CA2033071A1 - Bovine leukemia virus vaccine - Google Patents
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Abstract
ABREGE
Vaccin contre le virus de la leucémie bovine.
Le vaccin contre le virus de la leucémie bovine (BLV), comprend une fraction peptidique, ou un virus recombinant l'exprimant, qui inclut la glycoprotéine d'enveloppe gp51 du virus BLV et qui induit à un degré élevé la formation d'anticorps neutralisants. La glycoprotéine gp51 est associée à une glycoprotéine transmembranaire ou à un anticorps monoclonal spécifique de l'un des épitopes de la gp51, de manière à restituer à la glycoprotéine gp51 sa con-figuration native où sont présents les épitopes F, G et H
responsables de l'activité biologique du virus BLV, dans un véhicule ou excipient pharmaceutique du type de ceux utilisés pour la constitution de vaccins. SHORT
Bovine leukemia virus vaccine.
The bovine leukemia virus (BLV) vaccine, includes a peptide moiety, or a recombinant virus the expressor, which includes the envelope glycoprotein gp51 of the BLV virus and which induces to a high degree the formation neutralizing antibodies. The gp51 glycoprotein is associated with a transmembrane glycoprotein or a monoclonal antibody specific for one of the epitopes of the gp51, so as to restore to the glycoprotein gp51 its native representation where the F, G and H epitopes are present responsible for the biological activity of the BLV virus, in a pharmaceutical vehicle or excipient of the type of those used for the constitution of vaccines.
Description
~ ~ 3 ~ ~ 7 ~
Vaccin contre le virus de la leucémie bovirle La présente invention a trait à un vaccin contre le virus de la leucémie bovine (BLV) notamment à un vaccin recombinant ou obtenu par recombinaison.
La leucémie bovine ou leucose bovine enzootique est une maladie hautement contagieuse due à un rétrovirus le virus de la leucémie bovine (BLV). Cette maladie qui sévit principalement dans les pays de l Europe de l Est et en - Amérique du Nord et du Sud touche essentiellement les ovins tO et les bovins, conduisant à une infection quasi généralisée des troupeaux. Il s agit d une maladie dont l évolution est relativement lente mais qui dans de nombreux cas, induit des tumeurs, entraînant la mort de l animal infecté. Le développement de cette maladie est d autant plus préoccupant que l on ne dispose à l heure actuelle pratiquement d aucun moyen pour la combattre et pour éviter la propagation du virus. La solution consistait jusqu ici à isoler les animaux infectés et à les abattre.
Le mouton est l anlmal expérimental par excellence pour les études de transmissidn de la maladie (voir notamment Mammeric~x, M. et al. cité ci-après et Mammerickx M. et ~ ~ 3 ~ ~ 7 ~
Bovine leukemia virus vaccine The present invention relates to a vaccine against bovine leukemia virus (BLV) including a vaccine recombinant or obtained by recombination.
Bovine leukemia or enzootic bovine leukosis is a highly contagious disease caused by a retrovirus the virus bovine leukemia (BLV). This rampant disease mainly in Eastern European countries and in - North and South America mainly affects sheep tO and cattle, leading to near-generalized infection herds. It is a disease whose evolution is relatively slow but which in many cases induces tumors, resulting in the death of the infected animal. The development of this disease is all the more worrying that we currently have practically no means to combat it and to prevent the spread of virus. The solution so far has been to isolate animals infected and slaughter them.
The sheep is the ultimate experimental animal for studies of disease transmission (see in particular Mammeric ~ x, M. et al. cited below and Mammerickx M. and
2~33~7~
al. dans Leukemia Research, 11, 353-358 (1987) dans lequel il est montré que l'injection en quantité mir,ime de lympho~
cytes provenant d'animaux in~ectés (926 lymphocytes) pro-vorlue l'apparition des symptômes de la maladic chez le mou-ton).
On a cherché depuis de nombreuses années à mettre au point un vaccin qui puisse apporter une certaine protection contre la leucémie bovine.
