonctionnalisation a été vérifiée par microscopie électronique à balayage (MEB).
Les clichés qui ont été obtenus montrent qu'un dépôt est créé sur les parois du pore et seulement à l'intérieur de celui-ci, la surface alentour restant parfaitement propre. Un pore témoin, n'ayant pas subi de 20 fonctionnalisation, ne présente quant à lui aucun dépôt sur les parois internes du pore. Cela montre que le procédé de fonctionnalisation fonctionne également pour des entités électroactivables tels que ces oxydes métalliques.
La texture des différents dépôts obtenus paraît différente d'un pore à l'autre, ceci pouvant être possiblement expliqué par des degrés 25 d'oxydation de l'iridium variables. Ainsi, les demi-réactions électrochimiques impliquées dans le cas des oxydes d'iridium sont les suivantes:
Ir(OH) + H2O <-> Ir(OH)2 + H+ + e (-0,1 V) lr(OH)2 + H2O <-> Ir(OH)3 + H+ + é (0,3 V) lr(OH)3 + H2O <-> lr(OH)4 + H+ + e- (0,8 V) 30 ou lr02 + 2H20 + H+ + e (divergence selon les publications) Etant donné l'aspect visuel hétérogène des dépôts observés en MEB à l'intérieur des pores, il est possible que, selon les conditions expérimentales utilisées, on n'obtienne pas les mêmes degrés d'oxydation 35 moyens de l'iridium dans le (ou les) oxyde(s) formé(s).

EXEMPLE IV : OBTENTION D'OBJETS STRUCTURES PAR
LA TECHNIQUE D'ELECTRODEPOT A DISTANCE :
i) Création d'un dépôt de polypyrrole :
Une membrane de polycarbonate, comportant des pores de taille nanométrique, peut être insérée indifféremment dans les montages a ou b. Des dépôts de copolymère pyrrole/pyrrole-couplé avec un oligonucléotide peuvent ensuite être obtenus à l'intérieur de ces pores en suivant le protocole précédemment décrit.
:
ii) Détachement des dépôts formés de leur support La membrane est ensuite rincée à l'eau et introduite dans un bain de dichlorométhane afin de dissoudre le polycarbonate et libérer en solution les objets créés à l'intérieur des pores. Les entités électroactivables peuvent être aussi détachées sans dissolution de la membrane, par exemple sous l'action de vibrations créées par des ultrasons. Par filtrations successives, les objets d'intérêt sont ensuite isolés ; il s'agit de nanostructures de pyrrole porteuses de sondes ADN possédant la forme des pores de la membrane.
EXEMPLE V :
Les figures 9a et 9b sont deux variantes de formes de pore non débouchant avec une électrode 61 qui recouvre en tout ou partie le fond de la cavité 60. Dans le cas des figures 9a et 9b, la zone du pore où a lieu le dépôt correspond à la seule région de striction 62, 62' qui concentre le champ. Ainsi, la forme du pore permet de localiser spécifiquement le dépôt sur une partie seulement de sa paroi.
Pour le dépôt d'un polymère tel que le polypyrrole ou un dérivé fonctionnel, la polarisation de l'électrode 61 au fond de la cavité 60 peut être anodique ou cathodique pour respectivement former ou non un dépôt du même polymère sur la surface de l'électrode 61, en plus du dépôt sur la région de striction 62, 62'.
CONCLUSION :
Le procédé technique de fonctionnalisation selon l'invention est efficace et relativement facile à mettre en pratique.
La reproductibilité des dépôts est satisfaisante et peut être encore améliorée en contrôlant les paramètres de manipulation plus strictement :
- distance inter-électrodes figée - contrôle de température - contrôle de l'hygrométrie Cette nouvelle technique, permet de contrôler de manière efficace la localisation de la fonctionnalisation de la surface d'un pore par des groupements réactifs. En effet, cette dernière est pour l'essentiel liée à
l'organisation des lignes de champ électrique au sein du pore, elle-même dépendante de la structure de l'environnement du pore (à savoir de sa géométrie).
Le procédé selon l'invention présente l'avantage d'être peu 1o coûteux :
- en termes financiers car seul un équipement réduit est nécessaire : potentiostats, électrodes...
- en termes de temps car la procédure de dépôt dure seulement quelques minutes.
Le dispositif expérimental est de plus peu encombrant et facilement transportable.
La stratégie est adaptable à tout type de support poreux, de nature organique ou inorganique, conducteur, semi-conducteur ou isolant, quelle que soit la dimension des pores.
Pour mesurer si le liquide a pénétré à l'intérieur du pore, un moyen est de contrôler si le contact électrique entre les deux électrodes est effectif, auquel cas le chronoampérogramme mesuré lors du dépôt (par exemple de polypyrrole) présente un signal en intensité non nul.
Pour caractériser la formation du dépôt par exemple de polypyrrole, il est possible d'utiliser la microscopie de fluorescence, voire même la microscopie de fluorescence confocale afin d'avoir un aperçu tri-dimensionnel de la fluorescence à l'intérieur de la cavité. La microscopie électronique à balayage peut également permettre, par exemple dans le cas de dépôt d'oxyde d'iridium, de caractériser le dépôt formé.
Les entités électroactivables, en particulier électropolymérisables (pyrroles, thiophènes...), pouvant être fonction nalisées, cette technique est parfaitement transposable à l'immobilisation au sein de pores de groupements actifs intervenant dans des interactions d'énergie faible comme les groupements ioniques, peptides, anticorps, enzymes, chélateurs d'ions par exemple.

