CA2389169A1 - Novel limonoids for use particularly in the treatment of cancer and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
NOUVEAUX LIMONOòDES UTILES EN PARTICULIER DANS LE
TRAITEMENT DU CANCER ET LEUR PROCEDE DE PREPARATION
La présente invention concerne de nouveaux limonoïdes, leur procédé de purification, ainsi que de préparation, et leur utilisation, en particulier dans le traitement du cancer, ou le traitement du paludisme.
Ces nouveaux limonoïdes peuvent être isolés à partir des organes végétaux de certaines plantes, en particulier du genre Harrisonia, mais aussi de toute autre genre, qui pourrait les contenir.
On trouve les plantes du genre Harrisonia, appartenant à la famille des simaroubacées principalement en Asie du Sud-Est. Par exemple, l'espèce Harrisonia perforata Merr. se rencontre au Viêt-nam, en Chine du Sud, au Laos, au Cambodge, en Thaïlande, aux Philippines, et en Indonésie. Cette espèce s' est montrée particulièrement apte à être utilisée en tant que matériel de départ dans la présente invention, mais il est évident que les procédés mis en oeuvre dans la présente invention pourront être utilisés avec d'autres espèces, de la même famille botanique, ou d'autres familles.
Les limonoïdes sont des composés déjà décrits dans la littérature, et peuvent être trouvés dans de nombreuses espèces végétales. Quelques représentants de ce type de composés ont été signalés dans des plantes du genre Harrisonia (Kubo et al.
Heterocycles, 1976, 5, 485-98 ; Rajab et al. J. Nat. Prod., 1997, 60, 822-5 ;
Koike et al. Tetrahedron, 1993, 49, 2209-16 ; Mitsunaga et al. Phytochemistry, 1994, 37, 1443-6) et des limonoïdes différents de ceux décrits dans la présente invention ont été isolés d'Harrisonia perforata (Byrne et al. Austr. J. Chem. 1991, 44, 165-9 ;
Wei et al. Jiegou Huaxue, 1985, 4, 281-7 ; TranVan et al. Phytochemistry, 1995, 38, 213-5 ; Kamiuchi et al. Heterocycles, 1996, 43, 653-64).
C'est un des objets de la présente invention que de caractériser les nouveaux liminoïdes isolés de plantes d'un tel genre, ainsi que de fournir un procédé
d' extraction.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) NEW LIMONOODS USEFUL IN PARTICULAR IN THE
CANCER TREATMENT AND THEIR PREPARATION PROCESS
The present invention relates to new limonoids, their process for purification, as well as preparation, and their use, in particular in the cancer treatment, or malaria treatment.
These new limonoids can be isolated from plant organs certain plants, in particular of the genus Harrisonia, but also of all other like that could contain them.
We find plants of the genus Harrisonia, belonging to the family of simaroubaceae mainly in Southeast Asia. For example, the species Harrisonia perforata Merr. meets in Vietnam, in South China, in Laos, at Cambodia, Thailand, the Philippines, and Indonesia. This species is shown to be particularly suitable for use as starting material in the present invention, but it is obvious that the methods implemented in the present invention may be used with other species, the same family botany, or other families.
Limonoids are compounds already described in the literature, and can be found in many plant species. Some representatives of this type of compounds have been reported in plants of the genus Harrisonia (Kubo et al.
Heterocycles, 1976, 5, 485-98; Rajab et al. J. Nat. Prod., 1997, 60, 822-5;
Koike et al. Tetrahedron, 1993, 49, 2209-16; Mitsunaga et al. Phytochemistry, 1994, 37, 1443-6) and limonoids other than those described herein invention have isolated from Harrisonia perforata (Byrne et al. Austr. J. Chem. 1991, 44, 165-9;
Wei et al. Jiegou Huaxue, 1985, 4, 281-7; TranVan et al. Phytochemistry, 1995, 38, 213-5; Kamiuchi et al. Heterocycles, 1996, 43, 653-64).
It is one of the objects of the present invention to characterize the new liminoids isolated from plants of such a genus, as well as providing a method extraction.
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
2 Ces nouveaux liminoïdes peuvent être modifiés, et les produits obtenus par les modifications chimiques sont également des objets de la présente invention, de même que les procédés de modification.
Il est connu que les liminoïdes peuvent avoir un effet contre certains types de cancer, ou dans le traitement du paludisme. La Demanderesse a montré que certains des produits selon l'invention possèdent une activité cytotoxique remarquable contre la prolifération cellulaire. Ainsi, l'utilisation des composés selon l'invention dans le traitement du cancer ou du paludisme, ou pour la préparation de médicaments pour une telle utilisation est également un des objets de l' invention.
Les composés selon l'invention sont obtenus à partir de plantes du genre Harrisonia, de manière préférée Harrisonia perforata, suivant un procédé
simple et bon marché.
Le procédé de l'invention consiste essentiellement à traiter des organes végétaux de Harrisonia perforata, en particulier les feuilles desséchées, réduites en poudre au préalable, par une solution hydroalcoolique, ce qui fournit une solution hydroalcoolique de principes actifs amers. Cette solution est ensuite traitée par une solution aqueuse d'acétate de plomb et le précipité formé est séparé par filtration. Le filtrat obtenu est traité par une solution aqueuse de sulfate de sodium. Après décantation et filtration on obtient un filtrat hydroalcoolique de principes amers que l'on peut traiter de deux façons différentes.
1. Le filtrat hydroalcoolique est traité, sous agitation, par du charbon actif qui absorbe les principes amers. On recueille le charbon par filtration.
Ce charbon est desséché à 50° et réduit en poudre. Les principes amers retenus par cette poudre de charbon sont extraits par du chloroforme.
L'extrait chloroformique est évaporé à sec. On obtient l'extrait brut de principes actifs.
2. Le filtrat hydroalcoolique est évaporé à sec sous vide. L'extrait brut est extrait au chloroforme. La solution chloroformique, évaporée à sec, fournit l'extrait brut de principes actifs L' extrait brut ainsi obtenu, contenant un mélange de nombreux principes actifs est également un des objets de l'invention, ainsi que les composés susceptibles d'être isolés à partir de cet extrait brut.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) 2 These new liminoids can be modified, and the products obtained by chemical modifications are also objects of this invention, of same as the modification processes.
It is known that liminoids can have an effect against certain types cancer, or in the treatment of malaria. The Applicant has shown that some of the products according to the invention have cytotoxic activity remarkable against cell proliferation. Thus, the use of compounds according to the invention in the treatment of cancer or malaria, or for the preparation of drugs for such use is also one of the objects of the invention.
The compounds according to the invention are obtained from plants of the genus Harrisonia, preferably Harrisonia perforata, according to a process simple and cheap.
The method of the invention consists essentially in treating organs Harrisonia perforata plants, especially dried leaves, reduced in powder beforehand, with a hydroalcoholic solution, which provides a solution hydroalcoholic bitter active ingredients. This solution is then processed by one aqueous solution of lead acetate and the precipitate formed is separated by filtration. The The filtrate obtained is treated with an aqueous solution of sodium sulfate. After decantation and filtration we obtain a hydroalcoholic filtrate of principles bitter that you can treat it in two different ways.
1. The hydroalcoholic filtrate is treated, with stirring, with activated carbon which absorbs bitter principles. The charcoal is collected by filtration.
This charcoal is dried at 50 ° and reduced to powder. The principles bitter retained by this coal powder are extracted with chloroform.
The chloroform extract is evaporated to dryness. We obtain the raw extract of active subtances.
2. The hydroalcoholic filtrate is evaporated to dryness under vacuum. The raw extract is chloroform extract. The chloroform solution, evaporated to dryness, provides the raw extract of active ingredients The raw extract thus obtained, containing a mixture of numerous principles active is also one of the objects of the invention, as well as the compounds likely to be isolated from this raw extract.
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
3 On effectue alors un traitement complémentaire de cet extrait brut pour en isoler les limonoïdes purs par chromatographie, soit sur colonne soit sur plaque de silice, en utilisant différents solvants, en particulier les toluène, cyclohexane, heptane, chloroforme, éther, acétate d'éthyle, éthanol, méthanol, chlorure de méthylène.
Les limonoïdes ainsi obtenus peuvent ensuite être modifiés en adaptant des procédés chimiques connus de l'homme du métier, afin de substituer certains radicaux, dans le but, par exemple, d'obtenir des composés possédant des stéréochimies différentes, ou une activité biologique améliorée. Ainsi, les exemples 7 et 10 décrivent certaines modifications connues de l'homme du métier.
Les composés selon l'invention possèdent tous des centres d'asymétrie et peuvent donc exister sous forme d'isomères optiques. La présente invention comprend aussi bien tous ces isomères, soit séparément, soit en tant que mélange.
Les composés selon l'invention auront de préférence une formule générale:
R9 O ~O (1) R7, Rs R1R2/I~ R3 dans laquelle B représente, soit le radical O
O la liaison s'effectuant au niveau du carbone porteur de R4, soit B forme avec R3 un composé de formule FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) 3 An additional treatment of this raw extract is then carried out in order to isolate the pure limonoids by chromatography, either on a column or on plate of silica, using different solvents, in particular toluene, cyclohexane, heptane, chloroform, ether, ethyl acetate, ethanol, methanol, chloride methylene.
The limonoids thus obtained can then be modified by adapting chemical processes known to those skilled in the art, in order to replace certain radicals, with the aim, for example, of obtaining compounds having different stereochemistry, or improved biological activity. So the examples 7 and 10 describe certain modifications known to those skilled in the art.
The compounds according to the invention all have centers of asymmetry and can therefore exist in the form of optical isomers. The present invention includes all of these isomers, either separately or as mixed.
The compounds according to the invention will preferably have a general formula:
R9 O ~ O (1) R7, Rs R1R2 / I ~ R3 in which B represents either the radical O
O the link taking place at the level carbon carrying R4, either B forms with R3 a compound of formula SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
4 et dans laquelle ~ les pointillés représentent, de façon indépendante, des simples liaisons ou des doubles liaisons, ~ R6 à R13, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur en C1-C4, linéaire ou ramifié, substitué ou non, de préférence un groupe méthyle, ~ Rl est le groupe OH, ou forme avec R2 un pont de structure O
~- ou ~ R2 est le groupe =O ou forme avec R1 un pont comme défini ci-dessus, ~ lorsque R3 est présent, R3 est choisi parmi l'atome d'hydrogène ou un groupe OH, ou forme avec RS un pont de structure ~ R4 est le groupe OH ou le groupe OCOCH3 ou R4 est absent afin de former la double liaison telle qu'indiquée en pointillé, ~ RS est un atome d'hydrogène ou forme avec R3 le pont tel que décrit précédemment, ainsi que leurs dérivés, sous forme libre, ou sous forme de sels pharmaceutiquement acceptables.
Par « dérivés », on entend tous les intermédiaires métaboliques produits lors de la synthèse biochimique de ces composés par le végétal, c'est-à-dire les FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) composés qui peuvent être obtenus en aval de la voie métabolique, ainsi que les composés présents en amont de cette même voie, et les composés qui en découlent.
Par « sels pharmaceutiquement acceptables », on entend les sels pouvant être formés à partir de ces composés, en particulier par association avec des bases 4 and in which ~ the dotted lines represent, independently, simple bonds or double bonds, ~ R6 to R13, identical or different, represent an atom hydrogen or a linear or branched C1-C4 lower alkyl group, substituted or unsubstituted, preferably a methyl group, ~ Rl is the OH group, or forms with R2 a structural bridge O
~ - or ~ R2 is the group = O or forms with R1 a bridge as defined above above, ~ when R3 is present, R3 is chosen from the hydrogen atom or an OH group, or forms with RS a structural bridge ~ R4 is the OH group or the OCOCH3 or R4 group is absent so to form the double bond as indicated in dotted lines, ~ RS is a hydrogen atom or forms with R3 the bridge such that previously described, as well as their derivatives, in free form, or in the form of salts pharmaceutically acceptable.
By "derivatives" is meant all the metabolic intermediates produced during of biochemical synthesis of these compounds by the plant, i.e.
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) compounds which can be obtained downstream of the metabolic pathway, as well as the compounds present upstream of this same path, and the compounds which arise.
By "pharmaceutically acceptable salts" is meant the salts which may be formed from these compounds, in particular by association with bases
5 classiques et non toxiques, organiques ou minérales. Les sels dérivés de bases minérales incluent les sels d'aluminium, de cuivre, de fer ferreux ou ferrique, de lithium, de manganèse, de zinc, et plus particulièrement les sels d'ammonium, de calcium, de potassium, de magnésium et de sodium. Les sels dérivés de bases organiques incluent les sels d'amines primaires, secondaires ou tertiaires, d'amines substitués, d'amines cycliques ou de résines échangeuses d'ions basiques, comme l'arginine, la bétaïne, la caféine, la choline, l'éthylènediamine, la diéthylamine, la triéthylamine, la tripropylamine, la triméthylamine, la trométhamine, la lysine, l'arginine, la méthylglucamine, la pipérazine, la pipéridine, les résines de polyamine, les purines, la N-éthylpipéridine, la glucamine, ou la glucosamine.
On préférera tout particulièrement les composés de formule (I), ayant pour formule particulière O
H3Ç
H CH3 \ O O
H3C~ ~ ~~OMe H3C
HO I I ne o' 1 0 ,O .
H
101 L l ' L2 > >
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) WO 01/30775 classic and non-toxic, organic or mineral. Salts derived from basics mineral include aluminum, copper, ferrous iron or ferric, from lithium, manganese, zinc, and more particularly the ammonium salts, of calcium, potassium, magnesium and sodium. Salts derived from bases organic include salts of primary, secondary or tertiary amines, amines substituted, cyclic amines or basic ion exchange resins, as arginine, betaine, caffeine, choline, ethylenediamine, diethylamine, the triethylamine, tripropylamine, trimethylamine, tromethamine, lysine, arginine, methylglucamine, piperazine, piperidine, resins polyamine, purines, N-ethylpiperidine, glucamine, or glucosamine.
Particular preference will be given to the compounds of formula (I), having for special formula O
H3Ç
H CH3 \ OO
H3C ~ ~ ~~ OMe H3C
HO II does o '1 0 , O.
H
101 L the L2 >>
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) WO 01/3077
6 PCT/FR00/02951 HsÇ O
H CH3 ~O
HsC . H CHs ~O
Rome H3C , p OH II
O Rome H - HO
O / -O
O
O ' ou O
!1e Parmi les dérivés des composés de formule générale (I), on entend comprendre les composés qui peuvent également être extraits du végétal considéré, font partie de la même voie métabolique que les composés de formule générale I, et font donc partie de l' invention.
Les exemples montreront que les composés suivants, qui possèdent la même structure que les composés de formule générale (I), peuvent être isolés et caractérisés à partir de l'extrait brut. Ils font donc partie de l'invention.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) O ~ L5 6 PCT / FR00 / 02951 HsÇ O
H CH3 ~ O
HsC. H CHs ~ O
Rome H3C, p OH II
O Rome H - HO
O / -O
O
Where or O
! 1st Among the derivatives of the compounds of general formula (I), is meant understand the compounds that can also be extracted from plants considered, are part of the same metabolic pathway as the compounds of the general formula I, and are therefore part of the invention.
The examples will show that the following compounds, which have the same structure that the compounds of general formula (I), can be isolated and characterized from the raw extract. They are therefore part of the invention.
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) O ~ L5
7 O HsC O O
O
HsC~~ OH / H HaC~~ O H
'O ~'O
w0 w0 "' ~ O
HO OH HO OH
OMe O O OMe O O
O ~,, O , O
O
H
H
i O
OH H U
IIL l IIL2 O
n O O O Hs U
IV V
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) 7 O HsC OO
O
HsC ~~ OH / H HaC ~~ OH
'O ~' O
w0 w0 "'~ O
HO OH HO OH
OMe OO OMe OO
O ~ ,, O, O
O
H
H
i O
OH HU
IIL l IIL2 O
not OOO Hs U
IV V
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
8 Les compositions pharmaceutiques contenant un composé selon l'invention, et des excipients pharmaceutiquement acceptables font également partie de l'invention. Ces compositions peuvent être formulées pour l'administration aux mammifères, y compris l'homme.
On pourra ainsi utiliser toute sorte de d'agents liant, tensioactif, d'enrobage, de dispersion, de mouillage afin de favoriser la stabilité, la conservation, et la libération de ces composés. En particulier, on utilisera des excipients classiques, par exemple la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique, ou analogues.
On pourra ainsi définir toutes sortes de compositions pharmaceutiques, en particulier injectables, ou permettant une prise orale. Les compositions permettant une prise orale pourront être des comprimés, des gélules, des poudres, des granules ou des suspensions ou solutions orales. Elles comprennent également les formes d'administration sublinguale et buccale. Les compositions injectables pourront l'être par voie sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intranasale ou intraoculaire.