J. MILLER et M. VAN DE~ MAATEN ont mentionné dans Ann.
Recherche V~t., p. 871 à 877, 9 (1978) la possi~ilité
d'utiliser des glycoprotéines de l'enveloppe du virus BLV
inactivé, commme principe actif d'un vaccin.
L.V. PATRASCU et al. ont décrit, dans Rev. Méd.
Virologie, p. 995 à 1002, 31 (1980), la préparation d'un vaccin dénommé BL-VACC-RO contre le virus de la leucémie bovine, obtenu à partir d'un virus BLV inactivé.
M. MAMMERICKX, D. PORTETELLE, A. BURNY et J. LEUEN rap-portent, dans Zbl. V~t. Med. B27, p. 291 à 303 (1981), les résultats d'études qui montrent que des anticorps passifs ae~uis par le colostrum protègent les animaux contre une infection.
M. ONUMA et al. signalent dans Am. J. Vet. Res. 45, p.
1212 à 1215 (1984) qlle les anticorps contre la glycoprotéine d'enveloppe de poids moléculaire 51 000 du virus BLV, désignée par l'abréviation gp51, montrent une activité nr~
. tralisante contre le virus BLV. Dans cet article, il est fait état de vaccins réalisés à partir de la glycoprotéine gp51, de la protéine p24 et de cellules de reins d'agneau foetal (FLK) infectées et qui, admini.strés au mouton, appor-tent une certaine protection.
PARFANOVICH et al. dt~(~;.vent dans Br. Vet. J. 139, p.
137 à 146 (1983) la préparation d'un virus ~LV inactivé à
l'aide de composés aminométhylés provenant de la réacti~n entre le formaldéhyde et un amino-acide tel que la leucine ou la lysine.
G. H. THEILEN et al. dans Current Topics in Veterinary ': ' 2 ~ 33 ~ 7 ~
al. in Leukemia Research, 11, 353-358 (1987) in which it is shown that the injection in quantity mir, ime of lympho ~
cytes from infected animals (926 lymphocytes) pro-vorlue the appearance of the symptoms of the disease in the your).
We have sought for many years to point a vaccine that can provide some protection against bovine leukemia.
J. MILLER and M. VAN DE ~ MAATEN mentioned in Ann.
Research V ~ t., P. 871 to 877, 9 (1978) the possibility to use BLV envelope glycoproteins inactivated, as the active ingredient in a vaccine.
LV PATRASCU et al. have described in Rev. Med.
Virology, p. 995 to 1002, 31 (1980), the preparation of a BL-VACC-RO vaccine against leukemia virus bovine, obtained from an inactivated BLV virus.
M. MAMMERICKX, D. PORTETELLE, A. BURNY and J. LEUEN report bear, in Zbl. V ~ t. Med. B27, p. 291-303 (1981), results of studies showing that passive antibodies ae ~ uis by colostrum protect animals from infection.
M. ONUMA et al. point out in Am. J. Vet. Res. 45, p.
1212 to 1215 (1984) qlle antibodies against glycoprotein BLV virus 51,000 molecular weight envelope, designated by the abbreviation gp51, show an activity nr ~
. tracing against the BLV virus. In this article, it is reports on vaccines made from glycoprotein gp51, p24 protein and lamb kidney cells Fetal (FLK) infected and which, administered to sheep, are trying some protection.
PARFANOVICH et al. dt ~ (~; .vent in Br. Vet. J. 139, p.
137 to 146 (1983) preparation of a ~ LV virus inactivated at using aminomethylated compounds from the reacti ~ n between formaldehyde and an amino acid such as leucine or lysine.
GH THEILEN et al. in Current Topics in Veterinary ':'
3 2~307~
Medicine and Animal Science 15, p 547 à 559 (1982) indi-quent avoir vacciné des bovins avec des cellules vivantes provenant d'une lignée cellulaire BL-3, obtenue à partir de moelle osseuse et de thymus d'un cas sporadique de leucose bovine.
E. RISTAU et al. dans Arch. Exper. Vet. Med. Leipzig 41, p. 1a5 à 196, et p. 323 à 331 (19.~7) font de leur côté
état d'expériences de vaccination utilisant ces cellules ~L-3.