Le polymère peut également servir de couche de départ pour un dépôt localisé, en particulier en utilisant des anions dopants d'intérêt comme les polysaccharides (héparine par exemple favorisant l'adhésion de cellules (Zhou et al. Reactive & Functional Polymers, 1999. 39 : p. 19 et 5 suivantes)) ou les surfactants.
Des empilements de type multi-couche peuvent être envisagés à partir des dépôts obtenus par électrodépôt à distance . Il est ainsi possible de préparer un dépôt localisé (première couche) présentant par exemple une certaine charge de surface ou un groupement chimique réactif io qui favorise la fixation d'une deuxième couche d'entités organiques ou inorganiques donnée par rapport au support vierge.
La technique a permis expérimentalement la mise en oeuvre d'une immobilisation d'ADN, ce dernier étant une biomolécule présentant un aspect modulaire, c'est-à-dire pouvant être utilisée comme élément de 15 reconnaissance biomoléculaire pour l'immobilisation via une hybridation d'une molécule d'intérêt fonctionnalisée par des cibles ADN complémentaires. Le procédé a également permis d'immobiliser une entité d'intérêt biologique, la biotine, par hybridation avec des sondes ADN immobilisées avec une cible complémentaire biotinylée, ce qui souligne l'aspect modulaire de la technique.
20 Le dispositif expérimental peut de plus intégrer des dispositifs thermiques et optiques permettant par exemple des expériences de réticulation ou encore une visualisation de l'organisation des dépôts réalisés.
Plusieurs applications peuvent être envisagées dans le domaine des biocapteurs miniaturisés ultrasensibles. Des membranes poreuses biofonctionnalisées peuvent trouver des applications dans le domaine de la santé, en particulier pour la détection de (bio)molécules présentes en petite quantité dans des échantillons biologiques. De nombreuses équipes de recherche ont ainsi orienté leurs travaux vers la conception de systèmes permettant la détection de molécules uniques. Ces compteurs de Coulter moléculaires ont fourni des résultats encourageants avec des pores protéiques (Vercoutere, W. et collaborateurs, Nature Biotechnology, 2001. 19: p. 248 ; Bayley and Cremer, Nature, 2001. 413: p.
226 et suivantes).
L'avantage considérable des pores synthétiques par rapport à
ces derniers réside dans la possibilité de :

- moduler leurs propriétés en créant des charges, des groupements réactifs en surface, - contrôler la géométrie (diamètre du pore, épaisseur de la membrane... ), - réaliser une intégration plus aisée dans un appareillage microfluidique.
Le procédé convient également à des applications dans le domaine de la micro- ou nano-chromatographie (échange d'ions, exclusion stérique, chromatographie d'affinité ou d'adsorption) pour la purification de (bio)molécules.
Des pores fonctionnalisés peuvent également être utiles pour réaliser la capture de bactéries ou de cellules, notamment en immobilisant de l'héparine ou de la chondoitine à l'intérieur d'un pore.
Les membranes poreuses fonctionnalisées trouvent également classiquement des applications dans les systèmes de purification et de filtration (eau, effluents... ), la présence de chélateurs ou d'échangeurs d'ions à la surface des pores étant susceptible de permettre de séparer sélectivement certains composants du liquide passant au travers de la membrane.
L'immobilisation de particules catalytiques, contenant par exemple des métaux tels que le palladium ou le platine dans des pores, par l'intermédiaire du procédé décrit, pourrait permettre la création de micro-voire nano-réacteurs pour réaliser des réactions chimiques comme les hydrogénations par exemple. Le fait de pouvoir paralléliser ces réactions en utilisant des réseaux de pores répartis dans une membrane permet de faire de la micro/nano-chimie combinatoire. L'électrodépôt de métaux par cette technique peut trouver également des applications dans les domaines des pots catalytiques (catalyse en phase gazeuse).
Le procédé est enfin compatible avec la mise en oeuvre de techniques d'impression moléculaire ( molecular imprint ), ce qui ouvre des applications intéressantes dans le domaine de l'électrophorèse capillaire par exemple.
On comprendra que la solution d'entités électroactivables pour laquelle on a mentionné ci-dessus la présence éventuelle de sondes ADN, peut de manière plus générale comporter optionnellement des ligands, à savoir :

