CA2567887A1

CA2567887A1 - Methodes de criblage et compositions pour le traitement de cancers

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Publication number: CA2567887A1
Application number: CA002567887A
Authority: CA
Inventors: Dean W. Hum; Florence Gizard
Original assignee: Genfit; Dean W. Hum; Florence Gizard
Current assignee: Genfit SA
Priority date: 2004-05-27
Filing date: 2005-05-27
Publication date: 2005-12-15
Also published as: US20080044436A1; EP1751554A1; FR2870745B1; WO2005119264A1; FR2870745A1

Abstract

L'invention concerne des compositions et méthodes pour le traitement de pathologies prolifératives, notamment des cancers. Elle repose sur l'identification de propriétés particulières de TReP-132 dans le contrôle du cycle cellulaire et dans le contrôle de la prolifération cellulaire. Cette protéine se comporte comme un suppresseur de tumeur et constitue donc une cible privilégiée pour le développement de stratégies thérapeutiques efficaces. L'invention concerne des compositions, utilisations et méthodes d'identification de composés capables de moduler l'activité de cette protéine, et utilisables pour le traitement de diverses pathologies prolifératives, en particulier chez l'homme.

Description

DEMANDE OU BREVET VOLUMINEUX

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METHODES DE CRIBLAGE ET COMPOSITIONS POUR LE TRAITEMENT DE CANCERS

La présente demande concerne des compositions et méthodes pour le traitement de pathologies prolifératives, notamment de cancers et plus particulièrement de cancers hormono-dépendants. Elle repose sur l'identification de propriétés particulières d'une protéine dans le contrôle du cycle cellulaire et dans le contrôle de la prolifération cellulaire. Cette protéine, désignée TReP-132, se comporte comme un suppresseur de tumeur et constitue donc une cible privilégiée pour le développement de stratégies thérapeutiques efficaces. L'invention concerne des compositions, utilisations et méthodes d'identification de composés capables de moduler l'activité de cette protéine et utilisables pour le traitement de diverses pathologies prolifératives, en particulier chez l'homme.

La caractérisation fonctionnelle du promoteur du gène codant pour le cytochrome P450scc a permis d'isoler la protéine TReP-132 (Transcriptional Regulating Protein of 132 kDa). Cette protéine est impliquée dans la régulation de l'expression de gènes stéroïdogéniques et notamment dans l'activation de l'expression du gène codant pour l'enzyme P450scc (Gizard et al., 2001 et Gizard et al., 2004). Le cytochrome P450scc est un enzyme mitochondrial codé par le gène CYP11A1 et exprimé dans des tissus stérôidogéniques tels que les ovaires, les testicules, le placenta ou les surrénales (Mellon et al., 1993 et Stromstedt et al., 1995). P450scc catalyse la première étape.
enzymatique de la synthèse stéroïdienne en formant la pregnénolone à partir du cholestérol (Miller, 1988).
Il a été montré que la sur-expression de TReP-132 dans-- des cellules adrénales humaines NCI-H295 entraîne une augmentation significative de la production de prégnénolone, ce qui est en accord avec la capacité de ce facteur à augmenter l'expression du gène P450scc et à augmenter potentiellement la production d'hormones stéroïdiennes, y compris les minéralocorticoïdes, glucocorticoïdes et stéroïdes sexuels.
TReP-132 semble donc impliquée dans de multiples effets physiologiques des hormones stéroïdiennes.

L'ADNc de TReP-132 (3600 nucléotides) a été isolé initialement par criblage d'une banque d'ADNc de placenta humain. La séquence de la protéine présente des motifs caractéristiques d'un facteur impliqué dans la régulation transcriptionnelle des gènes tels que 3 motifs en doigts de zinc de sous type C2H2, des régions riches en acides

2 aminés acides, en proline et en glutamine et 2 motifs LXXLL. L'analyse en Northern blot et par protection à la RNase démontre que TReP-132 est exprimé dans différents tissus, avec un taux d'expression particulièrement élevé dans les tissus cibles des stéroïdes tels que l'utérus, la prostate, les testicules et certaines zones du cerveau (Gizard et aI ; 2001 ; Gizard et al., 2002b et Duguay et al., 2003) ainsi que dans les lignées cellulaires cancéreuses LNCaP, MCF-7 et T47-D (Gizard et al., 2001).
L'analyse en immunocytochimie démontre une localisation de la protéine TReP-dans le noyau. Sur la base de l'analyse de la structure primaire, il apparaît que TReP-132 présente plusieurs domaines susceptibles d'interagir avec des protéines tels que 2 motifs LXXLL.
Il a été montré dans les cellules NCI-H295, que la régulation de l'expression des gènes par TReP-132 passe par la formation d'un complexe d'activation transcriptionnel et par une interaction directe de TReP-132 avec SF-1 (Steroidogenic Factor-1) et le cofacteur CBP/p300 (Gizard et al., 2002b et Gizard et al., 2004). L'interaction TReP-requiert le motif LXXLL situé dans la région N-terminale de TReP-132 ainsi que le domaine d'activation proximal et le motif AF-2 de la protéine SF-1.
L'interaction de TReP-132 avec l'ADN, sa localisation nucléaire ainsi que son implication dans la régulation de l'expression des gènes montrent que TReP-132 est un facteur de régulation de la transcription.
Les inventeurs ont noté que TReP-132 est exprimé dans différents tissus, y compris dans des tissus non stéroïdogéniques tels que le cerveau, le thymus ou le coeur ce qui semble indiquer, compte tenu de sa capacité à interagir avec l'ADN pour réguler l'expression des gènes, que TReP-132 pourrait être impliqué dans différentes fonctions, autres que la régulation de la synthèse stérôidienne. La présente demande démontre donc maintenant l'implication de TReP-132 dans la prolifération cellulaire et les mécanismes associés, tels que la différenciation cellulaire et le développement tissulaire. La présente demande démontre notamment une régulation de l'expression de TReP-132 pendant le cycle cellulaire, et révèle un rôle de ce facteur dans la régulation de la prolifération cellulaire.
Plus particulièrement, les inventeurs ont mis en évidence l'implication de TReP-132 dans la prolifération cellulaire dépendante des hormones stéroïdes ou de leurs analogues et plus spécifiquement de la progestérone, notamment au niveau des cancers affectant les organes sensibles aux hormones stéroïdes et typiquement féminins, en particulier le cancer du sein et le cancer de l'utérus. Les hormones

3 stéroïdes (cestrogène et progestérone) jouent en effet un rôle clé dans la prolifération et la différenciation des glandes mammaires (Musgrove et al., 1994). Des études in vitro réalisées sur des lignées cellulaires T47-D ont permis de démontrer que la réponse cellulaire à la progestérone ou à ses dérivés R5020 et ORG 2058 (Stahlberg et al., 2003) est biphasique : une exposition initiale conduit à une prolifération tandis qu'une exposition prolongée entraîne une inhibition de la croissance cellulaire.
Ainsi, les administrations prolongées de progestatifs de synthèse tels que l'acétate de Megestrol ou l'acétate de medroxy-progestérone sont utilisées en clinique dans le traitement de certains cancers du sein (Sitruk-Ware et al., 1999 et Ingle, 2002).
La présente demande démontre le rôle de TReP-132 en tant que régulateur de la prolifération cellulaire. Les inventeurs ont démontré que la transfection de cellules HeLa, qui n'expriment pas de PR (Progesterone Receptor) endogène, avec un plasmide d'expression codant TReP-132 entraîne la présence de moins de colonies que la transfection avec un vecteur vide seul. Ce résultat indique que l'expression de TReP-132 diminue ou arrête la progression du cycle cellulaire. De plus, les cellules exprimant le TReP-132 exogène présentent un temps de dédoublement significativement plus long que les cellules contrôles et les colonies obtenues suite à la transfection de TReP-132 sont plus petites.
Parallèlement, les inventeurs ont mis en évidence que l'expression de TReP-132 est augmentée dans les cellules T47-D après un traitement à la progestérone et que l'inhibition sélective de TReP-132 augmente la prolifération cellulaire et abolit l'action inhibitrice de la progestérone. Ces résultats démontrent l'effet inhibiteur de TReP-132 sur la prolifération cellulaire dépendante de la progestérone. L'implication de TReP-132 dans la prolifération cellulaire a ensuite été démontrée dans les cellules épithéliales mammaires humaines cancéreuses MCF-7: le traitement de ces cellules avec de l'oestradiol conduit à une diminution significative de l'expression de TReP-1 32 et à une augmentation concomitante de la prolifération cellulaire. Ces résultats démontrent l'effet inhibiteur de TReP-132 sur la prolifération cellulaire dépendante ou non de la progestérone.

De plus, la présente demande démontre une régulation de l'expression de TReP-pendant le cycle cellulaire. Il a été démontré qu'en l'absence d'un traitement à
l'cestradiol des cellules MCF-7, une proportion plus élevée des cellules était en phase

4 PCT/FR2005/001314 G1, suggérant ainsi que l'expression de TReP-132 arrête la progression du cycle cellulaire de la phase GI à la phase S.
L'implication de TReP-132 dans la phase G1 du cycle cellulaire a encore été
démontrée par la mise en évidence que cette protéine est exprimée exclusivement durant la phase G1 du cycle cellulaire suite à la synchronisation des cellules HeLa.
De plus, dans les cellules T47-D, les inventeurs démontrent que la surexpression de TReP-132 provoque l'arrêt de la prolifération cellulaire en phase G1 associée à
l'inhibition des activités CDK (Cyclin Dependant Kinase) et à une baisse de la phosphorylation de pRb (protéine du Rétinoblastome). Ces résultats démontrent une corrélation négative entre l'expression de TReP-132 et la progression du cycle cellulaire.

Les effets d'une surexpression de TReP-132 sur le niveau d'inhibiteurs de kinases dépendantes de cycline (CDKIs) ont également été déterminés. Dans la mesure où
TReP-132 a été caractérisée comme impliquée dans la régulation de l'expression de gènes, il est pertinent d'identifier des gènes cibles régulés par TReP-132 qui sont impliqués dans le cycle cellulaire. Il a été montré, par des expériences de protection à
la RNase et des essais gènes rapporteurs, que l'induction de TReP-132 est associée à
une augmentation de l'expression des CDKIs p21, p16 et p27. Les inventeurs ont par ailleurs montré, par des expériences de transfections, d'immunoprécipitations et de retards sur gel, que TReP-132 active les promoteurs de gènes codant pour p21, p16 et p27 par un mécanisme mettant en jeu un complexe formé de TReP-132, du facteur de transcription Sp1 et de PR. Ces résultats montrent donc que TReP-132 agit comme un co-facteur de PR (Progesterone Receptor), dans le complexe de régulation formé
avec Sp1.
De la même manière, les inventeurs ont mis en évidence une interaction entre TReP-132 et le récepteur aux oestrogènes (ER).

Les inventeurs suggèrent par ailleurs que l'expression de TReP-132 est associée à une faible incidence tumorale et à une faible agressivité tumorale. De manière intéressante, il a été montré que le chromosome 6, sur lequel est localisé le gène codant pour TReP-132 en position 6p21.1-p12.1 (Gizard et al., 2002a) est le 4ème chromosome réarrangé
dans les tumeurs humaines et que le locus 6p21 est le siège d'importantes mutations associées à des évènements d'immortalisation de certains cancers. Des mutations affectant l'expression ou l'activité de TReP-132 pourraient donc être associés à des tumeurs. TReP-132 pourrait donc constituer un marqueur de prédisposition, de différenciation cellulaire et de développement, et d'agressivité des tumeurs.

La présente demande démontre par ailleurs le rôle de TReP-132 dans la différenciation

5 cellulaire: Gizard et al., 2004 suggère que la surexpression de TReP-132 dans les cellules adrénales NCI-H295 induit la différenciation des cellules des zonae fasciculata et reticularis et que TReP-132 induit l'expression du gène codant pour la P450 aromatase, nécessaire à la différenciation des glandes mammaires. De plus, l'inhibition de la prolifération des cellules T47-D par la progestérone, montrée comme augmentant l'expression de TReP-132 par les inventeurs, est liée à l'induction de programmes de différenciation (Musgrove et al.,1998). Cette hypothèse est confirmée par l'augmentation de la régulation de p21, p16 et p27 qui sont des molécules facilitant la différenciation hormono-dépendante dans de nombreuses voies de différenciation cellulaire (Inoue et al., 1999). Dans le tissu mammaire, l'augmentation de la régulation de p27 est à la base de l'arrêt de la différenciation au niveau de la phase alvéolaire (Said et al., 2001) et des niveaux importants de p21 et p27 sont respectivement associés aux états de différenciation intermédiaire et avancé du "ductal carcinoma in situ" (DCIS = forme non invasive du cancer du sein) (Mommers et al., 2001). En considérant les effets similaires de TReP -132 et de la progestérone sur l'expression de p21, p27 et p16, il apparaît clairement que TReP-132 est un marqueur de différenciation cellulaire, en particulier des cellules épithéliales des glandes mammaires et que TReP-132 est un facteur de différenciation.

Les activités ainsi démontrées de TReP-132 montrent que le gène codant pour TReP-132 est potentiellement un gène suppresseur de tumeur. Comme cela a pu être démontré pour d'autres gènes suppresseurs de tumeur, tels que p53 qui active également des gènes inhibiteurs des kinases dépendantes de cyclines comme p21, TReP-132 régule vraisemblablement aussi le cycle cellulaire via de nombreuses voies inhibitrices de la croissance. Ceci inclut la régulation transcriptionnelle positive de gènes cibles en favorisant l'apoptose et de gènes inhibiteurs de la croissance, ainsi que la régulation négative d'autres groupes de gènes, incluant des facteurs de survie et des gènes anti-apoptose.
Pris ensemble, ces résultats démontrent la capacité de la protéine TReP-132 à
réguler la progression du cycle cellulaire dans différents types cellulaires. TReP-132 constitue donc un gène suppresseur de tumeur potentiel. L'expression régulée de TReP-1 32 et la

6 production de protéines TReP-132 fonctionnelles, sont des étapes clés nécessaires à la progression correcte du cycle cellulaire et constituent des cibles d'intervention thérapeutique particulièrement avantageuses. Ces résultats montrent également que des composés capables d'augmenter l'activité de la protéine TReP-132 représentent des inhibiteurs potentiels puissants et sélectifs de voies impliquées dans la progression du cycle cellulaire, dans une prolifération cellulaire incontrôlée, dans le développement tissulaire et/ou la différenciation cellulaire.

Un premier objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé
augmentant ou mimant l'activité de la protéine TReP-132 pour la préparation d'une composition destinée au traitement d'une maladie proliférative.

Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de cette composition en combinaison avec une hormone pour une administration simultanée, séparée ou séquentielle.
L'invention concerne également des méthodes de traitement de pathologies prolifératives, comprenant l'administration à un sujet d'un composé augmentant ou mimant l'activité de la protéine TReP-132, notamment d'un composé qui mime l'activité
de la protéine TReP-132, stimule l'expression, la maturation ou le ciblage nucléaire de la protéine TReP-132 et/ou augmente la concentration de la protéine TReP-132 dans les cellules. L'administration peut être réalisée par toute voie classique pour ce type d'approche thérapeutique, comme notamment par voie systémique, en particulier, par injection, notamment intraveineuse, intradermique, intra-tumorale, sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire, intra-artérielle, etc.
Un objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation de la protéine TReP-132 ou d'un analogue pour la préparation d'une composition destinée au traitement d'une maladie proliférative.

Un autre objet de la présente demande concerne l'utilisation d'un acide nucléique codant la protéine TReP-132 pour la préparation d'une composition destinée au traitement d'une maladie proliférative.

Un autre objet particulier de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une protéine TReP-132 ou un acide nucléique codant la protéine TReP-

7 132, et un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique. L'invention concerne par ailleurs une composition pharmaceutique comprenant, dans un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, un composé choisi parmi la protéine TReP-132, un analogue de cette dernière, un composé augmentant ou mimant l'activité TReP-132 et un composé identifié à l'aide d'une méthode selon l'invention, combiné à une ou à
plusieurs hormones, en vue d'une administration simultanée, séparée ou séquentielle pour traiter une maladie proliférative.

Dans un mode de réalisation préférée, la composition pharmaceutique comprend, dans un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, la protéine TReP-132.

Dans un autre mode de réalisation préférée, la composition pharmaceutique comprend, dans un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, la progestérone ou un oestrogène.
L'invention est utilisable pour le traitement de diverses pathologies prolifératives, et notamment pour le traitement des cancers. L'invention est particulièrement adaptée au traitement des cancers hormono-dépendants, en particulier les cancers sensibles à un dérèglement de la synthèse et/ou de l'activité des oestrogènes ou de la progestérone.
L'invention est notamment utilisable pour le traitement du cancer du sein ou de l'utérus.
Un autre objet de la présente demande concerne une méthode pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs modulant, de préférence diminuant, la prolifération cellulaire comprenant la détermination de la capacité d'un composé test à mimer, augmenter ou favoriser la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes ou à moduler l'activité d'un gène cible dudit récepteur, notamment du gène p27, p21 ou p16.