KONO et al. dans Jpn. J. Vet. Sci. 48, p. 117 à 125 (1986) rapportent les résultats d'une étude montrant que des anticorps acquis passivement ou après injection de la glycoprotéine d'enveloppe gp51 puriL-iée protègent d'une surinfection ultérieure, à condition que ]es taux d'anticorps anti-gp51 soient suffisants avant la surinfec-tion par BLV.
Tous ces vaccins ne confèrent toutefois qu'une protec-tion de très courte durée et aucun n'a recu une application à grande échelle.
Il est connu que, dans certaines conditions, la glycoprotéine gp51 induit des anticorps neutralisants.
C. BRUCK et al. dans Virology 122, 342-352 (1982) ont mis en évidence huit régions antigéniques indépendantes sur la glycoprotéine gp51 par compétition d'anticorps mono-clonaux antl-BLV.
D. PORTETELLE et al. dans Comm. Eur. Communities (REP) EUR (1984), EUR 8471, Agri.culture, 45-51 précisent que trois de ces épitopes, F, G, H, situés sur un fragment apparemment non qlycosylé, de poids moléculaire d'environ 15 000, obtenu par digestion par une solution d'urokinase de la glycoprotéine gp51, sont impliqués dans la neutralisation du virus, et envisagent la possibilité de préparer un vaccin anti-BLV par insertion du gène d'enveloppe gp51 ou d'une région correspondant aux sites biologiquement actifs dans un système d'expression autorisant la glycosylation.
D. PORTETELLE et a].. dans J. CELL. Biochem. Suppl. 1OA 3 2 ~ 307 ~
Medicine and Animal Science 15, p 547 to 559 (1982) indi-who have vaccinated cattle with living cells from a BL-3 cell line obtained from bone marrow and thymus of a sporadic case of leukosis bovine.
E. RISTAU et al. in Arch. Exper. Vet. Med. Leipzig 41, p. 1a5 to 196, and p. 323 to 331 (19. ~ 7) do their part state of vaccination experiences using these cells ~ L-3.
KONO et al. in Jpn. J. Vet. Sci. 48, p. 117 to 125 (1986) report the results of a study showing that antibodies acquired passively or after injection of the envelope glycoprotein gp51 puriL-iée protect from subsequent secondary infection, provided that the rates anti-gp51 antibodies are sufficient before superinfection tion by BLV.
However, all of these vaccines only provide protection very short term and none received an application in large scale.
It is known that, under certain conditions, the gp51 glycoprotein induces neutralizing antibodies.
C. BRUCK et al. in Virology 122, 342-352 (1982) have highlighted eight independent antigenic regions on the glycoprotein gp51 by competition of mono- antibodies clonal antl-BLV.
D. PORTETELLE et al. in Comm. Eur. Communities (REP) EUR (1984), EUR 8471, Agri.culture, 45-51 specify that three of these epitopes, F, G, H, located on a seemingly fragment non-glycosylated, with a molecular weight of approximately 15,000, obtained by digestion with a solution of urokinase from the glycoprotein gp51, are involved in neutralizing the viruses, and are considering the possibility of preparing a vaccine anti-BLV by insertion of the envelope gene gp51 or of a region corresponding to biologically active sites in a expression system allowing glycosylation.
D. PORTETELLE and a] .. in J. CELL. Biochem. Suppl. 1OA
4 2 ~ 3 ~
(1986) (abrégé) et dans Virology 1~9, 27-33 (19~9) estiment que les trois épitopes F G, H peuvent jouer un rôle impor-tant dans la conception d'un vaccin de sous-unité anti-~LV.
Ces trois épitopes sont sensibles à la présence d'un agent de réduction sotlt localisés sur un fragment faiblement glycosylé sur la partie NH2 terminale de la glycoprotéine et sont les seuls épitopes reconnus sur le virion non dégradé.