- des éléments de reconnaissance moléculaire et/ou biomoléculaire notamment les nucléotides, oligonucléotides, polynucléotides, ADN, ARN, PNA, peptides, polypeptides, anticorps, antigènes, enzymes, protéines, acides aminés, glycopeptides, biotines, haptènes, sucres, oligosaccharides, polysaccharides, lipides, glycolipides, stéroïdes, hormones, récepteurs.
- d'autres groupements affins notamment les chélateurs d'ions et les échangeurs d'ions.
- des fonctions chimiquement actives notamment les io fonctions amine, amide, oxy-amine, ester actif, alcool, acide carboxylique, alcyne, thiol, époxyde, anhydride, chlorure d'acyle, aldéhyde et leurs dérivés.
- des objets uniques (dans le cadre d'une immobilisation individuelle ou collective d'objets) notamment des microparticules et nanoparticules. Les particules peuvent être et/ou contenir des cellules biologiques et/ou des composants et/ou des produits cellulaires, notamment des lignées cellulaires et/ou des globules et/ou des liposomes et/ou des noyaux cellulaires et/ou des chromosomes et/ou des brins d'ADN ou d'ARN
et/ou des nucléotides et/ou des ribosomes et/ou des enzymes et/ou des anticorps et/ou des protides et/ou des protéines et/ou des peptides et/ou des principes actifs et/ou des parasites et/ou des bactéries et/ou des virus et/ou des pollens et/ou des polymères et/ou des facteurs biologiques et/ou des stimulants et/ou des inhibiteurs de croissance et/ou des billes en suspension dans un liquide, et/ou des bioparticules en suspension dans une solution, et/ou des molécules. Les particules manipulées peuvent être et/ou contenir des particules solides insolubles telles que des particules magnétiques et/ou des particules diélectriques, ou des particules conductrices, ou des particules fonctionnalisées, ou des pigments, ou des colorants, ou des cristaux de protéines, ou des poudres, ou des structures de polymères, ou des substances pharmaceutiques insolubles, ou des fibres, ou des fils, ou des 3o nanotubes de carbone, ou des agrégats (clusters) de petite taille formés par agglomération de colloïdes - des groupements o présentant des particularités surfaciques = en termes de pH, notamment les couples acides/bases faibles et les composés amphotères = et/ou en termes d'hydrophilie et/ou d' hydrophobie et/ou d'amphiphilie, = et/ou en termes de polarité, o et/ou présentant des interactions de faible énergie notamment = liaisons hydrogène, = interactions de Van der Waals, = interactions ioniques notamment échange de protons interactions électrostatiques, ponts salins notamment ceux formés par des ions divalents comme les ions calcium et magnesium entre les groupements chargés négativement o et/ou étant des surfactants.
- des modifications de surface préparant une modification ultérieure : la couche de fonctionnalisation déposée sur les parois du pore comporte par exemple des moyens d'interaction ou de réaction avec des molécules et/ou biomolécules.ll s'agit notamment de groupements modulaires tels que l'ADN, photoactivables tels que la benzophénone, électroactivables tels que les entités électroactivables mentionnées ci-dessus, ou bien encore thermoactivables tels que les polymères thermodurcissables.
On notera que le ligand doit être couplé à une entité
électroactivable pour permettre la fonctionnalisation par le procédé selon la présente invention.
Il n'est pas nécessaire qu'il y ait dans la solution à la fois des entités électroactivables et des entités électroactivables couplées à un ligand : il peut aussi y avoir seulement des entités électroactivables couplées à un ligand, ou bien seulement des entités électroactivables . 9 electric. Semiconductor materials are preferably used as silicon or its oxide and nitride derivatives.
In Example I below, the monomer used is pyrrole.
Indeed, polypyrrole is a polymer that has the advantage of being biocompatible and is therefore very interesting for developing biosensors. he also has the advantage of being stable in handling conditions biochemical tests (physiological pH, aqueous buffers, presence of oxygen ...). It is also a conductive polymer that has a hydrophilic character allowing its use in systems io biological. In addition, chemically, the synthesis of pyrrole-biomolecule is very well controlled and is done with good performance.
Polypyrrole, polycarbazole, polyaniline, PEDOT, polyindole, and polythiophene belong to the group of polymers pi-conjugated conductors.
It is known that the corresponding monomers are electropolymerizable, namely that they lead to the formation of a polymer under the effect of the application of anodic potential on the surface of a electrode. These entities behave in the same way account of solvent and oxidation conditions that are not identical from one entity to another.
POLYPYRROLE - IMPLEMENTATION OF EXAMPLES
1. - Material A) Reagents and consumables:
Pyrrole is aliquoted at a concentration of 1 M in solvent acetonitrile then stored at -20 ° C. Pyrrole bearing an oligonucleotide was prepared according to the protocol described in the patent application FR 2 703 359.
The DNA sequences used are the following:
Py-probeZip6: Py5 '- (T) 1-GAC CGG TAT GCG ACC TGG TAT GCG3' (Py-SEQ ID NO.1) . Target-Zip6-bio: biotin-5 'CGC ATA CCA GGT CGC ATA CCG GTCY
(Biotin-SEQ ID NO: 2) The chips used are silicon oxide membranes or silicon nitride. They have nine micrometric-sized pores distributed on a surface of 2x2 cm2.