La présente invention concerne par ailleurs une méthode pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs, comprenant la détermination de la capacité d'un composé test à moduler la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes.

8 Cette méthode pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation, in vitro ou ex vivo, de composés actifs modulant la prolifération cellulaire, comprend :
a) la mise en contact d'un composé test avec :
i) la protéine TReP-132 ou un complexe comprenant la protéine TReP-132, et, ii) le récepteur d'une ou de plusieurs hormones stérôides, et b) la mesure de la liaison de la protéine TReP-132 ou du complexe comprenant la protéine TReP-132 avec ledit récepteur.

Dans le cadre de l'invention, le récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes est en particulier le récepteur de la progestérone (PR) ou le récepteur des oestrogènes (ER).

Notamment, l'invention concerne un composé test qui augmente ou favorise la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes (par exemple le récepteur de la progestérone), ou encore un composé test qui diminue ou inhibe la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes (par exemple le récepteur des oestrogènes).
Un autre objet de l'invention réside dans une composition pharmaceutique comprenant, dans un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, un composé modulant la liaison de la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stérôides.
La présente demande concerne par ailleurs une méthode pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation, in vitro ou ex vivo, de composés actifs modulant, de préférence diminuant, la prolifération cellulaire, comprenant :
a) la mise en contact, en présence de la progestérone ou d' strogènes, d'un composé test avec:
i) respectivement, le récepteur de la progestérone ou des oestrogènes, ii) Sp1, et iii) un acide nucléique comprenant tout ou partie du promoteur d'un gène cible de la progestérone ou des oestrogènes, et

9 b) la mesure de la liaison de Sp1 ou du complexe comprenant le récepteur de la progestérone ou des oestrogènes et Sp1 audit promoteur, ou la mesure de l'expression dudit promoteur, ladite mesure étant une indication de l'effet du composé test sur la prolifération cellulaire.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la méthode est mise en oruvre en présence de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132.

De manière préférée, cette méthode peut être mise en oeuvre dans une cellule.

Dans le cadre de l'invention, les gènes cibles de la progestérone ou des oestrogènes sont les gènes p21, p16 et/ou p27.

Un autre aspect de la présente demande concerne une méthode de détection d'une prédisposition, de diagnostic, de suivi et de mesure de l'agressivité d'une maladie proliférative comprenant la détection, chez un patient, de la surexpression de I'oestradiol, de la diminution de l'expression de la progestérone ou d'une diminution de l'expression des CDKIs p21, p16 et/ou p27.
Comme indiqué, l'invention repose sur la mise en évidence de la capacité de la protéine TReP-132 à agir comme un régulateur du cycle cellulaire, et notamment à
inhiber la prolifération de cellules cancéreuses, en particulier dans le cadre des cancers hormono-dépendants.
Dans le cadre de l'invention, les compositions pharmaceutiques comprennent notamment les composés augmentant la liaison de la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stérôides, dans un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un composé augmentant, favorisant ou facilitant la liaison de la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stérôides pour la préparation d'une composition destinée au traitement d'une maladie proliférative.

Un autre objet particulier de l'invention concerne un procédé de préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une maladie proliférative comprenant une étape utilisant une méthode telle que décrite précédemment.

5 Un objet particulier de l'invention concerne le traitement de diverses pathologies prolifératives, telles que le cancer ou la sténose, de manière avantageuse le cancer.
L'invention est en particulier utilisable dans le traitement de cancers hormono-dépendants, et notamment dans le traitement du cancer du sein ou du cancer de l'utérus.
Dans le cadre de l'invention, le récepteur à une ou plusieurs hormones stéroïdes est en particulier un récepteur de la progestérone ou un récepteur des oestrogènes.

Protéine TReP-132 Dans le contexte de l'invention, l'expression protéine TReP-132 désigne un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID NO : 2, les variants, naturels ou fonctionnels, les dérivés ou homologues de cette dernière. Il s'agit plus particulièrement de tout variant naturel de la séquence SEQ ID NO : 2, résultant d'un polymorphisme, d'un épissage, d'une mutation, etc. De tels variants naturels peuvent donc comprendre une ou plusieurs modifications telles que des substitutions, insertions et/ou délétions d'un ou plusieurs résidus, etc. Le terme homologue désigne par ailleurs les protéines TReP-132 d'autres espèces, par exemple de rongeurs, bovins, etc. De préférence, il s'agit d'un polypeptide reconnu par un anticorps polyclonal produit à partir de la protéine TReP-132 de séquence SEQ ID NO : 2.

De manière générale, le terme protéirie TReP-132 désigne un polypeptide de séquence SEQ ID NO : 2.

Des variants préférés comportent au moins 80% de la séquence SEQ ID NO : 2, plus préférentiellement au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 2. Le degré
d'identité peut être déterminé par exemple en utilisant la méthode CLUSTAL.
Des variants particuliers possèdent une mutation ou une substitution affectant 5 acides aminés au plus de la séquence SEQ ID NO: 2. Des variants fonctionnels particuliers au sens de l'invention sont des variants résultant d'épissage(s). Il s'agit par exemple des variants décrits dans GenBank sous les numéros de référence AJ277276 et AJ277275 .
Des variants fonctionnels particuliers selon l'invention sont des fragments de la protéine TReP-132 décrite ci-dessus, notamment des polypeptides comprenant une partie de la séquence SEQ ID NO : 2. Les polypeptides fragments de l'invention contiennent de préférence moins de 200 acides aminés, plus préférentiellement moins de 150 acides aminés. Une protéine TReP-132 selon l'invention peut par ailleurs comprendre des résidus hétérologues, ajoutés à la séquence d'acides aminés indiquée. Ainsi, un objet de l'invention réside dans un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO : 2 ou un variant naturel de celle ci ou une partie hétérologue. La partie hétérologue peut correspondre à des acides aminés, à des lipides, à des sucres, etc. Il peut également s'agir de groupe(s) chimique(s), enzymatique(s), radioactif(s), etc.
L'élément hétérologue peut en particulier être un marqueur, un agent de ciblage, un agent stabilisateur, un agent facilitant la production, un agent protecteur, un agent facilitant la pénétration de la protéine dans les cellules, une toxine, un composé actif, un anticorps, etc.
De manière générale, l'expression protéine TReP-132 désigne un polypeptide de SEQ ID NO : 2 ou tout polypeptide codé par un acide nucléique s'hybridant avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec une région de celle-ci (typiquement comprenant au moins 50 bases), dans des conditions de stringence modérées ou élevées. Des conditions de stringence adaptées sont par exemple une incubation à 42 C
pendant 12 heures dans une solution comprenant 50% formamide, 5 X SSPE, 5 X Denhardt's, 0.1% SDS, (1 X SSPE se compose de 0.15M NaCI, 10 mM NaH2PO4, 1.3 mM EDTA, pH 7.4). Il est bien entendu possible de faire varier la température et la salinité du milieu.

Dans le cadre de l'invention, le terme analogue de la protéine TReP-132 désigne tout analogue fonctionnel de la protéine TreP-132 Ces analogues fonctionnels sont des polypeptides, comprenant éventuellement une partie hétérologue telle que définie ci-dessus, ayant au moins une propriété biologique de la protéine TReP-132, en particulier la capacité de lier une protéine, de préférence un récepteur hormonal et en particulier un récepteur de la progestérone ou un récepteur des oestrogènes, ou encore la capacité de réguler l'expression des gènes p27, p21 et p16. En particulier, une protéine TReP-132 ou un variant selon l'invention comprend au moins un motif LXXLL.

Dans le cadre de l'invention, le terme <e complexe comprenant la protéine TReP-désigne tout type de complexe dans lequel la protéine TReP-132 est impliquée.
Ce complexe peut comprendre de nombreux partenaires, tels que des récepteurs nucléaires, des co-facteurs, etc. qui peuvent avoir des natures et des fonctions variées.
Parmi les cofacteurs, on peut citer par exemple des facteurs de transcription, en particulier p300, Sp1 ou VDR (Vitamin D Receptor). Les récepteurs sont notamment les récepteurs nucléaires parmi lesquels on peut citer les récepteurs d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes, les récepteurs orphelins, les récepteurs PPAR, LXR, RXR, FXR
ou tout autre récepteur nucléaire. De manière préférée, les récepteurs selon l'invention sont impliqués dans la prolifération ou la différenciation cellulaire. Encore plus préférentiellement, les récepteurs d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes sont le récepteur de la progestérone (PR) et le récepteur des oestrogènes (ER).

Une protéine TReP-132 selon l'invention peut être préparée par toute technique connue de l'homme de l'art, notamment par synthèse artificielle et plus particulièrement par synthèse en phase solide, ou par toute technique biologique, génétique ou enzymatique, et notamment par expression dans un hôte cellulaire approprié
d'un acide nucléique codant ladite protéine.
Une protéine TReP-132 préférée au sens de l'invention est une protéine TReP-humaine dont la séquence est par exemple identique à la séquence SEQ ID NO :
2.
Composé

Un objet de l'invention réside dans une méthode pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs modulant, de préférence diminuant, la prolifération cellulaire, comprenant la détermination de la capacité d'un composé test à mimer, augmenter ou favoriser la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stérôides.
Cette méthode peut comprendre la mise en contact d'un composé test avec la protéine TReP-132 ou avec un complexe comprenant la protéine TReP-132, et avec un récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes ; et la mesure de la liaison de la protéine TReP-132 ou du complexe comprenant la protéine TReP-132 avec le récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes.

L'expression composé augmentant, favorisant ou facilitant la liaison de la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones désigne, au sens de l'invention, tout composé, agent, facteur, condition ou traitement susceptible d'augmenter ou de stimuler, dans une cellule, la liaison de la protéine TReP-132 au récepteur de l'hormone d'intérêt. Il s'agit d'un ligand de récepteur nucléaire, de préférence d'hormones stéroïdes (en particulier la progestérone et les oestrogènes) ou d'un analogue de stéroïdes.

Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé modulant la liaison de la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes, en particulier à un récepteur de la progestérone ou à un récepteur des oestrogènes, pour la préparation d'une composition destinée au traitement d'une maladie proliférative.
Selon l'invention, la modulation de la liaison peut consister en une augmentation ou en une diminution de la liaison de la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stérôides tels ceux mentionnés ci-dessus.

De manière préférée, l'invention concerne l'utilisation d'un composé
augmentant ou favorisant la liaison de la protéine TReP-132 ou du complexe comprenant cette protéine au récepteur de la progestérone et/ou diminuant la liaison de la protéine TReP-132 ou du complexe comprenant cette protéine au récepteur des oestrogènes, pour la préparation d'une composition destinée au traitement d'une maladie proliférative et en particulier d'un cancer hormono-dépendant.

Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé
augmentant ou mimant l'activité de la protéine TReP-132 pour la préparation d'une composition destinée au traitement d'une maladie proliférative. En particulier, l'invention est utilisable dans le traitement de cancers hormono-dépendant, notamment dans la traitement des cancers sensibles à un dérèglement de la synthèse et/ou de l'activité de la progestérone ou des cestrogènes tels que le cancer du sein ou de l'utérus.

Dans un mode préférée de mise en oeuvre de l'invention, la composition est utilisée en combinaison avec une hormone pour une administration simultanée, séparée ou séquentielle.

L'expression composé augmentant ou mimant l'activité de la protéine TReP-132 désigne au sens de l'invention tout composé, agent, facteur, condition ou traitement susceptible d'augmenter, de mimer ou de simuler, dans une cellule, l'activité
de la protéine TReP-132.
Il s'agit préférentiellement de substances, choisies, par exemple, parmi un acide nucléique, un polypeptide, un lipide, une petite molécule, etc. De tels composés peuvent être identifiés à l'aide d'une méthode selon l'invention.

Le composé utilisé est préférentiellement un composé qui mime l'activité de la protéine TReP-132, stimule l'expression ou le transport nucléaire de la protéine TReP-132 et/ou augmente la concentration de la protéine TReP-132 dans les cellules.

Les composés particulièrement préférés sont ceux capables d'augmenter de manière sélective l'activité de la protéine TReP-132, c'est-à-dire essentiellement sans affecter de manière directe et significative l'activité d'une autre voie métabolique.

Plus précisément, au sens de la présente demande, le terme activité de la protéine TReP-132 désigne notamment la synthèse de cette protéine (transcription, traduction, etc.), sa maturation, son transport vers le noyau, son interaction avec un récepteur ou avec un acide nucléique, son activité transcriptionnelle, sa dégradation, etc.
Le composé augmentant l'activité de la protéine TReP-132 peut donc être un agent augmentant la synthèse de la protéine TReP-132, un agent augmentant son transport, un agoniste de la protéine TReP-132, un agent mimant l'activité de la protéine TReP-132, etc.

Dans un mode particulier de mise en oruvre de l'invention, un composé capable d'augmenter la synthèse de la protéine TReP-132, c'est-à-dire notamment la transcription ou la traduction de son gène ou de son ARN est utilisé.
Avantageusement, il est possible d'utiliser un composé qui augmente l'expression de la protéine TReP-132 dans une cellule. Un objet de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un composé
augmentant l'expression de la protéine TReP-132 pour la préparation d'une composition destinée au traitement des maladies prolifératives.

Un tel composé est préférentiellement un acide nucléique codant une protéine TReP-132, un composé stimulant le promoteur du gène TReP-132 ou un composé
augmentant la stabilité des ARNm TReP-132.

5 A cet égard, un objet particulier de la présente invention réside dans l'utilisation d'un acide nucléique codant une protéine TReP-132 pour la préparation d'une composition destinée au traitement d'une maladie proliférative. Un autre objet de l'invention réside dans une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique codant la protéine TReP-132 et un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique.
L'acide nucléique, au sens de l'invention, peut être un ADN ou un ARN, par exemple un ADN génomique, complémentaire ou synthétique, un ARN messager, etc. Il s'agit de préférence d'un ADNc. Un acide nucléique particulier code pour une protéine de séquence SEQ ID NO : 2 ou pour un variant naturel ou fonctionnel de celle-ci.
Il s'agit plus particulièrement de tout acide nucléique codant une protéine TReP-132 et capable de s'hybrider avec la séquence SEQ ID NO: 1 ou avec une région de celle-ci (typiquement comprenant au moins 50 bases), dans des conditions de stringence modérée ou élevée. Des conditions de stringence adaptées sont par exemple une incubation à 42 C pendant 12 heures dans une solution comprenant 50%
formamide, 5 X SSPE, 5 X Denhardt's, 0.1% SDS, (1 X SSPE se compose de 0.15M NaCI, 10 mM
NaH2PO4, 1.3 mM EDTA, pH 7.4). Il est bien entendu possible de faire varier la température et la salinité du milieu. Dans le contexte de l'invention, l'acide nucléique peut comprendre éventuellement des régions régulatrices, notamment, une région promotrice, un poly A, etc. Il est notamment possible d'utiliser des promoteurs homologues ou hétérologues, forts ou faibles, régulés, constitutifs ou inductibles, spécifiques de tissus ou ubiquitaires, etc. Ils peuvent être d'origines variées, tels que des promoteurs viraux, cellulaires, bactériens, artificiels, etc. Des exemples spécifiques de promoteurs incluent notamment le promoteur HSV-LTR, CMV, TK, SV40, PGK, albumine, etc.
L'acide nucléique peut être inséré dans un vecteur, notamment un vecteur d'expression, comme par exemple un plasmide, un cosmide, un phage, un virus, un chromosome artificiel, etc. Il s'agit de préférence d'un vecteur plasmidique ou dérivé
d'un virus, comme par exemple un rétrovirus, un adénovirus, un AAV, un virus de l'herpès, etc. Des virus particulièrement utiles sont des rétrovirus, des adénovirus ou des AAV, dont le génome a été modifié pour comporter une région codant une protéine TReP-1 32, et pour être défectif pour la réplication. Les techniques de production de tels virus défectifs sont connues de l'homme du métier, et comprennent, par exemple, l'introduction d'un vecteur viral recombinant dans une cellule d'encapsidation, éventuellement en présence d'un plasmide ou d'un virus helper. Les virus recombinants utilisés dans le cadre de l'invention sont avantageusement défectifs pour la réplication, c'est-à-dire qu'ils sont essentiellement incapables de réplication autonome dans une cellule. Ces virus recombinants présentent donc un génome recombinant dans lequel un ou plusieurs gènes viraux (ou régions virales) essentiels à la réplication ont été
inactivés (e.g., mutés ou délétés, en tout ou partie), comme par exemple les régions El ou E4 (pour les adénovirus), Rep ou Cap (pour les AAVs), GAG et/ou POL (pour les rétrovirus), etc. Des méthodes de production de rétrovirus recombinants ont été
décrites par exemple dans W090/02806, US 5,324,645 et W094/19478. Des méthodes de production d'adénovirus recombinants ont été décrites par exemple dans W095/02697 et W096/22378.