L'utilisation d'un composé selon l'invention pour la préparation d'un médicament, en particulier destiné au traitement du cancer ou du paludisme fait également partie de l'invention. La posologie varie selon le traitement et selon l'affection en cause.
Les exemples qui suivent servent à illustrer l'invention, sans qu'ils ne représentent une quelconque limitation à l'invention. Il est entendu que les méthodes d'extraction chromatographiques peuvent être optimisées. En particulier, l'homme du métier reconnaîtra qu'un changement dans les solvants décrits dans ces exemples pourra éventuellement permettre d'obtenir les mêmes composés.
* EXEMPLE 1 1 000 g de feuilles séchées et pulvérisées de Harrisonia perforata sont mis en macération avec de l'éthanol aqueux titrant 25°, à la température du laboratoire.
On extrait ensuite, par lixiviation, avec au total, 10 L d'alcool titrant 25°. Le lixiviat hydroalcoolique est traité par 400 ml de solution aqueuse d'acétate de plomb à
30%.
Il se forme un précipité que l'on élimine par filtration.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) 8 Pharmaceutical compositions containing a compound according to the invention, and pharmaceutically acceptable excipients are also part of the invention. These compositions can be formulated for administration to mammals, including humans.
We can thus use all kinds of binding agents, surfactants, coating, dispersion, wetting in order to promote stability, conservation, and the release of these compounds. In particular, excipients will be used classics, by example gelatin, starch, lactose, magnesium stearate, talc, the gum arabic, or the like.
We can thus define all kinds of pharmaceutical compositions, in particular injectable, or allowing an oral intake. The essays allowing an oral intake may be tablets, capsules, powders, granules or suspensions or oral solutions. They also include shapes sublingual and oral administration. The injectable compositions may be it subcutaneously, intramuscularly, intravenously, intranasally or intraocular.
The use of a compound according to the invention for the preparation of a medicament, in particular intended for the treatment of cancer or malaria fact also part of the invention. The dosage varies depending on the treatment and according to the condition in question.
The examples which follow serve to illustrate the invention, without they represent any limitation to the invention. It is understood that Chromatographic extraction methods can be optimized. In particular, those skilled in the art will recognize that a change in the solvents described in these examples may possibly make it possible to obtain the same compounds.
* EXAMPLE 1 1000 g of dried and sprayed leaves of Harrisonia perforata are put in maceration with aqueous ethanol titrating 25 °, at the temperature of laboratory.
Then extracted, by leaching, with a total of 10 L of alcohol titrating 25 °. Leachate hydroalcoholic is treated with 400 ml of aqueous lead acetate solution to 30%.
A precipitate is formed which is removed by filtration.
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
9 Le filtrat obtenu est ensuite traité par 120 ml d'une solution aqueuse de sulfate de sodium à 15%. Le précipité de sulfate de plomb qui s'est formé est éliminé par filtration. On obtient ainsi une solution hydroalcoolique de principes actifs. Cette solution est traitée, en trois fois, par agitation avec du charbon végétal (en tout 30 g de charbon ) qui retient les principes actifs. Le charbon est séparé par filtration et séché à 50° pendant 24 h. Ce charbon renfermant les principes actifs est introduit dans un Soxhlet et extrait par du chloroforme.
On évapore l'extrait chloroformique à sec sous vide pour obtenir 2,42 g d'extrait sec, nommé extrait N° 1. Le rendement en extrait sec est de 0,25%.
* EXEMPLE 2 L'extrait N° 1 obtenu selon l'exemple 1 ( 175 g) est dissous dans du toluène (400 ml) et soumis à un traitement chromatographique sur colonne de silice 60 H.
On effectue une élution de la colonne de silice (1 kg) par des fractions de 1 L d'un mélange de toluène-éther (1:l). Chaque fraction est évaporée à sec sous vide et pesée. Les différentes fractions sont analysées par chromatographie en couche mince de silice (CCM).
La première fraction F~ (4 L) par évaporation sous vide à sec fournit un résidu de 74,80 g nommé extrait N° 2.
Par cristallisation dans le méthanol ce résidu fournit l'haperforine A (HA, composé IL2) (1,30 g) qui présente les caractéristiques suivantes '-; O
H CH3CC~ zz // z1 18 _ 20 H
12 17 p Il 13 H 1~ H 9 Is~~'~.
H 6~ 1o H 3C0 ~ O 1~ 4 O
Haperforine A
C31 H36 ~ 14 - 632 FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) Haperforine A : C3,H36O,4 = 632. F 238°-240° (MeOH), [a]D =
+ 51,8 (CHC13, c = 1,05); HR ICSM : MH+ 633,2180 (calc. 633,2183 pour C3,H3,0,4);
Analyse : % tr. C 58,84, H 5,74, O 35,42, calc. C 58,86, H 5, 74, O 35,42 pour 5 C3,H,6O,4 ; UV : lm~ (EtOH) : 272,6 nm (e = 13750); IR lnm: 3468 (OH), 1743 (C=O), 1712 (C=O conjugué), 1243 (C-O), 1200 (C-O),1050 (C-O); 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 1,18 (3H, s, CH3), 1,28 (3H, s, CH3-18), 1,40 (6H, s, 2 CH3), 1,58 (3H, s, CH3), 2,0 (3H, s, COCH3), 2,50 (3H, s, COCH3), 3,0 (1H, d, J= 4, H-9), 3,80 ((3H, s, COzCH3), 4,30 (1H, s, H-15), 5,16 (1H, d, J = 4, H-12), 5,80 et 6,08 9 The filtrate obtained is then treated with 120 ml of an aqueous solution of 15% sodium sulfate. The precipitate of lead sulfate which has formed is removed by filtration. A hydroalcoholic solution of principles assets. This solution is treated, in three stages, by stirring with vegetable coal (altogether 30 g of charcoal) which retains the active ingredients. Coal is separated by filtration and dried at 50 ° for 24 h. This coal containing the active ingredients is introduced into a Soxhlet and extracted with chloroform.
The chloroform extract is evaporated to dryness under vacuum to obtain 2.42 g dry extract, called extract N ° 1. The dry extract yield is 0.25%.
* EXAMPLE 2 Extract No. 1 obtained according to Example 1 (175 g) is dissolved in toluene (400 ml) and subjected to a chromatographic treatment on a silica column 60 H.
Elution is carried out from the silica column (1 kg) in fractions of 1 L of a toluene-ether mixture (1: l). Each fraction is evaporated to dryness under empty and weighed. The different fractions are analyzed by chromatography in layer thin silica (TLC).
The first fraction F ~ (4 L) by dry vacuum evaporation provides a residue of 74.80 g named extract N ° 2.
By crystallization from methanol this residue provides haperforin A (HA, compound IL2) (1.30 g) which has the following characteristics '-; O
H CH3CC ~ zz // z1 18 _ 20 H
12 17 p He 13 H 1 ~ H 9 Is ~~ '~.
H 6 ~ 1o H 3C0 ~ O 1 ~ 4 O
Haperforin A
C31 H36 ~ 14 - 632 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Haperforine A: C3, H36O, 4 = 632. F 238 ° -240 ° (MeOH), [a] D =
+ 51.8 (CHCl3, c = 1.05); HR ICSM: MH + 633.2180 (calc. 633.2183 for C3, H3,0,4);
Analysis:% tr. C 58.84, H 5.74, O 35.42, calc. C 58.86, H 5, 74, O 35.42 for 5 C3, H, 6O, 4; UV: lm ~ (EtOH): 272.6 nm (e = 13750); IR lnm: 3468 (OH), 1743 (C = O), 1712 (C = O conjugate), 1243 (CO), 1200 (CO), 1050 (CO); 'H NMR d ppm, J Hz, CDC13: 1.18 (3H, s, CH3), 1.28 (3H, s, CH3-18), 1.40 (6H, s, 2 CH3), 1.58 (3H, s, CH3), 2.0 (3H, s, COCH3), 2.50 (3H, s, COCH3), 3.0 (1H, d, J = 4, H-9), 3.80 ((3H, s, COzCH3), 4.30 (1H, s, H-15), 5.16 (1H, d, J = 4, H-12), 5.80 and 6.08
10 (2H, AB J = 12, H-5 et H-6), 5,86 (1H, t, J = 4, H-11), 6,0 (1H, s, H-17), 6,30 (1H, s, H-22), 7,30 (1H, s, H-23), 7,40 (1H, s, H-21) ;'3C RMN d ppm : 16,09 (CH3-18), 16,50 (CH3), 19,41 (CH3), 21,45 (COCH3), 21,60 (COCH3), 24,50 (CH3), 27,92 (CH3), 42,77 (C), 48,47 (CH-9), 49,83 (C), 51,09 (C), 52,69 (OCH3), 54,99 (CH-15), 63,89 (CH-11), 66,53 (C), 71,77 (CH-12), 75,90 (CH-17), 81,68 (C), 87,85 (C), 108,49 (C-3), 109,87,34 (CH-22), 120,14 (C-20), 123,98 (CH-6), 142,04 (CH-23), 144,25 (CH-21), 152,17 (CH-5), 167,20 (C=O ), 167,44 (C=O), 170,07 (C=O), 170,50 (C=O), 204,17 (C=O, C-1). Les attributions ont été réalisées à l'aide d'expériences de RMN 2D, COSY'H-'H et "C-'H.
La deuxième fraction F2 (7 L) est évaporée à sec sous vide et redissoute dans le méthanol. Les cristaux formés séparés et purifiés fournissent 12,05 g d'haperforine E (HE, composé IV) L'haperforine E présente les caractéristiques suivantes ,a 1 ~~ O Haperforine E
~3 9 $ 14 1516 C27H3408 = 486 ~~21 10 "" " O
H ' 9 svH O
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) 10 (2H, AB J = 12, H-5 and H-6), 5.86 (1H, t, J = 4, H-11), 6.0 (1H, s, H-17), 6.30 (1H, s, H-22), 7.30 (1H, s, H-23), 7.40 (1H, s, H-21); '3C NMR d ppm: 16.09 (CH3-18), 16.50 (CH3), 19.41 (CH3), 21.45 (COCH3), 21.60 (COCH3), 24.50 (CH3), 27.92 (CH3), 42.77 (C), 48.47 (CH-9), 49.83 (C), 51.09 (C), 52.69 (OCH3), 54.99 (CH-15), 63.89 (CH-11), 66.53 (C), 71.77 (CH-12), 75.90 (CH-17), 81.68 (C), 87.85 (VS), 108.49 (C-3), 109.87.34 (CH-22), 120.14 (C-20), 123.98 (CH-6), 142.04 (CH-23), 144.25 (CH-21), 152.17 (CH-5), 167.20 (C = O), 167.44 (C = O), 170.07 (C = O), 170.50 (C = O), 204.17 (C = O, C-1). Allocations were made using 2D NMR experiments, COZY'H-'H and "C-'H.
The second fraction F2 (7 L) is evaporated to dryness under vacuum and redissolved in methanol. The separated and purified crystals formed provide 12.05 g haperforin E (HE, compound IV) Hperforin E has the following characteristics ,at 1 ~~ O Haperforine E
~ 3 $ 9 14 1,516 C27H3408 = 486 ~~ 21 10 """O
H '9 svH O
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
11 Haperforine E : Cz,H34O8 = 486; F 225-226° (EtOH), [a]D = - 52 (CHC13, c = 1); HR ICSM : MH+ 487,2343 (calc. 487,2331 pour CZ,H3508); Analyse : % tr. C
66;18 H 7,01, O 26,82 calc. C 66,65, H 7,05, O 26,32 pour CZ,H34O8 ;UV : lmaX
(EtOH) : ; IR (laque) n cm' : 1767 et 1744 (C=O), 1658 (C=C), 1507 et 3136 (furanne), 1405, 1250, 1039 (C-O) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDCl3: 0,86 (3H, s, CH3), 1,04 (3H, s, CH3), 1,16 (1H, m, H-12a), 1,50 (3H, s, CH3), 1,62 (3H, s, CH3), 1,83 (2H, m, CHZ-12b, CHZ-1 1a),),2,04 ((1H, m, CHZ-l lb), 2, 24 (1H, dd, J =
6, J' _ 11, H-3), 2,40 (2H, m, CHZ-6), 2, 50 (1H, d, J = 4, H-9), 2, 78 et 2,87 (2H, AB, J =
18, CHZ-15), 2,92 (1H, ABX, J = 11, J' = 18, H-2a), 3,32 (1H, dd, J = 6, J' =
18, H-2b), 3,62 (1H, dd, J = 4, J' = 10, H-5), 3,70 ((3H, s, OCH3), 4, 90 (1H, s, H-30a), 5,18 (1H, s, H-30b), ), 5,62 (1H, s, H-17), 6,38 (1H, s, H-22), 7,38 (1H, s, H-23), 7,45 (1H, s, H-21) ; '3C RMN d ppm : 14,52 (CH3), 24,80 (CH3), 26,35 (CHI-11), 26,72 (CH3), 30,28 (CHZ-12), 32,65 (CHZ-15), 33,19 (CH3), 33,70 (CHz-2), 35,08 (CHZ-6), 41,52 (C), 48,04 (C), 48,82 (CH-9), 50,80 (CH-3), 52,32 (OCH3), 78,42 (CH-5), 79,56 (CH-17), 81,95 (C), 87,59 (C), 109,78 (CH-22), 111,72 (CHZ-30), 120,76 (C-20), 140,60 (CH-23), 142,88 (CH-21), 146,50 (C-8), 169,81 (C=O ), 171,28 (C=O ), 175,44 (C=O).
Les attributions ont été réalisées à l'aide d'expériences de RMN 2D, COSY
'H-'H et '3C-'H.
* EXEMPLE 3 L'extrait N°2 (91 g) de l'exemple 2 est dissous dans le toluène et soumis à un traitement chromatographique sur colonne de silice 60 H (1 kg). La colonne de silice est éluée par des fractions de solvants de 1 L (toluène-éther (1:1).
La troisième fraction de 1 L est évaporée à siccité sous pression réduite et conduit à un résidu N°3 ( 52 g ) qui sera décrit dans l'exemple 4.
La quatrième fraction (4 L) par cristallisation du méthanol fournit l'haperforine E ( 6,20 g) décrite dans l'exemple 2.
* EXEMPLE 4 Les résidus des chromatographies des exemples 2 et 3 ( 127 g) sont dissous dans du toluène (400 ml) et soumis à un traitement chromatographique sur colonne de silice 60 H ( 1 kg).
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) 11 Haperforin E: Cz, H34O8 = 486; F 225-226 ° (EtOH), [a] D = - 52 (CHC13, c = 1); HR ICSM: MH + 487.2343 (calc. 487.2331 for CZ, H3508); Analysis:% tr. VS
66; 18 H 7.01, O 26.82 calc. C 66.65, H 7.05, O 26.32 for CZ, H34O8; UV: lmaX
(EtOH):; IR (lacquer) n cm ': 1767 and 1744 (C = O), 1658 (C = C), 1507 and 3136 (furan), 1405, 1250, 1039 (CO); 'H NMR d ppm, J Hz, CDCl3: 0.86 (3H, s, CH3), 1.04 (3H, s, CH3), 1.16 (1H, m, H-12a), 1.50 (3H, s, CH3), 1.62 (3H, s, CH3), 1.83 (2H, m, CHZ-12b, CHZ-1 1a),), 2.04 ((1H, m, CHZ-1 lb), 2.24 (1H, dd, J =
6, I _ 11, H-3), 2.40 (2H, m, CHZ-6), 2.50 (1H, d, J = 4, H-9), 2.78 and 2.87 (2H, AB, J =
18, CHZ-15), 2.92 (1H, ABX, J = 11, J '= 18, H-2a), 3.32 (1H, dd, J = 6, J' =
18, H-2b), 3.62 (1H, dd, J = 4, J '= 10, H-5), 3.70 ((3H, s, OCH3), 4.90 (1H, s, H-30a), 5.18 (1H, s, H-30b),), 5.62 (1H, s, H-17), 6.38 (1H, s, H-22), 7.38 (1H, s, H -23), 7.45 (1H, s, H-21); '3C NMR d ppm: 14.52 (CH3), 24.80 (CH3), 26.35 (CHI-11), 26.72 (CH3), 30.28 (CHZ-12), 32.65 (CHZ-15), 33.19 (CH3), 33.70 (CHz-2), 35.08 (CHZ-6), 41.52 (C), 48.04 (C), 48.82 (CH-9), 50.80 (CH-3), 52.32 (OCH3), 78.42 (CH-5), 79.56 (CH-17), 81.95 (C), 87.59 (C), 109.78 (CH-22), 111.72 (CHZ-30), 120.76 (C-20), 140.60 (CH-23), 142.88 (CH-21), 146.50 (C-8), 169.81 (C = O), 171.28 (C = O), 175.44 (C = O).
