wo s6l03s26 2 1 9 5 4 8 0 . ~I/r s ~
Procédé d~""~l;r~ ;Illl d'acide nucléiaue à l'aide d'un nucléoside modifi~, et détection du produit d'o ~ I ~1; ri, ~ n à l'aide d'anticorPs.
L'invention a pour objet un procédé d~qmpliflrqfif~n d'une séquence d'acide nucléique utilisant un nucléoside n ;1~ ,;3 n avec une base purique ou IJ~Iilllidi~U~;
modifiée qui se trouve incorporée dans les brins d'acide nucléique né,o~yulh~,Li~f i lors de l'opération d',qmplifir,qtinn A l'aide d'anticorps Irc~ ,I,é~ ;r"l"~ f .n Ia base modifiée, il est possible de détecter et/ou de quantifier le produit d'A ~ l ~I ,l; ri. Al ;, Il, En outre, le produit d',qmplif r -qtinn peut être utilisé dans la préparation deIllulLhll~,.ra contenant plusieurs copies de la séquence amplifiée avec base modifiée, et contenant en outre au moins une séquence spécifique d'une séquence d'intérêt. Un tel multimère peut être utilisé pour la détection et/ou la qnslltifif Ation d'une séquence poly..ucléo~ ue ~ " 1~ ~, avec ,..,,I,l;ri, ,ni~", du signal.
On sait que les méthodes d~ ;r~ in vitro par voie cIlLylll~lLi~l ~, ont pour 15 but n~ - n~ ~ ~ l d~obtenir un grand nombre de copies d~une séquence d~un poly~ lé~v~idr présent dans un échantillon en faible quantité, sans qu'il soit nécessaire d'isoler et de cloner ledit poly..u.,lc'vLide.
La méthode d~ ,1; ri, ~ I ;I II I par voie CIIL,~IIIr~ UC qui a été décrite en premier estl'~,,lll;ri,r~ill,,enchâîneparpolylll~ plusconnuesousla~signqri~npcR
~Polymerase Chain Reaction). Dans cet~e méthode, on utilise deux amorces f)~ l lr'~,l;~l;,l, l~ ~ dont chacune est c~ 5 ~, n ~;, r d'un segment d'un des brins d'un DNA contenant la séquence à amplifier, de telle sorte que lesdits segments encadrent ladite séquence, Après chauffage pour dénaturer le DNA les amorces s'hybrident avec leur séquence f~ n~;' r et, en présence d'une DNA polyIl~ ., th~ .tmf)ct,qhll- et de 25 ~,rl~n~ ~lf.~ ' ~ rr~ ' en excès, un brin de DNA, ~ r du brin matrice est synthétisé par élongation à partir de l'extrémité 3' de l'amorce hybridée. Le mélange est alors dénaturé à nouveau par la chaleur, et au rcfrflirl;cc~ m~-nt les amorces s'hybrident sur les brins de DNA présents à l'origine ou nouvellement synthétisés, une nouvelle élongation des amorces a lieu, et ainsi de suite. Ces cycles successifs d'a~ ,uI~,.lL des amorces, d'élongation et de ~f'.l-U~ ll conduisent à un ~onhlr~mrnt du nombre de copies de la séquence d'intérêt à chaque cycle.
Une méthode analogue à la PCR, dite RT-PCR consiste à utiliser comme produit de départ à amplifier un RNA, la méthode comportant alors une étape préalable de n q"~ "' inverse du RNA en DNA ~ l.k'.,~ alA;Ir Cette méthode est utile IlOL~lllllll~,~l. lorsque la cible est le génome d'un rétrovirus ou lorsqu'on utilise comme cible un RNA messager pour eviter d'amplifier les introns.
W096/03526 . 21 95480 I~l/r~
.
Diverses autres méthodes d'A",I,l;ri. ~ ont été décrites~ et nr~Ammrnr celles qui consistent à utiliser une amorce contenant une séquence de promoteur de RNA
puly"~C.G~f,, de façon à obtenir par élongation un double brin de DNA dont la;
en présence de RNApolyu,C.~O conduira à l'obtention de plusieurs dizaines de copies, sous forme de RNA transcrit qui peut entrer dans le cycle d~ ; r~ La méthode comprend une n ~ inverse du RNA pour former un L~Lf'ludu~ A DNA-RNA, puis la d~ ;u~l de l'kf'tf'.ull"~ formé, I'hybridation d'une amorce sur le brin de DNA et l'élongation de l'amorce, suivie de la n.."~ l;r.., du double brin obtenu, et ainsi de suite. Les brins de RNA formés l~ f'~ .., ....I peuvent chacun donner naissance à un 10 double brin de DNA qui pourra à son tour être transcrit.
L'un des inconvénients des méthodes l.u'~ rC est la nécessité de dénaturer les duplex. Cette opération qui se fait gf'n~r llrmrnt à i~,ul~CIalul~; supérieure à 90~C, nécessite l'emploi d'enzymes ll,. .. ",..,~-hlf.5 Pour éviter les étapes de .I~",,n;"", on a imaginé des méthodes d~ pl; ril A l ;l ll l pouvant être mises en oeuvre de façon isotherme.
15 Une méthode isotherme consiste à partir d'une séquence cible de RNA et d'une amorce de DNA.A l'aide d'une ~ , ;IOA~r inverse, on obtient un h~iC~ullu~ ,A RNA-DNA. Par l'action d'une rihnln.lrl~Acf on hydrolyse le RNA. Le DNA simple brin est transformé en double brin par élongation d'une amorce appropriée en présence d'une DNApol~... '~a~c.
Le DNA double brin obtenu peut alors être transcrit et on obtient ainsi plusieurs copies du 20 RNA cible qui peuvent à leur tour entrer dans le cycle d~ ; r~ Une autre méthode isotherme consiste à utiliser le 1,l f.,.. ,.. ? m de ~If~ .. I de brin à l'aide de deux amorces capables de s'hybrider avec un même brin d'acide nucléique cible: le produit d'élongation d'une première amorce situé du côté 5' par rapport à une seconde amorce, déplace le produit d'élongation de la seconde amorce qui est ainsi libéré sous forme de 25 monobrin, tandis que le produit d'élongation de la première amorce forme un duplex avec le brin cible de départ. Le monobrin ainsi formé peut à son tour entrer dans un cycle d'i.,..l.l;ri. -,;..., à l'aide d'un système analogue de deux amorces. En outre, la première amorce peut contenir du côté S', par rapport au site de ~ A;~ ,r de la cible, un site de Ir~r..~ A". e pour une RNA~ulyul~lf~s~,ou pour une enzyme de resttiction, ce qui 30 permet d~utiliser différentes voies pour le cycle d~A ~ r~ iu~ l; voir Ep-os4 36l2~
Tous les spécialistes du domaine estiment que les techniques d~ampliflrArir~n sont appelées à jouer un rôle rr~nci~l~rAhlr notamment dans le diagnostic des infections ou ~,,IA,I.;,.~l;r~nc b- ~ n~f s ou virales.
Il existe donc un besoin de techniques simples et rapides permettant une 35 évaluation 4u~ liv~ des produits d'~ 1; r~ pour remplacer les techniques d'éle,,LIul.LfJl~st sur gel et de transfert sur membrane (blotting). Les techniques les plus sensibles Artl.rllrm~ nt consistent à utiliser un nucléoside n ;I,lm,~ modifié, à savoir un W096103526 2 1 9 5 4 8 0 P.u~ . ~Di df,~ yuu; Ih-c i, ' , ' (dUTP) biotinylé ou un dUTP lié à la riign~figfnin~ Les produits d'A. ,1,1; rh ~1;u~I contenant le nucléotide modifié sont détectés ou quantifiés par un conjugué avidine-enzyme dans le premier cas et par un anticorps l. ~ o~
anti-rlignxi~ninP dans le second cas.