L'acide nucléique ou le vecteur peut être utilisé dans le cadre de l'invention pour augmenter l'expression et donc l'activité de la protéine TReP-132 in vitro, ex vivo ou directement in vivo. Il s'agit plus généralement d'une utilisation directe in vivo, dans les cellules prolifératives, ou ex vivo, à partir du prélèvement d'un échantillon ou d'une biopsie du tissu à traiter, qui est ensuite réinjecté au patient, typiquement après irradiation.

Un autre objet particulier de la présente invention réside dans l'utilisation d'un composé
stimulant le promoteur du gène TReP-1 32 ou augmentant la stabilité des ARNm TReP-132 pour la préparation d'une composition destinée au traitement d'une maladie proliférative. Un tel composé permet en effet d'augmenter la quantité de protéine TReP-132 présente dans une cellule.

Un autre objet de l'invention réside dans une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé stimulant le promoteur du gène TReP-132 et un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique. Un tel composé peut être identifié, validé, ou optimisé par exemple à l'aide d'un procédé comprenant la détermination de la capacité d'un composé test à lier le promoteur du gène TReP-132 ou une partie de celui-ci, et/ou à activer ce promoteur. Cette activité peut être déterminée par mesure de l'expression d'un gène placé sous le contrôle du promoteur du gène TReP-132.

Selon un autre mode préféré de mise en ceuvre, on utilise dans le cadre de l'invention un ou plusieurs composés capables d'augmenter, d'induire ou de stimuler la maturation, la stabilité ou l'activité de la protéine TReP-132 dans une cellule. Un objet de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un composé augmentant la maturation, la stabilité ou l'activité de la protéine TReP-132 pour la préparation d'une composition destinée au traitement d'une maladie proliférative. La protéine TreP-132 et les analogues de cette dernière sont des exemples de composés susceptibles d'être utilisés.

Selon un mode préféré de mise en oruvre de l'invention, il est en effet possible d'utiliser directement la protéine TReP-132, typiquement produite par voie recombinante in vitro, afin d'augmenter l'activité anti-proliférative. La protéine TReP-132 peut être fabriquée in vitro par expression d'un acide nucléique recombinant dans tout système cellulaire approprié, et récupération de la protéine fabriquée. On peut citer notamment une bactérie (e.g., E. coli), une levure (e.g., Saccharomyces, Kluyveromyces), une cellule eucaryote, notamment humaine (fibroblaste, hépatocyte, etc.).
Selon un autre mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, le composé
capable d'augmenter l'activité transcriptionnelle de la protéine TReP-1 32 est représenté par tout composé augmentant la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au promoteur d'un gène cible de la protéine TReP-132. On entend par gène cible de la protéine TReP-132 tout gène dont la transcription est régulée par la protéine TReP-132, notamment les gènes p27, p21 et p16. La présente demande montre en effet que la protéine TReP-132 est capable de stimuler l'expression des gènes p27, p21 et p16. La présente invention met donc en évidence une nouvelle voie et de nouvelles cibles moléculaires, utilisables dans le cadre d'approches thérapeutiques efficaces.

Un objet de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un composé augmentant la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au promoteur d'un gène cible de la protéine TReP-132 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une maladie proliférative.

Dans un mode préféré de mise en oruvre de l'invention, on utilise un composé
qui augmente l'activité du promoteur d'un gène cible de la protéine TReP-132.

Dans le cadre de l'invention, les gènes cibles de la protéine TReP-132 sont notamment les gènes codant pour p21, p27 ou p16. Un tel composé peut être sélectionné, validé
ou optimisé selon différentes approches, et notamment au moyen d'un test de liaison ou d'un test transcriptionnel utilisant un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un promoteur ayant la séquence de tout ou partie du promoteur du gène p27, p21 ou p16.
Un tel composé peut être un peptide dérivé de la protéine TReP-132, un anticorps, une petite molécule, etc.

Bien que toute approche permettant d'augmenter ou de mimer l'activité de la protéine TReP-132 soit utilisable dans le cadre de la présente invention, on préfère tout particulièrement les stratégies, molécules et conditions permettant d'augmenter la synthèse de la protéine TReP-132, notamment l'emploi d'un acide nucléique codant la protéine TReP-132. A cet égard, un objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un acide nucléique codant la protéine TReP-132 pour la préparation d'une composition destinée au traitement d'une maladie proliférative.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé modulant la formation ou l'activité du complexe comprenant la protéine TReP-132, Sp1 et un récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes, e.g., un récepteur de la progestérone ou un récepteur des oestrogènes, pour la préparation d'une composition destinée au traitement d'une maladie proliférative, en particulier d'un cancer hormono-dépendant.

Préférentiellement, le composé test module l'interaction de la protéine TReP-132, de Sp1 et d'un récepteur d'une ou de plusieurs hormones (en particulier stérôides, e.g., un récepteur de la progestérone ou un récepteurs des oestrogènes), module la liaison du complexe comprenant la protéine TReP-132, Sp1 et un tel récepteur aux promoteurs de gènes cibles de TReP-132 ou module l'action du complexe comprenant la protéine TReP-132, Sp1 et un récepteur tel que décrit ci-dessus sur le promoteur d'un gène cible.

Dans le cadre de l'invention, les gènes cibles sont en particulier les gènes p21, p27 et/ou p16.

L'invention peut être mise en oruvre dans le traitement d'une maladie proliférative, telle que le cancer. Préférentiellement, l'invention est utilisée pour traiter les cancers hormono-dépendants, en particulier les cancers sensibles à un dérèglement de la synthèse et/ou de l'activité de la progestérone ou de l'cestradiol, encore plus préférentiellement, le cancer du sein ou de l'utérus.

Utilisation des composés :

Compte tenu des propriétés fonctionnelles physiologiques de la cible utilisée, les composés selon l'invention peuvent être utilisés dans le cadre du traitement d'une maladie proliférative et notamment dans le traitement d'un cancer. Les composés selon l'invention sont en particulier les composés capables de mimer ou d'augmenter l'activité
de la protéine TReP-132, les composés capables de moduler la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes, e.g., un récepteur de la progestérone ou un récepteur des oestrogènes, ou les composés capables de moduler la formation ou l'activité du complexe comprenant la protéine TReP-132, Sp1 et le récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes, e.g., un récepteur de la progestérone ou un récepteur des oestrogènes. Les composés selon l'invention sont notamment les composés identifiés à
l'aide d'une méthode telle que décrite précédemment.
Dans le contexte de l'invention, le terme traitement désigne le traitement préventif, curatif, palliatif, ainsi que la prise en charge des patients (réduction de la souffrance, amélioration de la durée de vie, amélioration de la qualité de vie, ralentissement de la progression de la maladie, réduction de la taille d'une tumeur), etc. Le traitement peut en outre être réalisé en combinaison avec d'autres agents ou traitements, notamment adressant des voies métaboliques distinctes. Il peut aussi être combiné à des traitements d'hormono-, de chimio- ou de radio-thérapie, par exemple. Un traitement combiné particulier comporte l'utilisation séquentielle, simultanée ou séparée d'un composé augmentant ou mimant l'activité de la protéine TReP-132 et d'une hormone.
Un autre traitement combiné particulier comporte l'utilisation séquentielle, simultanée ou séparée d'un composé stimulant la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes, e.g., au récepteur de la progestérone ou au récepteur des oestrogènes et d'une hormone.

Un objet particulier de l'invention concerne ainsi l'utilisation d'une composition selon 5 l'invention destinée au traitement d'une maladie proliférative en combinaison avec une hormone pour une administration simultanée, séparée ou séquentielle.

L'invention est utilisable pour le traitement de maladies prolifératives affectant les mammifères, et l'homme en particulier. Les résultats fournis dans les exemples

10 démontrent la capacité de la protéine TReP-132 à inhiber la prolifération cellulaire, notamment celle des cellules tumorales, et à bloquer la progression du cycle cellulaire.
On entend par maladie proliférative au sens de l'invention toute pathologie caractérisée par ou associée à une dérégulation du cycle cellulaire et/ou à une prolifération 15 incontrôlée ou pathologique de cellules. Des exemples typiques de telles pathologies sont notamment les cancers, la sténose, la fibrose, le psoriasis, etc.
L'invention est particulièrement adaptée au traitement du cancer, et notamment des tumeurs solides, primaires ou métastasées. On peut citer notamment les cancers du poumon, du foie, du colon, les cancers tête-et-cou, du cerveau, de la vessie, de la rate, de la peau, du sein, 20 de la prostate, de l'utérus, du thymus, etc. Il s'agit en particulier des cancers hormono-dépendants et en particulier des cancers typiquement féminins que sont les cancers du sein et de l'utérus.

Un objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé tel que défini ci avant pour la préparation d'une composition destinée au traitement d'une maladie proliférative, notamment pour le traitement d'un cancer. L'invention fournit également des méthodes de traitement des maladies prolifératives basées sur l'utilisation de composés définis ci avant.

L'invention concerne notamment l'utilisation d'un composé tel que défini ci avant pour réduire la prolifération de cellules tumorales chez un patient, ainsi qu'une méthode correspondante.

L'invention concerne aussi l'utilisation d'un composé tel que défini ci avant pour réduire la progression d'une tumeur, ou pour induire une régression de la taille d'une tumeur chez un patient, ainsi qu'une méthode correspondante.

L'invention concerne encore l'utilisation d'un composé tel que défini ci-avant pour induire l'apoptose de cellules tumorales chez un patient, ainsi qu'une méthode correspondante.

Tests de Criblage L'invention concerne des méthodes pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs modulant, de préférence diminuant, la prolifération cellulaire, basées sur la mesure de la modulation de la liaison ou de l'activité de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant TReP-132 à un récepteur hormonal ou à un gène cible, la mesure de la modulation de la liaison ou de l'activité
du complexe comprenant la protéine TReP-132 et un récepteur hormonal sur le promoteur d'un gène cible ou la mesure de la modulation de la liaison du complexe comprenant la protéine TReP-132, un récepteur hormonal (par exemple un récepteur de la progestérone ou des oestrogènes) et son hormone ainsi que le facteur de transcription Sp1 au promoteur d'un gène cible.
L'invention concerne en particulier des méthodes pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs modulant la prolifération cellulaire, comprenant la détermination de la capacité d'un composé test à moduler, i.e., mimer, augmenter ou favoriser la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes, e.g., au récepteur de la progestérone ou au récepteur des oestrogènes, ledit récepteur étant éventuellement complexé au facteur de transcription Sp1.

A cet égard, les tests de criblage selon l'invention reposent, d'une manière générale, sur la sélection de composés capables d'augmenter ou de favoriser la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stérôides ou encore de diminuer ou d'inhiber la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes.

Un autre objet de l'invention concerne des méthodes pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs, comprenant la détermination de la capacité d'un composé test à moduler l'action de la protéine TReP-132 sur le promoteur d'un gène cible de la protéine TReP-132.
Les tests de criblage selon l'invention reposent, d'une manière générale, sur la sélection de composés capables de moduler l'expression de gènes cibles de la protéine TReP-132 (Criblage d'expression) ou sur la sélection de composés capables de moduler la liaison de la protéine TReP-132 sur l'un ou plusieurs de ses gènes cibles (test de liaison), c'est-à-dire de gènes dont l'expression est régulée par cette protéine.
L'invention concerne aussi un test de criblage de composés modulant la formation ou l'activité. du complexe comprenant un récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes telles que la progestérone ou les oestrogènes et éventuellement la protéine TReP-132 et/ou le facteur de transcription Sp1. A cet égard, les tests de criblage selon l'invention reposent sur la sélection de composés capables de moduler l'expression d'un ou de plusieurs gènes cibles du complexe comprenant un récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes, et éventuellement la protéine TReP-132 et/ou le facteur de transcription Sp1.
Dans le cadre de l'invention, les gènes cibles de la protéine TReP-132 sont en particulier les gènes p21, p27 et p16.

Un autre aspect de l'invention concerne des méthodes pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs, comprenant la mesure de l'expression d'un gène rapporteur placé sous le contrôle de tout ou partie de la séquence du promoteur du gène TReP-132, en présence d'un composé test.

Plus particulièrement, l'invention fournit des méthodes de criblage destinées à
sélectionner, identifier ou caractériser des composés biologiquement actifs ou des méthodes utilisables pour la validation, caractérisation, optimisation ou production des composés.

Les méthodes selon l'invention peuvent être mises en oeuvre de différentes façons, en tests in vitro, cellulaires ou acellulaires, ou in vivo.

A - Méthodes basées sur un test de liaison Un objet de l'invention réside dans une méthode pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs, comprenant la détermination de la capacité d'un composé test à moduler la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stérôides.
Préférentiellement, la méthode comprend la détermination de la capacité d'un composé
test à diminuer ou à inhiber la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stérôides. Encore plus préférentiellement, la méthode comprend la détermination de la capacité d'un composé test à mimer, à augmenter ou à favoriser la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes.

Un objet de l'invention concerne, dans ce mode de réalisation des méthodes pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs modulant la prolifération cellulaire, comprenant :
a) la mise en contact d'un composé test avec :
i) la protéine TReP-132 ou un complexe comprenant la protéine TReP-132, et ii) le récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes, et b) la mesure de la liaison de la protéine TReP-132 ou du complexe comprenant la protéine TReP-1 32 avec ledit récepteur.
Dans le cadre de l'invention, le récepteur des hormones stérôides est un récepteur des oestrogènes (ER) ou un récepteur de la progestérone (PR), préférentiellement, le récepteur de la progestérone (PR).

Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation, in vitro ou ex vivo, de composés actifs diminuant la prolifération cellulaire, comprenant :
a) la mise en contact, en présence de la progestérone ou d'orstrogènes, d'un composé test avec :
i) respectivement le récepteur de la progestérone ou des oestrogènes , ii) Sp1, et iii) un acide nucléique comprenant tout ou partie du promoteur d'un gène cible de la progestérone ou des oestrogènes, et b) la mesure de la liaison de Sp1 ou du complexe comprenant le récepteur de la progestérone ou des oestrogènes et Sp1 audit promoteur, ou la mesure de l'expression dudit promoteur, ladite mesure étant une indication de l'effet du composé test sur la prolifération cellulaire.

La mise en contact est éventuellement réalisée en présence de la protéine TReP-ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132. Préférentiellement, la mise en contact est réalisée dans une cellule.

Comme indiqué ci-dessus, le gène cible des hormones stéroïdes est avantageusement choisi parmi les gènes p21, p16 et/ou p27.
Un autre objet de l'invention comprend une méthode pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs comprenant la détermination de la capacité d'un composé test à moduler la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 sur le promoteur des gènes cibles de la protéine TReP-132, notamment des gènes p27, p21 et p16.

Dans un autre mode de réalisation, la méthode comprend :
a) la mise en contact du composé test en présence de TReP-132 avec une construction d'acide nucléique comprenant une séquence de tout ou partie d'un promoteur du gène p21, p27 ou p16 ou d'une région de celui ci comprenant le site de liaison de la protéine TReP-132 ou d'un élément de réponse de la protéine TReP-et, b) la détermination de la liaison dudit composé test sur l'acide nucléique cible et/ou sur le complexe formé par la liaison de TReP-132 à son ou ses éléments de réponse ou sites de fixation.

Pour la mise en oeuvre du test de liaison, il est possible d'utiliser un acide nucléique comprenant tout ou partie de la séquence du promoteur, et de déterminer in vitro la capacité d'un composé test à lier celle-ci. La partie de la séquence comporte de préférence au moins 10 nucléotides consécutifs de la séquence du promoteur, encore plus préférentiellement au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence du promoteur. Par ailleurs, il est possible de tester en parallèle plusieurs fragments de la séquence du promoteur.

5 La capacité dudit composé test à moduler la liaison de TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes ou à l'élément de réponse d'un gène cible de la protéine TReP-132 peut être mesurée en déterminant la quantité de TReP-132 liée en présence du composé test par rapport à cette quantité en l'absence du composé
test ou en effectuant la réaction en présence de la protéine TReP-132 marquée et en 10 mesurant le déplacement de la liaison de la protéine marquée par le composé
test.

Ces tests peuvent être réalisés in vitro, dans tout dispositif approprié
(tube, boite, flasque, etc.). Ils peuvent éventuellement être réalisés avec l'un des partenaires immobilisé, par exemple l'acide nucléique (colonne, bille, support, verre, filtre, 15 membrane, etc.).

La liaison du composé test dans le cadre des méthodes selon l'invention peut être mise en évidence grâce à une migration sur gel, une électrophorèse ainsi que par d'autres méthodes basées sur la luminescence ou utilisant la technique FRET
(Fluorescence 20 Resonance Energy Transfer) ou la technique SPA (Scientillation Proximity Assay), ou par toute autre technique connue de l'homme du métier.

B - Méthodes basées sur un criblacge d'expression 25 Un autre objet de l'invention est basé sur l'activité transcriptionnelle de la protéine TReP-1 32 (test d'activité transcriptionnelle).