Allocations were carried out using 2D NMR experiments, COZY
'H-'H and'3C-'H.
* EXAMPLE 3 Extract No. 2 (91 g) from Example 2 is dissolved in toluene and subject to chromatographic treatment on a 60 H silica column (1 kg). The column of silica is eluted with 1 L solvent fractions (toluene-ether (1: 1).
The third fraction of 1 L is evaporated to dryness under reduced pressure and leads to a residue No. 3 (52 g) which will be described in Example 4.
The fourth fraction (4 L) by crystallization of methanol provides haperforin E (6.20 g) described in Example 2.
* EXAMPLE 4 The residues from the chromatographies of Examples 2 and 3 (127 g) are dissolved in toluene (400 ml) and subjected to a chromatographic treatment on column 60 H silica (1 kg).
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
12 La colonne de silice est éluée par fraction de 1 000 ml d'un mélange de toluène-éther (7 : 3). Chaque fraction est évaporée à sec sous vide et pesée.
La fraction 1 (2 L) fournit un résidu de 4 g, que l'on dissout dans du méthanol.
Les cristaux, formés après concentration et repos à basse température (3°) sont séparés et purifiés par recristallisation dans ce même solvant, fournissent l'haperforine A (225 mg), décrite dans l'exemple 2.
La fraction 3 ( 7 L) évaporée à sec ( 91 g) est traitée selon l'exemple 5.
* EXEMPLE 5 Chromatographie N° 1 La fraction 3 ( 91 g) obtenue dans l'exemple 4 est dissoute dans du toluène (400 ml) et la solution obtenue est soumise à un traitement chromatographique sur colonne de silice 60 H (lkg).
La colonne de silice est éluée par fraction de 1 000 ml d'un mélange de toluène-éther (7 : 3). Chaque fraction est évaporée à sec sous vide et pesée.
La fraction 1 (2 L) fournit un résidu de 1,55 g. La fraction 2 (1 L) fournit un résidu de 10,95 g.
Par cristallisation dans le méthanol, on obtient l'haperforine A2 (210 mg) qui présente les caractéristiques suivantes Haperforine A2 : C29H3zO,3 = 588. F 222° (MeOH), [a]D = + 77,8 (CHC13, c =
1), ; HR ICSM : MH+ 589,1955 (calc. 575,1921 pour CZgH33O~3) ; 'H RMN d ppm, J
Hz, CDCl3: 1,16 (3H, s, CH3), 1,25 (3H, s, CH3), 1,32 (3H, s, CH3), 1,46 (3H, s, CH3), 1,70 (3H, s, CH3), 2,14 (3H, s, COCH3), 3,40 (2H, s), 3,70 (3H, s, OCH3), 3,88 (1H, s, OH), 3,93 (1H, s), 4,30 (1H, s), 5,03 (1H, s), 5,17 (1H, s, OH), 5,67 et 5,92 (1H, AB, J = 12), 5, 90 (1H, s), 6,26 (1H, S, H-22), 7,30 (1H, s, H-23), 7,35 (1H, s, H-21) ; '3C RMN d ppm : 16,73 (CH3), 17,34 (CH,), 18,58 (CH3), 20,65 (COÇH3), 23,66 (CH3), 26,87 (CHZ), 42,65 (C), 48,98 (C), 50,53 (C), 51,91 (CH?), 54,24 (OCH,), 59,75 (CH), 65,54 (C), 73,96 (CH), 75,07 (CH), 81,27 (C), 87,16 (C), 105,56 (C), 109,01 (CH-22), 118,90 (C-20), 121,76 (CH), 141,58 (CH-23), 143,55 (CH-21), 151,56 (CH), 166,30 (C=O), 168,15 (C=O), 199,67 (C=O ), 215,58 (C=O ).
Par recristallisation des eaux-mères, on obtient l'haperforine A, (200 mg).
Par ailleurs, la cristallisation du résidu restant dans le méthanol fournit fhaperforine A (440 mg).
L'haperforine A~ présente les caractéristiques suivantes FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) 12 The silica column is eluted in 1000 ml fractions of a mixture of toluene ether (7: 3). Each fraction is evaporated to dryness under vacuum and weighed.
The fraction 1 (2 L) provides a residue of 4 g, which is dissolved in methanol.
The crystals, formed after concentration and rest at low temperature (3 °) are separated and purified by recrystallization from this same solvent, provide haperforin A (225 mg), described in Example 2.
Fraction 3 (7 L) evaporated to dryness (91 g) is treated according to Example 5.
* EXAMPLE 5 Chromatography N ° 1 Fraction 3 (91 g) obtained in Example 4 is dissolved in toluene (400 ml) and the solution obtained is subjected to a chromatographic treatment sure 60 H silica column (lkg).
The silica column is eluted in 1000 ml fractions of a mixture of toluene ether (7: 3). Each fraction is evaporated to dryness under vacuum and weighed.
Fraction 1 (2 L) provides a residue of 1.55 g. Fraction 2 (1 L) provides a residue of 10.95 g.
By crystallization from methanol, haperforin A2 (210 mg) is obtained, which has the following characteristics Haperforine A2: C29H3zO, 3 = 588. F 222 ° (MeOH), [a] D = + 77.8 (CHC13, c =
1),; HR ICSM: MH + 589.1955 (calc. 575.1921 for CZgH33O ~ 3); 'H NMR d ppm, J
Hz, CDCl3: 1.16 (3H, s, CH3), 1.25 (3H, s, CH3), 1.32 (3H, s, CH3), 1.46 (3H, s, CH3), 1.70 (3H, s, CH3), 2.14 (3H, s, COCH3), 3.40 (2H, s), 3.70 (3H, s, OCH3), 3.88 (1H, s, OH), 3.93 (1H, s), 4.30 (1H, s), 5.03 (1H, s), 5.17 (1H, s, OH), 5.67 and 5.92 (1H, AB, J = 12), 5.90 (1H, s), 6.26 (1H, S, H-22), 7.30 (1H, s, H-23), 7.35 (1H, s, H-21); '3C NMR d ppm: 16.73 (CH3), 17.34 (CH,), 18.58 (CH3), 20.65 (COÇH3), 23.66 (CH3), 26.87 (CHZ), 42.65 (C), 48.98 (C), 50.53 (C), 51.91 (CH?), 54.24 (OCH,), 59.75 (CH), 65.54 (C), 73.96 (CH), 75.07 (CH), 81.27 (C), 87.16 (C), 105.56 (C), 109.01 (CH-22), 118.90 (C-20), 121.76 (CH), 141.58 (CH-23), 143.55 (CH-21), 151.56 (CH), 166.30 (C = O), 168.15 (C = O), 199.67 (C = O), 215.58 (C = O).
By recrystallization from the mother liquors, haperforin A (200 mg) is obtained.
Furthermore, the crystallization of the residue remaining in methanol provides fhaperforin A (440 mg).
Hperforin A ~ has the following characteristics SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
13 Haperforine A, : CZyH34012 574, F 265° (MeOH), [a]D = + 47,5 (CHC13, C
= 0,9),; HR ICSM : MH+ 575,2175 (cale. 575,2128 pour Cz9H35O,2), 557,2007 (cale.
557,2022 pour Cz9H33~11)~ 529,2118 (cale. pour CZgH33O,o 529,2073), 515,1941 (cale. 515,1917 pour CZ,H3,O,o) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 1,18 (3H, s, CH3), 1,22 (3H, s, CH3), 1,29 (3H, s, CH3), 1,38 (3H, s, CH3), 1,47 (3H, s, CH3), 1,64 (1H, s, OH), 1,79 (1H, t, J = 14, Ha de CHz), 2;26 (3H, s, COCH3), 2,28 (1H, m, He de CHZ), 2,90 (1H, dd, J = 14, J' = 6, CH),3,69 (1H, s), 3,80 (3H, s, OCH3), 4,27,95 (1H, s), 4,78 (1H, d, J = 8), 5,13 (1H, s), 5,77 et 5,93 (1H, AB, J = 12), 6, 03 (1H, s), 6,17 ( 1 H, S, H-22), 7,3 5 ( 1 H, s, H-23 ), 7,41 ( 1 H, s, H-21 ); ' 3 C
RMN d ppm 13,65 (CH3), 16,38 (CH3), 16,60 (CH,), 20,79 (COÇH3), 23,49 (CH,), 25,48 (CHI), 26,80 (CH3), 41,90 (C), 45,41 (CH), 48,85 (C), 49,12 (C), 51,52 (OCH3), 54,78 (CH), 66,22 (C), 72,01 (CH), 74,65 (CH), 80,54 (C), 87,82 (C), 107,77 (C), 108,50 (CH-22), 119,42 (C-20), 122,93 (CH), 140,69 (CH-23), 143,08 (CH-21), 152,44 (CH), 166,06, 166,54, 169,32 et 215,90 (4 C=O ) Chromatographie N° 2 Les eaux mères de la fraction 2 de l'exemple 5 sont évaporées à sec, et le résidu obtenu (8,5 g), redissout dans l'heptane est soumis à une chromatographie sur colonne de silice (450 g).
L'éluat heptane-acétate d'éthyle ( 4 : 1) est recueilli par fraction de 25 ml dans des tubes.
On évapore les fractions 13-15 à sec. Leur cristallisation dans le mélange de solvants, heptane-acétate d'éthyle (4:1)permet d'obtenir 373 mg d'haperforine qui présente les caractéristiques suivantes Haperforine A, : CZ,H320,o = 516 F 146-147° (MeOH) ; HR ICSM : MH+
517,2051 (cale. 517,2073 pour CZ,H33O,o) ; ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDCI,: 1,17 (3H, s, CH3), 1,19 (3H, s, CH3), 1,28 (3H, s, CH;), 1,37 (3H, s, CH3), 1,47 (3H, s, CH3), 1, 51 (1H, m, partie de CH2), 1,75 (2H, m, parties de CHz), 1,85 (1H, m, partie de CHI), 1,97 (1H, s, OH), 2,14 (1H, s, OH), 2,98 (1H, dd, J = 6, J' = 13 Haperforine A,: CZyH34012 574, F 265 ° (MeOH), [a] D = + 47.5 (CHC13, C
= 0.9) ,; HR ICSM: MH + 575.2175 (block. 575.2128 for Cz9H35O, 2), 557.2007 (wedge.
557.2022 for Cz9H33 ~ 11) ~ 529.2118 (wedge for CZgH33O, o 529.2073), 515.1941 (wedge. 515.1917 for CZ, H3, O, o); 'H NMR d ppm, J Hz, CDC13: 1.18 (3H, s, CH3), 1.22 (3H, s, CH3), 1.29 (3H, s, CH3), 1.38 (3H, s, CH3), 1.47 (3H, s, CH3), 1.64 (1H, s, OH), 1.79 (1H, t, J = 14, Ha of CHz), 2.26 (3H, s, COCH3), 2.28 (1H, m, He of CHZ), 2.90 (1H, dd, J = 14, J '= 6, CH), 3.69 (1H, s), 3.80 (3H, s, OCH3), 4.27.95 (1H, s), 4.78 (1H, d, J = 8), 5.13 (1H, s), 5.77 and 5.93 (1H, AB, J = 12), 6, 03 (1H, s), 6.17 (1H, S, H-22), 7.35 (1H, s, H-23), 7.41 (1H, s, H-21); '3 C
NMR d ppm 13.65 (CH3), 16.38 (CH3), 16.60 (CH,), 20.79 (COÇH3), 23.49 (CH,), 25.48 (CHI), 26.80 (CH3), 41.90 (C), 45.41 (CH), 48.85 (C), 49.12 (C), 51.52 (OCH3), 54.78 (CH), 66.22 (C), 72.01 (CH), 74.65 (CH), 80.54 (C), 87.82 (C), 107.77 (C), 108.50 (CH-22), 119.42 (C-20), 122.93 (CH), 140.69 (CH-23), 143.08 (CH-21), 152.44 (CH), 166.06, 166.54, 169.32 and 215.90 (4 C = O) Chromatography N ° 2 The mother liquors of fraction 2 of Example 5 are evaporated to dryness, and the residue obtained (8.5 g), redissolved in heptane is subjected to a chromatography on silica column (450 g).
The heptane-ethyl acetate eluate (4: 1) is collected in 25 ml fractions.
in tubes.
The fractions 13-15 are evaporated to dryness. Their crystallization in the mixture of solvents, heptane-ethyl acetate (4: 1) provides 373 mg of haperforin which has the following characteristics Haperforin A,: CZ, H320, o = 516 F 146-147 ° (MeOH); HR ICSM: MH +
517.2051 (wedge 517.2073 for CZ, H33O, o); ; 'H NMR d ppm, J Hz, CDCI ,: 1.17 (3H, s, CH3), 1.19 (3H, s, CH3), 1.28 (3H, s, CH;), 1.37 (3H, s, CH3), 1.47 (3H, s, CH3), 1.51 (1H, m, part of CH2), 1.75 (2H, m, parts of CHz), 1.85 (1H, m, part of CHI), 1.97 (1H, s, OH), 2.14 (1H, s, OH), 2.98 (1H, dd, J = 6, J '=
14, CH), 3,64 ( 1 H, s, OH), 3,80 (3H, s, OCH3), 4,30 ( 1 H, s), 5,07 ( 1 H, s), 5,68 ( 1 H, s), 5,46 et 6,01 ( 1 H, AB, J = 12), 5, 80 ( 1 H, s), 6,34 ( 1 H, s, H-22), 7,42 ( 1 H, s, H-23 ), 7,43 (1H, s, H-21) ; '3C RMN d ppm : 14,37 (CH3), 14,84 (CHZ), 15,34 (CH3), 17,43 (CH3), 24,27 (CH3), 26,47 (CHz), 27,55 (CH3), 39,72 (C), 46,97 (CH), 49,88 (C), 50,13 (C), 52,17 (OCH3), 57,50 (CH), 68,74 (C), 78,57 (CH), 81,08 (C), 88,78 (C), 108,46 (C), 110,04 (CH-22), 121,18 (C-20), 123,32 (CH), 141,32 (CH-23), 143,14 (CH-21), 154,04 (CH), 166,83 (C=O), 167,95 (C=O), 217,09 (C=O ).
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) * EXEMPLE 6 L'extrait N°1 obtenu selon l'exemple 1 (1,48 g ) est dissous dans le chlorure de méthylène (40 ml ) et soumis à un traitement chromatographique sur colonne de silice (75 g).
L'éluat dans un mélange de chlorure de méthylène-acétate d'éthyle (90:10) est collecté par fractions de 8 ml.
On réunit les fractions (62-102), et on les évapore sous vide à sec (833 mg).
Le produit obtenu (833 mg) est dissous dans le toluène et chromatographié sur la silice 60 H (30 g).
L'éluat obtenu avec le mélange toluène-éther (50:50) est évaporé à sec sous vide, pour donner 350 mg de résidu.
Ce résidu (350 mg) est chromatographié ensuite sur une colonne de silice (10g). L'éluat constitué par le mélange toluène-éther (95:5) est recueilli par fraction de 4 ml. Les fractions (51-90) évaporées à sec fournissent 137 mg de résidu.
Ce résidu (137 mg) est purifié par chromatographie préparative sur plaque de silice, l'éther étant utilisé comme éluant.
Cette opération conduit à l'obtention de 57 mg d'haperforine B (HB, composé L5) qui présente les caractéristiques suivantes 18 22' // 21 9 CH O'O O
HsC
I 1~C' 10O H 1 $ 15 16OCH 3 ~2 O
Haperforine B
~ 2~ H so ~ s = 498 Haperforine B : C27H;pOç = 498. non cristallisé, HR ICSM : MH' 499, 1935 (calc. 499,1967 pour CZ,H3'O9) ; IR (CHCl3) n cm': 2993 (CH), 1756, 1731, 1700, 1668 (C=O), 1310, 1025 (C-O) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 1,06 (3H, s, CH3), 1,16 (3H, s, CH3), 1,36 (3H, d, J = 6, CH3), 1,46 (1H, d, J = 7, H-12b), 1,59 (3H, s, CH3), 1,62 (3H, s, CH3), 1,80 ((2H, m, CHI-11), 2,60 (2H, m, H-9, H-12a), 3,49 FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) (1H, s, H-15), 3,75 (3H, s, COZCH3), 3,85 (1H, m, H-10), , 5,48 (1H, d, J = 2, H-2), 5,96 ( 1 H, d, J = 2, H-5), 6,92 ( 1 H, s, H-22), 7,40 ( 1 H, s, H-23 ), 8,42 ( 1 H, s, H-21 ) ;
'3C RMN d ppm : 16,06 (CH3), 19,0 (CHZ-11), 20,46 (CH3-19), 24,23 (CH3), 30,25 (CH3), 30,40 (CH3), 36,92 (CHz-12), 50,20 (CH), 52,95 (OCH3), 53,02 (C-13), 5 54,56 (C)?, 58,79 (CH-15), 69,52 (C-8), 78.65 (CH-10), 79,23 (C-14), 91,39 (CH-2), 111,18 (CH-22), 123,35 (C-1 ou C-3)?, 126,16 (C-20), 126,40 (CH-5), 140,98 (C-3 ou 1), 142,99 (CH-23), 149,73 (CH-21), 165,36 (C=O ), 166,45 (C=O ), 168,37 (C=O), 196,58 (C=O C-17). Les attributions ont été réalisées à l'aide d'expériences de RMN 2D, COSY'H-'H et '3C-'H.