On a maintenant découvert qu'il est possible de mettre en oeuvre les méthodes d'~ f~ en utilisant un nucléoside ~ , ou NTP (NTP désignant ici aussi bien un dCsv,.y- il). .~ lf.n~iriP. I ~ h~ hr lr qu'un rihnmlrlP.nci~1P l I ;I~h~ I IAtI .) dont la base purique ou ~yliullidi~ est modifiée par une ~l lh~ , simple telle qu'une ,"h~l; n . l ;. l.
par un ~ilvu~,.-l.,llL méthyle, LYIIIV~YII~CL~ ou acétyle. On a découvert que les NTP
modifiés sont utilisables par les polymérases pour synthétiser in vitro de nouvelles copies d'une matrice mlrlP'ntirlirlllP, sans perte d'efficacité. Avec des anticorps qui ~r~l..lllA;~ ..
~14. ;r~ l.. 1l un nucléoside à base modifiée et qui ne .c~ pas un nucléoside contenant ladite base sous forme non modifiée, on peut ainsi détecter une séquence d'intérêt amplifiée dans laquelle le nucléoside modifié a été incorporé. En outre, de façon :~UUJJI;,.I~UI~" la technique de détection avec des anticorps dirigés contre ces l .~lfn modifiés ~rll Licul;~ est~ comme on le verra dans la partie ~ f~ lP, ci-après, nettement plus sensible que les techniques de détection classique à l'aide d'un conjugué
viL.~c-c..~.ylllc (dans le cas d'utilisation d'amorces biotinylées) ou à l'aide du système rlignxig~ ulLicullJs anti-riignxigrp~ninp : L'invention a donc pour objet un procédé d~Allllll;rh ~1;. .~ par voie C.l~yll~dLi Luc, d'une séquence nnrlf.otirlirlnP, dans lequel on met en contact un pol~.luclcvLidc contenant ladite séquence, des amorces nlignn~rlPotirlirlnPc, les l ~lfc.~ l.}. -~et/oudC~v~y~ foc~ u ;l.hn~ contenantlesdiverses bases puriques et ~Jyfillli~:liclu.,i, nécessaires à la synthèse du produit d~mrlifir~tinnl et un système en~ymatique ayant une activité de DNA polymérase et/ou de RNA polyméraseet/ou de IIAII~. 1;l,1~. inverse, ~ dans des conditions permettant d'effectuer, de fac,on connue en soi, une nrlifinAtinn de ladite séquence d'intérêt, caractérisé par le fait que l'un desdits 1111~ lfnci.lr s U ;IIh. ~ IIAt~ ., et/ou dCio~y,-.,llf.o~:~lrsuil.h~ .hAI.cestprésentsoitsousuneformemodifiée,soitàlafoissous une forme modifiée et sous une forme non modifiée, et que, dans ladite forme modifiée, la base ~yfi~llidi~luc ou purique est substituée par au moins un ~luulJ~ uL
métbyle, hy~llu~ylllC,.llyle ou acétyle.
L'invention a également pour objet un procédé d'nmrlifrAtinn d'une séquence mlrlP.otirli-lnP~ et de détection et/ou de ~ u;ri. Alinn du produit d'nmrlifrAtinn dans lequel, on met en contact un polyl,..~lévLidc contenant ladite séquence, des amorces nli~;...",nlf.~ ". c, les ~lnlfnc.rlr.~ trirhncrhAtps et/ou dC~v;~yl ~rlf~ l s u ;I h l~l~h w0 96/03526 2 ~ 9 5 4 ~ 0 . ~
contenant les diverses bases puriques et ~yliulidiu,u~.s nécessaires à la synthèse du produit d~ r~ l et un système ul~yll~dLiu,uG ayant une activité de DNA polymérase et/ou de RNA poly-~ , et/ou de ~ C inverse, dans des conditions permettant d'effectuer, de façon connue en soi, une ~; ~AmrlifirAtinn de ladite séquence d'intérêt, caractériséparlefaitquel'undesdits,lll~lfn~:~l;s~ n~llhAt~setlou d6su,-yl " l~ 1. s i ~. ' . ' est présent soit sous une forme modifiée, soit à la fois sous une forme modifiée et sous une forme non modifiée, et que, dans ladite forme modifiée, la base pyrimidique ou purique est substituée par au moins un ~luuy~ llL
10 méthyle, hyd~u~y~ Ie ou acétyle, et que l'on détecte et/ou quantifie le produit d~ lkr~A~;nll~ selon des méthodes connues en soi, à l'aide d'un anticorps Ir~,,,lA;~A,ll crcrifi~lnl mrn~ ledit nucléoside modifié et ne ~cc..", lAi~ pas ledit nucléoside non modifié.
L'Amrlifir~inn peut etre effectuée par toute méthode connue basée sur I'élongation d'amorces pour synthétiser un DNA double brin, un DNA r . ", ~l~ln~ A; I
ou pour synthétiser un RNA transcrit. On peut utiliser par exemple des méthodes d'~-"l.1; r~ 111 qui ont été décrites ci-dessus, et dont les détails de mise en oeuvre, qui sont bien connus, ne seront pas rappelés ici.
Parmi les, ~ Oci~l, modifiés, on peut citer notamment la 5-méthyl cytidine, la N4-acétyl cytidine, la 3-méthyl cytidine, la N6-méthyl adénosine, la N6,N6-diméthyl adénosine, la l-méthyl guanosine, la N2-méthyl guanosine, la N2,N2-diméthyl guanosine, la 7-méthyl guanosine, la 3-méthyl uridine, la 5-hylllu~ylll~illyl uridine, et la l-méthyl inosine.
Les ~ ~ ;I.k-.~l.l - t~ ' de ces, l~oCi~lnc modifiés sont connus ou peuvent etrepréparés selon les méthodes connues.
Les anticorps capables de reconnaître crerifirlnrm~-nr ces ,~ o~: L s modifiés peuvent être préparés selon les méthodes connues. Il s'agit de préférence d'anticorps mnnn,rlr,nAnx Certains de ces anticorps ont déjà été décrits; voir C Reynaud et al., Cancer Letters, 255-262 (1991). Lors de la préparatiûn des anticorps mnnnrlr,n ~-lY on a constaté
qu'il est possible, de façon générale, d'obtenir des anticorps ~r~ n", IA i ~ c~,irl~lu.,lll~.llL
le nucléoside modifié. C'est ainsi que, par exemple, dans le cas des anticorps anti-5-méthyl cytidine, on a observé qu'environ 3 % des clones d'Lyl.llidulll~,s testés sécrétaient des anticorps spécifiques lccn,n,A;~"I la 5-méthyl cytidine et ne ~ pas la cytidine. De même, dans le cas des anticorps anti-~-méthyl guanosine, 4 % des clones d'hybridome testés sécrétaient des anticorps Irl nllllA ~lll le nucléoside modifié, mais pas la guanosine.
W0 96103526 2 1 9 5 4 8 0 F~l~r~ C i .. ~ , Il résulte des études effecluées que le nucléoside n, I , ' peut être utilisé
au même titre que le nucléoside ~ C~ modifié dans l'élongation d'une amorce " ~lfu~ Lorsque la séquence à amplifier ne contient qu'une faible proponion du nucléoside que l'on souhaite remplacer par l'incorporation du phosphate ~ lf~
modifié, il est possible en principe d'utiliser le nucléoside ~ ,hn~l. h,ur considéré sous forme modifiée "'';'l" ~l~ .l Toutefois, lorsque le nucléoside considéré est présent en plusieurs positions voisines dans la séquence à amplifier, I'incorporation du nucléoside , ~ , ' modifié seul peut s'avérer difficile. C'est pourquoi il est preférable en général d'utiliser, pour le nucléoside considéré, un mélange de la forme modifiée et de la forme non modifiée.