Selon un premier mode préféré de réalisation de l'invention, la méthode pour la sélection, l'identification ou l'optimisation de composés actifs comprend :
a) La mise en contact d'un composé test avec un acide nucléique rapporteur comprenant un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un promoteur comprenant tout ou partie de la séquence du promoteur du gène codant pour la protéine TReP-132 et, b) La mesure de l'expression du gène rapporteur.

Un autre objet de l'invention comprend la détermination de la capacité d'un composé
test à moduler l'expression d'un ou de plusieurs gènes cibles de la protéine TReP-132, notamment des gènes p21, p16 et/ou p27.

Dans ce mode de réalisation, la méthode comprend :
a) la mise en contact d'un composé test, en présence de la protéine TReP-132, avec un acide nucléique rapporteur comprenant un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un promoteur comprenant tout ou une partie de la séquence du promoteur du gène p21, p16 ou p27 ou du site de liaison de la protéine TReP-132 ou d'un élément de réponse de la protéine TReP-132 et, b) la détermination de l'effet du composé test sur l'expression du gène rapporteur.
Selon un mode d'exécution particulier des méthodes selon l'invention, les effets éventuels obtenus sont comparés avec les effets éventuels déterminés grâce à
une méthode réalisée dans les mêmes conditions mais avec une construction d'acide nucléique comprenant au moins un variant inactif (par exemple une copie mutée) de la séquence du promoteur du gène p27, p21 ou p16 ou d'une région de celui-ci comprenant le site de liaison de la protéine TReP-132 ou un élément de réponse de TReP-1 32.
Des études ont démontré la capacité de TReP-132 d'interagir directement avec l'ADN
pour réguler l'activité de promoteurs. Par ailleurs, il a également été montré
que TReP-132 interagit avec d'autres protéines liant l'ADN pour réguler la transcription. Ainsi, TReP-132 peut fonctionner comme co-régulateur de récepteurs nucléaires tels que SF-1 pour réguler l'expression de gènes. De ce fait, TReP-132 peut aussi réguler l'activité
de promoteurs sans interagir avec l'ADN.

Compte tenu de la capacité de TReP-132 à fonctionner comme co-régulateur de récepteurs nucléaires, la protéine entière ou des fragments de celle-ci peuvent être utilisés dans un test de recrutement de protéines nécessitant la présence d'un ligand ainsi que pour le criblage de ligands de récepteurs nucléaires partenaires. La protéine d'un récepteur nucléaire X peut être incubée avec la protéine TReP-132 entière ou avec des fragments de celle-ci, afin de permettre le recrutement du polypeptide TReP-132 par le récepteur nucléaire, en présence du ligand. Selon le type de marquage du récepteur nucléaire et du polypeptide TReP-132, il est possible de mesurer l'interaction protéine-protéine ou le recrutement de protéine par différentes techniques, incluant la fluorescence, le comptage de scintillation radioactive ou la calorimétrie. Les composés isolés peuvent conduire à une augmentation ou à une diminution du recrutement de TReP-132 dans le mécanisme d'expression du gène. En utilisant ces approches, il est possible de cribler des composés se liant à des récepteurs nucléaires qui affectent l'expression de gènes cibles régulés par TReP-1 32.

Un objet particulier de l'invention concerne une méthode pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs comprenant la détermination de la capacité d'un composé test à moduler l'activité du complexe constitué d'au moins la protéine TReP-132 et d'un récepteur à une ou plusieurs hormones stéroïdes.

Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs comprenant la détermination de la capacité d'un composé test à moduler l'expression de gènes cibles du complexe comprenant la protéine TReP-132 et un récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes.

Dans le cadre de ce mode de réalisation particulier de l'invention, la méthode comprend :
a) la mise en contact du composé test avec la protéine TReP-132 et un acide nucléique rapporteur comprenant un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un promoteur comprenant la séquence du promoteur d'un gène cible du complexe comprenant la protéine TReP-132 et un récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes, ou une région dudit promoteur comprenant le site de liaison du complexe ou un élément de réponse du complexe et, b) la mesure de l'expression dudit gène rapporteur.

Dans le cadre de l'invention, le récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes est un récepteur des oestrogènes (ER) ou un récepteur de la progestérone (PR).

Les gènes cibles de la protéine TReP-1 32 sont notamment les gènes codant pour p27, p21 ou p16.

Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation, in vitro ou ex vivo, de composés actifs diminuant la prolifération cellulaire, comprenant :
a) la mise en contact, en présence de la progestérone ou d'cestrogènes, d'un composé
test avec :
i) respectivement le récepteur de la progestérone ou aux oestrogènes , ii) Sp1, et iii) un acide nucléique comprenant tout ou partie du promoteur d'un gène cible de la progestérone ou des oestrogènes, et b) la mesure de la liaison de Sp1 ou du complexe comprenant le récepteur de la progestérone ou des oestrogènes et Sp1 audit promoteur, ou la mesure de l'expression dudit promoteur, ladite mesure étant une indication de l'effet du composé test sur la prolifération cellulaire.

Les procédés de l'invention peuvent être mis en oeuvre avec différents types de cellules, de promoteurs, de gènes rapporteurs, et dans différentes conditions, comme il est décrit ci-après.

Cellule hôte :
Certaines méthodes de criblage, utilisées dans le cadre de la présente invention, comprennent une étape de mise en contact du composé test avec une cellule hôte, dans des conditions particulières permettant de déterminer l'expression dans ladite cellule d'un gène rapporteur ou de la protéine TReP-132, de mettre éventuellement en évidence d'autres étapes de la synthèse de la protéine TReP-132, et d'obtenir ainsi une information concernant l'effet du composé test. Classiquement, l'effet du composé test est comparé au niveau d'expression du gène rapporteur ou à l'activité du produit d'expression déterminés en l'absence dudit composé.
Les cellules utilisées peuvent être choisies parmi toutes les cellules cultivables en laboratoire. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, il s'agit de cellules de mammifères (hépatocytes, fibroblastes, cellules endothéliales, musculaires, glandes mammaires, etc.). De manière encore plus préférée, ces cellules sont d'origine humaine. Il peut s'agir de cultures primaires ou de lignées établies. Dans un autre mode de mise en oeuvre, il est possible également d'utiliser des cellules procaryotes (bactéries), des cellules de levure (Saccharomyces, Kluyveromyces, etc.), des cellules végétales, etc.

Système rapporteur :

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, cette dernière met en oruvre un système rapporteur comprenant un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un promoteur particulier. Cette construction, ou toute cassette ou vecteur la contenant, peut être introduite dans des cellules hôtes, utilisables pour des tests cellulaires.

Pour la mise en oeuvre du test transcriptionnel, un système rapporteur comprenant tout ou partie du promoteur du gène cible lié de manière opérationnelle à un gène rapporteur est avantageusement utilisé.

Ledit gène rapporteur peut être notamment tout gène dont le produit de transcription ou d'expression peut être détecté ou dosé dans des extraits biologiques. Il peut s'agir, par exemple, du gène codant pour la luciférase et plus particulièrement pour la luciférase de luciole ou pour celle de Renilla, pour la phosphatase alcaline sécrétée, la galactosidase, la lactamase, la Chloramphénicol acétyle transférase (CAT), l'hormone de croissance humaine (hGH), la P-glucuronidase (Gluc) et la Green fluorescent protein (GFP) etc. Il est entendu que le terme gène désigne au sens large tout acide nucléique, notamment un ADNc, un ADNg, un ADN synthétique, un ARN, etc.

Le gène rapporteur, quel qu'il soit, est placé sous le contrôle d'un promoteur comprenant tout ou partie de la séquence du promoteur d'un gène cible de la protéine TReP-132 ou du complexe comprenant la protéine TReP-132 et un récepteur d'une ou de plusieurs hormones stérôides, du promoteur du gène codant pour la protéine TReP-132, du promoteur du complexe comprenant la protéine TReP-132, Sp1 et un récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes ou d'un variant fonctionnel de celle-ci, tel que défini ci-avant. Préférentiellement, il s'agit d'un promoteur dont le différentiel d'activité en présence et en l'absence de TReP-132 ou d'un équivalent fonctionnel de ce dernier peut être détecté.

Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, le gène rapporteur est placé
sous le contrôle d'un promoteur qui comprend la séquence complète du promoteur d'un gène cible de la protéine TReP-132, d'un gène cible du complexe comprenant la protéine TReP-132 et un récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes, du promoteur du complexe comprenant la protéine TReP-132, Sp1 et un récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes ou du promoteur du gène codant la protéine TReP-132. A cet égard, un objet de l'invention concerne également un acide nucléique 5 comprenant un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un promoteur comprenant tout ou partie de la séquence du promoteur du gène p27, p21 ou p16, notamment du promoteur humain. La partie éventuellement sélectionnée de la séquence du promoteur comprend avantageusement au moins 10 nucléotides consécutifs de cette séquence, de préférence au moins 20, plus préférentiellement au moins 30, encore plus 10 préférentiellement au moins 50. Le promoteur peut comprendre en outre des régions hétérologues, provenant d'autres gènes ou promoteurs, comme par exemple des signaux silencers ou enhancers, des séquences conférant un caractère régulable ou spécifique de tissu, etc. Ces séquences particulières peuvent être présentes à
raison d'une ou de plusieurs copies dans le promoteur (préférentiellement 1 à 10 et encore 15 plus préférentiellement 1 à 6), en amont, en aval ou en interne, dans la même orientation ou dans l'orientation opposée. Le promoteur peut être un promoteur hybride associant des régions d'autres promoteurs, par exemple du promoteur du gène de la thymidine kinase (TK) du virus de l'herpès, du promoteur immédiat du CMV, du promoteur PGK, du promoteur SV40, etc.
20 En outre, les différents domaines fonctionnels mentionnés ci-dessus peuvent être liées directement les uns aux autres, ou séparés par des nucléotides n'affectant pas significativement le caractère fonctionnel de la cassette d'expression ou conférant des caractéristiques ou performances améliorées au système (amplificateur, silencer, intron, site d'épissage, etc.).
La construction peut être introduite dans tout vecteur approprié, tel qu'un plasmide, un cosmide, un phage, un virus, etc. La construction ou le vecteur peut être introduit dans une cellule hôte par tôute méthode classique, incluant notamment l'électroporation, la précipitation au phosphate de calcium, les liposomes, les agents transfectants, etc. Les cellules ou leur descendance peuvent être cultivées dans tout milieu approprié
(DMEM, RPMI, etc.).

Mise en contact :

Les composés tests peuvent être mis au contact des cellules à différents moments, selon leur(s) effet(s), leur concentration, la nature des cellules et l'appréciation technique.

Le contact peut être effectué sur tout support approprié et notamment sur une plaque, une boîte, dans un tube ou une flasque. Généralement, la mise en contact est réalisée sur une plaque multi-puits ce qui permet de conduire, en parallèle, des essais nombreux et variés. Parmi les supports typiques on trouve des plaques de microtitration et plus particulièrement des plaques 96 ou 384 puits (ou plus), faciles à
manipuler.

Selon le support et la nature du composé test, des quantités variables de cellules peuvent être utilisées lors de la mise en oruvre des méthodes décrites. De manière classique, entre 103 et 106 cellules sont mises en contact avec un composé
test particulier, dans un milieu de culture approprié, et de manière préférentielle entre 104 et 105 cellules. A titre d'exemple : dans une plaque de 96 puits, 105 cellules peuvent être incubées dans chaque puit avec une quantité voulue d'un composé test ; dans une plaque à 384 puits, moins de 105 cellules et typiquement entre 1x104 et 4x104 cellules sont généralement incubées dans chaque puit avec le composé test.
La quantité (ou la concentration) de composé test peut être ajustée par l'utilisateur en fonction des caractéristiques dudit composé (sa toxicité, sa capacité de pénétration cellulaire, etc.), du nombre de cellules, de la longueur de la période d'incubation, etc.
Généralement, les cellules sont exposées à des quantités de composés test qui varient entre 1 nM et 1 mM. Il est bien sûr possible de tester d'autres concentrations sans dévier de la présente invention. Chaque composé peut de plus être testé en parallèle à
différentes concentrations.
Différents adjuvants et/ou vecteurs et/ou produits facilitant la pénétration des composés dans les cellules tels que des liposomes, des lipides cationiques ou des polymères peuvent en outre être utilisés, si nécessaire.

Le contact est typiquement maintenu entre quelques minutes et plusieurs heures, généralement entre 1 et 48 heures. En particulier, lorsque le test comprend l'expression d'un gène rapporteur, les cellules et les divers réactifs doivent, de préférence, rester en contact suffisamment longtemps pour permettre la synthèse de novo du produit d'expression du gène rapporteur.

Mesure de l'effet :

La mesure ou la mise en évidence d'un effet du composé test peut être réalisée de différentes façons, selon le test utilisé.
Des méthodes de détection de la liaison in vitro ont été mentionnées ci-avant.

Les tests d'activité transcriptionnelle comprennent une étape de détermination et de détection de l'expression du gène rapporteur.
Il peut s'agir d'une détermination de l'activité transcriptionnelle. A cette fin, l'ARN total est extrait des cellules en culture dans des conditions expérimentales d'une part et dans une situation témoin d'autre part. Cet ARN est dosé (ou utilisé comme sonde) pour analyser les changements dans l'expression du ou des gène(s) rapporteur(s).
Il peut également s'agir d'une révélation ou d'un dosage du produit d'expression du gène rapporteur. Cette révélation (ou ce dosage) peut être obtenue à l'aide de techniques variées dont la nature dépend du type de gène rapporteur utilisé.
La mesure peut, par exemple, correspondre à une densité optique ou à une émission fluorescente dans le cas d'une utilisation comme gène rapporteur du gène codant pour la galactosidase ou la luciférase.
L'expression du gène rapporteur peut encore être mesurée à travers le niveau d'hydrolyse d'un substrat du produit d'expression du gène rapporteur, comme par exemple un substrat de la P-lactamase. On peut citer notamment tout produit contenant un noyau (3-lactame et dont l'hydrolyse peut être contrôlée. Les substrats préférés sont ceux spécifiques de la P-lactamase (i.e., ils ne sont généralement pas hydrolysés dans les cellules de mammifères en l'absence de (3-lactamase), ceux qui ne sont pas toxiques à l'égard des cellules de mammifères et/ou dont le produit d'hydrolyse peut être contrôlé facilement, par exemple par des méthodes basées sur la fluorescence, la radioactivité, une activité enzymatique ou toute autre méthode de détection.
Des substrats encore plus préférés sont les substrats radiométriques.
L'hydrolyse de ces substrats peut être directement corrélée à l'activité du produit d'expression du gène rapporteur par le nombre de cellules.

Le produit d'expression peut également être dosé par des techniques immunologiques ou immunoenzymatiques, impliquant par exemple un anticorps spécifique. Ce système est particulièrement adapté pour doser par exemple la protéine TReP-132 synthétisée par une cellule traitée ou non traitée par un composé test.

D'une manière générale, la présence du produit du gène rapporteur (ou du produit d'hydrolyse du substrat) peut être déterminée par des méthodes classiques connues de l'homme du métier [fluorescence, radioactivité, D.O., luminescence, FRET (voir WO
0037077), SPA, biopuces, méthodes immunologiques, etc.]. Généralement, on détermine l'activité d'un composé test dans une cellule et cet effet est comparé au niveau d'activité en l'absence de composé test ou à une valeur moyenne déterminée en l'absence de tout composé test.
La mesure de l'hydrolyse implique essentiellement une mesure (ou la détermination de la quantité relative) du produit d'hydrolyse contenu dans chaque échantillon réactionnel grâce à différentes techniques connues de l'homme du métier, incluant la détection d'une fluorescence, d'une radioactivité, d'une couleur, d'une activité
enzymatique, d'un complexe immun antigène-anticorps.

Un test secondaire permettant de valider la sélection des composés peut être réalisé, par exemple par la détermination de la prolifération cellulaire en culture ou chez l'animal, ou par comparaison avec des cellules ou animaux non traités.

La présente invention est particulièrement adaptée à la sélection, l'identification ou la caractérisation d'un nombre important de composés. Ce criblage simple et efficace peut être accompli en un laps de temps très court. Les méthodes décrites peuvent en particulier être partiellement automatisées, autorisant ainsi le criblage efficace et simultané de composés divers et nombreux, soit sous forme de mélange soit sous forme séparée.

Les méthodes décrites précédemment pour la sélection, l'identification et la caractérisation de composés test selon l'invention peuvent être utilisés pour la sélection, l'identification et la caractérisation de composés capables d'inhiber la prolifération cellulaire et/ou de réguler le cycle cellulaire.

D'autres objets de l'invention concernent une méthode de détection d'une prédisposition, une méthode de diagnostic, une méthode de suivi et de mesure de l'agressivité d'une maladie proliférative comprenant la mesure de la liaison de la protéine TReP-132 à une ou à plusieurs hormones stéroïdes dans un échantillon prélevé sur un mammifère, en particulier chez l'homme. Comme indiqué
précédemment, le récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes est préférentiellement un récepteur de la progestérone (PR) ou un récepteur des oestrogènes (ER).
Les méthodes mentionnées ci-dessus peuvent comprendre ou impliquer uniquement le dosage de la protéine TReP-1 32.