Il a été décrit dans la demande de hrevet FR-A-87-03881 déposée par le demandeur le 20 mars 19~7 des fractions pep-tidiques induisant la formation d'anticorps protecteurs con-tre le virus de la leucémie bovine (BLV) qui sont caractérisées par le fait qu'elles comportent une séquence peptidique ~eproduisant tout ou partie de la séquence du fragment de l'enveloppe glycoprotéique gp51 du virus de la leucémi.e bovine portant au moins l'un des épitopes F, G, H
responsables de l'activité biologique du virus.
Enfin , K. OHISHI et ~l. dans Vaccine (19~), 7, 42a-432, ont essayé d'exprimer gp51 par le gène env en entier.
S'il est donc connu que, dans certaines conditions, la glycoprotéine gp51 peut induire la formation d'anticorps neutralisants, et si l'on a pu identifier et localiser sur cette glycoprotéine les épitopes responsables de l'activité
biologique du virus, il n'a cependant pas été jusqu'ici pos-sible de développer un vaccin qui puisse conférer une bonne protection contre la leucémie bovine sur une longue période.
Iles difficultés rencontrées dans la mise au point d'un vac-cin, résident dans l'immunogénicité insuffisante de la glycoprotéine ou de son fragment qui porte les épitopes F, G, H responsables de l'activité du virus, due à la confi-guration spatiale fragile de ces épitopes.
La présente invention a pour objectif de fournir unvaccin dans lequel la gp51 se retrouve dans sa configuration native où les épitopes F, G, H sont présents et bien exposés, comme à la surface d'une particule virale, permet-tant aux propriétés immunogènes de ces épitopes de pleine-ment se manifester.
... .
20330~1 Le vaccin conforme a l'invention comprend une ~rac~.i.on peptidique qui inclut la glycoprotéine d'enveloppe gp51 du virus BLV et qui induit à un degré e].evé la formation d'ant;corps neutralisants, caractérisé en ce que la glycoprotéine gp51 est associée à une glycoprotéine transmembranaire, de manière à restituer à la glycoprotéine gp51 sa configuration native où sont présents les épitopes F, G et H responsables de l'activité biologique du virus BLV, dans un véhicule ou excipient pharmaceutique du type de ceux utilisés pour la constitution dc vcrccins.
Ces épitopes sont alors reconrllls par les anticorps monoclonaux dirigés contre eux-mêmes sur la particule virale.
I.a glycoprotéine transmembranaire associée à la glycoprotéine d'enveloppe gp51 est avantageusement constituée par la glycoprotéine gp30 du virus BLV, laquelle interagit avec la glycoprotéine gp51 pour restituer à
celle-ci sa configuration native où les épitopes F, G, H
sont présents. Ces épitopes retrouvent la collfigllration native observée à la surface de la particule virale BLV et présentent, alors, une très grande réactivité avec les anticorps monoclonaux dirigés contre eux.
La glycoprotéine transmembranaire gp30 est un polypep-tide fortement glycosylé comportant 214 acides aminés et qui est, en part.i.culier, responsable de la bonne fixation des protéines d'enveloppe dans la membrane de la cellule infectée.
Les deux protéines glycosylées gp51 et gp30, de poids moléculaires apparents 51000, respectivement 30000 daltons, sont codées par le gène env du virus. La séquence en acides aminés de la gp30 est typique des protéines transmem-branaires de retrovirus : deux régions très hydrophobes dont celle située à l'extrémité -COOH terminale est probablement celle qui traverse la membrane virale. Voir N.R. RICE et al., Virology (1984) 138, 82-93.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, on 2~33~7~
synthétise les glycoprotéines gp51 et gp30 dans un système d'expression qui exprime ensemb]e, en une molécule unique, la gp51 et la gp30 et qui peut être, par exemple, un virus recombinant ou une levure.
Le molécule comprenant gp51 et gp30 ainsi exprimee comprend un site dc clivage naturel.
Toutefois, dans un mode de réalisation particulier de l'i.nvention, on pourra, selon toute méthode connue, indui.re une mutation du gène codant pour ladit:e molécule avant son insertion dans le plasmide, de faSon qlle la molécule con-tenant gp51 et gp30 soit dépourvue de son sit-e de clivage naturel. Dans ce mode de réali:-jation, les glycoprotéines gp51 et gp30 resteront donc liées par liaison covalente.