La proponion de nucléoside ~riphncrhAtP modifié par rappon à la proponion totale du nucléoside modifié et du nucléoside COIlc~lJul~d~llL non modifié, peut varier g~nP~lPn~Pnt de 10 à 100 % en moles et en particulier de 20 à 75 r~ en moles Bien entendu, lorsqu'on utilise un mélange de nucléoside modifié et de nucléoside non modifié, le produit d'~mrlifir~-inn contiendra une proponion variable du nucléoside cullG~ .d.~ sous forme modifiée et sous forme non modifiée, cette proponion dépendant de la naturc de la ~ u~ I ;u . de la séquence à amplifier et des UI~U~Liuus de 1-11.~ h -' c (modifié et non modifié) préSents lors de I~ 1 On a constaté que, pour une séquence à amplifier donnée, et pour une proponion donnée de 20 u ;I.h~l.l,~t~ c modifié et non modifié, les yluL~uldull~ respectives de " lf .~ /.s modifiés et non modifiés dans le produit d'~mplifirl~tinn sont 5,~:hl~ . ...: constantes. Il en résulte que la détection du produitd'..,~pl;li. AI;~ à l'aide d'anticorps spécifiques du nucléoside modifié permet aussi une ~ r ;I Al;~
Pour détecter les produits d'~mplifir:~tinn on utilise les anticorps spécifiques25 ,....,I;...".~ c ci-dessus. On a constaté que les anticorps préparés par ;.1.lll~ à l'aide des I .. ,- ll'nci~f c modifiés, conjugués à une protéine, sont capable de reconnaître le nucléoside modifié incorporé dans un brin de DNA ou de RNA.
Les anticorps peuvent être utilisés sous la forme d'anticorps marqués avec un agent traceur, par exemple avec une enzyme telle que p~,lu~yda;~c ou phncrh~t~ cP alcaline, 30 ce qui permet une révélation avec formation d'un produit coloré, selon les méthodes connues.
La révélation de la fixation de l'anticorps spécifique sur le produit d'~mplifir~tinn peut également être faite avec un anticorps marqué anti-immnnnglnblllinP, de facon connue. Par exemple si l'anticorps mnnorlnnAl utilisé est une IgG de souris, on 35 utilisera pour la révélation un anticorps marqué anti-IgG de souris.
La re~vélation et évPnmPllPmpnt la qll~nti~ir~tinn à l'aide d'anticorps sont desopérations bien connues dont les details de mise en oeuvre ne seront pas rappelés ici.
W096/03526 21 9 5 4 ~3 0 F~,l/r~_' .
Par ailleurs, en utilisant des amorces d~ t;r U liées, de façon connue, à
un ligand (par exemple la biotine), il est possible d'effectuer la détection et/ou la r ; r~ sur plaque de ~ u~ iu.l sur laquelle a été fixé un anti-ligand CUIIG~UIId~ (par exemple l'avidine).
S Le procédé de l'invention peut donc être utilisé notamment dzns le domaine du diagnostic médical ou dans le domaine agro-alimentaire, dans la recherche d'infections ou de ~ n~ b =- .~'. ;. .. " ,~ ~ ou virales.
Un autre intérêt du procédé d'~mrlifir:~tir~n est qu'il conduit à des produits pouvant servir à la fabrication de ~Ilul~hl~ utilisables comme agents d'~mrlifir:~tirln de 10 signal dans les méthodes d'hylJIi~liull à l'aide de sondes nucléiques~
Le principe de 1'~ ;. ", de signal est connu. Lorsque le nombre de copies du poly..uclcu~ide cible est faible, on peut, au lieu de multiplier par ~Imrlifir~ir n le nombre de copies de la cible, utiliser une sonde de détection cuu~ r~ une quantité
importante d'agent traceur, d'où une r~mrIifin~tjon de signal La sonde de détection 15 spécifique d'une cible à détecter, est greffée à un polymère sur lequel sont fixés plusieurs motifs contenant l'agent traceur Des exemples de réalisation de multimères utilisables comme réactifs d',....~ ;. ,u;~,. de signal sont décrits notamment dans les demandes de brevet EP-0317077, EP-0450594, etc~
Dans le cas où l'on souhaite utiliser le produit d'~ til~n obtenu selon le procédé d',."Il,l;l;. n;"" de la présente demande comme réactif d'amplification de signal, il convient de réaliser un multimère ~,UIII~JI~,~IO,II~ une pluralité de motifs constitués par le produit d',.~ t;. .11 et au moins un motif poly~ u~ r capable de s'hybnder avec un polylIu"l~ide d'intérêt Dans ce cas, la séquence du produit d'~mrIif natinn peut être ~ il suffit qu'elle ne soit pas capable de s'hybrider avec le ~olyuu~,lcu~id~, cible~
On peut réaliser le réactif ~ de signal par exemple sous la forme d'un polymère portant en r~ -nifir~tir,n une pluralité de séquences . . ~ u~ s dans lesquelles est incorporé le nucléoside modifié On peut préparer de façon connue des polymères portant des l~ f _1;~ en fourchette, en peigne, etc; voir par exemple les demandes de brevet ~ F'F ~ ci-dessus.
Le réactif d'~lplirl~ iull de signal contenant ainsi de nombreuses molécules du nucléoside modifié, la détection à l'aide d'anticorps Ir~ r~;r.I." .". .1l Ie nucléoside modifié, conduira à l'obtention d'un signal d'intensité élevée.
L'invention a donc également pour objet l'utilisation d'un produit d~ - pouvant être obtenu selon le procédé d',, . . ,l-l; r;- A ~ décrit ci-dessus.
Cette utilisation consiste en la préparation, de façon connue en soi, d'un multimère CUIII~IIGIICII~ une pluralité de motifs constitué par ledit produit d'~ ,.l~l;l';~ - ;r". et au moins W0961035~6 2 1 95480 r~l/rl ~
un motif poly~ k U~ Ir capable de s'hybrider avec un polylluulcuLid~ d'intérêt.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps dans la détection et/ou la .~ r~ selon une méthode connue en soi~ d7un produit d~d~ l; r~
obtenuselonleprocédédécritl.,l~.~'.l. ,-.. -.l oudansladétectionet/oula~ ,;ri~ l;.. .
selon une méthode connue en soi, d'un multimère pouvant être obtenu comme décritci-dessus. Iedit multimère étant hybridé avec ledit poly..u.,l~"iu~ d'intérêt. Cette utilisation est ~ par le fait que l'anticorps utilisé est un anticorps capable de ~uO~ le nucléoside modifié sans l~uo~ ûLl~i le nucléoside c~ non modifié.
L'exemple suivant illustre l'invention.
EXEMPLE 1: Amplification du ~énome du virus d'Epstein-Barr (I~BV) a) Amorces On a synthétisé deux amorses situées aux extrémités d'un segment de 186 paires de bases choisies dans la région BamHIW du génome d'EBV qui est une région hautement conservée parmi les différentes souches d'EBV. Chaque amorce a été
biotinylée à l'extrémité 5' lors de la synthèse selon la méthode décrite par P.R. Langer et al., P.N.A.S. USA Vol. 78 n~ 11, 6633-6637 (1981).
Les séquences des amorces sont les suivantes:
Amorce 1: 5' TTT GTC CCC ACG CGC GCA TA 3' Amorce 2: 5' AGG TGG CGT AGC AAC GCG AA 3' La position de ces amorces par rapport à la région BamHIW du génome d'EBV
25 est décrite dans l'article de R Griffais et al., Nucleic Acids Research, Vol. 19, n~ 14, 3887-3891 rl991~
b) Pr.,~ Liu,. de la rnatrice de DNA
On utilise des sellules de Iymphome de Burkitt de la lignée Namalwa, qui possèdent le DNA d'EBV intact dans un ulllulllOaolllc; voir Matsuo et al., Science ~, 1322-1325 (1984) et Gargano et al., Genes Chrom. Cancer, 4, 205-210 (1992). En fait, il a été montré que deux genomes d'EBV sont intégrés sur un site connu du .,I,lu,uoauu.e l;
voir Lawrence et al., Cell ~, 51 -61 (1988).
Les cellules sont Iysées par la soude de façon connue.
Des dilutions en série des Iysats cellulaires sont préparées et utilisées comme wo 96/035Z6 . 2 1 9 5 4 8 0 r~llr~ ~
matricGs pou} I' ~mrlifir~rinn selon la méthode PCR.
c) A~ l;r~ iu~
Des fractions aliquotes de Iysats cellulaires (lû microlitres) sont ajoutées à 100 1 d'une solution tampon contenant 50 mM KCI, 10 mM HCI (pH 8,4) 1,5 mM MgCI2, 100 }Ig/ml de gélatine, 200 uM de chacun des nnrlPocifiPc hirhncrh~tPC dATP, dTTP et dGTP, 40 IIM de dCTP, 40 ,lLM de 5-méthyl dCTP (ci-après: 5-MedCTP) (Boehringer Mannheim) 0,5 ,uM de chaque amorce et 1 unité de Taq polyll.~
On utilise un appareil LL~,llllouy~ l Perkin-Elmer 180.