Un objet particulier de l'invention concerne par ailleurs une méthode de détection d'une prédisposition, de diagnostic, de suivi et de mesure de l'agressivité d'une maladie proliférative comprenant la détection, chez un patient, de la surexpression de l'cestradiol, de la diminution de la progestérone ou d'une diminution de l'expression des CDKIs p21, p16 et/ou p27.
Composés test.

Les composés susceptibles d'être identifiés à l'aide d'un procédé selon l'invention peuvent être des composés de nature, structure et origine variées, notamment des composés biologiques, des facteurs nucléaires, des cofacteurs, des composés chimiques, synthétiques, etc.
La présente invention peut donc être appliquée à tout type de composé test.
Ainsi, le composé test peut être tout produit qui se présente sous une forme isolée ou en, mélange avec d'autres produits. Le composé peut être défini en termes de structure et/ou de composition ou être défini sur le plan fonctionnel. Le composé peut, par exemple, être un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé de structure indéfinie, un mélange de produits connus et caractérisés ou une composition indéfinie comprenant un ou plusieurs produits. Un ou plusieurs composés peuvent ainsi être testés, en mélange ou de manière séparée. De telles compositions indéfinies peuvent être, par exemple, des échantillons de tissus, des fluides biologiques, des surnageants cellulaires, des préparations végétales, etc. Les composés test peuvent être choisis parmi un produit inorganique ou organique et notamment un polypeptide, une protéine ou un peptide, un acide nucléique, un lipide, un polysaccharide et un composé
chimique ou biologique. Il peut s'agir par exemple d'un facteur nucléaire, d'un cofacteur ou de tout mélange ou dérivé de ces derniers. Le composé peut être d'origine naturelle ou synthétique et inclure une banque combinatoire, un clone ou une banque de clones d'acides nucléiques exprimant un ou plusieurs polypeptide(s) liant l'ADN, etc.
Composition pharmaceutique Un objet particulier de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un composé augmentant ou mimant l'activité de la protéine TReP-132 et un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique.
Préférentiellement, cette composition pharmaceutique est utilisée en combinaison avec 10 une hormone pour une administration simultanée, séparée ou séquentielle.

Encore plus préférentiellement, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend la protéine TReP-132 ou un analogue de cette dernière dans un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique.
La présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un composé modulant, en particulier mimant, augmentant ou favorisant, la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes et un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique.
Préférentiellement, la composition pharmaceutique comprend un composé
stimulant la liaison de la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes et un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique. Encore plus préférentiellement, la composition pharmaceutique comprend un composé augmentant la liaison de la protéine TReP-132 au récepteur de la progestérone (PR) ou à celui des oestrogènes (ER).

Un autre objet de l'invention réside dans une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend, dans un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique, un composé stimulant l'activité du complexe comprenant la protéine TReP-132 et un récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes.

Un autre objet particulier de l'invention concerne une composition pharmaceutique, caractérisé en ce qu'elle comprend, dans un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, un composé modulant, en particulier mimant, augmentant ou favorisant, l'action de la protéine TReP-132 sur l'un des promoteurs de ses gènes cibles, notamment celui d'un gène codant pour p21, p27 ou p16.

La présente invention concerne aussi une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique, un acide nucléique codant la protéine TReP-132. De manière préférée, l'acide nucléique est incorporé à un vecteur d'expression, de préférence à un vecteur plasmidique ou viral.

Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant, dans un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, un composé modulant la formation ou l'activité du complexe comprenant la protéine TReP-132, Sp1 et un récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes.

Un objet particulier de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant : dans un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, un composé
choisi parmi la protéine TReP-132, un analogue de cette dernière, un composé
augmentant ou mimant l'activité TReP-1 32 et un composé identifié à l'aide de l'une des méthodes selon l'invention, combiné à une ou à plusieurs hormones, en vue d'une administration simultanée, séparée ou séquentielle pour traiter une maladie proliférative.
De manière préférée, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend un composé identifié à l'aide d'une méthode telle que décrite précédemment. De manière encore plus préférée, le composé choisi est TReP-1 32.
De manière préférée, l'hormone combinée au composé choisi est la progestérone.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention, destinées au traitement de maladies prolifératives, peuvent notamment être préparées selon un procédé
comprenant une étape impliquant une méthode telle que décrite précédemment.

Les compositions pharmaceutiques selon l'invention comprennent avantageusement un ou plusieurs excipients ou véhicules, acceptables sur le plan pharmaceutique.
On peut citer par exemple des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, surfactants, conservateurs, etc.
D'autre part, les compositions selon l'invention peuvent comprendre d'autres agents ou principes actifs.
Les composés ou compositions selon l'invention peuvent être administrés de différentes manières et sous différentes formes. Les composés de l'invention sont typiquement administrés par voie systémique, de préférence locale. On peut citer avantageusement l'injection intra-tumorale ainsi que l'injection dans une zone proche de la tumeur ou irriguant une tumeur.

Des doses variées peuvent être mises en oruvre, selon le composé, le nombre d'administrations, l'association avec d'autres principes actifs, le stade d'évolution de la pathologie, etc.
La présente invention représente une nouvelle stratégie efficace et avantageuse de traitement des maladies prolifératives. Elle est en effet basée sur la caractérisation d'une voie métabolique naturelle sur laquelle des interventions sélectives peuvent être réalisées.

D'autres aspects et avantages de la présente demande apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

LEGENDE DES FIGURES

Figure 1: Effet de la protéine TReP-132 sur la formation de colonies résistantes au G418.

Figure 2: Expression de la protéine TReP-132 dans des cellules MCF-7 cancéreuses du sein, dépendantes des oestrogènes.

Figure 3: Induction de TReP-132 par la progestérone et abolition de l'inhibition de la prolifération des cellules T47-D par la progestérone suite à la suppression de l'ARNm de TReP-132 par la technique d'interférences-ARN ("siRNA") (Les cellules T47-D
sont traitées pendant les périodes de temps indiquées avec de la progestérone (30nM)). Les expériences ont été réalisées en triplicata, et les valeurs représentent les moyennes ET d'une expérience représentative.

Figure 3A: Analyse des taux d'ARNm TReP-1 32 par RT-PCR quantitative.
Figure 3B : Les cellules, transfectées avec les siRNA contrôle ou les siRNA
TReP-132 (400ng) à 0 et 3 jours, sont récupérées à 2, 4 ou 6 jours pour être comptées.
(ns : non significatifs - *, p<0.05 ; **, p<0.01 ; ***, p<0.001).
Figure 4: Système d'expression bidirectionnel Tet-Off.

Figure 5: Induction de l'expression de la protéine TReP-132 en absence de doxycycline.
Figure 6: Inhibition de la prolifération cellulaire par la protéine TReP-132.

Figure 7: Effet de l'induction de la protéine TReP-132 sur la transition Gl/S
du cycle cellulaire.
Figure 8A, 8B: Expression de l'ARNm de TReP-132 après synchronisation des cellules en fin de phase G1.

Figure 9: Effet de TReP-1 32 sur les activités CDK de la phase G, et sur les niveaux de phosphorylation de pRb.
Figure 9A : L'activité kinase associée à chaque CDK ou cycline immunoprécipitée a été
quantifiée en utilisant les substrats pRb pour la mesure des activités associées à la cycline D1 et à CDK6, ou l'histone H1 pour la mesure de l'activité de la cycline A et de la CDK2. Les niveaux de phosphorylation de l'histone H1 ou de pRb dans les cellules HTO (HeLa Tet Off) induites sont exprimés par rapport aux niveaux dans les cellules HTO non induites (correspondant au niveau 1.0).
Figure 9B : Les extraits protéiques (20 microgrammes) des cellules HTO
exprimant la GFP ou la GFP et TReP-132 sous le contrôle de la doxycycline, incubées ou non avec la Dox pendant les périodes de temps indiquées, sont analysés par Western-blot en utilisant des anticorps anti-pRb dirigés contre la totalité des pRb (hyperphopshorylée, phosphorylée et hypophosphorylée) ou seulement contre la pRb phosphorylée au niveau de la Ser 780, un résidu cible de la cycline D1/CDK4.

Figure 10: Effet de l'induction de l'expression de la protéine TReP-132 sur la transcription de gènes régulateurs clés du cycle cellulaire (CDK et CDKI).

Figure 11 : La protéine TReP-132 active les promoteurs de p16, p21 et p27.

Figure 12: Action synergique de la protéine TReP-132 avec Sp1 et p300 sur l'activation du promoteur p21.

Figure 13: Induction des activités des promoteurs des gènes p21 et p27 par TReP-132 mettant en jeu une interaction avec Sp1 dans les cellules Hela.
Figures 13A et 13B : les constructions rapporteurs Luciférase sous le contrôle des promoteurs p21 et p27 délétés ou mutés sont cotransfectées dans des cellules HeLa avec les plasmides d'expression Sp1 (0.1 microgrammes) et/ou TReP-132 (0.3 microgrammes). Les lysats cellulaires sont ensuite testés pour leur activité
luciférase.
Les résultats représentent les niveaux d'activité luciférase, les activités des constructions rapporteurs -2320p21 Luc et -3568p27 Luc étant arbitrairement fixées à
1Ø Les flèches indiquent les sites d'initiation de la transcription.
Figure 13C : Les cellules HTO-GFP ou HTO-GFP/TReP-132 incubées ou non avec la Dox pendant 48 heurés ont été récupérées pour extraction de la chromatine soluble.
Les immunoprécipitations (IPs) ont été réalisées avec l'anticorps anti-Flag.
Les PCR
contrôles sont effectuées sans ADN (H20) ou avec des l'ADN génomique non précipitée (input). Les extraits d'ADN sont amplifiés en utilisant les primers suivants :
zone -117/-65 du promoteur du gène p21, région distale du promoteur du gène p21 (1kb en amont du promoteur), zone -549/-511 du promoteur du gène p27, région distale du promoteur du gène p27 (1 kb en amont du promoteur) ou une zone du gène codant pour la béta-actine.
Figure 13D: les protéines GST-TReP-132 sont incubées avec du 35[S]-Spl et immobilisées sur une colonne Glutathion-sepharose. L'analyse des interactions spécifiques se fait par comparaison avec les résultats issus de l'incubation de la GST
seule avec du 35[S]-Sp1.
Sp1 input : 1/10ème du taux de Sp1 radioactive utilisée dans les incubations.
Figure 14: Augmentation de l'activation progestérone-dépendante des promoteurs des gènes p21 et p27 par TReP-132, via une augmentation des liaisons des sites de liaison Sp1 dans les cellules T47-D.
Figures 14A et 14B : les cellules T47-D sont cotransfectées avec des constructions rapporteurs contenant le promoteur p21 (Figure 14A) ou p27 (figure 14B). 12 heures après les transfections, les cellules sont incubées avec de la progestérone (30nM) ou de l'éthanol pendant 34 heures. Les lysats cellulaires sont ensuite testés pour leur activité luciférase. Les activités luciférase des constructions -93p21 Luc et -549p27 Luc représentent le niveau 1. Les flèches indiquent les sites de départ de transcription.
5 Figure 14C: la chromatine est issue des cellules T47-D traitées ou non à la progestérone (30nM). Les IPs sont réalisées avec les anticorps anti-TReP-132 (colonnes 2-3). Les contrôles incluent les PCR réalisées sans ADN (colonne 1, H20), les PCR réalisées avec AD N génomique non précipitée (colonnes 2 et 3, input), les immunoprécipitations réalisées sans anticorps (colonnes 4 et 5, no Ab) ou avec un 10 anticorps non pertinent (colonnes 6 et 7, anti-HA). L'ADN extrait est amplifié en utilisant les mêmes primers que ceux décrits pour la figure 13C.
Figure 14D à gauche : la GST-TReP-132 immobilisée sur glutathion-Sepharose est incubée avec le PR marqué à la 35[S]-Methionine, en absence ou avec des concentrations croissantes de progestérone (0-10 microM). Les interactions spécifiques 15 sont analysées par comparaison avec des expériences réalisées en incubant la GST
avec des 35[S]-PR, en présence de 100 microM de progestérone (GST).
Figure 14D à droite : la GST-TReP-132 wt, la GST-TReP-132 ml (mutée au niveau du site LRQLL) et la GST-TReP-132 m2 (mutée au niveau du site LEMLL) sont analysées au niveau de l'interaction avec 35[S]-PR tel que décrit précédemment, en présence de 20 10 microM de progestérone.
Input PR: 1/10ème du taux de PR radioactifs utilisé dans les expériences.

Figure 15 : Analyse de l'interaction entre TReP-132 et le récepteur des oestrogènes (ER).
25 La GST-TReP-132 wt est analysée au niveau de l'interaction avec 35[S]-ER, de la manière décrite précédemment.

EXEMPLES
MATÉRIELS ET MÉTHODES
1. Plasmides.
Le vecteur TReP-132-HA, correspondant à la région entière de l'ADNc de TReP-possédant en 3' l'épitope HA, est créé par amplification par PCR de TReP-132 avec les oligonucléotides introduisant un site fCpnl en 5' et un épitope HA et un site Xbal en 3'.
Les produits de PCR sont digérés avec Kpnl et Xbal et sous-clonés dans le vecteur d'expression pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Le plasmide GST-TReP-132 est réalisé par la fusion en phase de la région codante de TReP-1 32 en aval de la séquence GST du vecteur pGEX-2TK (Amersham Pharmacia Biotech, Baie d'Urfé, Québec, Canada). Les mutants GST-TReP-132m1 et GST-TReP-132m2 ont été créés en utilisant le kit QuickChange site-directed mutagenesis (Stratagene), par mutations des leucines en alanines dans les NR-box (Nuclear Receptor box) 1 et 2 (Gizard et al., 2002b). Le plasmide pBI-EGFP qui contient un promoteur bidirectionnel répondant à la tétracycline permettant de coexprimer un gène d'intérêt avec la protéine fluorescente verte (EGFP pour "Enhanced Green Fluorescent Protein"). Il provient de Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, ainsi que le plasmide pBi-EGFP-Luc contrôle, exprimant à
la fois la protéine GFP et la luciférase. Le plasmide pBl-EGFP-TReP-132 a été
réalisé
par clonage direct de l'ADNc complet de TReP-132 obtenu par PCR dans le site Nhel de pBI-EGFP. Toutes les constructions ont été validées par séquençage aux didéoxynucléotides. Le plasmide d'expression pcDNA3-Spl (Blais et al., 2002) et le plasmide rapporteur du gène humain de p21 WAF' contenant le fragment -1560/+34 (p21-Luc -1560/+34) sous-cloné dans le vecteur pGL3, ont été généreusement fourni par le Dr. Monté (IBL, France). De la même manière, les constructions -2320p21 Luc et -154p21 Luc ont été fournies généreusement par les Drs Kraft et Biggs (Div. Of Oncology, University of Colorado, Health Sciences center, Denver), la construction -93p21 Luc et ses mutants par Dr. Wang (Dept. Of Pharmacology, Duke University Medical Center, NC), et le plasmide rapporteur du gène humain p27K'p' sous-cloné dans vecteur basique pGL2 (Promega) par le Dr. Toshiyuki Sakai (Kyoto Prefectural University of Medecine, Japon). La région en 5' du gène humain codant pour p16 contenant la séquence nucléotidique de -1 à-369 par rapport à l'ATG, sous-clonée entre les sites Kpnl et Bglll de pGL2, a été généreusement fourni par le Dr Gordon Peters. La série de vecteurs rapporteurs de p16CDKN2 a été construite par cette équipe par sous-clonage de différents fragments de PCR générés avec des oligonucléotides spécifiques en 5' du gène.