B) Buffers used (given as an indication):
. Electropolymerization buffer: 6g / L Na2HPO4 / NaH2PO4, 2.9 g / L NaCl, 10% v / v glycerol, 2% v / v acetonitrile (v / v = by volume).
. Hybridization Buffer: 0.02 M Na2HPO4 / NaH2PO4.1.1 M
5 NaCl, 5.4 mM KCl, 4% v / v 50X Denhardt, 0.2% v / v sperm DNA
salmon, 0.3% v / v Tween 20 at pH 7.4 . Rinse buffer: PBS 5 tablets / L, NaCl 23,375 g / L, Tween 20 0.15% v / v.
C) Experimental assemblies for electropolymerization 1o distance:
Two experimental montages have been validated.
a) Electropolymerization cell (see FIGS. 2a to 2c):
The material of this cell C is "Delrin" (brand filed) polyoxymethylene said "Delrin POM". The cell is split in two sealed compartments 3 and 4 by introducing into its receptacle rectangular 34 a support piece 8 having one or more pores.
platinum wires for example can be introduced into each of compartments 3 and 4 through the openings 91 and 92 of the cover 9 to form the electrodes. 93 and 94 designate the fastening openings of the cover 9 on the C cell, and 95 and 96 the screw fixing holes on the cell C.
b) "Multipores" chip assembly If we want to functionalize differently each pores of a chip, it should work in parallel with a source of multi-channel voltage or several single-channel voltage sources, for example a multi-channel potentiostat, or several single-channel potentiostats.
In the assembly described in connection with FIG. 3, the chip 10 has 9 pores P1 ..... Pg. Each pore is isolated between two compartments sealed (31, 41, 32, 42, .... 39, 49). In other words, it is possible to to put each of the nine pores P1, P2 ...... P9 which have the same diameter or not contact with a different solution Si, S2 ...... S9 of entities électroactivables.
Each of these compartments is equipped with electrodes to which is applied a given electrical potential difference and which are arranged at a distance d from the end of each pore. The distance d can be not the same for the two electrodes of the same pore. She may be different from one pore to another depending on the requirements of functionalization.
There is thus has nine working electrodes Et ,, Et2, ... Et3 ... Et9 which are connected or no to same potentiostat (or more generally to the same voltage source) and nine counter-electrodes that can be coupled to electrodes of reference Eai, Ea2, ..... Ea9. The solutions S1, S2, ..... S9 can be or no same. A "multi-channel" PT potentiostat is used to apply these voltages simultaneously (even if the values are different).
Each pore (P1,... P9) of a chip 10 is positioned between two watertight compartments 31, 41, ...; 39, 49 which here have a volume of 10 l.
The assembly comprises one or two printed circuits 21, 22 (Fig. 4) having an integrated circular electrode 23, 28 connectable to a external potentiostat. In at least one of the electrodes are pierced two holes 26, 27 for introducing and discharging liquid via capillaries polytetrafluoroethylene. Two watertight compartments 31 and 41 are created between the chip 10 and the printed circuits 21 and 22 thanks to O-rings 24 and 25 (Figure 4). In order to achieve the electropolymerization so as to to obtain a deposit located on the pore walls, use is made of:
- the electrodes integrated in printed circuits - Or electrodes (wire not shown) introduced into capillaries on either side of the pore, - either electrodes dipping directly into a compartment. In this case, a plastic card (not shown) is used instead of the printed circuit board.
II) IMPLEMENTATION
A) Preparation of the substrate:
a) Cleaning:
At first, the chip undergoes a cleaning (67%
sulfuric acid, 33% hydrogen peroxide v / v) in a clean room to eliminate any contaminant of organic origin. The chip is soaked 10 min in the solution then rinsed through a circulation of water until a 3o resistivity of 9 MQ.m. The chip is then dried in an oven at 180 ° C.
for 10 minutes. It can then be stored at room temperature.
b) Increased hydrophilicity of the surface thanks to the application of an oxygen plasma:
This step makes the surface hydrophilic, which is advantageous in order to fill the pore, whatever its size, by a predominantly aqueous solution. The chip is thus placed during 45 seconds in a plasma 02 at a power of 100 W.
c) Deposit of polypyrrole:
A polymerization solution containing 20 mM pyrrole and 5M of py-probeZip6 in electropolymerization buffer was used to make polymer deposits in the pores.
Both montages (a and b above) were used.
In each case, the chip comprising pores is introduced in such a way as to be in between 1o compartments. The polymerization solution is introduced into both compartments. An electrode is inserted into each compartment and a potential difference equal to 2 V is applied. It will be noted that in practice, a voltage of between 10 mV and 500 V can be used and preferably between 100 mV and 10V depending on the pore size, the goal being obtaining a sufficiently high field inside the pore so that the deposit takes place on its wall. The follow-up of the filing process is done in tracing the curve of the evolution of the intensity of the current as a function of time:
the pace of this curve (presence or absence of an electrical signal) makes it possible to see if the liquid has penetrated inside the pore (electrical contact) or not (absence electrical signal). The chip is then removed from the assembly and rinsed water, dried with compressed air and kept dry at 4 C.
d) Verification of functionalization by microscopy of fluorescence In order to verify the formation of a polypyrrole deposit, uses fluorescence microscopy. The format of the test used is illustrated to the Figure 5. It is achieved by depositing drops of 15 I of liquid on a pore.
The pore is first saturated with Hybridization Buffer (5 min at room temperature).
ambient). Then a drop of biotinylated target at 100 nM Buffer Hybridization is added (15 min, room temperature). The chip is then 3o thoroughly rinsed with the Rinse Buffer. Each pore is then incubated in a 10% streptavidin-phycoerythrin solution (SAPE) (v / v = by volume) as Rinsing Buffer (15 min at room temperature).
The chip is then placed between blade and coverslip to be observed in fluorescence microscopy at 530 nm, emission wavelength of the phycoerythrin.