Les fractions (103-134) évaporées à sec fournissent 230 mg de résidu. Ce résidu (230 mg) est purifié par chromatographie préparative sur plaque de silice, en utilisant le mélange (chlorure de méthylène - méthanol : 95 / 5) en tant qu'éluant.
Cette opération conduit à l'obtention de 71 mg d'haperforine F (HF, composé V) qui présente les caractéristiques suivantes z1 O
19 18 ~ , 23 1 ~ 22 O O H 11 1z O
1i 981514 1 29 ~
4 3 5 ~~60 _ C 1i 3 28 ~ 6 I 30 Haperforine F
~27H32~1o°516 Haperforine F : CZ,H3zO,o= 516. F 224° (MeOH), [a]p = + 16,9 (CHCI;, C =
20 0,93), ; HR ICSM : MH+ 517,2101 (calc. 517,2073 pour Cz,H;30,o) ; IR
(laque) n cm': 1762, 1740, 1690, 1658 (C=O), 1272 ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 1,45 (3H, s, CH3), 1,48 (1H, m, CHZ-l la), 1,53 (3H, s, CH3), 1,61 (3H, s, CH3), 1,67 (3H, s, CH3), 1,77 (1H, m, CHI-12a), 1,85 (3H, s, CH,), 2,0 (1H, dm, J = 12, CHI-l lb), 2,26 (1H, tt, J = 12, J' = 2, H-12b), 2,54 (1H, dd, J = 12, J' = 2, H-9), 2,82 et 3,05 (2H, AB, J = 20, CHZ-2), 2,96 et 3,15 (2H, ABX, J = 17, J,~,~ = 7, JBh = 9, CHZ-6), 3,44 (1H, t, J = 8, H-5), 3,76 (3H, s, OCH3), 3,95 (1H, s, OH), 6,77 (1H, s, H-22), 7,44 (1H; s, H-23), 7,99 (1H, s, H-21) ;'3C RMN d ppm : 21,71 (CH3), 24,08 (CH,-FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) 11), 26,54 (CH3), 27,58 (CH3), 27,60 (CH3), 27,84 (CH3), 32,32 (CHZ-6), 35,23 (CHZ-12), 46,02 (CH-2), 50,05 (CH-5), 53,08 (OCH3), 56,14 (C),56,61 (C), 59,30 (CH-9), 59,55 (C), 81,56 (C), 87,68 (C), 94,59 (C), 110,02 (CH-22), 124,87 (C-20), 142,85 (CH-23), 145,76 (CH-21), 171,97 (C=O), 172,06 (C=O), 174,21 (C=O ), 196,47 (C=O C-17), 208,93 (C=O C-15). Les attributions ont été réalisées à
l'aide d'expériences de RMN 2D, COSY'H-'H et '3C-'H.
* EXEMPLE 7 L'extrait N° 1 obtenu selon l'exemple 1 (3,24 g) est dissous dans du toluène et soumis à un traitement chromatographique sur colonne de silice (150g).
L'éluat constitué par le mélange toluène-éther est récolté par fraction de 8 ml.
On réunit les fractions (161-174) et on les évapore à sec pour obtenir un résidu de 503 mg. Ce résidu (503 mg) est purifié par chromatographie préparative sur plaque de silice, l'éther étant utilisé comme éluant.
On obtient ainsi deux produits purs : l'haperforine B2 non cristallisée et l'haperforine C~.
L'haperforine B2 (83 mg) présente les caractéristiques suivantes Haperforine Bz : CZSHz80,= 440 non cristallisé. HR ICSM : MH+ 441,1926 (cale. 441,1913 pour C25H29~7)~ 423,1808 (cale. 423,1807 pour Cz5Hz,06) ; 'H
RMN
d ppm, J Hz, CDCI3: 0,69 (3H, s, CH3), 1,14 (3H, s, CH3), 1,51 (3H, s, CH3), 1,54 (3 H, s, CH;), 1, 5 5 ( 1 H, m), 1;68 (2H, m), 2,10 ( 1 H, m), 2,45 ( 1 H, dd, J = 14, J' = 6, CH), 2,60 (1H, d, J = 14), 3,30 (lH,m), 5,30 (1H, s), 5,68 (1H, q, J = 3), 5,88 (1H, d, J = 6), 6,60 ( 1 H, s, H-22), 7,30 ( 1 H, d, J = 6), 7,43 ( 1 H, s, H-23 ), 7,45 ( 1 H, s, H-21) ; '3C RMN d ppm : 13,03 (CH3), 22,17 (CHZ), 23,78 (CH3), 25,13 (CH;), 31,90 (CH3), 32,60 (CHz), 39,75 (CHz), 40,80 (CHZ), 52,68 (CH), 82,55 (C), 83,54 (CH), 83,62 (C), 87,43 (C), 110,17 (CH-22), 120,05 (CH), 122,03 (CH), 122,33 (C-22), 132,66 (C), 141,62 (CH-23), 143,15 (CH-21), 152,44 (CH), 161,15 (C=O), 172,50.
L'haperforine C~ ( 19 mg) présente les caractéristiques suivantes Haperforine C, : CZSHZ80, = 440 non cristallisé; HR ICSM : MH+ 441,1944 (cale. 441,1913 pour CZSH~90,) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDCI,: 0,77 (3H, s, CH3), 1,14 (3H, s, CH3), 1,31 (3H, s, CH3), 1,50 (3H, s, CH3), 1,75 (2H, m), 2,10 (2H, m), 2,35 (2H, m ), 2,60 (1H, d, J = 14), 3,20 (lH,m), 4,99 (1H, s), 5,75 (1H, q, J
= 3), 6,01 (1H, d. J = 6), 6,58 (1H, s, H-22), 7,42 (1H, d, J = 6), 7,43 (2H, s, H-23 et H
21).
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) WO 01/30776 CA 02389169 2002-04-26 pCT~R00/02951 Les fractions (201-225) sont réunies et évaporées à sec pour donner un résidu de 308 mg. Ce mélange (308 mg) est purifié par chromatographie préparative sur plaque de silice, l'éther est utilisé comme éluant.
On obtient deux produits purs : l'haperforine B3 et l'haperforine C.
L'haperforine B3 (HB3, composé IL 1 ) présente les caractéristiques suivantes H C 22 / ~ 21 3 ~C °O OH 18 20 H
1 12 13 17 ~
H'9~ H 9 ~8~0 16 H 10 '4 Is H3CO ~ O 12 43 O
Haperforine B
C 24 H 39 ~ 13 - 590 Haperforine B,,: C24H34013 = 590; F 185° (MeOH), [a)p = + 49 (CHC13, c =
0,9); HR ICSM : MH+ 591,2119 (calc. 591,2077 pour CzyH3s~13)~ 573, 2006 (calc.
573, 1972 pour C29H33O,2, MH+-H20), 555, 1848 (calc. 555, 1866 pour C2~H3,0", MH+-H20-H20); UV : lmaX (EtOH) : ; IR (laque) n cm': 3440 (OH), 1729 (C=O), 1622 (C=C), 1436, 1390, 1271 (C-O) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 1,16 (3H, s, CH3), 1,18 (3H, s, CH3), 1,38 (3H, s, CH3), 1,40 (3H, s, CH3), 1,65 (3H, s, CH3), 2,18 (3H, s, COCH3), 2;34 (1H, d, J = 4, OH), 2,98 (1H, d, J = 7, H-9), 3,89 (1H, s , OH), 3,93 (3H, s, OCH3), 3,98 (1H, dd, J = 7, J' = 4, H-12a), 4,24 (1H, s, H-14, CH), 3.64 (1H, s, OH), 3.80 (3H, s, OCH3), 4.30 (1H, s), 5.07 (1H, s), 5.68 ( 1 H, s, 5.46 and 6.01 (1 H, AB, J = 12), 5.80 (1 H, s), 6.34 (1 H, s, H-22), 7.42 (1 H, s, H-23), 7.43 (1H, s, H-21); '3C NMR d ppm: 14.37 (CH3), 14.84 (CHZ), 15.34 (CH3), 17.43 (CH3), 24.27 (CH3), 26.47 (CHz), 27.55 (CH3), 39.72 (C), 46.97 (CH), 49.88 (VS), 50.13 (C), 52.17 (OCH3), 57.50 (CH), 68.74 (C), 78.57 (CH), 81.08 (C), 88.78 (VS), 108.46 (C), 110.04 (CH-22), 121.18 (C-20), 123.32 (CH), 141.32 (CH-23), 143.14 (CH-21), 154.04 (CH), 166.83 (C = O), 167.95 (C = O), 217.09 (C = O).
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) * EXAMPLE 6 Extract No. 1 obtained according to Example 1 (1.48 g) is dissolved in the chloride methylene (40 ml) and subjected to column chromatographic treatment of silica (75 g).
The eluate in a mixture of methylene chloride-ethyl acetate (90:10) is collected in 8 ml fractions.
The fractions are combined (62-102), and they are evaporated in vacuo to dryness (833 mg).
The product obtained (833 mg) is dissolved in toluene and chromatographed on the 60 H silica (30 g).
The eluate obtained with the toluene-ether mixture (50:50) is evaporated to dryness under vacuum, to give 350 mg of residue.
This residue (350 mg) is then chromatographed on a silica column (10g). The eluate constituted by the toluene-ether mixture (95: 5) is collected by fraction of 4 ml. The fractions (51-90) evaporated to dryness provide 137 mg of residue.
This residue (137 mg) is purified by preparative plate chromatography silica, ether being used as eluent.
This operation leads to the obtaining of 57 mg of haperforin B (HB, compound L5) which has the following characteristics 18 22 '// 21 9 CH O'O O
HsC
I 1 ~ C ' 10O H 1 $ 15 16OCH 3 ~ 2 O
Haperforin B
~ 2 ~ H so ~ s = 498 Haperforin B: C27H; pOç = 498. not crystallized, HR ICSM: MH '499, 1935 (calc. 499.1967 for CZ, H3'O9); IR (CHCl3) n cm ': 2993 (CH), 1756, 1731, 1700, 1668 (C = O), 1310, 1025 (CO); 'H NMR d ppm, J Hz, CDC13: 1.06 (3H, s, CH3), 1.16 (3H, s, CH3), 1.36 (3H, d, J = 6, CH3), 1.46 (1H, d, J = 7, H-12b), 1.59 (3H, s, CH3), 1.62 (3H, s, CH3), 1.80 ((2H, m, CHI-11), 2.60 (2H, m, H-9, H-12a), 3.49 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) (1H, s, H-15), 3.75 (3H, s, COZCH3), 3.85 (1H, m, H-10),, 5.48 (1H, d, J = 2, H-2), 5.96 (1 H, d, J = 2, H-5), 6.92 (1 H, s, H-22), 7.40 (1 H, s, H-23), 8.42 (1 H, s, H-21);
'3C NMR d ppm: 16.06 (CH3), 19.0 (CHZ-11), 20.46 (CH3-19), 24.23 (CH3), 30.25 (CH3), 30.40 (CH3), 36.92 (CHz-12), 50.20 (CH), 52.95 (OCH3), 53.02 (C-13), 5 54.56 (C)?, 58.79 (CH-15), 69.52 (C-8), 78.65 (CH-10), 79.23 (C-14), 91.39 (CH-2), 111.18 (CH-22), 123.35 (C-1 or C-3) ?, 126.16 (C-20), 126.40 (CH-5), 140.98 (C-3 or 1), 142.99 (CH-23), 149.73 (CH-21), 165.36 (C = O), 166.45 (C = O), 168.37 (C = O), 196.58 (C = O C-17). Allocations were made using 2D NMR experiments, COZY'H-'H and '3C-'H.
The fractions (103-134) evaporated to dryness provide 230 mg of residue. This residue (230 mg) is purified by preparative chromatography on a plate silica in using the mixture (methylene chloride - methanol: 95/5) as that eluting.
This operation leads to the production of 71 mg of haperforin F (HF, compound V) which has the following characteristics z1 O
19 18 ~, 23 1 ~ 22 OOH 11 1z O
1i 981514 1 29 ~
4 3 5 ~~ 60 _ C 1i 3 28 ~ 6 I 30 Haperforine F
~ 27:32 ~ 1o ° 516 Haperforine F: CZ, H3zO, o = 516. F 224 ° (MeOH), [a] p = + 16.9 (CHCI ;, C =
20 0.93),; HR ICSM: MH + 517.2101 (calc. 517.2073 for Cz, H; 30, o); IR
(lacquer) n cm ': 1762, 1740, 1690, 1658 (C = O), 1272; 'H NMR d ppm, J Hz, CDC13: 1.45 (3H, s, CH3), 1.48 (1H, m, CHZ-l la), 1.53 (3H, s, CH3), 1.61 (3H, s, CH3), 1.67 (3H, s, CH3), 1.77 (1H, m, CHI-12a), 1.85 (3H, s, CH,), 2.0 (1H, dm, J = 12, CHI-1 lb), 2.26 (1H, tt, J = 12, J '= 2, H-12b), 2.54 (1H, dd, J = 12, J' = 2, H-9), 2.82 and 3.05 (2H, AB, J = 20, CHZ-2), 2.96 and 3.15 (2H, ABX, J = 17, J, ~, ~ = 7, JBh = 9, CHZ-6), 3.44 (1H, t, J = 8, H-5), 3.76 (3H, s, OCH3), 3.95 (1H, s, OH), 6.77 (1H, s, H-22), 7.44 (1H; s, H-23), 7.99 (1H, s, H-21); '3C NMR d ppm: 21.71 (CH3), 24.08 (CH, -SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 11), 26.54 (CH3), 27.58 (CH3), 27.60 (CH3), 27.84 (CH3), 32.32 (CHZ-6), 35.23 (CHZ-12), 46.02 (CH-2), 50.05 (CH-5), 53.08 (OCH3), 56.14 (C), 56.61 (C), 59.30 (CH-9), 59.55 (C), 81.56 (C), 87.68 (C), 94.59 (C), 110.02 (CH-22), 124.87 (C-20), 142.85 (CH-23), 145.76 (CH-21), 171.97 (C = O), 172.06 (C = O), 174.21 (C = O), 196.47 (C = O C-17), 208.93 (C = O C-15). Allocations were made to ugly 2D NMR experiments, COZY'H-'H and '3C-'H.
* EXAMPLE 7 Extract No. 1 obtained according to Example 1 (3.24 g) is dissolved in toluene and subjected to a chromatographic treatment on a silica column (150 g).
The eluate consisting of the toluene-ether mixture is harvested in 8 ml fractions.
The fractions are combined (161-174) and evaporated to dryness to obtain a residue of 503 mg. This residue (503 mg) is purified by chromatography preparatory on a silica plate, ether being used as eluent.
Two pure products are thus obtained: the non-crystallized haperforin B2 and haperforin C ~.
Hperforin B2 (83 mg) has the following characteristics Haperforine Bz: CZSHz80, = 440 not crystallized. HR ICSM: MH + 441.1926 (wedge. 441.1913 for C25H29 ~ 7) ~ 423.1808 (wedge. 423.1807 for Cz5Hz, 06); 'H
NMR
d ppm, J Hz, CDCI3: 0.69 (3H, s, CH3), 1.14 (3H, s, CH3), 1.51 (3H, s, CH3), 1.54 (3 H, s, CH;), 1.5 5 (1 H, m), 1.68 (2H, m), 2.10 (1 H, m), 2.45 (1 H, dd, J = 14, J '= 6, CH), 2.60 (1H, d, J = 14), 3.30 (1H, m), 5.30 (1H, s), 5.68 (1H, q, J = 3), 5.88 (1H, d, J = 6), 6.60 (1 H, s, H-22), 7.30 (1 H, d, J = 6), 7.43 (1 H, s, H-23), 7.45 (1 H, s, H-21); '3C NMR d ppm: 13.03 (CH3), 22.17 (CHZ), 23.78 (CH3), 25.13 (CH;), 31.90 (CH3), 32.60 (CHz), 39.75 (CHz), 40.80 (CHZ), 52.68 (CH), 82.55 (C), 83.54 (CH), 83.62 (C), 87.43 (C), 110.17 (CH-22), 120.05 (CH), 122.03 (CH), 122.33 (C-22), 132.66 (C), 141.62 (CH-23), 143.15 (CH-21), 152.44 (CH), 161.15 (C = O), 172.50.