Les cycles sont ~)IU~;Ia.lllll.l~S de la facon suivante:
- 1 cycle consistant en 10 minutes à 9g~C, 2 minutes à 62~C et 2 minutes à
72~C, - puis 35 cycles consistant en 30 secondes à 95~C, 1 minute à 62~C et 2 minutes à 72~C.
A la fin de l'opération les érh~ntillnnc sont maintenus pendant 5 minute à 72~C.
d) (';~ r. ' 2û On soumet des parties aliquotes (10 ~,11) de chaque produit d'~mrlifir~rinn à une uu~Jhu~u~i sur gel d'agarose (3 % d'agarose NueSieve et 1 % d'agarose SeaKem).
Après migration, on visualise le DNA par ~ s~ du bromure d'ethidium sous irradiation UV.
Le DNA est ensuite transféré sur des ",. .",l" .1~. s de nylon (Hybond N+, Amersham Iu~ul,latiullGl).
Pour vérifier la spécificité des produits d'~mplifir~tinn on a effectué une hybridation avec une sonde de détection marquée à la (lignxigPninr et capable des'hybrider avec une séquence d'un brin de DNA située à l'intérieur de la séquence encadrée par les amorces 1 et 2, On a obtenu cette sonde de détection par PCR, en présence de nnrlpnci~l~c trirhocrh~c et d'un dUTP marqué à la ~lignxif.~Pninl (riignxig~nin 1 I dUTP - Boehringer Mannheim), avec les amorces suivantes:
- amorce 3: 5' CCA ~GA AGC GGG TCTATG 3' - amorce 4: 5' CCT TTG GTG AAG TCA CAA ACA 3'.
On obtient ainsi un amplimère de 106 .luclc'uLidc s dont la séquence est inclusedans la séquence de 186 m~rlP.nhrl.-c amplifiée ~,.éc~.l...,"~....l On a vérifié que la sonde ainsi obtenue s'hybride crPrifir~ m~ nt avec les W0961035~6 2~95480 r~llrl rl g produits d'~mplifir.~a~inn PCR obtenus en c) ci-dessus. La révélation de la sonde hybridée marquée à la rlignxig~.nin~. est effectuée à l'aide d'anticorps anti-rli~nxig~nin~ conjugués à
la phncrhoroc~. alcaline, en présence de N8T/X-phosphate qui fournit un précipité bleu (kit de detection d'acides nnrl~irlllr c, Boehringer Mannheim).
e) T~ .u"o~ e~ l;u., de la 5-méthYI cytidine L'incorporation de S-méthyl cytidine dans le DNA amplifié a été démontrée de la fa,con suivante.
Après ~lc~,LIu~llolè~,, puis transferts sur mr mhr~lnr c de nylon comme mentionné ~ , les, ...., .l ,..."r; sont immergées pendant 30 minutes dans une solution à 0,5 ~o de réactif bloquant (Boehringer Mannheim) dilué dans un tampon TRIS
0,05 M pH 7,4.
Les m-mhr~nr-s sont lavées trois fois avec du PBST (tampon phosphate contenant 0,2 % de Tween 20) puis on laisse incuber pendant une heure à L ~ ' n ~ r ambiante avec un anticorps mnnnr lnn~l anti-5-méthyl cytidine. L'anticorps ,." ".o~l. . ~l est celui décrit par C. Reynaud et al., Cancer Letters, Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd, 255-262 (1991). La solution d'anticorps est un surnageant non dilué de culture d'hybridome contenattt entre 10 et 15 ,ug/ml d'antico~ps. Les mr mhr~nr s sont ensuite iucubées pendant une heure à tC.11~)61~11111C ambiante avec des anticorps de chèvre anti-IgG
(H+L) de souris conjugués à la .1~ u~y~sC et purifiés par ul~ U~ h;~ d'affinité
(Biorad T -' -). On lave à nouveau trois fois avec du PBST puis on rince avec dut;~mpon phosphate (PBS).
On ajoute alors le substrat (60 ml d'une solution de 4-chloro-1-naphtol à 0,3 %
dans le méthanol, dans 100 ml de tampon phosphate contenant 0,02 % de peroxyde d'hydrogène) et on laisse incuber à ~eul~ ul~ ambiante pendant 30 minutes.
f) P-C~r~U~IL;UII de l~dwu~lauu~,s _ _ On utilise des plaques de microtitrat;on en polystyrène carboxylé; référence:
Niveleau et al. J. Immunol. Methods, 15g, 177-189 (1993).
On ajoute dans chaque puits 100 ul d'une solution à 10 llg/ml de chlorhydrate de N-(3-dill~ ylallli~lul~lu~yl)-N'-~Lllyl~ulJodiilllide (Merck) dilué dans du tampon phosphate pH 7,2. Après 10 minutes à t~,ul~ Lulc ambiante, on ajoute dans chaque puits ID0 ,ul d'une solution à 1011glml d'avidine (Sigma) dans un tampon phosphate de pH 7,2.
Au bout d'une heure, les plaques sont lavées avec du tampon phosphate pH 7,2 contenant 0,05 1Yo de Tween 20, puis lavées 3 fois avec du tampon phosphate.
wo 96io3s26 2 1 9 5 ~ 8 0 1 ~I/r Les produits d' , ' ' dénaturés par la chaleur sont ajoutés à raison de 50 ,ul par puits. Après 15 minutes à t~ ,laLul;i ambiante, les puits sont lavés 3 fois par du PBST. On ajoute alors 50 1ll de la solution d'anticorps mr,nr,rlrn~ll anti-5-méthyl cytidine (sumageant de culture d'hybridome). On laisse incuber pendant 30 minutes à t~ alulc ambiante puis on lave 3 fois avec du PBST contenant I % de sérum albumine bovine(PBST-BSA).
On ajoute ensuite 50 ~d d'anticorps de chèvre anti-IgG (H+L~ de souris conjugué à la pw~yddsc (Biorad Laboratories). Après 30 minutes à Lc.iliu~,.d~u.cambiante, on rince 3 fois avec du PBST-BSA puis on ajoute le substrat de la p~,.u~-y-la~;
qui est la 3,3',5,5' t~lal~ llyl- benzidine, en solution dans le dimé~l.yl~
mélangé à 10 9'o (en volume) de peroxyde d'hydrogène. 100 ~LI de ce mélange sont ajoutés dans chaque puits et on laisse incuber à ~ ,la~UIC ambiante pendant 17-20 minutes, jusqu'à ce qu'une coloration bleu intense du produit de réaction apparaisse. La réaction est stoppée par addition d'acide sulfurique lN (100 Izl par puits). La densité optique à 655 nm estmesuréepar~ uu~ lll3;l;e Résultats . _ = . .=. ==._ . = . = =.== ==--_ - = = ~ = --- - =
Les dilutions en série de 10 en 10 du DNA d'EBV qui ont été utilisées comme matrices dans l~al ~ ; r~ par pcR~ l e~ ,l de 2 à 20.000 copies du génome d'EBV.
On a comparé les résultats d~ ; r~ ,-l l par PCR, effectuée comme en c) ci-dessus, avec un mélange de dCTP et de 5-MedCTP et des amorces biotinylées, et les rcsultats d'llmrlifir~itir,n par PCR effectuée de façon classique avec NTP non modifiés et amorces non biotinylées.
Les produits d~mrlifir~tirln ont été analysés par cle~ uiuhu.c~e sur gel d'agarose et visualisés par nuul.,S.~ c du bromure d'éthidium sous irradiation ultraviolette. L'analyse en eL",~uiullulc~, montre que dans lesdeux cas les DNA amplifiés ont les tailles attendues, d'après les distances de migration. La sensibilité de la réaction, déterminée par l'intensité de la ~ w~c~u~ sur le gel, atteint 200 molécules cibles de DNA, aussi bien avec la PCR selon l'invention qu'avec la PCR classique.