Ceci peut être réalisé par exemple en induisant une 15 mutation de la séquence en acides aminés 26a-269 de façon à
- ob~enir Gln-Thr au lieu de Arg-Ser, avec la méthode de Eck-stein, pratiquée avec un ki.t commercial du type Amersllam "In vitro Mutagenesis Systèm", code RPN 2322.
Grâce à la technique des virus recombinants, de nom-breux gènes étrangers ont pu être insérés et exprimés.
L'insertion des gènes codant pour la gp51 et la gp30, dans le génome du virus s'effectue par les techniques, main-tenant bien connues, de (onstruction de recombinants et qui ~i comportent la série d'étapes suivante :
- insertion du gène env (gène codant pour la gE~51 et la gp30) dans un vecteur p]a:~ i.dique convenable, - introduction du plasmide recombinant dans une cellule préalablemen~: i.nfectée par une souche du virus, - les séquences nucléotidiques étant identiques, une recombinaison in vitro intervient entre les régions homolo-gues du plasmide recombinant et de l'ADN vi. r:;l 1 ; par cette recombinaison, le gène env se trouve intégré dans le génome ; du virus darl:; 1eqllel il est propagé et exprimé.
L'insertion du gène codant pour la gp51, en même temps que du gène codant pour la gp30, dans le génome du virus, peut être, bien entendu, réalisée encore sous des ~ormes 2033~
très diverses :
- gène env provenant d'un variant BLV, par exemp].e dépourvu de l'un ou de deux des trois sites F, G, H, - insertion d'un morceau seu:Lement du gène codant pour S 1a ~pS1, par exemple provenant d'un variant ~LV, - insertion d'une séquence nucléotidique pouvant pro-venir d'un provirus ~LV cloné ou bien d'une copie d'ADNc résultant de la transcription inverse de l'ARN vira], - ou d'un oligonucléotide synthétique codant pour tout ou partie de ]a gp51.
Parmi les virus utilisables, on peut citer notamment les adénovi.rus, les herpèsvirus, le virus de la vaccine, le virus Fowlpox, le virus Canarypox et les baculovirus. (Pour un vecteur Fowlpox, voir par exemple J. Taylor et E.
Paoletti dans Vaccine (1988), 6, p 466-467 et J. Taylor et al. dans Vaccine (1988), 6, p 497-503).
Les virus recombinants peuvent être utilisés tels quels comme agents vaccinants contre la leucémie bovine ou pour-ront être utilisés pour infecter une culture cellulaire et produire in vitro la fraction peptidique, que l'on récupérera et que l'on utilisera comme agent vaccinant.
Bien entendu, dans le cas de vaccins comprenant des virus recombinants, le virus recombinant peut avantageuse-ment exprimer une molécule unique, comprenant gp51 et gp30, dépourvue 1~11 non de site de clivage.
Les vaccins ainsi préparés peuvent être administrés par des voies variées ; en particulier, on peut procéder par voie intradermique, sous-cutanée ou intramusculaire. Ils peuvent être adminis~rés avec des supports pharmaceutiques connus et comporter, en outre, de:; adjuvants.
Pour la préparation de vaccins, si les virucj recom-binants constituent un moyen particulièrement commode pour que soient expr:imées ensemble la gp51 et la gp30, de nom-breux autres systèmes d'expression peuvent être également utilisés tels que les levures, notamment la levure S. cerevisiae.
... ,.,~ , 2~3~7~
La présente invention s'étend donc aussi d'une facon générale à tout vaccin comprenant un système d'expression qlJ i permet d'exprimer ensemble la gp51 et la gp30.
On peut également obten.ir des préparati.ons vaccinales selon l'invention à base de lipo:;ollles dans lesquels la frac-tion gp51 et gp30 serait insérée dans les couches lipi-diques.
Les glycoprotéines gp51 et gp30 peuvent être egcl~ement insérées dans des prépara~ions type ISCOM ("Immunostimulat-ing comp].ex") telles que celles qui ont été décrites par B.MOREIN et al. dans Immunology Today Vol. 8 n- 11, p. 333 à
338 (1987).