Hperforin C ~ (19 mg) has the following characteristics Haperforin C,: CZSHZ80, = 440 not crystallized; HR ICSM: MH + 441.1944 (wedge. 441.1913 for CZSH ~ 90,); 'H NMR d ppm, J Hz, CDCI,: 0.77 (3H, s, CH3), 1.14 (3H, s, CH3), 1.31 (3H, s, CH3), 1.50 (3H, s, CH3), 1.75 (2H, m), 2.10 (2H, m), 2.35 (2H, m), 2.60 (1H, d, J = 14), 3.20 (1H, m), 4.99 (1H, s), 5.75 (1H, q, J
= 3), 6.01 (1H, d. J = 6), 6.58 (1H, s, H-22), 7.42 (1H, d, J = 6), 7.43 (2H, s, H-23 and H
21).
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) WO 01/30776 CA 02389169 2002-04-26 pCT ~ R00 / 02951 The fractions (201-225) are combined and evaporated to dryness to give a residue of 308 mg. This mixture (308 mg) is purified by chromatography preparatory on a silica plate, ether is used as eluent.
Two pure products are obtained: haperforin B3 and haperforin C.
Hperforin B3 (HB3, compound IL 1) has the following characteristics HC 22 / ~ 21 3 ~ C ° O OH 18 20 H
1 12 13 17 ~
H'9 ~ H 9 ~ 8 ~ 0 16 H 10 '4 Is H3CO ~ O 12 43 O
Haperforin B
C 24 H 39 ~ 13 - 590 Haperforin B ,,: C24H34013 = 590; F 185 ° (MeOH), [a) p = + 49 (CHC13, c =
0.9); HR ICSM: MH + 591.2119 (calc. 591.2077 for CzyH3s ~ 13) ~ 573, 2006 (calc.
573, 1972 for C29H33O, 2, MH + -H20), 555, 1848 (calc. 555, 1866 for C2 ~ H3,0 ", MH + -H20-H2O); UV: lmaX (EtOH):; IR (lacquer) n cm ': 3440 (OH), 1729 (C = O), 1622 (C = C), 1436, 1390, 1271 (CO); 'H NMR d ppm, J Hz, CDC13: 1.16 (3H, s, CH3), 1.18 (3H, s, CH3), 1.38 (3H, s, CH3), 1.40 (3H, s, CH3), 1.65 (3H, s, CH3), 2.18 (3H, s, COCH3), 2.34 (1H, d, J = 4, OH), 2.98 (1H, d, J = 7, H-9), 3.89 (1H, s, OH), 3.93 (3H, s, OCH3), 3.98 (1H, dd, J = 7, J '= 4, H-12a), 4.24 (1H, s, H-
15), 5,12 ( 1 H, s large, OH), 5,40 ( 1 H, t, J = 7, H-11 ), 5,80 ( 1 H, d, J = 12, H-6), 6,08 (1H, d, J = 12, H-5), 6,28 (1H, s, H-17), 6,45 (1H, s, H-22), 7,40 (1H, s, H-23), 7,50 (1H, s, H-21) ; '3C RMN d ppm : 16,14 (CH3), 16,80 (CH3), 19,83 (CH3), 22,04 (COÇH3), 24,55 (CH3), 27,98 (CH3), 43,64 (C), 49,03 (CH-9), 49,56 (C), 51,15 (C), 52,75 (OCH3), 54,82 (CH-15), 65,90 (CH ?), 67,51 (CH-11), 70,42 (CH), 76,53 (CH), 88, 06 (C-2), 108,54 (C-3), 110,47 (CH-22), 120,83 (C-20), 124,0 (CH-6), 142,0 (CH-23), 143,80 (CH-21), 152,55 (CH-5), 167,17 (C=O ), 168,20 (C=O ), 170,83 (C=O), 196,0 (C=O C-17), 205 (C=O). Les attributions ont été réalisées à
l'aide d'expériences de RMN 2D, COSY'H-'H et '3C-'H.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) L'acétylation de l'haperforine Bj selon le procédé suivant conduit à
l'obtention de l'acétyl-haperforine B3 Une solution d'haperforine B3 (22 mg) dans l'anhydride acétique (0,5 ml) et la pyridine (0,5 ml) est laissée à la température ambiante pendant 24 h. Après addition d'eau (5 ml), les produits organiques sont extraits par de l'éther (3 fois 3 ml). La phase éthérée lavée, séchée sur MgS04 et évaporée sous pression réduite fournit un résidu qui, purifié par chromatographie sur plaque de silice (éluant éther), fournit l'acétylhaperforine B3 (5 mg) dont les caractéristiques physiques ('H
RMN, SM, CCM) sont identiques à celles de l'haperforine A.
L'haperforine C (HC, composé L2) présente les caractéristiques suivantes 1s H sCH O O O
H C ~ s 1V-C' s ~ H ~~ 15 OCH 3 ~2s H ss ~ » = 560 Haperforine C : CZçH3601 i = 560. non cristallisée, [a] p = - 87 (CHCI,, c = 1 );
HR ICSM : MH+ 561,2366 (calc. 561,2335 pour CZ9H3,0") ; UV : 1",aX (EtOH) : ;
IR
(laque) n cm': 1742, 1655 (C=O), 1237 (C-O) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 0,91 (3H, s, CH;), 1,06 (3H, s, CH3), 1,23 (3H, d, J = 6, CH3), 1,32 (3H, s, CH,), 1,35 (1H, m, CHI-12a), 1,40 (3H, s, CH3), 1,80 ((2H, m, CHZ-11), 2,10 (3H, s, COCH3), 2,42 (1H, m, H-9), 2,58 (2H, m, H-3, H-12b), 2,80 (2H, ABX, J = 18, J' = 8, H-6), 3,55 (1H, s, OH), 3,66 (1H, dd, J = 10, J' = 6, H-10), 3,82 (3H, s, CO~CH3), 3,98 (1H, d, J = 4, H-2), 4, 72 ( 1H, td, J = 8, J' = 1, H-7), 5,08 (1H, s, H-15), 6,92 (1H, d, J=2, H-22), 7,38 (1H, dd, J=2, f=1, H-23), 8,35 (1H, d, J=1, H-21) ; '3C
RMN d ppm : 14,98 (CH3), 19,29 (CHI-11), 20,67 (CH3-19), 23,93 (CH3), 27,23 (CH3), 28,73 (CH;), 34,72 (CHZ-6), 37,11 (CHI-12), 46,15 (CH-3), 51,69 (C-13), 52,15 FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) Haperforine C
(CH-9), 52,45 (OCH3), 52,80 (C-8), 59,04 (CH-15), 69,88 (C-4), 71.98 (CH-7), 72,63 (CH-2), 75,66 (CH-10), 79,43 (C-14), 110,59 (CH-22), 117,30 (C-1), 125,59 (C-20), 142,61 (CH-23), 149,34 (CH-21), 167,83 (C=O), 170,40 (C=O ), 197,42 (C=O C-17). Les attributions ont été réalisées à l'aide d'expériences de RMN
2D, COSY'H-'H et '3C-'H.
Les fractions (226-270), réunies et évaporées à sec, donnent un résidu de 97 mg. Ce mélange (97 mg) est purifié par chromatographie préparative sur plaque de silice, l'éther étant utilisé comme éluant.
On obtient ainsi 34 mg d'haperforine BI (HB 1, composé L 1 ) qui présente les caractéristiques suivantes 182' /~ 21 12 17 Lu 11 _ HaC H s CH O O O
HO H~ 15 16 ~OC~'i3 6~
U
Haperforine B1 C2~H320s=500 Haperforine B, : C27H32O~= 500; F 200° (MeOH), [a]p = - 72,8 (CHC13, c =
1,02); HR ICSM : MH+ 501,2116 (calc. 501,2124 pour CZ,H33O9); UV : lmaX (EtOH) 272,6 nm (e = 13750); IR (laque) n cm': 3437 (OH), 1757, 1728, 1714, 1651 (C=O), 1302, 1124 (C-O) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 0,96 (3H, s, CH3), 1,19 (3H, s, CH3), 1,24 (3H, d, J = 6, CH3), 1,34 (1H, d, J = 7, H-12b), 1,50 (3H, s, CH3), 1,57 (3H, s, CH3), 1,66 ((2H, m, CHZ-11), 2,47 (1H, dd, J= 7, J' = 3, H-12a), 2;56 (1H, t; J = 8, H-9), 3,30 (1H, m, H-10), 3,49 (1H, s, H-15), 3,79 ((3H, s, COZCH3), 5,25 ( 1 H, s, OH), 6,06 ( 1 H, dd, J = 10, J' = 2, H-6), 6,32 ( 1 H, s, H-2), 7,01 ( 1 H, s, H-22), 7,46 (1H, s, H-23), 7,68 (1H, d, J = 10, H-5), 8,53 (1H, s, H-21) ;'3C
RMN d ppm : 15,39 (CH3), 22,77 (CHZ-11), 23,33 (CH3-19), 24,39 (CH3), 29,14 (CH;), 29,72 (CH3), 34,93 (CHI-12), 49,69 (CH-9), 51,65 (C-13); 52,72 (OCH3), 56,07 (C-FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) 8), 58,74 (CH-15), 69,87 (CH-10), 70,44 (C-14), 83,45 (C-4), 110,34 (CH-22), 122,63 (CH-6), 126,55 (C-20), 127,42 (CH-2), 138,16 (CH-5), 143,60 (CH-23), 145,88 (C-3), 149,21 (CH-21), 163,80 (C=O ester C-16), 166,27 (C=O lactone C
7), 196,0 (C=O C-17), 204,85 (C=O, C-1). Les attributions ont été réalisées à
l'aide 5 d'expériences de RMN 2D, COSY'H-'H et '3C-'H.
Les fractions (330-406), réunies et évaporées à sec, donnent un résidu de 63mg. Ce mélange (63 mg) est purifié par chromatographie préparative sur plaque de silice, l'éther est utilisé comme éluant.
10 On obtient ainsi l'haperforine H qui présente les caractéristiques suivantes Haperforine H : Cz5Hz80, . , F 208° (MeOH) ; HR ICSM : MH+
441,1939 (calc. 441,1913 pour CZSH290,) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDCl3 : 0,96 (3H, s, CH3), 1,25 (3H, s, CH3), 1,48 (3H, s, CH3),1,56 (3H,s, CH,), 2,66 (1H, t, J = 8), 2,75 et 3,25 (2H, ABX, J = 16, J' = 2, J" = 1 ), 4,25 ( 1 H, m), 4,96 ( 1 H, s), 6,03 ( 1 H, d, J =
15 5), 6,31 ( 1 H, s large, H-22), 7,41 ( 1 H, d, J = 5), 7,45 ( 1 H, s large, H-23 ), 7,46 ( 1 H, s large, H-21 ).
* EXEMPLE 8 On soumet l'extrait N°1 obtenu selon l'exemple 1 (10g) à un traitement 20 chromatographique sur colonne de silice (350 g). L'éluat constitué d'un mélange d'heptane-acétate d'éthyle (80:20) est recueilli par fraction de 20 ml Les fractions (311-330), réunies et ëvaporées à sec, donnent un résidu de 530 mg qui, après dissolution et cristallisation dans le méthanol, fournit 100 mg d'haperforine C2 (HC2, composé IIL2) qui présente les caractéristiques suivantes 21 ~ ~ 22 9 g 14 y( 16 z 4 ~ ~OH7I 3o O
29 28 ~ 6 Haperforine C,z C25 H26 ~7 = 438 FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) Haperforine C~ : CZSH260W 438. F 270° (MeOH), [a]p = - 284 (CHC13, c =
0,9); HR ICSM : MH+ 439,(calc. 439,pour CzsH2,0,) ; UV : lmax (EtOH) : ; IR
(laque) n cm': 1768, 1712, 1668 (C=O), 1381, 1306, 1131, 1025, 1000 (C-O) ; 'H
RMN d ppm, J Hz, CDC13: 0,90(3H, s, CH3), 1,25 (3H, s, CH3), 1,40 (3H, s, CH3), 1,68 (3H, s, CH3), 1,74 ((2H, m, CHZ-12), 1,94 (2H, m, H-9, H-l la), 2,13 (1H, m, H-11 b), 3,07 ( 1 H, s, H-6), 3,48 ( 1 H, s, H-14), 5,0 ( 1 H, s, H-17), S, 76 ( 1 H, s, H-30), 5,92 et 6,14 (2H, AB, J = 15, H-1 et H-2), 6,20 ( 1 H, s, H-22), 7,30 ( 1 H, s, H-23), 7,37 (1H, s, H-21) ; '3C RMN d ppm : 20,22 (CH3), 25,04 (CH,), 26,77 (CH3), 27,68 (CH3), 28,25 (CHz-11), 37,02 (CHZ-12), 47,93 (C), 48,52 (C), 53,86 (CH-9), 58,35 (CH-6), 64,34 (CH-14), 72,13 (CH-17), 83,09 (C-4), 83.40 (C-5), 109,03 (CH-22), 121,26 (C-20), 123,58 (CH-1), 126,82 (CH-30), 140,48 (CH-23), 144,56 (CH-21), 148,97 (CH-2), 150,47 (C-8), 165,37 (C=O), 174,73 (C=O ), 197,03 (C=O
C-7). Les attributions ont été réalisées à l'aide d'expériences de RMN 2D, COSY
'H-'H et '3C-'H.
* EXEMPLE 9 On dissous l'extrait N° 1 obtenu selon l'exemple 1 (6,40 g) dans du toluène et on le soumet à un traitement chromatographique sur colonne de silice 60 H. On élue par fractions de volume de 300 ml.
Eluat 1 = (toluène-éther ; 80:20);
Eluat 2 (toluène-éther ; 70:30);
Eluat 3 (toluène-éther ; 60:40);
Eluat 4 (toluène-éther ; 50:50);
Eluat 5 (toluène-éther ; 40:60).
L'éluat 5 évaporé à sec fournit un résidu de 500 mg. Ce mélange (500 mg) est purifié par chromatographie préparative sur plaque de silice, l'éther est utilisé
comme éluant.
On obtient ainsi deux produits: l'haperforine D et l'haperforine Dl.
L'haperforine D (HD, composé L4) (66 mg) présente les caractéristiques suivantes FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) H 1 9 CH a V0 .O
H3C~1oH
O iniui0 7\
29 ~4 5 Haperforine D
C2~H 34 ~ ~o= 518 Haperforine D : C"H340,o = 518. F 239° (EtOH), [a]p = - 98 (CHCl3, c =
0,98); HR ICSM : MH+ 519,2244 (calc. 519,2230 pour CZ,H35O,o), 501, 2099 (calc.
501, 2124 pour CZ,H33O9, MH+-H~O); UV : l,"ax (EtOH) : ; IR (CHCI,) n cm' :
1762, 1725, 1662 (C=O) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 1,0 (3H, s, CH3), 1,06 (3H, s, CH3), _1,24 (3H, d, J = 6, CH3), 1,32 (3H, s, CH3), 1,40 (1H, m, CH,-12a), 1,48 (3H, s, CH,), 1,80 ((2H, m, CHZ-11), 2,42 (1H, m, H-9), 2,58 (2H, m, H-3, H-12b), 2,80 (2H, ABX, J = 18, J' = 8, H-6), 3,55 (1H, s, OH), 3,66 (1H, dd, J = 10, J' =
6, H-10), 3,82 (3H, s, CO~CH,), 3,98 (1H, d, J = 4, H-2), 4, 72 ( IH, td, J = 8, J' = 1, H-7), 5,08 (1H, s, H-15), 6,92 (1H, s, H-22), 7,38 (1H, s, H-23), 8,35 (1H, s, H-21) ; '3C
RMN d ppm : 14,35 (CH3), 19,08 (CHZ-11), 20,67 (CH3-19), 23,93 (CH3), 27,23 (CH3), 28,73 (CH3), 34,72 (CHZ-6), 37,11 (CHI-12), 46,15 (CH-3), 51,69 (C-13), 52, I 5 (CH-9), 52,45 (OCH3), 52,80 (C-8), 59,04 (CH-15), 69,88 (C-4), 71.98 (CH-7), 72,63 (CH-2), 75,66 (CH-10), 79,43 (C-14), 110,59 (CH-22), 117,30 (C-1), 125,59 (C-20), 142,61 (CH-23), 149,34 (CH-21), 167,83 (C=O), 169,51 (C=O ), 196,46 (C=O C-17). Les attributions ont été réalisées à l'aide d'expériences de RMN
2D, COSY'H-1H et 13C-1H.