Par ailleurs, à titre de c~ uilla;~ull, les produits d'amplification obtenus parPCR classique ont été analysés avec la sonde spécifique conjuguée à la ~ligrl~ig~-ninp (obtenue en d) ci-dessus), par hybridation de Southern et révélation avec un anticorps anti--1igo~riprninr (Boehringer Mannheim). La sensibilité de la réaction atteint 20 molécules de DNA cible.
W0 96~03526 2 1 9 5 4 8 0 F~ r~ .
On a analysé le produit d'amplifir~tinn PCR selon l'invention d'une part après c'lc.~,llu~l~wè~ et transfert de Southern (voir e) ci-dessus) et d'autre part sur plaque de microtitration revêtue d'avidine (voir f~ ci-dessus).
- Dans le premier cas (c~le~,LIu~Lolci~, et transfert de Southern) le produit S d',.,,,l,l;l;.~i.,,,estdénaturéparlasoudeetoneffectueladétectionàl'aidedel'anticorps " ~""-~rl- l"~l allti-s Mec~ dorlt la fixatioll est révélée comme illdiqué ~ par un anticorps anti-IgG de souris, marqué à la ~ u~ydaac. Le seuil de sensibilité de la méthode est alors de deux molécules de DNA cible.
Lorsque l'analyse est faite par dépôt du produit d'"" .~ sur plaque de ~ ,luLiLlaLiull revêtue d'avidine, et détection à l'aide de l'anticorps mnnnrlnn~l anti-S
MeC comme ~ c~.l, .n .. ,. a on a trouvé que le seuil de détection est cette fois inférieur à
deux molécules de DNA cible.
L'intensité du signal augmente avec la quantité de produit d'amplification, ce qui permet la qn~ntifir~tinn 2û
3û wo s6l03s26 2 1 9 5 4 8 0. ~ I / rs ~
Process for ~ "" ~ l; r ~; Illl of nucleic acid using a modified nucleoside ~, and detection of the product o ~ I ~ 1; ri, ~ n using anticorPs.
The subject of the invention is a method of ~ qmpliflrqfif ~ n of an acid sequence nucleic acid using a nucleoside n; 1 ~,; 3 n with a purine base or IJ ~ Iilllidi ~ U ~;
modified which is incorporated into the strands of born nucleic acid, o ~ yulh ~, Li ~ fi during the operation of, qmplifir, qtinn Using antibodies Irc ~, I, é ~; r "l" ~ f .n Ia base modified, it is possible to detect and / or quantify the product of A ~ l ~ I, l; laughed. Al;, He, In addition, the product of, qmplif r -qtinn can be used in the preparation of IllulLhll ~, .ra containing several copies of the amplified sequence with modified base, and further containing at least one specific sequence of a sequence of interest. Such multimer can be used for detection and / or qnslltifif Ation of a sequence poly..ucléo ~ ue ~ "1 ~ ~, avec, .. ,, I, l; ri,, ni ~", du signal.
It is known that the methods of re ~ in vitro by cIlLylll ~ lLi ~ l ~, have for 15 goal n ~ - n ~ ~ ~ ld ~ obtain a large number of copies of ~ a sequence of ~ a poly ~ lé ~ v ~ idr present in a sample in small quantities, without the need to isolate and clone said poly..u., lc'vLide.
The method of ~, 1; ri, ~ I; I II I by CIIL, ~ IIIr ~ UC which was described first estl '~ ,, lll; ri, r ~ ill ,, enchâîneparpolylll ~ plusconnuesousla ~ signqri ~ npcR
~ Polymerase Chain Reaction). In this ~ e method, we use two primers f) ~ l lr '~, l; ~ l;, l, l ~ ~ each of which is c ~ 5 ~, n ~ ;, r of a segment of one of the strands of a DNA containing the sequence to be amplified, so that said segments frame said sequence, After heating to denature the DNA, the primers hybridize with their sequence f ~ n ~; ' r and, in the presence of a DNA polyIl ~., th ~ .tmf) ct, qhll- and 25 ~, rl ~ n ~ ~ lf. ~ '~ Rr ~' in excess, a strand of DNA, ~ r of the template strand is synthesized by elongation from the 3 'end of the hybridized primer. The mixture is then denatured again by heat, and at rcfrflirl; cc ~ m ~ -nt the primers hybridize on DNA strands originally present or newly synthesized, a new extension of the primers takes place, and so on. These successive cycles of a ~, uI ~, .lL des primers, elongation and ~ f'.lU ~ ll lead to an ~ onhlr ~ mrnt copy number of the sequence of interest in each cycle.
A method analogous to PCR, called RT-PCR consists in using as starting product to amplify an RNA, the method then comprising a prior step of nq "~"'reverse of RNA into DNA ~ l.k'., ~ alA; Ir This method is useful IlOL ~ lllllll ~, ~ l. when the target is the genome of a retrovirus or when the target is used a messenger RNA to avoid amplifying the introns.
W096 / 03526. 21 95 480 I ~ l / r ~
.
Various other methods of A ", I, l; ri. ~ Have been described ~ and nr ~ Ammrnr those which consist in using a primer containing an RNA promoter sequence puly "~ CG ~ f ,, so as to obtain by elongation a double strand of DNA of which the;
in the presence of RNApolyu, C. ~ O will lead to the production of several dozen copies, in the form of transcribed RNA which can enter the cycle of ~; r ~ The method comprises a n ~ inverse of the RNA to form an L ~ Lf'ludu ~ A DNA-RNA, then the d ~; u ~ l of the kf'tf'.ull "~ formed, hybridization of a primer on the strand DNA and extension of the primer, followed by the n .. "~ l; r .., of the double strand obtained, and so right now. The RNA strands formed l ~ f '~ .., .... I can each give rise to a 10 double strand of DNA which can in turn be transcribed.
One of the disadvantages of l.u '~ rC methods is the need to denature the duplexes. This operation which is done gf'n ~ r llrmrnt to i ~, ul ~ CIalul ~; greater than 90 ~ C, requires the use of enzymes ll ,. .. ", .., ~ -hlf.5 To avoid the steps of .I ~" ,, n; "", we have devised methods of pl; ril A l; l ll l can be used in an isothermal manner.
15 An isothermal method consists in starting with a target RNA sequence and a primer of DNA.Using a ~,; IOA ~ r reverse, we obtain a h ~ iC ~ ullu ~, A RNA-DNA. Through the action of a rihnln.lrl ~ Acf hydrolyses the RNA. Single strand DNA is transformed into double strand by elongation of a suitable primer in the presence of DNApol ~ ... '~ a ~ c.
The double stranded DNA obtained can then be transcribed and several copies of the 20 target RNA which can in turn enter the cycle of ~; r ~ Another method isotherm is to use the 1, l f., .., ..? m of ~ If ~ .. I of strand using two primers capable of hybridizing with the same strand of target nucleic acid: the product elongation of a first primer located on the 5 ′ side relative to a second primer, displaces the extension product of the second primer which is thus released in the form of 25 single strand, while the extension product of the first primer forms a duplex with the starting target strand. The single strand thus formed can in turn enter a cycle of i., .. ll; ri. -,; ..., using a similar system of two primers. In addition, the first primer may contain on the S 'side, relative to the site of ~ A; ~, r of the target, a site of Ir ~ r .. ~ A ". e for an RNA ~ ulyul ~ lf ~ s ~, or for a restriction enzyme, which 30 allows to use different channels for the cycle of ~ A ~ r ~ iu ~ l; see Ep-os4 36l2 ~
All specialists in the field believe that the techniques of ampli are called upon to play a role rr ~ nci ~ l ~ rAhlr in particular in the diagnosis of infections or ~ ,, IA, I.;,. ~ L; r ~ nc b- ~ n ~ fs or viral.