Les glycoprotéines gp51 et gp30 peuvent être encore - insérées dans des polyélectrolytes (copolymère d'acide acrylique et de N-vinylpyrrolidone) servant notamment d'a(ljllv.lnt à gp51 et gp30 (voir Petrov et al. Immmunology Letters (1986) 12 237-242).
L'invention concerne encore (.1es vacci.ns contre la leucemie bovine obtenus à partir de ces préparations ISCOM
- 20 ou de ces polyélectrolytes.
Les inventeurs ont constaté que l'on pouvait également, dans une cert;~ine mesure redonner à la gp51 sa configura-tion native, en fixant sur cette glycoprotéine un anticorps monoclonal spécifique de l'un des épitopes.
Une variante de réalisation de l'invention consisterait donc en un vaccin contre le virus de 1.a leucémie bovine (~LV) comprenant une fraction peptidique comportant la glycoprotéine d'envelopl~e. gp51 du virus BLV et induisant à
un degré ele.vé la formation d'anticorps neutralisants, caractérise en ce que la glycoprotéine gp51 est associée à
un anticorps monoclonal spécifique de l'un des épitopes de la gp51, de manière à restituer à la glycoprotéine gp51 sa configuration native où sont présents les épitopes F, G et H
responsables de l'activité biologiql.le du virus BLV, dans un véhicule ou excipient pharmaceutique du type de ceux utilisés pour la constituti.on de vaccins.
9 2Q330~
L'anticorps monoclonal que l'on ~ixe à 1.a gl~51 est avantageusement constitué par l'anticorps monoclonal dirigé
contre le site E ou contre le site A.
Une variante de réalisation de l'invention consist.ercli.t.
donc à fixer ;ll r l.a glycoprotéine gpS 1 un anticorps mono-clonal dirigé cont.re le site E ou contre le site A.
L'anlicorps monoclonal di.rigé contre le site E ou (on-tre le site A interagit avec lcl gp51, à la maniere de la gp30, restituant à la gp51 sa configurati.on native.
La gp51 sur laquelle on a fixé un ant.i~t)rps monoclonal dirigé contre les épitopes E oll A, est reconnue par les anticorys monoclonaux dirigés contre les épitopes F, G, El.
La gp51 et l'anticorps monoclollal dirigé contre le site E ou A peuvent etre exprimés dans un système d'expression.
Un tel ;ys~ème d'expression peut être constitué par un virus recombinant dans lequel on a inséré le gène codant pour la gp51 et des gènes codan~ pour l'anticorps monoclonal dirigé contre le site E-ou le site A.
On peut aussi envisager d'insérer dans des préparations type "ISCOM" l'anticorps monoclonal dirigé contre le site E
ou le site A et qui capte, ensuite, l'antigène gp51 ~ sa surface.
L'invention s'étendr~it., également, aux vaccins obtenus à partir d'un, ou contenant un virus recombinant (?~primant 2S la gp51 liée à son anticorps monoclonal E ou A, ou encore réalisés à partir des préparations type I!.~)M d;~ns lequelles est inséré l'anticorps monoclonal qui captera, en~sui.te, la gp51.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de l'exemple de mise en oeuvre de l'i.nvention donné, ci-après, à titre non limitatif.
Sur les figures annexées :
- la figure 1 représente la c()~lrbe de titration des anticorps gp51 de lapins qui ont reçu des virus recombir~ t.s qui expriment d'une part la gp51 seule, et d'autre part la gp51 et la gp30 ensemble;
2~33~7~
- les figures 2 3 et 4 représentent les courbes de compétition des anticorps anti-gp51 de lapins qui ont reçu des virus recombinants qui expriment d'une part la gp51 et d'autre part la gp51 et la gp30 ensemble avec respective-ment les anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopesF, G et H liés à l'enzyme peroxydase.