L'haperforine DI (83 mg) présente les caractéristiques suivantes Haperforine D, : CZSHZ80,= 440. F 208° (MeOH) ; ICSM : MH+ 441, 423 ;
'H RMN d ppm, J Hz, CDCl3: 0,98 (3H, s, CH3), 1,28 (3H, s, CH3), 1,35 (1H, m), FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) 1,46 (3H, s, CH3),1,46 (lH,m), 1,60 (3H, s, CH3), 1,80 (1H, m), 1, 85 et 2,0 (2H, ABX, J = 13, J' = 7), 2,20 (1H, m), 2,70 (1H, dd, J =14, J' = 7), 2,97 et 3,10 (2H, ABX, J = 19, J' = 3, J" = 2),3,69 (1H, s), 4,48 (1H, td, J = 6, J' = 2), 4,88 (1H, s), 6,03 ( 1 H, d, J = 6), 6,3 8 ( 1 H, s, H-22), 7,42 ( 1 H, d, J = 6), 7,44 ( 1 H, s, H-23 ), 7,48 (1H, s, H-21) ; '3C RMN d ppm : 22,55 (CH3), 23,33 (CH3), 24,80 (CH3), 27,77 (CHz), 28,27 (CHz), 31,42 (CH3), 36,68 (CHZ), 38,97 (CHZ), 43,25 (C), 52,39 (CH), 74,67 (CH), 81,51 (CH), 83,18 (C), 86,83 (C), 108,50 (CH-22), 110,28 (C), 119,36 (C-20), 119,48 (CH), 126,19 (C), 139,68 (CH-23), 143,09 (CH-21), 151,98 (C), 160,40 (CH), 167,96 (C=O), 171,85.
Eluat 9 (toluène - éther; 40 : 60) : l'éluat 9 évaporé à sec fournit un résidu de 440 mg. Ce mélange (440 mg) est purifié par chromatographie préparative sur plaque de silice, le mélange (chlorure de méthylène - méthanol ; 95 : 5) étant utilisé
comme éluant.
On obtient ainsi deux produits: l'haperforine EI et l'haperforine G.
L'haperforine E~ (32 mg) présente les caractéristiques suivantes Haperforine E, : CZSH3o0, = 442. non cristallisée ; HR ICSM : MH+
443,2076 (calc. 443,2063 pour CZSH3,0,), 425,2002 (calc. 425,1963 pour CZSHZ~O~) ;
'H RMN d ppm, J Hz, CDCI,: 0,94 (3H, s, CH3), 1,10 (3H, s, CH3), 1,30 (3H, s, CH3), 1,32 (3H, s, CH3), 1,50 (2H, m), 2,1 (1H, m), 2,40 (1H, dd, j = 15, J' =
6), 2,60 (1H, m), 2,60 et 2,75 (2H, ABX, J = 20, J' = 1, J" = 6), 3,69 (1H, s), 2,65 (1H, dd, J = 4, J' = 10), 2,90 (1H, s large), 3, 28 (1H, d, J = 18), 3,65 (1H, td, J = 6, J' _ 2), 3,72 (1H, t, J = 3), 4,18 (1H, d, J = 6), ), 5,22 (1H, s), 5,74 (1H, q, J
= 2), 6,30 ( 1 H, s, H-22), 7,40 ( 1 H, s, H-23 ), 7,45 ( 1 H, s, H-21 ).
L'haperforine G (HG, composé IIL1) (38 mg) présente les caractéristiques suivantes FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) 21 ~ ~ 22 O H
29 /30 19 9 8 ~ 14 ". O
H OH
Haperforine G
C 25 H28 ~ 6 - 424 Haperforine G : C25H2806 = 424. , F 251 ° (CH2Cl2 / AcOEt), [a]p =
+ 24,1 (CHC13, c = 0,9); HR ICSM : MH+ 425, 1972 (calc. 425, 1963 pour C25H29O6) ; IR
5 (laque) n cm': 3650 (OH), 1764, 1707 (C+O), 1271, 1201, 1089 (C-O) ; 'H RMN
d ppm, J Hz, CDCl3: 0,89(3H, s, CH3), 1,42 (3H, s, CH3), 1,55 (3H, s, CH3), 1,72 ((2H, m, CH2-l la, CH2-12a), 1,91 (3H, s, CH3-30), 2,04 (1H, dd, J = 10, J' =
5, CH2-1), 2,30 (2H, m, H-l lb, H- ), 2,35 (1H, s, OH), 2,61 (1H, dd, J = 16, J' = 2, CH2-), 2,88 et 3,04 (2H, AB, J = 21, CH2-7), 3,48 (1H, m, H-9), 4, 96 ( 1H, s, H-17), 5,39 10 (1H, s, H-1), 6,34 (1H, s, H-22), 7,44 (1H, s, H-23), 7,47 (1H, s, H-21) ;'3C RMN d ppm : 18,58 (CH2), 21,42 (CH3), 23,45 (CH3), 27,44 (CH3), 28,59 (CH3), 31,27 (CHZ), 38,30 (CHz), 42,44 (C), 46,33 (CH2), 46,99 (CH), 48,20 (CH-), 61,30 (C), 82,83 (C), 83.63 (CH-17), 85,26 (C), 107,96 (CH-22), 118,77 (CH-1), 119,84 (C-20), 125,65 (C), 139,34 (CH-23), 143,08 (CH-21), 145,38 (C), 151,77 (C), 168,14 (C=O), 168,76 (C=O). Les attributions ont été réalisées à l'aide d'expériences de RMN 2D, COSY'H-'H et '3C-'H.
Eluat 10 (toluène - éther ; 40 : 60). L'éluat 10 évaporé à sec fournit un résidu de 350 mg. Ce mélange (350 mg) est purifié par chromatographie préparative sur plaque de silice, le mélange (chlorure de méthylène - méthanol ; 95 : 5 ) étant utilisé
comme éluant.
On obtient ainsi l'haperforine F~ (9 mg) qui présente les caractéristiques suivantes Haperforine F, : C2,H32O9 = 500; F 209 (MeOH) ; HR ICSM : MH
501,2122 (calc. .501,2124 pour CZ,H33O9), 483,2021 (cals. 483,2018 pour CZ,H3,0$) :
'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 0,98 (3H, s. CH3), 1,25 (3H, s, CH3), 1,38 (3H, s, CH3),1,55 (3H,s, CH3), ), 1,66 (3H, s, CH3), 2,10 (1H, m), 2,18 (1H, d, J
=14), 2,61 FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) WO 01/30776 CA 02389169 2002-04-26 pCT~R00/02951 (1H, dt, J = 14, J' = 2), 3,20 (1H, d, J = 14), 3,82 (3H, s OCH3), 6,18 et 6,36 (2H, AB, J= 18), 6,92 (1H, s, H-22), 7,38 (1H, s, H-23), 8,60 (1H, s, H-21).
Eluat 11 (toluène - éther ; 40 : 60). L'éluat 11 évaporé à sec fournit un résidu 5 de 320 mg. Ce mélange (320 mg) est purifié par chromatographie préparative sur plaque de silice, le mélange (chlorure de méthylène - méthanol 95 : 5) étant utilisé
comme éluant.
On obtient ainsi deux produits : l'haperforine F3 et l'haperforine F6.
L'haperforine Fj (11 mg) cristallisée dans l'éthanol présente les 10 caractéristiques suivantes Haperforine F, : C27H3ZO~p = 516. F > 220° (MeOH) ; HR ICSM : MH+
517,2098 (talc. 517,2073 pour Cz,H33O,o) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDCI3: 1,42 (3H, s, CH,), 1,52 (3H, s, CH3), 1,62 (3H, s, CH3),1,65 (3H,s, CH,), 1,80 (1H, m), 2, 02 (1H, td, J = 14, J' = 3), 2,56 et 2,96 (1H, AB, J = 18), 2,85 (1H, m), 3,42 (1H, dd, J
15 = 4, J' = 9), 3,78 (3H, s, OCH3), 4,25 (lH,s,), 6,25 et 6,80 (2H, AB, J =
10), 6,76 (1H, d, J = 1, H-22), 7,21 (1H, t, J = 1, H-23), 8,0 (1H, s, H-21).
L'haperforine F6 (27 mg) présente les caractéristiques suivantes Haperforine F6 : CZ,H34O9 = 502. non cristallisée; HR ICSM : MH+
20 503,2281 (talc. 503,2280 pour Cz,H35O9), 485,2191 (talc. pour C~7H33Og 485,2175) ;
'H RMN d ppm, J Hz, CDC13 : 0,86 (3H, s, CH3), 0,98 (3H, s, CH3), 1,56 (3H, s, CH3),1,77 (3H,s, CH3), 1,97 ( 1 H, td, J = 14, J' = 6), 2,22 ( 1 H, t, J =
10), 2,47 (2H, m), 2,87 (2H, m), 3,25 (1H, dd, J = 10, J' = 18), 3,67 (3H, s, OCH3), 5,07 et 5,58 (2H, 2s, =CHZ), 5,45 (1H, s), 6,35 (1H, s large, H-22), 7,38 (1H, s large, H-23), 7,41 25 (1H, s large, H-21) ; '3C RMN d ppm CSHSN : 14,98 (CH3), 22,10 (CH3), 25,27 (CH3), 31,21 (CHI), 32,83 (C), 33,84 (CHZ), 34,62 (CHI), 36,06 (CHZ), 37,89 (CHI), 41,48 (C), 52,92 (OCH;), 53,59 (CH), 53,22 (C), 77,78 (CH), 79,79 (CH), 80,36 (CH), 83,51 (C), 89,05 (C), 110,17 (CH-22), 110,35 (CHZ), 121,25 (C-20), 141,16 (CH-23), 143,56 (CH-21), 150,48 (C), 171,66 (C=O).
Eluat 13 (chlorure de méthylène). L'éluat 13 évaporé à sec fournit un résidu de 66mg. Par cristallisation dans le chlorure de méthylène, on obtient ainsi l'haperforine F déjà décrite dans l'exemple 6.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) * EXEMPLE 10 : Traitement de l'haperforine C
A une solution de düsopropylamidure de lithium (0,3 ml d'une solution 0,35M dans le THF, soit 0,10 mM), on ajoute à -78°C une solution d'haperforine C
(25 mg, 0,05 mM). Après 1h, la réaction est neutralisée par addition d'acide acétique (15 mM). De l'éther est ajouté et la solution organique lavée successivement avec une solution aqueuse de bicarbonate de sodium et de l'eau, est évaporée à sec sous pression réduite. On obtient un mélange 1/1 d'haperforine C et du produit de retroMichaël de l'haperforine C dénommée isohaperforine C. Ce mélange est purifié par chromatographie sur plaque préparative. On obtient ainsi fisohaperforine C pure qui présente les caractéristiques suivantes:
Isohaperforine C : C29 H36 0, ~ = 560. F 186° (MeOH), [a]p = + 12 (CHC13, c = 0,52) spectre de 'H RMN du mélange d ppm, J Hz, CDC13: 0,92 (3H, s, CH3), 1,0 (3H, s, CH3), 1,28 (3H, d, J = 6, CH3), 1,35 (6H, s, CH3), 2,10 (3H, s, COCH3), 3,40 (1H, m, H-3), 3,82 (3H, s, COZCH3), 5,02 (1H, s large, H-2), 5, 88 (1H, dd, J
= 9, J' = 2, H-6), 5,08 ( 1 H, dd, J = 9, J' = 4, H-7), 6,92 ( 1 H, d, J = 2, H-22), 7,3 8 ( 1 H, dd, J
= 2, J' = 1, H-23), 8,35 (1H, d, J=1, H-21).
* EXEMPLE 11 : Utilisation des haperforines contre la prolifération r~a~~Waora Le pouvoir anti-tumoral exercé in vitro par une famille de produits contenant une vingtaine d'exemples fut évalué à l'aide du test colorimétrique MTT
sur 6 lignées cancéreuses humaines.
Le principe du test MTT est basé sur la réduction réalisée au niveau d'enzymes mitochondriales (de cellules vivantes puisque métaboliquement actives) du produit MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) de couleur jaune en un produit de couleur bleue, le formazan. La quantité de formazan ainsi obtenue est directement proportionnelle à la quantité de cellules vivantes dans le milieu de culture. Cette quantité de formazan est mesurée par spectrophotométrie.
Six lignées cellulaires cancéreuses humaines ont été utilisées, à savoir les modèles A172, U373 et U87 (glioblastomes), A549 (cancer du poumon non-à-petites-cellules), et HCT-15 et LoVo (cancers colorectaux). Ces lignées cellulaires ont été obtenues auprès d'une banque de tissus tumoraux située aux USA, à savoir l'American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA).
Le procédé expérimental consiste à ensemencer 20 000 à 50 000 (selon le type cellulaire utilisé) cellules/ml de milieu de culture dans des plaques mufti-puits FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) de 96 puits contenant chacun 100 p,1 de milieu de culture avec la concentration cellulaire adéquate. Les cellules sont laissées au repos pendant 24 heures afin de favoriser au maximum leur adhérence sur le support de la plaque, puis on ajoute les différents produits dont on veut évaluer l'activité anti-tumorale. Chaque produit a été testé aux concentrations de 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 et 100 pg/ml, chaque concentration de produit étant étudiée en hexaplicat.
On effectue un contrôle, qui correspond à la condition expérimentale dans laquelle est ajouté le solvant. Dans le cas présent, le solvant est du DMSO
utilisé à
une concentration finale inférieure à 0.1 % par rapport au volume total de culture cellulaire. En effet, on sait que des concentrations de DMSO allant jusqu'à 5%
du volume totale de culture cellulaire ne perturbent pas la croissance des lignées utilisées pour le test.
On laisse les cellules en présence des produits pendant 72 heures, puis on ajoute le produit MTT jaune et on laisse ce produit en présence des cellules pendant 3 heures. L'intensité de la coloration bleue résultant de la transformation du produit MTT jaune en formazan bleu par les cellules encore vivantes au terme de l'expérience est quantifiée par spectrophotométrie à l'aide d'un appareil de type DYNATECH IMMUNOASSAY SYSTEM
Un logiciel intégré au spectrophotomètre calcule les valeurs moyennes de densité optique ainsi que les valeurs de déviation standard (Dév. Std.) et d'erreur standard sur la moyenne (ESM). Les évaluations statistiques se font à l'aide de tests paramétriques (analyse de la variance selon le test de Student) ou non paramétriques (test de rang de Mann-Whitney) selon que les distributions de valeurs de densité
optique répondent ou non à une distribution normale (testées par un test Chi2) et que les variances sont ou ne sont pas égales (testées par le test de Levene).
Les résultats obtenus figurent dans le Tableau I, qui détaille l'activité
observée pour 7 produits à chacune des concentrations testées pour chacune des lignées utilisées dans le test.
On observe donc que les composés selon l'invention possèdent une activité
remarquable de cytotoxicité pour les cellules cancéreuses, le produit HB 1 se révélant le plus intéressant en termes d'inhibition de la croissance tumorale.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) WO 01/30776 CA 02389169 2002-04-26 pCT~R00/02951 Tableau I
ProduitsConcentrationLignes Moyenne s (mglml) cellulaires ~ESM
LoVo 100.0 3 4 5 5 4 1 4~ 1 HA 10.0 99 125 72 69 118 49 8712 1.0 117 132 93 96 92 98 IOSt6 0.1 115 123 126 93 127 107 11516 100.0 78 54 28 19 11 5 3312 HB 10.0 109 109 103 96 108 110 1062 1.0 119 109 106 110 116 125 11414 0.1 121 102 106 113 103 131 1135 100.0 1 1 1 1 3 1 1~1 *HB1 10.0 42 62 13 34 15 11 308 1.0 90 112 76 109 101 43 8810 0.1 91 113 68 105 114 101 997 100.0 1 47 25 10 17 5 187 HC 10.0 137 130 119 115 92 111 1178 1.0 146 128 128 122 136 146 1344 0.1 147 124 106 119 152 174 13710 100.0 1 6 3 . 10 11 1 5~2 HE 10.0 101 99 61 76 105 80 877 1.0 100 126 96 97 124 109 1096 0.1 107 123 88 89 113 98 1036 100.0 144 101 85 92 114 5 1069 HF 10.0 166 113 113 122 153 I10 1329 1.0 169 121 124 120 160 125 13810 0.1 173 108 123 121 191 131 14814 100.0 I 8 1 7 8 1 4~2 HF2 10.0 106 109 84 88 89 92 957 1.0 104 99 93 92 99 105 992 0.1 102 121 103 103 103 117 1084 * HB 1 = Haperforine B 1 Les nombres figurant dans le tableau I représentent la valeur moyenne (calculée sur 6 valeurs pour chacune des conditions expérimentales) du pourcentage de cellules présentes en fin d'expérimentation par rapport à la condition contrôle.
cette dernière étant calibrée à 100% de manière arbitraire.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) 15), 5.12 (1 H, broad s, OH), 5.40 (1 H, t, J = 7, H-11), 5.80 (1 H, d, J = 12, H-6), 6.08 (1H, d, J = 12, H-5), 6.28 (1H, s, H-17), 6.45 (1H, s, H-22), 7.40 (1H, s, H-23), 7.50 (1H, s, H-21); '3C NMR d ppm: 16.14 (CH3), 16.80 (CH3), 19.83 (CH3), 22.04 (COÇH3), 24.55 (CH3), 27.98 (CH3), 43.64 (C), 49.03 (CH-9), 49.56 (C), 51.15 (VS), 52.75 (OCH3), 54.82 (CH-15), 65.90 (CH?), 67.51 (CH-11), 70.42 (CH), 76.53 (CH), 88, 06 (C-2), 108.54 (C-3), 110.47 (CH-22), 120.83 (C-20), 124.0 (CH-6), 142.0 (CH-23), 143.80 (CH-21), 152.55 (CH-5), 167.17 (C = O), 168.20 (C = O), 170.83 (C = O), 196.0 (C = O C-17), 205 (C = O). Allocations have been completed at using 2D NMR experiments, COZY'H-'H and '3C-'H.