2. Cultures cellulaires.
Les lignées cellulaires dérivées de cancer du sein cervicales HeLa et mammaires T47-D et MCF-7 et la lignée HeLa proviennent de l'ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) et sont cultivées en monocouche. Les cellules HeLa sont cultivées dans du milieu DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) (Life Technologies, Gaithersburg, MD), les cellules MCF-7 dans du milieu DMEM-F12 (composé d'un mélange égal de DMEM et de milieu Ham's F-12), et les cellules dans du milieu RPMI 1640. Tous les milieux sont additionnés de 10% de sérum bovin foetal (Hyclone, Logan, UT), de glutamine (2 mM), de pénicilline (50 U/ml) et de streptomycine (50 mg/ml) (Life Technologies, Ontario, CA). Pour les MCF-7, le milieu est supplémenté de 10-9 M d'orstradiol (E2) (Sigma-Aldrich CA Ltd.).
Pour les essais de transfections, les cellules HeLa et T47-D sont incubées 24 heures dans des plaques 24 puits à une densité initiale respective de 1.5x104 et 1.5x105 cellules par puit. Les cellules HeLa sont ensuite transfectées avec le transfectant ExGen 500 (MBI fermentas, Flamborough, Ontario, Canada) à un ratio de 4 microlitres d'ExGen 500 pour 0.5 microgrammes d'ADN et les cellules T47-D avec le transfectant FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals, Laval, Canada) à un ratio de 3:1 (FuGENE :ADN).
Les constructions rapporteurs pGL2 et pGL3 (100ng) sont cotransfectées avec les montants indiqués de vecteurs d'expression et lOng du plasmide contrôle pRL.Null. La quantité de plasmides a ensuite été normalisée avec le vecteur vide pcDNA3.
Après 12 heures de transfection, le milieu est changé et les cellules sont incubées pour une durée additionnelle de 10 et 34 heures respectivement. Durant cette période, les cellules T47-D sont cultivées en présence et en absence de progestérone (30nM). Les cellules sont ensuite récupérées et l'activité Luciférase du lysat cellulaire (20 microlitres) est testée (Dual LuciféraseTM reporter Assay System, Promega, Madison, USA) dans un luminomètre Berthold LUMAT LB9501. Les transfections sont réalisées en triplicata et chaque expérience est répétée au moins 3 fois.
3. Essai de formation de colonies.
Les cellules HeLa sont ensemencées dans une plaque de 12 puits à une densité
initiale de 100 000 cellules par puit. Après une incubation de 24 heures, les cellules sont transfectées avec chacun des plasmides suivants: pcDNA3, pcDNA3-Luc, pcDNA3-SF-1, ou pcDNA3-TReP-132, chacun possédant le gène de résistance à la néomycine. Les transfections sont effectuées en triplicata avec le transfectant ExGen 500 (MBI Fermentas, Flamborough, Ontario, Canada) à un ratio de 5 ial d'ExGen pour 1 pg de plasmide. Après une transfection de 12 heures, le milieu est changé et les cellules sont incubées pour une durée additionnelle de 8 heures. Les cellules sont ensuite trypsinées et transférées dans un pétri de 100 mm. Après 48 heures, le milieu est supplémenté avec 400 pg/ml de l'agent de sélection G418 (Sigma-Aldrich CA
Ltd.).
La forrriation de colonies distinctes est détectable après deux semaines de sélection avec le G418. Les cellules sont alors rincées avec du PBS et fixées avec un mélange de 10% d'acide acétique / 10% méthanol pendant 15 min, puis colorées au crystal violet (Sigma-Aldrich CA Ltd.).

4. Analyses de protections à la RNase dans les cellules MCF-7.
La préparation de la sonde TReP-132 radioactive est effectuée comme suit : le plasmide pcDNA3-TReP-1 32-HA est tout d'abord linéarisé par digestion avec l'enzyme de restriction Narl (New England Biolabs, Beverly, MA) avant d'amorcer la transcription in vitro à partir du promoteur T7 en présence du ribonucléotide marqué [a-32P]UTP
suivant les conditions spécifiées dans le kit MAXiscript (Ambion, Austin, Texas) . La sonde générée est un ARNc de 226 pb, contenant 174 bases nucléotidiques retrouvées à l'extrémité 3' de TReP-132 et 52 bases provenant du polylinker et incluant la séquence du tag HA. La ribosonde 18S utilisée pour la normalisation est générée à
partir du vecteur humain pTRI-18S (Ambion, Austin, Texas) et protège un fragment de 80 pb. Les essais de protection à la ribonucléase sont réalisés en utilisant le Kit de Protection à la Ribonucléase Il (Ambion, Austin, Texas) selon le protocole décrit par le manufacturier. 30 pg d'ARN provenant des cellules MCF-7 sont hybridés aux deux sondes pendant 16 heures à 45 C, et les hybrides sont ensuite digérés à 37 C
pendant 45 min dans la solution RNase A/RNase T1 diluée au 1/75 dans le tampon de digestion. Les échantillons sont résolus sur un gel de polyacrilamide-6%
d'urée.

5. Reverse transcription et PCR quantitative.
Les ARN totaux des cellules T47-D traitées ou non avec la progestérone sont transcrits de manière reverse et les niveaux d'ARNm de TReP-132 sont ensuite mesurés par RT-PCR quantitative tel que décrit dans (Gizard et al., 2004) en utilisant les primers spécifiques de TReP-132 (5'-gtcaacaatatggcccaggtg-3' et 5'-gccagaggctgctggtcgtc-3').

6. Abolition de l'expression de TReP-132 par la technique de Small Interfering RNA (siRNA).
Les oligonucléotides sens 5'-aacatgtttgagttgccaggcctgtctc-3' et antisens 5'-aacctggccaactcaaacatgcctgtctc-3' sont synthétisés (Eurogentec) et utilisés pour générer un siRNA double brins spécifiques de TReP-132 (21 bp correspondant aux acides aminés 861-881 en amont du codon d'initiation du gène humain TReP-132).

L'oligonucléotide non silencing siRNA de Qiagen, non spécifique de gène de mammifère est utilisé comme contrôle négatif. La transfection est réalisée en utilisant le réactif GeneSilencer (Gene Therapy Systems, San Diego, USA) de la manière décrite par le fabricant. L'efficacité de transfection est vérifiée par analyse des cellules par FACS (Fluorescence-Activated Celi Sorting) (voir ci-dessous). La PCR
quantitative indique une diminution de 75 +/- 12% des niveaux d'ARNm TReP-132. Les analyses statistiques sont réalisées en utilisant le test non paramétrique Kruskal-Wallis.

7. Synchronisation des cellules HeLa en phase G, .
Les cellules HeLa sont synchronisées en phase G, au niveau de la transition Gl->S par un double blocage à la thymidine comme décrit dans (Cao et al., 1991 et Tobey et al., 1967) avec quelques modifications. L'addition d'un excès de thymidine a pour effet d'inhiber la réaction enzymatique catalysant la formation de déoxycytidine triphosphate à partir de cytidine-5'-phosphate et d'empêcher la réplication de l'ADN, caractéristique de la phase S. Les cellules HeLa sont tout d'abord ensemencées à 1 million de cellules par boite de pétri (100 mm de diamètre) et cultivées pendant 24 heures. La thymidine est ajoutée à une concentration finale de 5mM et les cellules sont incubées pendant 14 heures. Cette période est calculée pour être un peu plus longue que la somme des durées des phases G2, M et G, pour les cellules HeLa. Les cellules sont ensuite synchronisées pour entrer en phase S en enlevant la thymidine du milieu pour une période de 9.5 heures, temps qui excède celui de la phase S. L'arrêt du cycle avant l'entrée en phase S se fait de nouveau par l'addition de thymidine dans le milieu pour une durée de 5 heures. Après cette période, la thymidine est enlevée et correspond au temps 0 de nos expériences.
8. Expression inductible de TReP-132 par le système Tet-off.
Les cellules HeLa Tet-off exprimant le transactivateur tTA sous contrôle de la tétracycline ou doxycycline (Dox) (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) ont été
transfectées de façon stable avec le plasmide pBl-EGFP-TReP-132 ou le plasmide contrôle pBi-EGFP. Afin de sélectionner les cellules transfectées de façon stable, le plasmide pcDNA6 (Invitrogen, Ontario, CA) possédant le gène de résistance à la blasticine a été cotransfecté au 1/50. Pour ces transfections, les cellules sont d'abord ensemencées dans des plaques de 6 puits à une densité initiale de 1x105 cellules par puit. Après une incubation de 24 heures, les cellules sont transfectées avec ExGen 500 (MBI Fermentas, Flamborough, Ontario, CA) à_un ratio de 5 tai d'ExGen 500 pour une quantité totale de 1 pg de plasmide comme décrit ci-dessus dans la section essai de formation de colonies. 48 heures après la transfection, les cellules sont sélectionnées pendant 2 semaines avec 2 pg/ml de blasticidine (Sigma-Aldrich CA Ltd.).
Lorsque les colonies sont suffisamment isolées, elles sont repiquées et transférées dans une 5 plaque de 12 puits pour permettre leur croissance. Il est à noter que les cellules sont toujours maintenues en présence de doxycycline de façon à réprimer la transcription des gènes sous le contrôle du transactivateur tTA.

9. Tri des cellules au FACS (Fluorescence-activated cell sorting).
10 Afin de déterminer l'efficacité du système d'expression inductible contrôlé
par la doxycycline dans les clones stables transfectés avec le vecteur pBI-EGFP-TReP
(système décrit ci-dessus), la fluorescence de chaque cellule à l'intérieur d'une population donnée est individuellement mesurée par cytométrie en flux sur un appareil EPICS XL (Beckman Coulter, Mississauga, CA). Les paramètres mesurés sont le FS
15 (Forward scatter), SS (side scatter) et la fluorescence émise à la longueur d'onde de 520 nm après excitation avec un laser Argon à 488 nm. Les cellules exprimant la GFP
sont alors triées avec un appareil EPICS ELITE ESP (Beckman Coulter, Mississauga, CA).

20 10. Mesure de la prolifération cellulaire.
Le taux de prolifération cellulaire est déterminé par le contenu en ADN des cellules en utilisant le fluorochorome DABA (dimethylaminobenzaldehyde). Après avoir enlever le milieu, les cellules sont déshydratées en ajoutant 150 lai de méthanol dans chaque puit.
Après évaporation complète, les cellules sont incubées pendant 1 heure à 60 C
avec 25 150 pl d'une solution de DABA préparée comme suit : 2 g de DABA sont dissout dans 10 ml d'acide chlorhydrique (HCI) 1N, et 1g/10 ml de Norit A Carbon est ajouté. Après agitation, le mélange est centrifugé pendant 30 minutes à température ambiante, puis passé sur un filtre de 0.45 microns. Après incubation, les plaques sont transférées dans la glace pour 10 min, et 1.25 ml d'HCI 1 N est ajouté dans chaque tube. La fluorescence 30 est mesurée à l'aide d'un fluorimètre Perkin-Elmer LS-2B Filter Fluorimeter, à la longueur d'onde d'excitation 400 nm et d'émission 508 nm. La quantité d'ADN
est calculée d'après une courbe standard effectuée avec des quantités déterminées d'ADN
de sperme de saumon.

35 11. Analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux.

Afin d'évaluer le pourcentage de cellules en Go/G,, S, ou G2/M, des profils de cytométrie en flux sont réalisés sur l'ADN de ces cellules incubées avec de l'iodure de propidium. Pour ce faire, les cellules sont trypsinées, centrifugées, re-suspendues dans 300 pI de PBS et refroidies dans la glace. Ensuite, en maintenant les cellules sous agitation douce à l'aide d'un vortex, on ajoute goutte à goutte un volume de 700 pl d'éthanol 95% et les cellules sont fixées dans la glace pour une durée de 30 min. Après centrifugation et lavage au PBS, les cellules sont incubées dans 500 pl de PBS
contenant 40 U/ml de RNase ( DNAse free , Roche Diagnostics, Laval, Québec, CA) et 50 lag/ml d'iodure de propidium (Sigma-Aldrich CA Ltd.) pendant 30 min à
température ambiante à l'abri de la lumière. Les mesures d'ADN sont effectuées sur un appareil Epics XL (Beckman Coulter, Mississauga, CA) en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 620 nm. Les pourcentages des cellules en phase GI, S, et G2/M sont quantifiés à l'aide du programme Multicycle AV (Phoenix Flow system, San Diego, CA) (28).
12. Transfections des cellules HeLa et T47D.
Les études d'activation des promoteurs des inhibiteurs de cycline p21, p27 et p16 par TReP-132 ont été réalisées par transfection des cellules HeLa et T47-D. Les cellules HeLa sont ensemencées à une densité initiale de 15,000 cellules par puit dans une plaque de 24 puits et transfectées le lendemain avec ExGen 500 (MBI Fermentas, Flamborough, Ontario, Canada) au ratio de 0.5 pg d'ADN pour 4 pl d'ExGen 500.
Les cellules T47D sont ensemencées à une densité de 100,000 cellules par puit et transfectées le lendemain avec le réactif FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals, Laval, Canada), au ratio de 3 pl de FuGENE pour 1 pg d'ADN. Après une incubation de 12 heures à 37 C, le milieu est remplacé et les cellules sont incubées pour une période additionnelle de 8 heures. Les cellules sont ensuite lysées pendant 15 minutes à la température ambiante dans une solution contenant 0.8% Triton X-100, 25 mM
Glycylglycine pH 7.8, 15 mM MgSO4, et 4 mM EGTA. L'activité luciférase est dosée à
l'aide d'un luminomètre Bérthold Lumat LB9501 (Berthold Detection Systems GmbH, Pforzheim, Allemagne) en utilisant le kit "Dual-LuciferaseTM reporter Assay System"
(Promega Corporation, Madison, WI) permettant de doser simultanément les activités de la luciférase de type firefly et de la Iuciférase de type Rénilla (codée par le plasmide pRL-null pour normalisation). Pour toutes les transfections, 0.1 pg de plasmide rapporteur contenant le promoteur étudié (p21WAF'iciP', p27Kip1, ou p16CDKN2) et 0.01 pg de pRL-null sont utilisés. Les quantités utilisées de vecteurs d'expression pour TReP-132, p300, et Sp1 varient en fonction des expériences et sont précisées dans la section "résultat". Pour chaque expérience, une transfection contrôle avec le plasmide d'expression pCDNA3-EGFP a été effectuée et une analyse de cytométrie en flux a permis de valider qu'il y ait au moins 60% des cellules transfectées.
13. Analyses de protections à la RNase dans les cellules HeLa.
La préparation de la sonde TReP-132 radioactive est effectuée comme décrit précédemment : le plasmide pcDNA3-TReP-132-HA est tout d'abord linéarisé par digestion avec l'enzyme de restriction Narl (New England Biolabs, Beverly, MA) avant d'amorcer la transcription in vitro à partir du promoteur T7 en présence du ribonucléotide marqué [a-32P]UTP suivant les conditions spécifiées dans le kit MAXlscript (Ambion, Austin, Texas) . La sonde générée est un ARNc de 226 pb, contenant 174 bases nucléotidiques retrouvées à l'extrémité 3' de TReP-132 et bases provenant du polylinker et incluant la séquence du tag HA. La ribosonde 18S utilisée pour la normalisation est générée à partir du vecteur humain pTRI-(Ambion, Austin, Texas) et protège un fragment de 80 pb. Les essais de protection à la ribonucléase sont réalisés en utilisant le Kit de Protection à la Ribonucléase Il (Ambion, Austin, Texas) selon le protocole décrit par le manufacturier. 30 pg d'ARN
provenant des cellules HeLa sont hybridés aux deux sondes pendant 16 heures à 45 C, et les hybrides sont ensuite digérés à 37 C pendant 45 min dans la solution RNase A/RNase T1 diluée au 1/75 dans le tampon de digestion. Les échantillons sont résolus sur un gel de polyacrilamide-6% d'urée.
L'ensemble des sondes radioactives spécifiques aux gènes p130, Rb, p107, p53, p57, p27, p21, p19, p18, p14/p15, L32, et GAPDH sont marquées avec le ribonucléotide [a-32P]UTP (PerkinElmer Life Sciences, Woodbridge, Ontario, CA) dans les conditions spécifiées dans le kit "hCC-2 Muti-Probe Template Set" (Pharmingen, Mississauga, Ontario, CA). Les essais de protection à la ribonucléase sont réalisés en utilisant le Kit de Protection à la Ribonucléase III (Ambion, Austin, Texas). 10 pg d'ARN
provenant des cellules HeLa sont hybridés avec le mixte de sondes radioactives à 56 C
puis sont digérés à 30 C pendant 45 min dans la solution RNAseA/RNase T1 diluée au dans le tampon de digestion. Les échantillons sont résolus sur un gel de polyacrilamide-6% d'urée.

14. Préparation des extraits protéiques, Analyse en Western blot et Coimmunoprécipitation.

Les cellules sont lavées 2 fois avec du PBS (Phosphate Buffer Saline) refroidi, puis collectées soit dans du tampon RIPA refroidi (1x PBS, 1% Nonidet P-40, 0.5%
Sodium deoxycholate, 0.1% SDS, Inhibiteurs de phosphatases et de protéases) pour les analyses de co-immunoprécipitation, soit dans du tampon de lyse (5OmM Tris, pH
8.0, 0.1 % IGEPAL (Sigma)) pour les essais de kinases. Les lysats sont incubés pendant 30 min sur la glace et les débris cellulaires sont enlevés par centrifugation.
Les extraits sont ensuite aliquotés et conservés à-80 C. Pour les analyses en Western Blot, le tampon RIPA ou le tampon de lyse est utilisé. Pour l'immunoprécipitation, les lysats de cellules entières (1 mg) mis dans le tampon RIPA sont préincubés avec 0.1 microgramme d'IgG de souris ou de lapin et 20 microlitres de billes de Sépharose-protéine A (Amersham Biosciences , Uppsala, Sweden) pendant 30 min à 4 C.
Après centrifugation, les lysats (1 mg) sont immunoprécipités pendant 1 heure à 4 C
avec un anticorps anti-CDK2 (sc-163) (Santa Cruz), anti-CDK6 (RB-017), anti-cyclin A
(RB-010) ou anti-cyclin D1 (MS-395) (Microm France, Francheville), puis incubés à 4 C
pendant 1 nuit avec la protéine A-Sepharose. Les protéines immunoprécipitées sont ensuite lavées 4 fois avec du tampon de lyse, puis resuspendues dans du tampon d'electrophorèse.
Les échantillons de protéines (20-100 microgrammes) sont ensuite portés à 95 C
pendant 5 min, puis séparés par SDS-PAGE et transférés sur une membrane de nitrocellulose. Les membranes ont été saturé par du lait déshydraté dilué dans du tampon TBS (10 mM Tris, Ph 8.0, 150 mM NaCI) additionné de 0.2% de Tween 20 (Sigma) et incubé ensuite (2-4 heures à température ambiante ou toute la nuit à 4 C) avec les anticorps anti-p21 (OP64) (Merck Eurolab, Fontenay-sous-bois, France) ; anti-p27 (K25020, Transduction Laboratories, Lexington, KY) ; anti-pRb (554136, reconnaissant tous les états de phosphorylation de pRb) ; anti-ppRb-Ser780 (sc-12901) spécifique de pRb phosphorylé au niveau de la Ser 780 ; anti-PR (MS-298-P) et anti-béta-actine (sc-7210) comme contrôle. Après lavage, les membranes sont incubées avec un anticorps secondaire de souris ou de lapin couplé au HRP (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) pendant 45 min. Les blots sont ensuite révélés avec un agent ECL et la quantification se fait avec les logiciels SCANWISE et Perfect-IMAGE V-5.3 (CLARA VISION, France).