There is therefore a need for simple and rapid techniques allowing a 35 4u ~ liv ~ evaluation of ~ 1 products; r ~ to replace techniques élle ,, LIul.LfJl ~ st on gel and transfer to membrane (blotting). The most sensitive Artl.rllrm ~ nt consist in using a nucleoside n; I, lm, ~ modified, namely a W096103526 2 1 9 5 4 8 0 Pu ~. ~ Sun df, ~ yuu; Ih-c i, ',' (dUTP) biotinylated or a dUTP linked to the riign ~ figfnin ~ Les A. products. , 1.1; rh ~ 1; u ~ I containing the modified nucleotide are detected or quantified by a avidin-enzyme conjugate in the first case and with an antibody l. ~ o ~
anti-rlignxi ~ ninP in the second case.
We have now discovered that it is possible to implement the methods of ~ f ~ using a nucleoside ~, or NTP (NTP also designating here well a dCsv, .y- there). . ~ lf.n ~ iriP. I ~ h ~ hr lr que rihnmlrlP.nci ~ 1P l I; I ~ h ~ I IAtI.) Whose base purique or ~ yliullidi ~ is modified by a ~ l lh ~, simple such as, "h ~ l; n. l;. l.
by a ~ ilvu ~, .- l., llL methyl, LYIIIV ~ YII ~ CL ~ or acetyl. We discovered that NTPs modified can be used by polymerases to synthesize new copies in vitro of an mlrlP'ntirlirlllP matrix, without loss of efficiency. With antibodies which ~ r ~ l..lllA; ~ ..
~ 14. ; r ~ l .. 1l a nucleoside with a modified base and which does not .c ~ a nucleoside containing said base in unmodified form, it is thus possible to detect a sequence of interest of interest in which the modified nucleoside has been incorporated. Furthermore, so : ~ UUJJI;,. I ~ UI ~ "the detection technique with antibodies directed against these l. ~ Lfn modified ~ rll Licul; ~ is ~ as we will see in the part ~ f ~ lP, below, significantly more sensitive than conventional detection techniques using a conjugate viL. ~ cc .. ~ .ylllc (when using biotinylated primers) or using the system rlignxig ~ ulLicullJs anti-riignxigrp ~ ninp : The invention therefore relates to a process of Allllll; rh ~ 1 ;. . ~ by way Cl ~ yll ~ dLi Luc, of a sequence nnrlf.otirlirlnP, in which one puts in contact a pol ~ .luclcvLidc containing said sequence, primers nlignn ~ rlPotirlirlnPc, l ~ lfc. ~ l.}. - ~ and / oudC ~ v ~ y ~ foc ~ u; l.hn ~ containing the various purine bases and ~ Jyfillli ~: liclu., i, necessary for the synthesis of the product d ~ mrlifir ~ tinnl and a ymatic system having DNA polymerase and / or RNA polymerase and / or IIAII activity. 1; l, 1 ~. reverse, ~ Under conditions making it possible to perform, in a way known in itself, a nrlifinAtinn of said sequence of interest, characterized in that one of said 1111 ~ lfnci.lr s U; IIh. ~ IIAt ~., And / or dCio ~ y, -., llf.o ~: ~ lrsuil.h ~ .hAI.cestpésentsoisitsuneunemoditée, ieàlafoissous a modified form and in an unmodified form, and that in said form modified, the base ~ yfi ~ llidi ~ luc or purine is substituted by at least one ~ luulJ ~ uL
metbyle, hy ~ llu ~ ylllC, .llyl or acetyl.
The invention also relates to a method of nmrlifrAtinn of a sequence mlrlP.otirli-lnP ~ and detection and / or ~ u; ri. Alinn of the product of nmrlifrAtinn in which, we put in contact a polyl, .. ~ lévLidc containing said sequence, primers nli ~; ... ", nlf. ~". c, les ~ lnlfnc.rlr. ~ trirhncrhAtps and / or dC ~ v; ~ yl ~ rlf ~ lsu; I hl ~ l ~ h w0 96/03526 2 ~ 9 5 4 ~ 0. ~
containing the various purine bases and ~ yliulidiu, u ~ .s necessary for the synthesis of the product d ~ r ~ l and an ul ~ yll ~ dLiu, uG system having DNA polymerase activity and / or poly- ~ RNA, and / or inverse C ~, under conditions making it possible to carry out, in a manner known per se, a ~; ~ AmrlifirAtinn of said sequence of interest, characterized by the fact that one of said, lll ~ lfn ~: ~ l; s ~ n ~ llhAt ~ setlou d6su, -yl "l ~ 1. if ~. '.' is present either in a modified form or at the same time in a modified form and in an unmodified form, and that in said form modified, the pyrimidine or purine base is substituted by at least one ~ luuy ~ llL
10 methyl, hyd ~ u ~ y ~ Ie or acetyl, and that the product d ~ lkr ~ A ~; nll ~ is detected and / or quantified according to methods known per se, using an antibody Ir ~ ,,, lA; ~ A, ll crcrifi ~ lnl mrn ~ Said nucleoside modified and does not ~ cc .. ", lAi not said nucleoside unmodified.
The Amrlifir ~ inn can be performed by any known method based on Elongation of primers to synthesize a double stranded DNA, a DNA r. ", ~ l ~ ln ~ A; I
or to synthesize a transcribed RNA. We can use for example methods d ~ - "l.1; r ~ 111 which have been described above, and whose implementation details, which are well known, will not be recalled here.
Among the, ~ Oci ~ l, modified, there may be mentioned in particular 5-methyl cytidine, N4-acetyl cytidine, 3-methyl cytidine, N6-methyl adenosine, N6, N6-dimethyl adenosine, l-methyl guanosine, N2-methyl guanosine, N2, N2-dimethyl guanosine, 7-methyl guanosine, 3-methyl uridine, 5-hylllu ~ ylll ~ illyl uridine, and l-methyl inosine.
~ ~; Ik-. ~ Ll - t ~ 'of these, l ~ oCi ~ lnc modified are known or can be prepared by known methods.
Antibodies capable of recognizing crerifirlnrm ~ -nr ces, ~ o ~: L s modified can be prepared according to known methods. These are preferably antibodies mnnn, rlr, nAnx Some of these antibodies have already been described; see C Reynaud et al., Cancer Letters, 255-262 (1991). During the preparation of mnnnrlr antibodies, n ~ -lY we found that it is possible, in general, to obtain antibodies ~ r ~ n ", IA i ~ c ~, irl ~ lu., lll ~ .llL
the modified nucleoside. This is how, for example, in the case of antibodies anti-5-methyl cytidine, it was observed that approximately 3% of the clones of Lyl.llidulll ~, s tested secreted specific antibodies lccn, n, A; ~ "I 5-methyl cytidine and did not ~ not cytidine. Similarly, in the case of anti-~ -methyl antibodies guanosine, 4% of the hybridoma clones tested secreted Irl nllllA ~ lll antibodies modified nucleoside, but not guanosine.
W0 96 103 526 2 1 9 5 4 8 0 F ~ l ~ r ~ C i .. ~, It follows from the studies carried out that the nucleoside n, I, 'can be used in the same way as the nucleoside ~ C ~ modified in the elongation of a primer "~ lfu ~ When the sequence to be amplified contains only a weak proponion of nucleoside that we want to replace with the incorporation of phosphate ~ lf ~
modified, it is possible in principle to use the nucleoside ~, hn ~ l. h, ur considered under modified form "'';'l" ~ l ~ .l However, when the nucleoside considered is present in several neighboring positions in the sequence to be amplified, the incorporation of the nucleoside , ~, 'modified alone can be difficult. This is why it is generally preferable to use, for the nucleoside considered, a mixture of the modified form and of the form not modified.