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The acetylation of haperforin Bj according to the following process leads to obtaining acetyl haperforin B3 A solution of haperforin B3 (22 mg) in acetic anhydride (0.5 ml) and pyridine (0.5 ml) is left at room temperature for 24 h. After addition of water (5 ml), the organic products are extracted with ether (3 times 3 ml). The ethereal phase washed, dried over MgS04 and evaporated under pressure scaled down provides a residue which, purified by chromatography on a silica plate (eluent ether), provides acetylhaperforin B3 (5 mg) with physical characteristics ('H
NMR, MS, CCM) are identical to those of haperforin A.
Hperforin C (HC, compound L2) has the following characteristics 1s H sCH OOO
HC ~ s 1V-C ' s ~ H ~~ 15 OCH 3 ~ 2s H ss ~ ”= 560 Haperforine C: CZçH3601 i = 560. not crystallized, [a] p = - 87 (CHCI ,, c = 1 );
HR ICSM: MH + 561.2366 (calc. 561.2335 for CZ9H3.0 "); UV: 1", aX (EtOH):;
IR
(lacquer) n cm ': 1742, 1655 (C = O), 1237 (CO); 'H NMR d ppm, J Hz, CDC13: 0.91 (3H, s, CH;), 1.06 (3H, s, CH3), 1.23 (3H, d, J = 6, CH3), 1.32 (3H, s, CH,), 1.35 (1H, m, CHI-12a), 1.40 (3H, s, CH3), 1.80 ((2H, m, CHZ-11), 2.10 (3H, s, COCH3), 2.42 (1H, m, H-9), 2.58 (2H, m, H-3, H-12b), 2.80 (2H, ABX, J = 18, J '= 8, H-6), 3.55 (1H, s, OH), 3.66 (1H, dd, J = 10, J '= 6, H-10), 3.82 (3H, s, CO ~ CH3), 3.98 (1H, d, J = 4, H-2), 4.72 (1H, td, J = 8, J '= 1, H-7), 5.08 (1H, s, H-15), 6.92 (1H, d, J = 2, H-22), 7.38 (1H, dd, J = 2, f = 1, H-23), 8.35 (1H, d, J = 1, H-21); '3C
NMR d ppm: 14.98 (CH3), 19.29 (CHI-11), 20.67 (CH3-19), 23.93 (CH3), 27.23 (CH3), 28.73 (CH;), 34.72 (CHZ-6), 37.11 (CHI-12), 46.15 (CH-3), 51.69 (C-13), 52.15 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Haperforin C
(CH-9), 52.45 (OCH3), 52.80 (C-8), 59.04 (CH-15), 69.88 (C-4), 71.98 (CH-7), 72.63 (CH-2), 75.66 (CH-10), 79.43 (C-14), 110.59 (CH-22), 117.30 (C-1), 125.59 (C-20), 142.61 (CH-23), 149.34 (CH-21), 167.83 (C = O), 170.40 (C = O), 197.42 (C = O C-17). Allocations were made using NMR experiments 2D, COZY'H-'H and '3C-'H.
The fractions (226-270), combined and evaporated to dryness, give a residue of 97 mg. This mixture (97 mg) is purified by preparative plate chromatography of silica, ether being used as eluent.
34 mg of haperforin BI (HB 1, compound L 1) are thus obtained, which have the following features 182 '/ ~ 21 12 17 Read 11 _ HaC H s CH OOO
HO H ~ 15 16 ~ OC ~ 'i3 6 ~
U
Haperforine B1 C2 ~ H320s = 500 Haperforin B,: C27H32O ~ = 500; F 200 ° (MeOH), [a] p = - 72.8 (CHC13, c =
1.02); HR ICSM: MH + 501.2116 (calc. 501.2124 for CZ, H33O9); UV: lmaX (EtOH) 272.6 nm (e = 13750); IR (lacquer) n cm ': 3437 (OH), 1757, 1728, 1714, 1651 (C = O), 1302, 1124 (CO); 'H NMR d ppm, J Hz, CDC13: 0.96 (3H, s, CH3), 1.19 (3H, s, CH3), 1.24 (3H, d, J = 6, CH3), 1.34 (1H, d, J = 7, H-12b), 1.50 (3H, s, CH3), 1.57 (3H, s, CH3), 1.66 ((2H, m, CHZ-11), 2.47 (1H, dd, J = 7, J '= 3, H-12a), 2; 56 (1H, t; J = 8, H-9), 3.30 (1H, m, H-10), 3.49 (1H, s, H-15), 3.79 ((3H, s, COZCH3), 5.25 (1 H, s, OH), 6.06 (1 H, dd, J = 10, J '= 2, H-6), 6.32 (1 H, s, H-2), 7.01 (1 H, s, H-22), 7.46 (1H, s, H-23), 7.68 (1H, d, J = 10, H-5), 8.53 (1H, s, H-21); '3C
NMR d ppm: 15.39 (CH3), 22.77 (CHZ-11), 23.33 (CH3-19), 24.39 (CH3), 29.14 (CH;), 29.72 (CH3), 34.93 (CHI-12), 49.69 (CH-9), 51.65 (C-13); 52.72 (OCH3), 56.07 (VS-SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 8), 58.74 (CH-15), 69.87 (CH-10), 70.44 (C-14), 83.45 (C-4), 110.34 (CH-22), 122.63 (CH-6), 126.55 (C-20), 127.42 (CH-2), 138.16 (CH-5), 143.60 (CH-23), 145.88 (C-3), 149.21 (CH-21), 163.80 (C = O ester C-16), 166.27 (C = O lactone C
7), 196.0 (C = O C-17), 204.85 (C = O, C-1). Allocations were made to ugly 5 of 2D NMR experiments, COZY'H-'H and '3C-'H.
The fractions (330-406), combined and evaporated to dryness, give a residue of 63mg. This mixture (63 mg) is purified by preparative chromatography on plate of silica, ether is used as eluent.
10 Hperforin H is thus obtained, which has the characteristics following Haperforine H: Cz5Hz80,. Mp 208 ° (MeOH); HR ICSM: MH +
441.1939 (calc. 441.1913 for CZSH290,); 'H NMR d ppm, J Hz, CDCl3: 0.96 (3H, s, CH3), 1.25 (3H, s, CH3), 1.48 (3H, s, CH3), 1.56 (3H, s, CH,), 2.66 (1H, t, J = 8), 2.75 and 3.25 (2H, ABX, J = 16, J '= 2, J "= 1), 4.25 (1 H, m), 4.96 (1 H, s), 6.03 (1 H, d, J =
15 5), 6.31 (1 H, wide s, H-22), 7.41 (1 H, d, J = 5), 7.45 (1 H, wide s, H-23), 7.46 (1 H, s large, H-21).
* EXAMPLE 8 The extract N ° 1 obtained according to Example 1 (10g) is subjected to a treatment 20 chromatography on a silica column (350 g). The eluate made up of a mixed heptane-ethyl acetate (80:20) is collected in 20 ml fractions The fractions (311-330), combined and evaporated to dryness, give a residue of 530 mg which, after dissolution and crystallization from methanol, provides 100 mg haperforin C2 (HC2, compound IIL2) which has the characteristics following 21 ~ ~ 22 9 g 14 y (16 z 4 ~ ~ OH7I 3o O
29 28 ~ 6 Haperforin C, z C25 H26 ~ 7 = 438 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Haperforine C ~: CZSH260W 438. F 270 ° (MeOH), [a] p = - 284 (CHC13, c =
0.9); HR ICSM: MH + 439, (calc. 439, for CzsH2.0,); UV: lmax (EtOH):; IR
(lacquer) n cm ': 1768, 1712, 1668 (C = O), 1381, 1306, 1131, 1025, 1000 (CO); 'H
NMR d ppm, J Hz, CDC13: 0.90 (3H, s, CH3), 1.25 (3H, s, CH3), 1.40 (3H, s, CH3), 1.68 (3H, s, CH3), 1.74 ((2H, m, CHZ-12), 1.94 (2H, m, H-9, Hl la), 2.13 (1H, m, H-11 b), 3.07 (1 H, s, H-6), 3.48 (1 H, s, H-14), 5.0 (1 H, s, H-17), S, 76 (1 H, s, H-30), 5.92 and 6.14 (2H, AB, J = 15, H-1 and H-2), 6.20 (1H, s, H-22), 7.30 (1 H, s, H-23), 7.37 (1H, s, H-21); '3C NMR d ppm: 20.22 (CH3), 25.04 (CH,), 26.77 (CH3), 27.68 (CH3), 28.25 (CHz-11), 37.02 (CHZ-12), 47.93 (C), 48.52 (C), 53.86 (CH-9), 58.35 (CH-6), 64.34 (CH-14), 72.13 (CH-17), 83.09 (C-4), 83.40 (C-5), 109.03 (CH-22), 121.26 (C-20), 123.58 (CH-1), 126.82 (CH-30), 140.48 (CH-23), 144.56 (CH-21), 148.97 (CH-2), 150.47 (C-8), 165.37 (C = O), 174.73 (C = O), 197.03 (C = O
C-7). Allocations were carried out using 2D NMR experiments, COZY
'H-'H and'3C-'H.
* EXAMPLE 9 Extract No. 1 obtained according to Example 1 (6.40 g) is dissolved in toluene and it is subjected to a chromatographic treatment on a 60 H silica column.
elected in 300 ml volume fractions.
Eluate 1 = (toluene-ether; 80:20);
Eluate 2 (toluene-ether; 70:30);
Eluate 3 (toluene-ether; 60:40);
Eluate 4 (toluene-ether; 50:50);
Eluate 5 (toluene-ether; 40:60).
The eluate 5 evaporated to dryness provides a residue of 500 mg. This mixture (500 mg) is purified by preparative chromatography on a silica plate, the ether is used as eluent.
Two products are thus obtained: haperforin D and haperforin Dl.
Hperforin D (HD, compound L4) (66 mg) has the characteristics following SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) H 1 9 CH a V0 .O
H3C ~ 1oH
O iniui0 7 \
29 ~ 4 5 Haperforine D
C2 ~ H 34 ~ ~ o = 518 Haperforine D: C "H340, o = 518. F 239 ° (EtOH), [a] p = - 98 (CHCl3, c =
0.98); HR ICSM: MH + 519.2244 (calc. 519.2230 for CZ, H35O, o), 501, 2099 (calc.
501, 2124 for CZ, H33O9, MH + -H ~ O); UV: l, "ax (EtOH):; IR (CHCI,) n cm ':
1762, 1725, 1662 (C = O); 'H NMR d ppm, J Hz, CDC13: 1.0 (3H, s, CH3), 1.06 (3H, s, CH3), _1.24 (3H, d, J = 6, CH3), 1.32 (3H, s, CH3), 1.40 (1H, m, CH, -12a), 1.48 (3H, s, CH,), 1.80 ((2H, m, CHZ-11), 2.42 (1H, m, H-9), 2.58 (2H, m, H-3, H-12b), 2.80 (2H, ABX, J = 18, J '= 8, H-6), 3.55 (1H, s, OH), 3.66 (1H, dd, J = 10, J' =
6, H-10), 3.82 (3H, s, CO ~ CH,), 3.98 (1H, d, J = 4, H-2), 4.72 (IH, td, J = 8, J '= 1, H-7), 5.08 (1H, s, H-15), 6.92 (1H, s, H-22), 7.38 (1H, s, H-23), 8.35 (1H, s, H-21 ) ; '3C
NMR d ppm: 14.35 (CH3), 19.08 (CHZ-11), 20.67 (CH3-19), 23.93 (CH3), 27.23 (CH3), 28.73 (CH3), 34.72 (CHZ-6), 37.11 (CHI-12), 46.15 (CH-3), 51.69 (C-13), 52, I 5 (CH-9), 52.45 (OCH3), 52.80 (C-8), 59.04 (CH-15), 69.88 (C-4), 71.98 (CH-7), 72.63 (CH-2), 75.66 (CH-10), 79.43 (C-14), 110.59 (CH-22), 117.30 (C-1), 125.59 (C-20), 142.61 (CH-23), 149.34 (CH-21), 167.83 (C = O), 169.51 (C = O), 196.46 (C = O C-17). Allocations were made using experiments of NMR
2D, COZY'H-1H and 13C-1H.
Hperforin DI (83 mg) has the following characteristics Haperforin D,: CZSHZ80, = 440. M 208 ° (MeOH); ICSM: MH + 441, 423;
'H NMR d ppm, J Hz, CDCl3: 0.98 (3H, s, CH3), 1.28 (3H, s, CH3), 1.35 (1H, m), SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 1.46 (3H, s, CH3), 1.46 (1H, m), 1.60 (3H, s, CH3), 1.80 (1H, m), 1.85 and 2.0 (2H, ABX, J = 13, J '= 7), 2.20 (1H, m), 2.70 (1H, dd, J = 14, J' = 7), 2.97 and 3.10 (2H, ABX, J = 19, J '= 3, J "= 2), 3.69 (1H, s), 4.48 (1H, td, J = 6, J' = 2), 4.88 (1H, s), 6.03 (1 H, d, J = 6), 6.3 8 (1 H, s, H-22), 7.42 (1 H, d, J = 6), 7.44 (1 H, s, H-23), 7.48 (1H, s, H-21); '3C NMR d ppm: 22.55 (CH3), 23.33 (CH3), 24.80 (CH3), 27.77 (CHz), 28.27 (CHz), 31.42 (CH3), 36.68 (CHZ), 38.97 (CHZ), 43.25 (C), 52.39 (CH), 74.67 (CH), 81.51 (CH), 83.18 (C), 86.83 (C), 108.50 (CH-22), 110.28 (C), 119.36 (C-20), 119.48 (CH), 126.19 (C), 139.68 (CH-23), 143.09 (CH-21), 151.98 (C), 160.40 (CH), 167.96 (C = O), 171.85.
Eluate 9 (toluene - ether; 40:60): the dry evaporated eluate 9 provides a residue of 440 mg. This mixture (440 mg) is purified by preparative chromatography on silica plate, the mixture (methylene chloride - methanol; 95: 5) being used as eluent.
Two products are thus obtained: haperforin EI and haperforin G.
Hperforin E ~ (32 mg) has the following characteristics Haperforin E,: CZSH3o0, = 442. not crystallized; HR ICSM: MH +
443.2076 (calc. 443.2063 for CZSH3.0,), 425.2002 (calc. 425.1963 for CZSHZ ~ O ~);
'H NMR d ppm, J Hz, CDCI ,: 0.94 (3H, s, CH3), 1.10 (3H, s, CH3), 1.30 (3H, s, CH3), 1.32 (3H, s, CH3), 1.50 (2H, m), 2.1 (1H, m), 2.40 (1H, dd, j = 15, J '=
6), 2.60 (1H, m), 2.60 and 2.75 (2H, ABX, J = 20, J '= 1, J "= 6), 3.69 (1H, s), 2.65 (1H, dd, J = 4, J '= 10), 2.90 (1H, s broad), 3.28 (1H, d, J = 18), 3.65 (1H, td, J = 6, J '_ 2), 3.72 (1H, t, J = 3), 4.18 (1H, d, J = 6),), 5.22 (1H, s), 5.74 (1H, q, J
= 2), 6.30 (1 H, s, H-22), 7.40 (1 H, s, H-23), 7.45 (1 H, s, H-21).