15. Les essais Kinases.
Les activités des kinases des histones H1 ou de la protéine Rb des immunoprécipitats sont mesurées de la manière suivante : les immunoprécipitats sont tout d'abord lavés une fois avec 1 ml de tampon de dosage (50 mM Tris-HCI, pH 7.4, 10 mM MgC12, 1 mM
dithiotheitol (DTT)), puis sont re-suspendus dans 20 microlitres de tampon de dosage contenant lmg/ml de caséine (Sigma) et 1 microgramme d'histone H1 ou de protéine Rb (769) (sc-4112) comme substrat. Après 5 min de préincubation à 30 C, la réaction est initiée par l'addition de 1 microMolaire d'ATP et 5 microCurie de [gamma 32P] ATP, puis continuée à 30 C pendant 1 heure.
microlitres de tampon d'électrophorèse (3X) sont ajoutés ensuite pour stopper la réaction et les échantillons sont déposés sur un gel SDS-PAGE 10%. Le gel est séché
puis autoradiographié et les quantités d'histones ou de pRB phosphorylés sont 10 mesurées par densitométrie.

16. Tests de liaison /n Vitro.
Afin d'évaluer l'interaction de TReP-132, Sp1, ER et PR, des protéines de fusion GST-TReP-132 wt et mutées sont exprimées puis immobilisées sur Glutathion-Sepharose de 15 la manière décrite dans (Frangioni and Neel, 1993 - Monte et al., 1998).
Les protéines 35S-[Sp1], 35S-[ER] et 35S-[PR-B] sont synthétisées in vitro en utilisant des lysat de réticulocytes de lapin et le système d'ARN polymerase T7 selon la procédure du fabricant (Promega Corporation, Madison, WI). Les protéines liées, puis détachées de la Sépharose après avoir été portées à ébullition dans du tampon SDS sont ensuite séparées par SDS-PAGE 10%. Les gels sont ensuite colorés par le bleu de Coomassie, puis séchés et autoradiographiés.

17. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP).
Les cellules HTO incubées en présence de Dox ou les cellules T47-D sont cultivées jusque 70% de confluence dans des boites de Pétri (150 mm de diamètre). Pour les cellules HTO, la Doxycyline est retirée sur la moitié des boites 48 heures avant la lyse.
Les cellules T47-D sont incubées avec 30 nM de progestérone ou avec de l'éthanol contenant 0.2% de BSA-RPMI pendant 2h30 avant la lyse. Les lysats cellulaires sont ensuite soumis à une sonication sur glace, 15 fois pendant 15 sec à 45 sec d'intervalle.
Un volume de lysat correspondant à 4x106 cellules est immunoprécipité en utilisant 4 microgrammes d'anticorps (indiqués précédemment) ainsi qu'un anticorps anti-HA
comme contrôle négatif. Le même volume est gardé pour une purification ultérieure d'ADN génomique. 1/20 ème de l'ADN extrait est ensuite amplifié par PCR
pendant 35 cycles (30 sec à 92 C, 30 sec à 55 C et 30 sec à 72 C) en utilisant les primers : pour p21, 5'-ggcactcttgttcccccaggc-3' et accatccccttcctcacctg-3' (élément de réponse à Sp1 sur p21) ou 5'-gcacactgacgcagcacacag-3' et 5'-cagtttgagaagcagccacct-3' (élément distal de p21); pour p27: 5'-aggccagccagagcaggtttgt-3' et 5'-ggaggagatccattggttgcgg-3' (élément de réponse à Sp1 sur p27) ou 5'-gacttgcatctagtcctgactccgg-3' et 5'-gcctacctcatctcatacgctccag-3' (élément distal de p27); et pour la béta-actine:
5'-5 aaactctccctcctcctcttcct-3' et 5'-cgagccataaaaggcaactttcg-3'. Un volume équivalent d'ADN génomique non précipité est amplifié comme contrôle négatif. 1/15ème (ADN
génomique non précipité) ou 1/5ème (ADN précipité) des produits de la PCR sont ensuite séparés sur un gel d'agarose 2% contenant du bromure d'éthidium.

10 18. FRET
Afin d'évaluer l'effet d'un ligand sur le recrutement de TReP-132 par ER et PR, un FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) est réalisé entre TReP-1 32 et PR ou ER.
Des protéines de fusion GST-LBD ER et GST-LBD PR ( GST pour Gluthatione-S-15 Transferase et LBD pour Ligand Binding Domain) sont exprimées et purifiées à
l'aide de colonnes GST-Trap (Amersham pharmacia).
Les 2 peptides correspondant aux NR-box (Domaine de liaison aux récepteurs nucléaires) de TReP-132 (NH2-AVMDGAPDSALRQLLQKPMEPPAPA-COOH et NH2-FEAKGDVMVALEMLLLRKPVRLKCH-COOH) sont synthétisés et marqués avec la 20 biotine. Les GST-LBD ER, GST-LBD PR et les peptides de NR box sont respectivement détectés avec l'AlloPhycoCyanin (APC) couplée avec un anticorps anti-GST et avec la R-phycoerythrine (RPE) couplée à la streptavidine.
Une concentration croissante de composés est incubée dans le tampon de liaison (0,1M PBS 2mM CHAPS, 2mM EDTA, lmM DTT, 0,1% BSA, pH 7,2) avec 35 nM de 25 GST-LBD ER ou de GST-LBD PR, 26.3 nM d'anticorps anti-GST marqués à I'APC, 1,25 nM de RPE strepavidine, 5-30 nM de peptide NR box biotinylé à 4 C pendant 4 heures dans des plaques de 384 puits. La RPE est excitée à 495 nm et son émission est mesurée à 635 nm (émission du RPE) et celle de I'APC à 670 nm. Les intensités de fluorescence sont mesurées avec un Genesis Freedom 200 Tecan. Les ratio de 30 fluoresence (intensité à 670 nm / intensité à 635 nm) par rapport au ligand sont calculés.

RÉSULTATS
35 1- Effet de TReP 132 sur la prolifération cellulaire.

L'effet de TReP-132 sur la prolifération cellulaire a été démontré tout d'abord dans les cellules HeLa par un essai de formation de colonies. Dans cette expérience, il a été
démontré que les cellules HeLa transfectées avec un vecteur d'expression pcDNA3-TReP forment beaucoup moins de colonies résistantes au G418 comparativement aux cellules transfectées avec le vecteur pcDNA3 seul (figure 1). Le nombre de colonies obtenues suite à la transfection du plasmide pcDNA3-TReP est 75 à 80%
inférieur à
celui obtenu suite à la transfection du plasmide contrôle. De plus, quand ces cellules ont été analysées pour l'expression du TReP-132 exogène, seules 2 colonies sur étaient positives. Quand ces deux colonies ont été dispersées et réensemencées, le taux de prolifération des cellules était diminué de façon significative. La durée de dédoublement des cellules exprimant TReP-132 était de 30 heures au lieu de 18 pour les cellules contrôles transfectées avec le vecteur pcDNA3 seul. Ainsi, ces résultats montrent que l'augmentation de l'expression de TReP-132 est corrélée avec la diminution de la prolifération cellulaire et est vraisemblablement en conséquence responsable du nombre réduit de colonies cellulaires viables.
Pour mettre davantage en évidence que l'expression de TReP-132 est en étroite relation avec la prolifération cellulaire, les cellules humaines de cancer du sein MCF-7 ont été traitées pendant 6 jours avec 10"$M d'oestradiol (E2), un composé
connu pour son effet prolifératif sur les cellules oestrogéno-dépendantes comme les cellules de cancer du sein par l'induction de la transition GI/S. Suite au traitement des cellules MCF-7 avec de l'cestradiol, une analyse basée sur la protection de la RNase a permis de mettre en évidence une diminution nette de l'expression de TReP-132 (figure 2) et une augmentation concomitante de la prolifération cellulaire.
L'effet de TReP-132 sur la prolifération cellulaire dépendante de la progestérone a été
démontré par mesure des taux d'ARNm TReP-132 dans les cellules T47-D traitées ou non à la progestérone. Il a déjà été montré que TReP-132 est un facteur stéroïdogénique exprimé dans les cellules mammaires cancéreuses T47-D
(Musgrove et al., 1997) exprimant d'importants niveaux de PR (Progesterone Receptor) (Mockus et al., 1982). Les résultats présentés sur la figure 3A montrent que les taux d'ARNm TReP-132 augmentent en fonction du temps d'exposition à la progestérone pour atteindre un maximum d'expression (3X) à 48 heures d'exposition. Ces résultats montrent ainsi que l'expression de TReP-132 est augmentée par le traitement des cellules T47-D à la progestérone.
L'influence de TReP-132 sur la prolifération cellulaire et sur la réponse à la progestérone est ensuite montrée par la technique du Small Interfering RNA
(siRNA).

Les résultats de la figure 3B montrent que la progestérone inhibe la prolifération cellulaire après 4 à 6 jours de traitement des cellules contrôles transfectées, tandis que le silencing de TReP-132 entraîne l'inhibition de la prolifération cellulaire, même dans les cellules non traitées. Ces résultats montrent ainsi que TReP-132 est un facteur d'inhibition de la croissance cellulaire et que TReP-132 agit comme médiateur sur l'effet anti-prolifératif de la progestérone.
De manière à étudier le mécanisme d'action de TReP-132 dans le contrôle de la croissance cellulaire, des clones stables exprimant de façon inductible TReP-132 par le système Tet-off ont été produits dans les cellules HeLa (Figure 4). Ainsi, les lignées cellulaires co-exprimant la GFP et TReP-132-Flag (HTO-GFP/TReP) ou exprimant seulement la GFP (HTO-GFP) sont établies. Dans ce système, les cellules sont cultivées en présence de doxycycline de façon à réprimer l'expression de TReP-132.
La protéine TReP-132-Flag n'est pas détectable dans les cellules cultivées en présence de Dox. Par contre, après enlèvement de la dox du milieu, la protéine TReP-132-flag ést détectable dès 12h et augmente jusqu'à 48h (Figure 5). Ainsi cette lignée représente un modèle relevant pour étudier les effets de l'expression de TReP-1 32 sur la prolifération cellulaire. Alors que les cellules HTO-GFP/TReP-132 cultivées en présence de Dox reprennent une croissance cellulaire normale avec un temps de doublement d'environ 16h 4 jours après l'ensemencement des cellules, l'enlèvement de la Dox réduit considérablement le taux de prolifération cellulaire à un temps de doublement d'environ 60h (Figure 6). Puisqu'il n'était pas observé de différence dans les taux de prolifération entre les cellules HTO-GFP ou les cellules parentales HTO
incubées ou non avec la Dox, il peut être conclu que la sur-expression de TReP-résulte en un effet inhibiteur puissant de la prolifération des cellules HeLa.
2- Effet de la sur-expression de TReP-132 sur le cycle cellulaire : arrêt en phase G1.
Si TReP-132 est effectivement impliqué dans la régulation de la progression du cycle cellulaire, on peut s'attendre à ce que son expression soit aussi régulée durant les différentes phases du cycle cellulaire. Pour résoudre cette question, l'étude par cytométrie de flux du contenu en ADN des cellules colorées à l'iodure de propidium indique que l'induction de l'expression de TReP-132 bloque les cellules en phase G1 (Figure 7). En effet, à partir de 48 heures après l'enlèvement de la doxycycline, qui correspond à l'induction optimale de TReP-132, on observe une augmentation de cellules en phase G1 et parallèlement, une diminution de cellules en phase S.

De plus, des cellules Hela ont été synchronisées en fin de phase GI par double blocage à la thymidine. Vingt heures après la fin de la deuxième incubation des cellules à la thymidine, qui correspond au temps 0 de nos expériences, les cellules ont été
récoltées toutes les quatre heures, pour analyses du cycle cellulaire par cytométrie de flux et de l'expression de TReP-1 32 par RNase protection. L'expression de TReP-1 32 est induite aux temps T20 et T28, lorsque les cellules sont majoritairement en phase G1 (88 et 57% des cellules, respectivement) (Figure 8). Au contraire, elle n'est pas détectable lorsque les cellules sont à 82% en phase S, au temps T24. Ainsi cette expérience démontre que l'expression de TReP-132 est dépendante du cycle cellulaire en phase G1, ce qui est cohérent avec la capacité de cette protéine à arrêter la progression du cycle cellulàire au niveau de cette phase.
Ces résultats démontrent une corrélation inverse entre l'expression de TReP-1 32 et la progression du cycle cellulaire.

3- L'expression de TReP-132 conduit à l'inhibition des activités CDK (Cyclin Dependant Kinases) et à la baisse de la phosphorylation de pRb (protéine du Rétinoblastome).
La progression du cycle cellulaire est assurée par des protéines kinases dépendantes des cyclines (CDKs) qui phosphorylent une variété de protéines clés impliquées dans le contrôle du cycle cellulaire (Schafer, 1998). Les CDKs étant constitutivement exprimées au cours du cycle cellulaire, la régulation de leur activité, qui intervient uniquement à
des étapes spécifiques du cycle cellulaire, est assurée par des mécanismes post-transcriptionnels. Ainsi, elles ne sont activées que par leur interaction avec des cyclines spécifiques, les cyclines A, B, C, Dl, ou E, appelées ainsi du fait de leur expression cyclique au cours du cycle cellulaire. D'autre part, elles sont inhibées par interaction avec les inhibiteurs des CDKs (CDKIs), ce qui empêche par compétition leur liaison avec les cyclines et leur activation conséquente. L'expression des CDKIs est également régulée pendant la progression du cycle cellulaire, ainsi que par les facteurs de croissance (Owa et al., 2001), en particulier ceux de la famille de l'insuline (Stewart et al., 1990). Par ailleurs, il a été montré que les taux respectifs des CDKIs (et des cyclines) sont altérés par l'exposition des cellules aux radiations, confirmant ainsi leur implication dans les processus associés au développement des tumeurs (Bernhard et al., 1995). Le fait que TReP-132 ait initialement été caractérisé comme facteur de transcription (Gizard et al., 2001) suggérait qu'il contrôlait la progression du cycle cellulaire en régulant l'expression des protéines induites transitoirement au cours du cycle.
La progression tout au long du cycle cellulaire est contrôlée par une famille de cdks dont l'activité est régulée par phosphorylation, activée par la liaison des cyclines et inhibée par des inhibiteurs de cdk, qui incluent la famille des inhibiteurs de cdk4 ( INK4 ) (p16i"K4A, p15 i"K4g, p18 et p19) et la famille des protéines inhibitrices des kinases ( KIP ) (p21 WAFiaP-', p27Kip1 et p57Kip2) (Sherr, 1994; Morgan, 1995; Sherr and Roberts, 1999). Une cible clef de l'action de cdk durant la phase G1 est le produit du gène de sensibilité au rétinoblastome (pRb) qui induit l'arrêt en phase G1 en séquestrant des facteurs de transcription de la famille E2F-DP. La phosphorylation de pRb et d'autres membres de cette famille tels que p107 et p130, grâce à des complexes actifs cycline-cdk, conduit à la libération de E2F et DP et à la régulation transcriptionnelle qui en découle de gènes cibles requis pour l'entrée en phase S.