BIO FUNCTIONALIZATION OF A PORE BY
NUCLEIC ACIDS
EXAMPLE I - (Montage a) i) Creation of a polypyrrole deposit A multi-pores chip with pores variable form (shape ratio Rf = pore diameter / thickness of the membrane in which it is pierced) and having undergone a plasma treatment is introduced in the bi-compartment cell "Delrin POM" described above. The polymerization solution is introduced successively into both 1o compartments of the cell. It consists of 20 mM pyrrole and 5 M
Zip6 probe pyrrole (py-probe Zip 6) in electropolymerization buffer.
Then, two platinum wires are introduced, one on each side of the chip. The first is connected to the counter electrode coupled to the reference electrode of the potentiostat and the second to the working electrode. A potential of 2 V is applied for a given duration (between 100 ms and 1 s) between the two electrodes (working electrode and counter-electrode). The chip is then removed from the cell, thoroughly rinsed with water and then dried with compressed air and stored at 4 C.
The effectiveness of the functionalization is verified by fluorescence microscopy according to the method described above.
ii) Results The manipulation was carried out with pores presenting different form reports:
. Rf = 35: pore 70 m in diameter in a membrane of 2 μm thick and 500 μm from the side (see Figure 6).
Fluorescence emission is observed in the form of a bright circle present on each side of the chip. Its dimensions corresponding to those of the pore contour, which allows us to deduce that the functionalization technique is efficient and allows a polymer deposit located on the walls of a pore of micrometric size.
Scanning electron micrographs show a thin deposition layer - of the order of 30 nm - on the contour of a pore. This deposit is absent from an unfunctional pore.
. Rf = 1 with a circular pore 18 m in diameter in a membrane of 20 m thickness: case of a pore pierced in a square membrane 50 m wide and 20 m thick. The deposit is performed at a voltage of 2 V applied for 100 milliseconds (Figure 7).
The realization of the fluorescence test explained above leads to the presence of light rings on each side of the pore that certifies efficient and localized functionalization of the pore by a carrier polymer oligonucleotide.
. Rf = 0.25 pore of diameter 2 μm in a membrane of 8 m thick. The pore with a size of 2 m is at the bottom of a cone of larger diameter equal to 10 m. The pore environment is called type funnel (Figures 8a and 8b).
Fluorescence microscopy images show that the pore wall was functionalised in a localized way, as well as the contour from the top of the cone (10 m in size).
This is a result that leaves the possibility of controlling the place of functionalization according to the morphology of the environment of the pore.
EXAMPLE II (assembly b):
i) Creation of a polypyrrole deposit A multi-pores chip with pores of variable Rf form and having undergone 02 plasma treatment is placed within of the assembly b described above (Figures 3 and 4). The polymerization solution is introduced successively into the two compartments. She is consisting of 20 mM pyrrole and 5 M pyrrole-probe-Zip6 buffer electropolymerization. Then, two electrodes are positioned each side of the chip. The first is connected to the auxiliary electrodes and reference of the potentiostat and the second to the working electrode. A potential 2V is applied for 100 ms between the two electrodes. The chip is then removed from the cell, thoroughly rinsed with water and then air-dried compressed and stored at 4 C.
ii) Results The effectiveness of functionalization has been verified by fluorescence microscopy according to the method described above. Each of the 9 pores of the multi-pores chip can be studied independently, optionally with a specific functionalization for each pore.
. Rf = 1 pore 18 m in diameter in a membrane of 18 m thick.

Fluorescence microscopy confirms that the method of surface functionalization also works for all values above mentioned using this arrangement (presence of a fluorescent ring).
Witnesses were made to establish the specificity of 5 the biochemical interaction resulting in functionalization characterized by fluorescence emission. These controls were performed on the pores of 18.tm diameter (Rf = 1) of a multi-pores chip:
a) Electrical potential To do this, 15 l of a polymerization solution It consists of 20 mM pyrrole and 5 μM pyrrole-probe-Zip6 buffer electropolymerization are deposited on a pore and left in contact with the surface for 5 min. The chip is then rinsed with water and air dried tablet (identical procedure to that performed after a remote electropolymerization). The chip is kept at 4 C and then it undergoes The procedure of the fluorescence test described above. Any fluorescence could not be observed, evidence that the application of a potential electrical is necessary for the functionalization of the pore.
b) Adsorption of pyrrole-oligonucleotide conjugate Another check was made to study whether the application of a potential favors the adsorption of DNA on the surface of the support.
To do this, a solution of py-SondeZip6 at 5 M in Buffer electropolymerization was used (no pyrrole in this case), then a electric potential difference was applied according to the same protocol than that used for the pyrrole / py-Probe Zip6 copolymer. The absence of fluorescence shows that in working conditions, adsorption not Pyrrole-oligonucleotide conjugate specific is negligible.
(c) Non-specific adsorption during the procedure of revelation i) On a non-functionalized pore that has not been in contact 3o with the polymerization solution, the hybridization procedure is carried out and of revelation described above, the first step being the saturation of the pore in Hybridization Buffer. There is no, under the operating conditions, of parasite fluorescence linked to the non-specific adsorption of the DNA target biotinylated.
ii) On an unfunctional pore that has not been in contact with the polymerization solution, the procedure of revelation described above, the first step being the saturation of the pore in hybridization buffer followed by a 15 minute incubation in hybridization buffer alone (without the corresponding target). SAPE diluted Rinse buffer is then added according to the protocol described above (II.
A, d). The fluorescence microscopy snapshot confirms that in the operating conditions tested, the SAPE does not adsorb on the surface of the support.
d) Denaturation of the hybridization On a functionalized pore which has undergone the procedure of 1o fluorescence revelation described above, a flushing is carried out 0.2 M NaOH solution for 2 s followed by abundant rinsing with water and drying with compressed air. We then observe the pore in fluorescence microscopy at the usual wavelength and with the same camera sensitivity settings (brightness, contrast). We observed the disappearance of the fluorescence after denaturation of the hybridization.
This shows the specificity of the fluorescence emission observed in the case complementary hybridization.
e) Fluorescence after rehybridization The fluorescence of a pore having undergone denaturation via the addition of NaOH (d) reappears after rehybridization of the DNA probes by their complementary target. The experimental approach followed for this second hybridization and its fluorescence revelation is exactly the same as that previously described for hybridization.
EXAMPLE III FUNCTIONALIZATION BY OXIDE
IRIDIUM:
i) Creation of an iridium oxide deposit An iridium oxalate solution is prepared according to following protocol (described in the article by AM Marsouk, Analytical Chemistry 2003, 75: p.1258 and following): 75 mg of IrCl4 monohydrate are dissolved 3o in 50 ml of distilled water; 0.5 ml of peroxide are then added of 30% hydrogen, 365 mg of potassium oxalate hydrate and carbonate of anhydrous potassium to adjust the pH to 10.5. A stirring of 10 minutes is required between each product addition. The solution is then heated to 90 C for a few minutes until reaching a final blue color night characteristic of the complexed form of Iridium (IV). The solution can then be stored several months at 4 C.