Hperforin G (HG, compound IIL1) (38 mg) has the characteristics following SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 21 ~ ~ 22 OH
29/30 19 9 8 ~ 14 ". O
H OH
Haperforine G
C 25 H28 ~ 6 - 424 Haperforine G: C25H2806 = 424., F 251 ° (CH2Cl2 / AcOEt), [a] p =
+ 24.1 (CHC13, c = 0.9); HR ICSM: MH + 425, 1972 (calc. 425, 1963 for C25H29O6); IR
5 (lacquer) n cm ': 3650 (OH), 1764, 1707 (C + O), 1271, 1201, 1089 (CO); 'H NMR
d ppm, J Hz, CDCl3: 0.89 (3H, s, CH3), 1.42 (3H, s, CH3), 1.55 (3H, s, CH3), 1.72 ((2H, m, CH2-1a, CH2-12a), 1.91 (3H, s, CH3-30), 2.04 (1H, dd, J = 10, J '=
5, CH2-1), 2.30 (2H, m, Hl lb, H-), 2.35 (1H, s, OH), 2.61 (1H, dd, J = 16, J '= 2, CH2-), 2.88 and 3.04 (2H, AB, J = 21, CH2-7), 3.48 (1H, m, H-9), 4.96 (1H, s, H-17), 5.39 10 (1H, s, H-1), 6.34 (1H, s, H-22), 7.44 (1H, s, H-23), 7.47 (1H, s, H-21) ; '3C NMR d ppm: 18.58 (CH2), 21.42 (CH3), 23.45 (CH3), 27.44 (CH3), 28.59 (CH3), 31.27 (CHZ), 38.30 (CHz), 42.44 (C), 46.33 (CH2), 46.99 (CH), 48.20 (CH-), 61.30 (VS), 82.83 (C), 83.63 (CH-17), 85.26 (C), 107.96 (CH-22), 118.77 (CH-1), 119.84 (C-20), 125.65 (C), 139.34 (CH-23), 143.08 (CH-21), 145.38 (C), 151.77 (C), 168.14 (C = O), 168.76 (C = O). Allocations were made using experiments of 2D NMR, COZY'H-'H and '3C-'H.
Eluate 10 (toluene - ether; 40:60). Eluate 10 evaporated to dryness provides a residue 350 mg. This mixture (350 mg) is purified by preparative chromatography on silica plate, the mixture (methylene chloride - methanol; 95: 5) being used as eluent.
This gives haperforin F ~ (9 mg) which has the characteristics following Haperforin F,: C2, H32O9 = 500; F 209 (MeOH); HR ICSM: MH
501.2122 (calc .501.2124 for CZ, H33O9), 483.2021 (cals. 483.2018 for CZ, H $ 3.0):
'H NMR d ppm, J Hz, CDCI3: 0.98 (3H, s. CH3), 1.25 (3H, s, CH3), 1.38 (3H, s, CH3), 1.55 (3H, s, CH3),), 1.66 (3H, s, CH3), 2.10 (1H, m), 2.18 (1H, d, J
= 14), 2.61 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) WO 01/30776 CA 02389169 2002-04-26 pCT ~ R00 / 02951 (1H, dt, J = 14, J '= 2), 3.20 (1H, d, J = 14), 3.82 (3H, s OCH3), 6.18 and 6.36 (2H, AB, J = 18), 6.92 (1H, s, H-22), 7.38 (1H, s, H-23), 8.60 (1H, s, H-21).
Eluate 11 (toluene - ether; 40:60). The dry evaporated eluate 11 provides a residue 5 of 320 mg. This mixture (320 mg) is purified by preparative chromatography sure silica plate, the mixture (methylene chloride - methanol 95: 5) being used as eluent.
Two products are thus obtained: haperforin F3 and haperforin F6.
Hperforin Fj (11 mg) crystallized from ethanol has the Next 10 features Haperforin F,: C27H3ZO ~ p = 516. F> 220 ° (MeOH); HR ICSM: MH +
517.2098 (talc. 517.2073 for Cz, H33O, o); 'H NMR d ppm, J Hz, CDCI3: 1.42 (3H, s, CH,), 1.52 (3H, s, CH3), 1.62 (3H, s, CH3), 1.65 (3H, s, CH,), 1.80 (1H, m), 2, 02 (1H, td, J = 14, J '= 3), 2.56 and 2.96 (1H, AB, J = 18), 2.85 (1H, m), 3.42 (1H, dd, J
15 = 4, J '= 9), 3.78 (3H, s, OCH3), 4.25 (1H, s,), 6.25 and 6.80 (2H, AB, J =
10), 6.76 (1H, d, J = 1, H-22), 7.21 (1H, t, J = 1, H-23), 8.0 (1H, s, H-21).
Hperforin F6 (27 mg) has the following characteristics Haperforin F6: CZ, H34O9 = 502. not crystallized; HR ICSM: MH +
20 503.2281 (talc. 503.2280 for Cz, H35O9), 485.2191 (talc. For C ~ 7H33Og 485.2175);
'H NMR d ppm, J Hz, CDC13: 0.86 (3H, s, CH3), 0.98 (3H, s, CH3), 1.56 (3H, s, CH3), 1.77 (3H, s, CH3), 1.97 (1 H, td, J = 14, J '= 6), 2.22 (1 H, t, J =
10), 2.47 (2H, m), 2.87 (2H, m), 3.25 (1H, dd, J = 10, J '= 18), 3.67 (3H, s, OCH3), 5.07 and 5.58 (2H, 2s, = CHZ), 5.45 (1H, s), 6.35 (1H, wide s, H-22), 7.38 (1H, wide s, H-23), 7.41 25 (1H, br s, H-21); '3C NMR d ppm CSHSN: 14.98 (CH3), 22.10 (CH3), 25.27 (CH3), 31.21 (CHI), 32.83 (C), 33.84 (CHZ), 34.62 (CHI), 36.06 (CHZ), 37.89 (CHI), 41.48 (C), 52.92 (OCH;), 53.59 (CH), 53.22 (C), 77.78 (CH), 79.79 (CH), 80.36 (CH), 83.51 (C), 89.05 (C), 110.17 (CH-22), 110.35 (CHZ), 121.25 (C-20), 141.16 (CH-23), 143.56 (CH-21), 150.48 (C), 171.66 (C = O).
Eluate 13 (methylene chloride). Eluate 13 evaporated to dryness provides a residue 66mg. By crystallization from methylene chloride, this gives haperforin F already described in Example 6.
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) * EXAMPLE 10: Treatment of haperforin C
To a solution of lithium dopropopropylamide (0.3 ml of a solution 0.35 M in THF, i.e. 0.10 mM), a solution is added at -78 ° C
haperforin C
(25 mg, 0.05 mM). After 1 hour, the reaction is neutralized by adding acid acetic (15 mM). Ether is added and the organic solution washed successively with an aqueous solution of sodium bicarbonate and water, East evaporated to dryness under reduced pressure. We obtain a 1/1 mixture of haperforine C and of the retroMichaël product of haperforin C called isohaperforine C. This mixture is purified by chromatography on a preparative plate. We obtain so pure fisohaperforin C which has the following characteristics:
Isohaperforine C: C29 H36 0, ~ = 560. F 186 ° (MeOH), [a] p = + 12 (CHC13, c = 0.52) 1 H NMR spectrum of the mixture d ppm, J Hz, CDC13: 0.92 (3H, s, CH3), 1.0 (3H, s, CH3), 1.28 (3H, d, J = 6, CH3), 1.35 (6H, s, CH3), 2.10 (3H, s, COCH3), 3.40 (1H, m, H-3), 3.82 (3H, s, COZCH3), 5.02 (1H, s wide, H-2), 5.88 (1H, dd, J
= 9, J ' = 2, H-6), 5.08 (1 H, dd, J = 9, J '= 4, H-7), 6.92 (1 H, d, J = 2, H-22), 7.3 8 (1 H, dd, J
= 2, J '= 1, H-23), 8.35 (1H, d, J = 1, H-21).
* EXAMPLE 11: Use of haperforins against proliferation r ~ a ~~ Waora The anti-tumor power exerted in vitro by a family of products containing about twenty examples was evaluated using the colorimetric test MTT
out of 6 human cancer lines.
The principle of the MTT test is based on the reduction achieved at the level mitochondrial enzymes (living cells since metabolically active) MTT product (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl tetrazolium bromide) of yellow color into a blue product, formazan. The quantity of formazan thus obtained is directly proportional to the quantity of cells alive in the culture medium. This amount of formazan is measured by spectrophotometry.
Six human cancer cell lines were used, namely the models A172, U373 and U87 (glioblastomas), A549 (lung cancer non-small cell), and HCT-15 and LoVo (colorectal cancers). These lines cells were obtained from a tumor tissue bank located at USA, namely the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA).
The experimental process consists of inoculating 20,000 to 50,000 (depending on the cell type used) cells / ml culture medium in plates mufti-well SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) of 96 wells each containing 100 μl of culture medium with the concentration adequate cellular. The cells are left to stand for 24 hours in order to maximize their adhesion to the support of the plate, then add them different products whose anti-tumor activity is to be evaluated. Each product a tested at concentrations of 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 and 100 pg / ml, each product concentration being studied in hexaplicate.
A control is carried out, which corresponds to the experimental condition in to which the solvent is added. In this case, the solvent is DMSO
used to a final concentration of less than 0.1% relative to the total volume of culture cellular. Indeed, we know that DMSO concentrations of up to 5%
of total volume of cell culture do not disturb the growth of bloodlines used for the test.
The cells are left in the presence of the products for 72 hours, then add the yellow MTT product and leave this product in the presence of the cells while 3 hours. The intensity of the blue coloration resulting from the transformation of the product Yellow MTT in blue formazan by cells still alive at the end of the experiment is quantified by spectrophotometry using a type DYNATECH IMMUNOASSAY SYSTEM
Software integrated into the spectrophotometer calculates the mean values of optical density as well as the standard deviation values (Dev. Std.) and error standard on the mean (ESM). Statistical assessments are done using of tests parametric (analysis of variance according to Student's test) or not parametric (Mann-Whitney rank test) according to whether the distributions of values of density optics respond or not to a normal distribution (tested by a Chi2 test) and that the variances are or are not equal (tested by the Levene test).
The results obtained are shown in Table I, which details the activity observed for 7 products at each of the concentrations tested for each of the lines used in the test.
It is therefore observed that the compounds according to the invention have an activity remarkable for cytotoxicity for cancer cells, HB 1 is revealing the most interesting in terms of inhibition of tumor growth.
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) WO 01/30776 CA 02389169 2002-04-26 pCT ~ R00 / 02951 Table I
ProductsConcentrationLine Lines s (mglml) cellular ~ ESM
LoVo 100.0 3 4 5 5 4 1 4 ~ 1 HA 10.0 99 125 72 69 118 49 8712 1.0 117 132 93 96 92 98 IOSt6 0.1 115 123 126 93 127 107 11 516 100.0 78 54 28 19 11 5 3312 HB 10.0 109 109 103 96 108 110 1062 1.0 119 109 106 110 116 125 11 414 0.1 121 102 106 113 103 131 1135 100.0 1 1 1 1 3 1 1 ~ 1 * HB1 10.0 42 62 13 34 15 11 308 1.0 90 112 76 109 101 43 8810 0.1 91 113 68 105 114 101 997 100.0 1 47 25 10 17 5 187 HC 10.0 137 130 119 115 92 111 1178 1.0 146 128 128 122 136 146 1344 0.1 147 124 106 119 152 174 13710 100.0 1 6 3. 10 11 1 5 ~ 2 HE 10.0 101 99 61 76 105 80 877 1.0 100 126 96 97 124 109 1096 0.1 107 123 88 89 113 98 1036 100.0 144 101 85 92 114 5 1,069 HF 10.0 166 113 113 122 153 I10 1329 1.0 169 121 124 120 160 125 13810 0.1 173 108 123 121 191 131 14814 100.0 I 8 1 7 8 1 4 ~ 2 HF2 10.0 106 109 84 88 89 92 957 1.0 104 99 93 92 99 105 992 0.1 102 121 103 103 103 117 1084 * HB 1 = Haperforin B 1 The numbers in Table I represent the average value (calculated on 6 values for each of the experimental conditions) of percentage of cells present at the end of the experiment in relation to the condition control.
the latter being arbitrarily 100% calibrated.
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
Claims (11)
dans laquelle .cndot. B représente, soit le radical:
la liaison s'effectuant au niveau du carbone porteur de R4, .cndot. soit B forme avec R3 un composé de formule et dans laquelle .cndot. les pointillés représentent, de façon indépendante, des simples liaisons ou des doubles liaisons, .cndot. R6 à R13, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur en C1-C4, linéaire ou ramifié, substitué ou non, .cndot. R1 est le groupe OH, ou forme avec R2 un pont de structure .cndot. R2 est le groupe =O ou forme avec R1, un pont comme défini ci-dessus, .cndot. lorsque R3 est présent, R3 est choisi parmi l'atome d'hydrogène ou un groupe OH, ou forme avec R5 un pont de structure .cndot. R4 est le groupe OH ou le groupe OCOCH3, ou R4 est absent afin de former la double liaison telle qu'indiquée en pointillé, .cndot. R5 est un atome d'hydrogène ou forme avec R3 le pont tel que décrit précédemment, ainsi que leurs dérivés, sous forme libre, ou sous forme de sels pharmaceutiquement acceptables. 1. Compounds having the general formula:
in which .cndot. B represents either the radical:
the connection taking place at the level of the carbon carrying R4, .cndot. either B forms with R3 a compound of formula and in which .cndot. the dotted lines represent, independently, simple bindings or double bonds, .cndot. R6 to R13, identical or different, represent an atom hydrogen or a lower C1-C4 alkyl group, linear or branched, substituted or not, .cndot. R1 is the OH group, or forms with R2 a structural bridge .cndot. R2 is the group =O or forms with R1, a bridge as defined below above, .cndot. when R3 is present, R3 is selected from the hydrogen atom or an OH group, or forms with R5 a structural bridge .cndot. R4 is the OH group or the OCOCH3 group, or R4 is absent to form the double bond as shown in dotted line, .cndot. R5 is a hydrogen atom or forms with R3 the bridge such that previously described, as well as their derivatives, in free form, or in the form of salts pharmaceutically acceptable.
sous forme libre, ou sous forme de sels pharmaceutiquement acceptables. 2. Compounds according to claim 1, having the formula:
in free form, or in the form of pharmaceutically acceptable salts.
sous forme libre, ou sous forme de sels pharmaceutiquement acceptables. 3. Derivatives of compounds of general formula I according to claim 1, choose among the derivatives of formula:
in free form, or in the form of pharmaceutically acceptable salts.
a. les feuilles des végétaux sont réduites en poudre, b. on traite les feuilles par une solution hydroalcoolique, pour obtenir la dissolution des principes actifs amers dans ladite solution hydroalcoolique, c. on traite la solution hydroalcoolique de principes amers par une solution aqueuse d'acétate de plomb, d. on sépare le précipité formé par filtration, e. on traite le filtrat obtenu par une solution aqueuse de sulfate de sodium, f. on filtre après décantation pour obtenir un filtrat hydroalcoolique de principes amers, 6. Process for the extraction of crude active products of limonoids from plants, characterized in that:
has. the leaves of the plants are reduced to powder, b. the leaves are treated with a hydroalcoholic solution, to obtain the dissolution of the bitter active principles in said solution hydroalcoholic, vs. the hydroalcoholic solution of bitter principles is treated with a solution aqueous lead acetate, d. the precipitate formed is separated by filtration, e. the filtrate obtained is treated with an aqueous solution of sodium sulphate, f. filtered after decantation to obtain a hydroalcoholic filtrate of bitter principles,
g. on traite le filtrat hydroalcoolique, sous agitation, par du charbon actif pour absorber les principes amers h. on recueille le charbon par filtration, on le dessèche et le réduit en poudre.
i. on extrait les principes amers retenus par la poudre de charbon par du chloroforme, que l'on évapore ultérieurement à sec pour obtenir l'extrait brut de principes actifs. 7. Method according to claim 6, characterized in that step (f) is tracking following steps:
g. the hydroalcoholic filtrate is treated, with stirring, with activated carbon to absorb the bitter principles h. the carbon is collected by filtration, dried and reduced to powder.
i. the bitter principles retained by the charcoal powder are extracted by chloroform, which is subsequently evaporated to dryness to obtain the extract gross of active ingredients.
g. on évapore le filtrat hydroalcoolique à sec sous vide h. on extrait l'extrait brut au chloroforme, que l'on évapore ultérieurement à sec pour obtenir l'extrait brut de principes actifs. 8. Method according to claim 6, characterized in that step (f) is followed by following steps:
g. the hydroalcoholic filtrate is evaporated to dryness under vacuum h. the crude extract is extracted with chloroform, which is subsequently evaporated dry to obtain the crude extract of active ingredients.
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| FR9913340A FR2800075A1 (en) | 1999-10-26 | 1999-10-26 | Haperforine limnoid compounds extracted from plants, especially of Harrisonia genus, are useful for treating cancer or malaria |
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