La phosphorylation de pRb et des histones H1 par les CDK de la phase G1 représente un événement important pour la passage des cellules en phase S (Peter and Herskowitz, 1994; Zarkoska and Mittnacht, 1997). Afin de déterminer l'influence de TReP-132 sur les activités des complexes cyclines/CDKs, les activités kinases associées aux complexes immunoprécipités cycline D1/CDK6 et cycline A/CDK2 ont été mesurées in vitro en utilisant respectivement les substrats pRb et les histones H1 (Kitagawa et al., 1996; Koff et al., 1991). Les résultats, présentés sur la figure 9A, montrent que l'induction de l'expression de TReP-132 dans les cellules HTO-GFP/TReP-132 pendant 48 heures réduit les activités kinases étudiées in vitro associées aux complexes cyclines/CDKs immunoprécipités de phase G1 (cycline D1/CDK6 et cycline A/CDK2).
Les analyses réalisées directement à partir d'extraits protéiques totaux de cellules HTO
présentés sur la figure 9B montrent que tandis que pRb est majoritairement présent dans un état inactif hyperphosphorylé (ppRb) dans les cellules HTO exprimant la GFP
et TReP-132 sous le contrôle de la Doxycycline non induites, l'expression de TReP-132 entraîne une augmentation significative de l'état hypophosphorylé de pRb (pRb) avec une réduction marquée du niveau de pRb phosphorylé (ppRb). Les niveaux de pRb phosphorylée baisse dans les 24 heures du retrait de la Dox avec un niveau presque indétectable après 72 heures tandis qu'aucun changement n'est constaté sur la phosphorylation de pRb dans les cellules HTO exprimant la GFP seule. Ainsi, ces résultats montrent que l'hypophosphorylation de pRb atteint son maximum à 36 heures, moment clé précédent l'accumulation maximale de cellules en phase G1 (observée à
48 heures), ce qui démontre le rôle de TReP-132 dans l'arrêt en phase G1.

4- TReP-132 entraîne une augmentation de l'expression des CDKI (Cyclin 5 Dependant Kinase Inhibitor).
Il a ensuite été déterminé par protection de la RNase si l'induction de TReP-132 dans les cellules HeLa affectait la transcription des gènes codant pour les CDKIs suivantes:
p57, p27, p21, p19, p18, p16 et p27/p15, ainsi que celle des facteurs contrôlant la progression de la phase G1: Rb, p130, p107 et p53. L'étude a montré que suite à
10 l'induction de l'expression de TReP-132 par l'élimination de la doxycycline du milieu, les gènes p27KIP', p21cIP1/WAF1~ p16I"K4 ont été induits (Figure 10). Le fait que ces trois inhibiteurs de cyclines soient impliqués dans la modulation de la progression de la phase G1 corrèle avec le fait que l'expression de TReP-132 est induite et que TReP-132 bloque le cycle cellulaire en phase G1.
15 La capacité de TReP-132 à activer les promoteurs de ces gènes a ensuite été
déterminée. Des doses croissantes du vecteur d'expression pcDNA3-TReP-132 ont été
co-transfectées avec chacun des plasmides rapporteurs contenant les régions promotrices des gènes codant pour p21, p16 et p27. Le promoteur p27 est activé
d'une manière dose-dépendante avec TReP-1 32, jusqu'à atteindre environ une induction de 7 20 fois, en co-transfectant 0,3 pg de vecteur d'expression TReP-132 (Figure

11). A des niveaux moindres, les promoteurs p21 et p16 peuvent aussi être activés par TReP-132 avec un niveau maximal d'induction de 2 à 3 fois, comparativement au contrôle en absence de TReP-132. Ces expériences démontrent clairement le rôle direct de TReP-132 sur la transcription de molécules clés régulatrices du cycle cellulaire.
5. Caractérisation de l'activation avec TReP-132 agissant comme médiateur sur les promoteurs p27 et p21.
p21 et p27 sont les CDKIs dont la régulation a été la plus étudiée notamment au niveau de leur fonction déterminante dans la transition de la phase GI à la phase S
du cycle cellulaire. En effet, ils inhibent les complexes CDK2 et CDK4 associés aux cyclines, dont l'activité est corrélée avec le début de la duplication des chromosomes.
La transcription de p21 peut être induite par la progestérone. (Owen et al., 1998) ont démontré que cette induction implique une interaction entre le récepteur à la progestérone (PR), CBP/p300 et le facteur de transcription Sp1, au niveau des sites de liaison de l'ADN à Sp1 à proximité de la TATA box. Puisque TReP-132 interagit avec CBP/p300 pour augmenter la transcription du gène codant pour P450scc (Gizard et al., 2001), il a été évalué si l'induction du promoteur p21 par TReP-132 impliquait similairement une interaction avec CBP/300. Afin de tester cette hypothèse, les vecteurs d'expression codant pour TReP-132, Sp1, ou p300 ont été co-transfectés indépendamment ou simultanément. Comme décrit précédemment par (Owen et al., 1998) Sp1 et p300 peuvent induire le promoteur p21 et ont un effet additif lorsque qu'ils sont co-transfectés simultanément (Figure 12). Dans cette invention, les inventeurs ont démontré que TReP-132 a un effet additif sur l'activation conférée par Sp1 ou p300, et qu'une activation maximale du promoteur p21 est obtenue lorsque les trois facteurs de transcription sont co-exprimés. La spécificité du rôle de p300 dans cette activation est démontrée par la co-expression de E1A qui est connu pour son effet inhibiteur sur p300 (Frangioni and Neel, 1993; Monte et al., 1998). Ainsi, en présence de la protéine E1A, l'effet activateur est fortement réprimé.
Des études antérieures ont permis l'identification de 6 sites de liaison proximaux à Sp1 dans la région -117/-51 du promoteur du gène p21 (Hong et al., 2002 ;
Kardassis et al., 1999 ; Lu et al., 2000 ; Nakano et al., 1997 ; Pardali et al., 2000; Prowse et al., 1997 ;
Santini et al., 2001 ; Somasundaram et al., 1997 ; Steger et al., 2002; Zhang et al., 2000) et de 2 sites de liaison au niveau des positions -544 et -536 du promoteur du gène p27 (Lee et al., 2003 ; Ryhanen et al., 2003 ; Williamson et al., 2002) jouant un rôle clé dans la régulation de ces gènes.
Afin d'étudier le mécanisme d'activation des promoteurs des gènes p21 et p27 par TReP-132, des constructions rapporteurs contenant des éléments de réponse à
Sp1 wt, mutants ou délétés ont été co-transfectées avec des vecteurs d'expression Sp1 et/ou TReP-132 dans des cellules HeLa. Les résultats, présentés sur les figures 13A et 13B montrent que, de manière surprenante, les activités des construits -2320 p21 Luc et -3568 p27 Luc sont augmentées en présence de Sp1 ou de TReP-132 seul, l'activité
la plus importante étant obtenue lors de la transfection des 2 facteurs. Les résultats de la figure 13B montrent que la construction promotrice la plus courte (-154 p21 Luc) comprenant l'élément de réponse à Sp1 est activée par Sp1 et TReP-132 tandis que la réponse à Sp1 et/ou à TReP-132 est abolie lorsque l'élément de réponse à Sp1 est délété. Les résultats de la figure 13B montrent que la construction -549 p27 Luc est toujours activée par Sp1 et/ou TReP-132 tandis que des délétions supplémentaires de la région comprenant les sites Sp1 entraînent un arrêt de l'activation par Sp1 ou TReP-132, seul ou ensemble. L'activation par Sp1 et TReP-132 est abolie par la mutation du nucléotide -544 dans la construction -3568 p27 Luc. Ces résultats indiquent donc que TReP-132 et Sp1 interagissent au niveau des sites proximaux de liaison à Sp1 sur les promoteurs des gènes p21 et p27.
Des expériences d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) ont ensuite été
mise en oruvre pour évaluer l'interaction de TReP-132 et de Sp1 avec les sites proximaux de liaison à Sp1 des prom'oteurs des gènes p21 et p27 dans la cellule. Pour ce faire, les expériences sont réalisées dans des cellules HTO en utilisant un anticorps anti-Flag pour immunoprécipiter la protéine de fusion Flag-TReP-132. Les résultats sont présentés sur la figure 13C. Les régions d'ADN génomiques entourant les éléments de réponse à Sp1 des promoteurs des gènes p21 et p27 ont été immunoprécipitées par l'anticorps anti-Flag dans les cellules HTO exprimant la GFP et TReP 132 sous le contrôle de la doxycycline dans lesquelles l'expression de TReP-132 est induite, mais non dans les cellules HTO exprimant la GFP. Des amplifications par PCR
utilisant des amorces couvrant une région d'environ 1 kb en amont des éléments de réponse à
Sp1 des promoteurs des gènes p21 et p27 ou des oligonucléotides spécifiques de la béta-actine n'ont pas montré de signaux significatifs démontrant ainsi la spécificité des immunoprécipitations et des réactions d'amplification par PCR. Ces résultats démontrent ainsi que TReP-132 fait parti d'un complexe liant les sites de liaison proximaux de Sp1 des promoteurs des gènes p21 et p27.
Des expériences de retard sur gel utilisant une protéine TReP-132 produite in vitro et des oligonucléotides double brins entourant les sites Sp1 sur les promoteurs des gènes p21 et p27 ont ensuite été réalisées afin de déterminer si TReP-132 se lie directement aux sites des liaison Sp1. La formation de complexes ADN/protéine n'a pas été
détectée, ce qui indique que TReP-132 active le promoteur via l'interaction avec d'autres protéines de liaison à l'ADN telles que Sp1. Afin de tester cette hypothèse, des expériences de pull-down ont été réalisées en utilisant les protéines de fusion GST ou GST-TReP-132 et des protéines Sp1 marquées. Les résultats, présentés sur la figure 13D, montrent qu'une interaction protéine/protéine est observée entre Sp1 et la protéine de fusion GST-TReP-132 tandis qu'aucune interaction n'est observée entre Sp1 et la protéine GST.
6- Interaction de TReP-132 avec les récepteurs de la progestérone et des oestrogènes.
La médiation par TReP-132 des effets inhibiteurs de la croissance cellulaire de la progestérone ainsi que les effets similaires de TReP-132 et de la progestérone sur la prolifération des cellules du cancer du sein suggèrent que ces 2 facteurs interagissent pour réguler la transcription des gènes p21 et p27. L'activation du gène p21 par le récepteur à la progestérone lié (PR) au travers de l'interaction avec Sp1 au niveau du 3ème et 4ème sites Sp1 (respectivement Sp1-3 et Sp1-4) a été démontrée par (Owen et al., 1998).
Afin de tester l'interaction de TReP-132, PR et Sp1 au niveau des sites de liaison à Sp1 des 2 promoteurs, les constructions rapporteurs comprenant les 2 promoteurs ont été
co-transfectées dans les cellules T47-D avec des plasmides d'expression TReP-132 et les cellules ont été traitées ou non à la progestérone. Les résultats, présentés sur les figures 14A et 14B, montrent que TReP-132 stimule les 2 promoteurs, de la même manière que le traitement à la progestérone tandis qu'une activation plus importante est constatée lors de la transfection des cellules avec TReP-132 combinée au traitement à
la progestérone. Les résultats de la figure 14A montrent qu'une mutation au niveau du site Sp1-3 du construit -93 p21 Luc abolit complètement l'activation du promoteur par TReP-132 et la progestérone, seul ou en combinaison, tandis que la mutation au niveau du Sp1-4 entraîne une réduction de l'activation progestérone-dépendante. De la même manière, la figure 14B présente les résultats obtenus lors de la délétion des sites de liaison Sp1 du promoteur du gène p27 montrant une réduction des effets d'induction de TReP-132 et de la progestérone. Ces résultats indiquent que TReP-132 pourrait coopérer avec PR et Sp1 pour agir en tant que médiateur des effets de la progestérone sur l'expression des gènes p21 et p27.
Des essais ChIP ont ensuite été réalisés afin de tester cette hypothèse dans la cellule, en utilisant l'ADN des cellules T47-D traitées ou non avec la progestérone et un anticorps anti-TReP-132. Les résultats (figure 14C) montrent que l'élément de réponse à Sp1 proximal des promoteurs p21 et p27 est immunoprécipité dans un complexe obtenu en utilisant un anticorps anti-TReP-132. La liaison par TReP-132 est beaucoup plus prononcée avec l'ADN des cellules traitées à la progestérone. Le contrôle négatif est constitué par des extraits d'ADN amplifiés avec des amorces couvrant une région d'environ 1 kb en amont des sites de liaison Sp1 ou des amorces spécifiques du gène de la béta-actine pour lesquels aucun produit n'a été identifié.
Des expériences de pull-down ont permis ensuite de montrer que TReP-132 et PR
interagissent (figure 14D, colonne 3) et que cette interaction est augmentée de manière dose-dépendante par la progestérone (figure 14D, colonnes 3 à 7). TReP-132 présente 2 NR-box (Nuclear Receptor box) et des motifs LXXLL au niveau des acides aminés 181 (LRQLL) et 863 (LEMLL) (Gizard et al., 2001). De plus, il a été montré que la présence du motif LXXLL amino-terminal est indispensable pour l'interaction avec SF-1 (Gizard et al., 2002b). Des expériences de pull-down ont ensuite été réalisées avec des protéines GST-TReP-132 mutées au niveau de chaque motif LXXLL. La figure 14D
(à
droite) montre qu'une mutation de chaque motif entraîne une diminution nette de la liaison de TReP-132 à PR ce qui prouve l'importance des motifs LXXLL dans l'interaction in vitro de TReP-132 avec PR. Pris ensemble, ces résultats montrent que TReP-132 est un co-activateur de PR dans le complexe de régulation formé avec au niveau du site de liaison proximal à SP1 des promoteurs des gènes p21 et p27.
De la même manière, des expériences de pull-down ont été réalisées afin de tester l'interaction de TReP-132 et de ER. Les résultats, présentés sur la figure 15, montrent que TReP-132 et ER interagissent (Iigne 3).
En combinant ces résultats avec les résultats montrant une diminution nette de l'expression de TReP-132 associée à une augmentation de la prolifération cellulaire dans les cellules MCF-7 traitées à l'cestradiol, on peut conclure que l'action de ER sur la prolifération cellulaire passe par un mécanisme mettant en jeu une interaction avec TReP-132.
Des expériences supplémentaires de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) ont par ailleurs permis de mettre en évidence l'effet d'un ligand sur le recrutement de TReP-132 par ER et PR : la mesure du transfert d'énergie entre d'un côté l'AlloPhycoCyanin (APC) couplée à un anticorps anti-GST aux protéines de fusion GST-PR ou GST-ER et de l'autre la R-phycoerythrine (RPE) couplée à la streptavidine au complexe Biotine/NR-box de TReP 132 permet la mise en évidence de la liaison ligand dépendante entre TReP 132 et les récepteurs ER et PR.

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Claims

1. Méthode pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs diminuant la prolifération cellulaire, comprenant la détermination de la capacité d'un composé test à mimer, augmenter ou favoriser la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes.

2. Méthode selon la revendication 1, comprenant a. la mise en contact d'un composé test avec :
i. la protéine TReP-132 ou un complexe comprenant la protéine TReP-132, et ii. le récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes, et b. la mesure de la liaison de la protéine TReP-132 ou du complexe comprenant la protéine TReP-132 avec ledit récepteur.

3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que le récepteur est le récepteur de la progestérone ou celui des oestrogènes.

4. Méthode pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation, in vitro ou ex vivo, de composés actifs diminuant la prolifération cellulaire, comprenant:
a. la mise en contact, en présence de la progestérone ou d'cestrogènes, d'un composé test avec :
i. respectivement le récepteur de la progestérone ou le récepteur des oestrogènes, ii. Sp1, et iii. un acide nucléique comprenant tout ou partie du promoteur d'un gène cible de la progestérone ou des oestrogènes, et b. la mesure de la liaison de Sp1 ou du complexe comprenant le récepteur de la progestérone ou des oestrogènes et Sp1 audit promoteur, ou la mesure de l'expression dudit promoteur, ladite mesure étant une indication de l'effet du composé test sur la prolifération cellulaire.

5. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que la mise en contact est réalisée en présence de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-1 32.

6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce qu'elle est réalisée dans une cellule.

7. Méthode selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisée en ce que le gène cible de la progestérone ou des oestrogènes est choisi parmi les gènes p21, p16 et/ou p27.

8. Utilisation d'un composé choisi parmi la protéine TReP-132, un analogue de cette protéine, un composé augmentant ou mimant l'activité TReP-132 et un composé obtenu à l'aide d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour la préparation d'une composition pharmaceutique en combinaison avec une ou plusieurs hormones stéroïdiennes en vue d'une administration simultanée, séparée ou séquentielle pour traiter un cancer hormono-dépendant.

9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'hormone est la progestérone ou un oestrogène.

10. Utilisation selon la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce que le cancer hormono-dépendant est un cancer du sein ou un cancer de l'utérus.

11. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, dans un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, un composé choisi parmi la protéine TReP-132, un analogue de cette protéine, un composé augmentant ou mimant l'activité TReP-132 et un composé identifié à l'aide d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, combiné à une ou à plusieurs hormones stéroïdiennes, en vue d'une administration simultanée, séparée ou séquentielle pour traiter un cancer hormono-dépendant.

12. Composition pharmaceutique selon la revendication 11, caractérisée en ce que l'hormone est la progestérone ou un oestrogène.