The nucleoside proponion ~ riphncrhAtP modified compared to the proponion total of modified nucleoside and COIlc ~ lJul ~ d ~ llL unmodified nucleoside, may vary g ~ nP ~ lPn ~ Pnt from 10 to 100% in moles and in particular from 20 to 75 r ~ in moles Of course, when using a mixture of modified nucleoside and unmodified nucleoside, the product of ~ mrlifir ~ -inn will contain a variable proponion of nucleoside cullG ~ .d. ~ in modified form and in unmodified form, this proponion depending on the naturc of the ~ u ~ I; u. of the sequence to be amplified and UI ~ U ~ Liuus from 1-11. ~ H - 'c (modified and not modified) present during I ~ 1 On found that, for a given sequence to be amplified, and for a given proponion of 20 u; Ih ~ ll, ~ t ~ c modified and unmodified, the respective yluL ~ uldull ~ of "lf. ~ /.S modified and unmodified in the product of ~ mplifirl ~ tinn are 5, ~: hl ~. ...: constants. The result that the detection of the product of .., ~ pl; li. AI; ~ using nucleoside-specific antibodies modified also allows a ~ r; I Al; ~
To detect the products of ~ mplifir: ~ tinn the specific antibodies are used25, ...., I; ... ". ~ C above. It was found that the antibodies prepared by; .1.lll ~ à ugly modified I .., - ll'nci ~ fc, conjugated to a protein, are able to recognize the modified nucleoside incorporated into a strand of DNA or RNA.
Antibodies can be used in the form of antibodies labeled with a tracer agent, for example with an enzyme such as p ~, lu ~ yda; ~ c or phncrh ~ t ~ alkaline cP, 30 which allows a revelation with the formation of a colored product, according to the methods known.
Revealing the binding of the specific antibody to the product ~ mplifir ~ tinn can also be made with a labeled anti-immnnnglnblllinP antibody, in a known way. For example if the antibody mnnorlnnAl used is a mouse IgG, we 35 will use for detection a labeled anti-mouse IgG antibody.
The re ~ vvelation and évPnmPllPmpnt the qll ~ nti ~ ir ~ tinn using antibodies are well known operations whose details of implementation will not be repeated here.
W096 / 03526 21 9 5 4 ~ 3 0 F ~, l / r ~ _ ' .
Furthermore, by using primers d ~ t; r U linked, in a known manner, to a ligand (for example biotin), it is possible to carry out detection and / or r ; r ~ on a plate of ~ u ~ iu.l on which an anti-ligand has been fixed CUIIG ~ UIId ~ (e.g. avidin).
The process of the invention can therefore be used in particular in the field of medical diagnosis or in the food industry, in the search for infections or of ~ n ~ b = -. ~ '. ;. .. ", ~ ~ or viral.
Another advantage of the ~ mrlifir: ~ tir ~ n process is that it leads to products can be used for the manufacture of ~ Ilul ~ hl ~ usable as agents of ~ mrlifir: ~ tirln de 10 signal in hylJIi methods ~ liull using nucleic probes ~
The principle of 1 ~;. ", signal is known. When the number of copies poly..uclcu ~ target ide is weak, we can, instead of multiplying by ~ Imrlifir ~ ir n the number of copies of the target, use a detection probe cuu ~ r ~ a quantity significant tracer agent, hence a signal r ~ mrIifin ~ The detection probe 15 specific to a target to be detected, is grafted to a polymer to which several patterns containing the tracer Examples of realization of multimers usable as reagents of, .... ~;. , u; ~ ,. signals are described in particular in patent applications EP-0317077, EP-0450594, etc ~
In the case where one wishes to use the product of ~ til ~ n obtained according to the method of,. "Il, l; l ;. n;""of the present application as a signal amplification reagent, it is necessary to make a multimer ~, UIII ~ JI ~, ~ IO, II ~ a plurality of patterns constituted by the product of,. ~ t ;. .11 and at least one poly ~ u ~ r pattern capable of hybridizing with a polylIu "l ~ ide of interest In this case, the sequence of the product of ~ mrIif natinn can be ~ it is enough that it is not able to hybridize with the ~ olyuu ~, lcu ~ id ~, target ~
We can realize the signal reagent ~ for example in the form of a polymer bearing in r ~ -nifir ~ shooting, n a plurality of sequences. . ~ u ~ s in which incorporates the modified nucleoside can be prepared in a known manner polymers bearing l ~ f _1; ~ in a fork, comb, etc; see for example the Patent applications ~ F'F ~ above.
The signal signal reagent ~ lplirl ~ iull thus containing many molecules of the modified nucleoside, detection using antibodies Ir ~ r ~; rI ".". .1l Ie modified nucleoside, will lead to obtaining a high intensity signal.
The invention therefore also relates to the use of a product d ~ - obtainable by the process of ,,. . , ll; r; - A ~ described above.
This use consists in the preparation, in a manner known per se, of a multimer CUIII ~ IIGIICII ~ a plurality of patterns consisting of said product of ~, .l ~ l; l '; ~ -; r ". And at least W0961035 ~ 6 2 1 95 480 r ~ l / rl ~
a poly ~ k U ~ Ir motif capable of hybridizing with a polylluulcuLid ~ of interest.
The invention also relates to the use of an antibody in the detection and / or the. ~ r ~ according to a method known per se ~ d7un product d ~ d ~ l; r ~
obtained according to the described procedure., l ~. ~ '. l. , - .. -.l oudansladétetet / oula ~,; ri ~ l; ...
according to a method known per se, of a multimer obtainable as described above. Said multimer being hybridized with said poly..u., The ~ "iu ~ of interest.
use is ~ by the fact that the antibody used is an antibody capable of ~ uO ~ the modified nucleoside without the ~ uo ~ ûLl ~ i the nucleoside c ~ no amended.
The following example illustrates the invention.
EXAMPLE 1 Amplification of the ~ enome of the Epstein-Barr virus (I ~ BV) a) Primers We synthesized two amors located at the ends of a segment of 186 base pairs chosen from the BamHIW region of the EBV genome which is a region highly conserved among the different EBV strains. Each primer has been biotinylated at the 5 'end during synthesis according to the method described by PR Langer and al., PNAS USA Vol. 78 no. 11, 6633-6637 (1981).
The primer sequences are as follows:
Bait 1: 5 'TTT GTC CCC ACG CGC GCA TA 3' Primer 2: 5 'AGG TGG CGT AGC AAC GCG AA 3' The position of these primers relative to the BamHIW region of the EBV genome 25 is described in the article by R Griffais et al., Nucleic Acids Research, Vol. 19, n ~ 14, 3887-3891 rl991 ~
b) Pr., ~ Liu ,. from the DNA producer Saddles of Burkitt's Lymphoma of the Namalwa line are used, which have intact EBV DNA in a ulllulllOaolllc; see Matsuo et al., Science ~, 1322-1325 (1984) and Gargano et al., Genes Chrom. Cancer, 4, 205-210 (1992). In fact, he been shown that two EBV genomes are integrated on a site known from., I, lu, uoauu.el;
see Lawrence et al., Cell ~, 51-61 (1988).
The cells are lyzed with sodium hydroxide in a known manner.
Serial dilutions of cell lysates are prepared and used as wo 96 / 035Z6. 2 1 9 5 4 8 0 r ~ llr ~ ~
matricGs pou} I ~ mrlifir ~ rinn according to the PCR method.
c) A ~ l; r ~ iu ~
Aliquots of cell lysates (10 microliters) are added to 100 1 of a buffer solution containing 50 mM KCI, 10 mM HCl (pH 8.4) 1.5 mM MgCI2, 100} Ig / ml gelatin, 200 μM of each of the nnrlPocifiPc hirhncrh ~ tPC dATP, dTTP and dGTP, 40 IIM dCTP, 40, lLM 5-methyl dCTP (hereafter: 5-MedCTP) (Boehringer Mannheim) 0.5, uM of each primer and 1 unit of Taq polyll. ~
We use a device LL ~, llllouy ~ l Perkin-Elmer 180.
The cycles are ~) IU ~; Ia.lllll.l ~ S in the following way:
- 1 cycle consisting of 10 minutes at 9g ~ C, 2 minutes at 62 ~ C and 2 minutes at 72 ~ C, - then 35 cycles consisting of 30 seconds at 95 ~ C, 1 minute at 62 ~ C and 2 minutes at 72 ~ C.
At the end of the operation the erh ~ ntillnnc are maintained for 5 minutes at 72 ~ C.
d) ('; ~ r.' 2. The aliquots (10 ~, 11) of each product of ~ mrlifir ~ rinn are subjected to a uu ~ Jhu ~ u ~ i on agarose gel (3% NueSieve agarose and 1% SeaKem agarose).