A multi-pores chip with pores Rf = 1 form and having undergone 02 plasma treatment is placed within the assembly b described above (Figures 3 and 4).
The solution of iridium oxalate is introduced successively in both compartments. Then, two electrodes are positioned each side of the chip. The first is connected to the auxiliary electrodes and reference of the potentiostat and the other to the working electrode. A potential of 0.80 V or 0.85 V or 0.90 V is applied for a duration of 5 s or 10 s.
In the same way as for polypyrrole deposits, the monitoring of the deposit 1o done by chronoamperometry to check the good electrical contact at through the pore.
The chip is then removed from the cell, thoroughly rinsed with water then dried with compressed air and stored at 4 C.
ii) Results ls The functionalization efficiency has been verified by scanning electron microscopy (SEM).
The snapshots that have been obtained show that a deposit is created on the walls of the pore and only inside of it, the surface surrounding remaining perfectly clean. A control pore, which has not undergone Functionalization, does not present any deposits on the walls internal pore. This shows that the functionalization process works also for electro-activatable entities such as these metal oxides.
The texture of the different deposits obtained seems different from a pore to another, this possibly being explained by degrees Iridium oxidation variables. So the half-reactions electrochemical involved in the case of iridium oxides are:
Ir (OH) + H2O <-> Ir (OH) 2 + H + + e (-0.1 V) lr (OH) 2 + H2O <-> Ir (OH) 3 + H + + (0.3 V) lr (OH) 3 + H2O <-> lr (OH) 4 + H + + e- (0.8 V) 30 or 1r02 + 2H20 + H + + e (divergence according to the publications) Given the heterogeneous visual appearance of the observed deposits in SEM inside the pores, it is possible that, depending on the conditions used, we do not obtain the same oxidation levels 35 means of the iridium in the (or) oxide (s) formed (s).

EXAMPLE IV: OBTAINING STRUCTURED OBJECTS BY
REMOTE ELECTRODEPOT TECHNIQUE:
i) Creation of a polypyrrole deposit:
A polycarbonate membrane, with pores of nanometric size, can be inserted indifferently in montages a or b. Pyrrole / pyrrole-coupled copolymer deposits with an oligonucleotide can then be obtained inside these pores by following the protocol previously described.
:
ii) Detachment of deposits formed from their support The membrane is then rinsed with water and introduced into a dichloromethane bath in order to dissolve the polycarbonate and release in solution the objects created inside the pores. The entities électroactivables can also be detached without dissolution of the membrane, for example under the action of vibrations created by ultrasound. By filtrations successive objects of interest are then isolated; it is pyrrole nanostructures carrying DNA probes having the shape of pores of the membrane.
EXAMPLE V
Figures 9a and 9b are two variants of pore shapes not opening with an electrode 61 which covers all or part of the bottom of the cavity 60. In the case of FIGS. 9a and 9b, the zone of the pore where the deposit corresponds to the only region of necking 62, 62 'which concentrates the field. Thus, the shape of the pore makes it possible to specifically locate the deposit on only part of its wall.
For the deposition of a polymer such as polypyrrole or a functional derivative, the polarization of the electrode 61 at the bottom of the cavity 60 can be anodic or cathodic to respectively form or not a deposition of the same polymer on the surface of the electrode 61, in addition to the deposit on the necking region 62, 62 '.
CONCLUSION:
The technical process of functionalization according to the invention is effective and relatively easy to put into practice.
The reproducibility of deposits is satisfactory and can be further improved by controlling the manipulation parameters more strictly :
- fixed inter-electrode distance - temperature control - hygrometry control This new technique makes it possible to control efficient localization of the functionalization of the surface of a pore by of the reactive groups. Indeed, the latter is essentially linked to the organization of electric field lines within the pore, itself dependent on the structure of the pore environment (ie its geometry).
The method according to the invention has the advantage of being little 1o expensive:
- in financial terms because only reduced equipment is necessary: potentiostats, electrodes ...
- in terms of time because the filing procedure lasts only a few minutes.
The experimental device is more compact and easily transportable.
The strategy is adaptable to any type of porous support, organic or inorganic nature, conductive, semiconductor or insulating, whatever the size of the pores.
To measure whether the liquid has penetrated inside the pore, a way is to check if the electrical contact between the two electrodes is in which case the chronoamperogram measured at the time of example of polypyrrole) has a non-zero intensity signal.
To characterize the formation of the deposit for example of polypyrrole, it is possible to use fluorescence microscopy or even confocal fluorescence microscopy in order to have a dimensional fluorescence inside the cavity. Microscopy scanning electronics can also allow, for example in the case deposition of iridium oxide, to characterize the deposition formed.
Electroactivatable entities, in particular electropolymerisable (pyrroles, thiophenes ...), which can be function ised, this technique is perfectly transferable to immobilization within pores of active groups involved in energy interactions weak as ionic groups, peptides, antibodies, enzymes, ion chelators for example.