After migration, the DNA is visualized by ~ s ~ of ethidium bromide under UV irradiation.
The DNA is then transferred to ",..", L ".1 ~. S of nylon (Hybond N +, Amersham Iu ~ ul, latiullGl).
To check the specificity of ~ mplifir ~ tinn's products, we carried out a hybridization with a detection probe labeled with (lignxigPninr and capable of hybridizing with a sequence of a DNA strand located inside the sequence framed by primers 1 and 2, This detection probe was obtained by PCR, in the presence of nnrlpnci ~ l ~ c trirhocrh ~ c and a dUTP marked with ~ lignxif. ~ Pninl (riignxig ~ nin 1 I dUTP - Boehringer Mannheim), with the following primers:
- primer 3: 5 'CCA ~ GA AGC GGG TCTATG 3' - primer 4: 5 'CCT TTG GTG AAG TCA CAA ACA 3'.
This gives an amplifier of 106 .luclc'uLidc s whose sequence is included in the sequence of 186 m ~ rlP.nhrl.-c amplified ~, .éc ~ .l ..., "~ .... l It has been verified that the probe thus obtained hybridizes crPrifir ~ m ~ nt with the W0961035 ~ 6 2 ~ 95480 r ~ llrl rl g ~ mplifir. ~ a ~ inn PCR products obtained in c) above. The revelation of the hybrid probe marked with rlignxig ~ .nin ~. is carried out using anti-rli ~ nxig ~ nin ~ antibodies conjugated to the phncrhoroc ~. alkaline, in the presence of N8T / X-phosphate which provides a blue precipitate (kit acid detection nnrl ~ irlllr c, Boehringer Mannheim).
e) T ~ .u "o ~ e ~ l; u., 5-methYI cytidine The incorporation of S-methyl cytidine into amplified DNA has been demonstrated by the fa, next con.
After ~ lc ~, LIu ~ llolè ~ ,, then transfers to mr mhr ~ lnr c of nylon as mentioned ~, the, ...., .l, ... "r; are immersed for 30 minutes in a 0.5 ~ o solution of blocking reagent (Boehringer Mannheim) diluted in TRIS buffer 0.05 M pH 7.4.
The m-mhr ~ nr-s are washed three times with PBST (phosphate buffer containing 0.2% Tween 20) and then incubated for one hour at L ~ 'n ~ r ambient with an antibody mnnnr lnn ~ l anti-5-methyl cytidine. The antibody,. "" .O ~ l. . ~ l is that described by C. Reynaud et al., Cancer Letters, Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd, 255-262 (1991). The antibody solution is an undiluted culture supernatant of hybridoma containing between 10 and 15, ug / ml of antico ~ ps. The mr mhr ~ nr s are then iucubated for one hour at tC.11 ~) 61 ~ 11111C ambient with goat anti-IgG antibodies (H + L) of mice conjugated to .1 ~ u ~ y ~ sC and purified by ul ~ U ~ h; ~ affinity (Biorad T - '-). Wash again three times with PBST and then rinse with dut; ~ mpon phosphate (PBS).
The substrate is then added (60 ml of a 0.3% solution of 4-chloro-1-naphthol in methanol, in 100 ml of phosphate buffer containing 0.02% peroxide hydrogen) and allowed to incubate at ~ eul ~ ul ~ room for 30 minutes.
f) PC ~ r ~ U ~ IL; UII of l ~ dwu ~ lauu ~, s _ _ Microtiter plates are used: carboxylated polystyrene; reference:
Niveleau et al. J. Immunol. Methods, 15g, 177-189 (1993).
100 μl of a solution containing 10 μg / ml of hydrochloride are added to each well.
N- (3-dill ~ ylallli ~ lul ~ lu ~ yl) -N'- ~ Lllyl ~ ulJodiilllide (Merck) diluted in buffer phosphate pH 7.2. After 10 minutes at t ~, ul ~ ambient Lulc, is added to each well ID0, ul of a 1011glml solution of avidin (Sigma) in a phosphate buffer of pH 7.2.
After one hour, the plates are washed with pH 7.2 phosphate buffer containing 0.05 1 Yo of Tween 20, then washed 3 times with phosphate buffer.
wo 96io3s26 2 1 9 5 ~ 8 0 1 ~ I / r The products of, '' denatured by heat are added at a rate of 50 µl per well. After 15 minutes at t ~, laLul; i ambient, the wells are washed 3 times with PBST. 50 μl of the antibody solution mr, nr, rlrn ~ ll are then added anti-5-methyl cytidine (supernatant of hybridoma culture). It is incubated for 30 minutes at t ~ alulc ambient then washed 3 times with PBST containing I% bovine serum albumin (PBST-BSA).
Then add 50 ~ d of anti-IgG goat antibody (H + L ~ from mouse conjugated to pw ~ yddsc (Biorad Laboratories). After 30 minutes at Lc.iliu ~, .d ~ u.cambiante, rinsed 3 times with PBST-BSA then the substrate of p ~, .u ~ -y-la ~ is added;
which is 3.3 ', 5.5' t ~ lal ~ llyl- benzidine, in solution in dimé ~ l.yl ~
mixed with 10% (by volume) of hydrogen peroxide. 100 ~ LI of this mixture are added in each well and allowed to incubate at ~, the ambient UIC for 17-20 minutes, until an intense blue color of the reaction product appears. The reaction is stopped by addition of lN sulfuric acid (100 Izl per well). The optical density at 655 nm is measured by ~ uu ~ lll3; l; e Results. _ =. . =. == ._. =. = =. == == --_ - = = ~ = --- - =
The 10 to 10 serial dilutions of EBV DNA that were used as matrices in al ~; r ~ by pcR ~ le ~, l from 2 to 20,000 copies of the genome of EBV.
We compared the results of ~; r ~, -ll by PCR, carried out as in c) above, with a mixture of dCTP and 5-MedCTP and biotinylated primers, and the results of llmrlifir ~ itir, n by PCR carried out in a conventional manner with unmodified NTP and non-biotinylated primers.
The products of ~ mrlifir ~ tirln were analyzed by cle ~ uiuhu.c ~ e on gel of agarose and visualized by nuul., S. ~ c of ethidium bromide under irradiation ultraviolet. The analysis in eL ", ~ uiullulc ~, shows that in both cases the amplified DNA
have the expected sizes, based on the migration distances. The sensitivity of the reaction, determined by the intensity of the ~ w ~ c ~ u ~ on the gel, reaches 200 target molecules of DNA, both with the PCR according to the invention and with conventional PCR.
Furthermore, as c ~ uilla; ~ ull, the amplification products obtained by conventional PCR were analyzed with the specific probe conjugated to the ~ ligrl ~ ig ~ -ninp (obtained in d) above), by Southern hybridization and revelation with an antibody anti - 1igo ~ riprninr (Boehringer Mannheim). Reaction sensitivity reaches 20 target DNA molecules.
W0 96 ~ 03 526 2 1 9 5 4 8 0 F ~ r ~.
The product of amplifying ~ tinn PCR according to the invention was analyzed on the one hand after c'lc. ~, llu ~ l ~ wè ~ and Southern transfer (see e) above) and on the other microtitration coated with avidin (see f ~ above).
- In the first case (c ~ le ~, LIu ~ Lolci ~, and Southern transfer) the product S d ',. ,,, l, l; l;. ~ I. ,,, is denatured by the detection or detection by means of the antibody "~""- ~ rl- l" ~ l allti-s Dude ~ dorlt the fixatioll is revealed as illdicated ~ by a anti-mouse IgG antibody, labeled with ~ u ~ ydaac. The sensitivity threshold of the method is then two molecules of target DNA.
When the analysis is made by depositing the product of "". ~ On a plate ~, luLiLlaLiull coated with avidin, and detection using the antibody mnnnrlnn ~ l anti-S
MeC as ~ c ~ .l, .n ..,. a we found that the detection threshold is this time lower than two target DNA molecules.
The intensity of the signal increases with the amount of amplification product, which which allows the qn ~ ntifir ~ tinn 2û
3û