The polymer can also be used as a starting layer for a localized deposit, in particular using doping anions interest polysaccharides (heparin, for example, promoting the adhesion of cells (Zhou et al., Reactive & Functional Polymers, 1999. 39: 19 and 19).
5)) or surfactants.
Multi-layer stacks can be considered from deposits obtained by remote electrodeposition. It is thus possible to prepare a localized deposit (first layer) presenting by example a certain surface charge or a reactive chemical group which favors the fixation of a second layer of organic entities or inorganic given relative to the blank medium.
The technique has experimentally enabled the implementation of a DNA immobilization, the latter being a biomolecule having a modular aspect, that is to say that can be used as an element of Biomolecular recognition for immobilization via hybridization a molecule of interest functionalized by complementary DNA targets. The process also made it possible to immobilize an entity of biological interest, the biotin, by hybridization with DNA probes immobilized with a target biotinylated complement, which underlines the modular aspect of the technique.
The experimental device can further integrate devices thermal and optical systems, allowing, for example, crosslinking or even a visualization of the deposit organization made.
Several applications can be envisaged in the domain of ultra-sensitive miniaturized biosensors. Membranes biofunctionalized pores can find applications in the health field, in particular for the detection of (bio) molecules present in small quantities in biological samples. Of many research teams have thus oriented their work towards systems design allowing the detection of unique molecules. These Molecular Coulter Counters Provided Encouraging Results with proteinaceous pores (Vercoutere, W. et al., Nature Biotechnology, 2001. 19: p. 248; Bayley and Cremer, Nature, 2001. 413: p.
226 and following).
The considerable advantage of synthetic pores over the latter lies in the possibility of:

- to modulate their properties by creating loads, reactive groups on the surface, - to control the geometry (diameter of the pore, thickness of the membrane... ), - achieve easier integration in an apparatus microfluidics.
The method is also suitable for applications in the field of micro- or nano-chromatography (ion exchange, exclusion steric, affinity or adsorption chromatography) for the purification of (Bio) molecules.
Functionalized pores can also be useful for carry out the capture of bacteria or cells, in particular by immobilizing heparin or chondroitin inside a pore.
Functionalized porous membranes are found also conventionally applications in purification systems and filtration (water, effluents ...), the presence of chelators or exchangers ions on the surface of the pores being able to separate selectively certain components of the liquid passing through the membrane.
Immobilization of catalytic particles, containing by examples of metals such as palladium or platinum in pores, for example through the process described, could allow the creation of micro-indeed nano-reactors to perform chemical reactions such as hydrogenations for example. Being able to parallelize these reactions by using pore networks distributed in a membrane allows to do combinatorial micro / nano-chemistry. Electrodeposition of metals by this technical can also find applications in the fields of catalytic converters (gas phase catalysis).
The method is finally compatible with the implementation of molecular imprint techniques, which opens up interesting applications in the field of capillary electrophoresis by example.
It will be understood that the solution of electro-activatable entities for which we mentioned above the possible presence of probes DNA, may more generally optionally include ligands, to know :

- elements of molecular recognition and / or biomolecular including nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides, DNA, RNA, PNA, peptides, polypeptides, antibodies, antigens, enzymes, proteins, amino acids, glycopeptides, biotins, haptens, sugars, oligosaccharides, polysaccharides, lipids, glycolipids, steroids, hormones, receptors.
- other affine groups including chelators of ions and ion exchangers.
chemically active functions, in particular amine, amide, oxy-amine, active ester, alcohol, carboxylic acid, alkyne, thiol, epoxide, anhydride, acyl chloride, aldehyde and their derivatives.
- unique objects (as part of a fixed asset individual or collective objects), in particular microparticles and nanoparticles. The particles can be and / or contain cells biological agents and / or components and / or cellular products, in particular cell lines and / or globules and / or liposomes and / or cell nuclei and / or chromosomes and / or strands of DNA or RNA
and / or nucleotides and / or ribosomes and / or enzymes and / or antibodies and / or proteins and / or proteins and / or peptides and / or active ingredients and / or parasites and / or bacteria and / or viruses and / or pollen and / or polymers and / or biological factors and / or stimulants and / or growth inhibitors and / or beads in suspension in a liquid, and / or bioparticles suspended in a solution, and / or molecules. The particles handled can be and / or contain insoluble solid particles such as magnetic particles and / or dielectric particles, or conductive particles, or particles functionalized, or pigments, or dyes, or crystals of proteins, or powders, or polymer structures, or insoluble pharmaceutical substances, or fibers, or yarns, or 3o carbon nanotubes, or small aggregates (clusters) formed by agglomeration of colloids - groupings o with surface features = in terms of pH, especially the acid / base pairs weak and amphoteric compounds and / or in terms of hydrophilicity and / or hydrophobicity and / or of amphiphilic, = and / or in terms of polarity, o and / or with low energy interactions especially = hydrogen bonds, = Van der Waals interactions, ionic interactions, especially proton exchange electrostatic interactions, saline bridges especially those formed by ions divalent ions like calcium and magnesium between groups negatively charged o and / or being surfactants.
- surface modifications preparing a modification later: the functionalization layer deposited on the walls of the pore for example comprises means of interaction or reaction with molecules and / or biomolecules.
such as DNA, photoactivables such as benzophenone, electro-activatable devices such as the electro-activatable entities mentioned above, or else thermoactivables such as thermosetting polymers.
Note that the ligand must be coupled to an entity electro-activatable to allow functionalization by the process according to the present invention.
It is not necessary that there be in the solution at the same time electro-activatable entities and electro-activatable entities coupled to a ligand: there can also be only electro-activatable entities coupled ligand, or only electro-activatable entities.

Claims

1) Method of functionalization of at least a part of the wall of at least one pore of a support material characterized in that has:
a) bringing the pore into contact with a solution of entities electro-activatable and position two electrodes in said solution, way to create inside the pore and when an electrical signal is applied between the two electrodes, a voltage drop capable of generating a deposit located on said wall.
b) apply at least one electrical signal between the two electrodes for activating the electro-activatable entities and performing said functionalization.

2) Method according to claim 1, characterized in that said voltage drop inside the pore is greater than 1000 V / m.

3) Method according to one of claims 1 or 2, characterized in that it comprises at least one iteration of a) and b) with a second solution of electro-activatable entities.

4) Method according to one of claims 1 to 3, characterized in what the pore is open at both ends and in that a solution is placed in two compartments in each of which opens a end of the pore, at least one of the two solutions containing the said entities électroactivables.

5) Method according to one of claims 1 to 3, characterized in the pore has only one open end, in that one of the electrodes is placed at the bottom of a cavity or at the bottom of the pore and in that the other electrode is placed in a compartment in communication with said open end of the pore.

6) Method according to one of the preceding claims, characterized in that after b, it comprises a rinsing.

7) Method according to one of the preceding claims, characterized in that the electro-activatable entities are monomers electropolymerizable, especially pi-conjugated conductive polymers.

8) Process according to claim 7, characterized in that the electro-activatable entities are chosen from pyrroles, thiophenes, the indoles, anilines, azines, phenylenevinylenes, phenylenes, pyrenes, furans, selenophenes, pyrridazines, carbazoles, acrylates, methacrylates and their derivatives;

9) Method according to one of claims 1 to 6 characterized in what electro-activatable entities carry functions electrograftable, especially diazonium groups.

10) Method according to one of claims 1 to 6, characterized in that the electro-activatable entities are selected from metals, metal oxides, catalytic particles, salts and complexes metal.

11) Method according to one of claims 1 to 6, characterized in that the electro-activatable entities consist of a paint Electrophoretic.

12) Method according to one of the preceding claims, characterized in that the solution comprises electro-activatable entities coupled to ligands.

13) Method according to claim 12, characterized in that the solution of electro-activatable entities comprises a mixture of entities electroactivables, in particular an electropolymerizable monomer and electro-activatable entities coupled to ligands.

14) Method according to claim 13, characterized in that said solution comprises pyrrole coupled to a biomolecule.

15) Method according to one of the preceding claims, characterized in that the electro-activatable entity solution includes ions dopants of interest, including heparin and / or chondroitin.

16) Method according to one of the preceding claims, characterized in that the support material is silicon-based.

17) Method according to one of the preceding claims, characterized in that the electrical signal is a voltage difference electric, in particular between 10 mV and 500 V and more especially between 100 mV and 10V.

18) Method according to one of the preceding claims, characterized in that the voltage difference is applied during a duration of between 10 μs and 100 s and more particularly between 10 ms and 100 s.

19) Method according to one of the preceding claims, characterized in that the concentration of electro-activatable entities is between 1 nM and 500 mM.

20) Method according to one of the preceding claims, characterized in that it has a detachment step of the entities electro-activatable support.

21) Method according to one of the preceding claims, characterized in that the support has at least one region of Flared functionalization that extends the wall of a pore.

22) Method according to one of the preceding claims, characterized in that the pore has a necking region (62, 62 ') constituting a region of functionalization.

23) Method according to one of the preceding claims, characterized in that the electro-activatable entities comprise molecules probes and in that it comprises a step of association by recognition, in particular by hybridization with complementary target molecules.

24) Method according to claim 23, characterized in that comprises a step of denaturing said association by recognition, possibly followed by a new stage of association by recognition, including rehybridization.