EXEMPLE
On dispose notamment :
- d'un recombinant vaccine exprimant la gp51 seule : VP391;
- de recombinants vaccine exprimant la gp51 et la gp30 VP392 et VP459;
- d'un recombinant vaccine exprimant la gp51 et la gp30 en l'absence du site de clivage naturel entre ces deux glycoprotéines : VP482 ; et 15- d'un recombinant vbtenu à partir du plasmide pGS20 et exprimant la gp51 et la gp30 : VV-ENV1 (voir construction ci-après).
CONSTRUCTION DU ~ECOMBINANT OBTENU A PARTIR DU PLASMIDE
pGS20 (gp51 + gp30) 20a) Obtention d'une banque d'ADNc dans ~gt10 Les ARNs totaux ont été extraits de cellules de poumon de chauve-souris produisant de façon chronique du virus DLV.
Les ARNs poly A+ ont été sélectionnés sur une colonne d'oligo-dT-cellulose afin d'être copiés en ADNc bicaténaires et liés au site EcoRI de l'ADN du phage A gt10.
b) Recherche d'ADNc correspondant à l'ARN messager de l'enveloppe Des bactéries C600 HFL sont infectées par les bactériophages de la banque d'ADNc et étalées sur boîtes de Petri. Chaque phage recombinant produit une plage de lyse.
Une empreinte de la boîte de Petri est réalisée sur un fil-tre de nitrocellulose. Après dénaturation et neutralisation l'ADN fixé sur le filtre est hybridé avec une sonde "~LV
provirale" marquée au 3~P par la tecl1nique de "déplacements de coupures" (Nick-translation). Le filtre est ensuite autoradiographié.
11 2~33a7:~
La sonde "BLV provirale'' permet de repérer les clones renfermant de l'ADNc du ~LV. I.es ph~ges contenant une infor-mation provirale sont ensuite purifi.és, digéres par l'enzyme de restriction EcoRI ; ].es fragments sont séparés par électrophorèse transférés sur filtre en nitrocel].ulose selon la méthode de "Southern".
L'hybridation moléculaire réalisée avec une sonde spécifique de la région env du virus BI.V et une analyse par enzymes de restri.ction permettent de repérer et purifier les phages recombinants porteurs de ].'information complète pour le gène env.
c) Clonage dans le plasmide pGS20 Le plasmide pGS20 a été décrit dans Mackett et al. J.
of Virology (1984) 49, 857-863. Il est constitué d'une par-tie du plasmide p~R323 et du gène de la thymidine kinase duvirus de la vaccine (gène TK). Le promoteur 7,5 K de ce Pox-virus, suivi de deux sites de clonage est inséré dans le gène TK.
Pour obtenir l'insert de 2 3 kb contenant la phase de lecture des 2 glycoprotéines l'ADN d'un phage recombinant intéressant est digéré par l'endonucléase de restriction Xho I. Les produits de la digestion sont séparés par électrophorèse en gel d'agarose. Le fragment de 2 3 kb est récupéré par électrophorèse et ses extrémités 5' en saillie sont rendues franches par un traitement par le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I.
Le vecteur pGS20 est linéarisé par l'endonucléase de restriction Sma I et traité à la phosphatase alcaline.
L'insert "ENV" de 2,3 kb est lié au site Sma I du plasmide pGS20. Des bactéries E. coli (souche MM294) rendues compétentes sont transformées. La sélection des bactéries transformées est réalisée sur ampicilline.
Un clone renfermant l'insert dans le sens 5'-3' derrière le promoteur P7,5K, est choisi. Le sens de l'insert est vérifié par la double digestion Eco RI-Pvu II.
On obtient le plasmide pGS20-ENV. La suite des t~3n7l opérations est résumée avantageusement dans le ;chéma I ci-joint.
d) Infection de cellules CV1 par le virus de la vaccine sauvat3e et transfection avec le plasmide recombinant pGS20 ENV.
Des cellules CV1 (fil)l-oblastes de singe) sont cultivées en couche monocellulaire. D'autre part, des particules de virus de la vaccine sauvage sont produit:es sur cellules con-fluentes.
Les fibroblastes sont infectés, à raison d'une parti-cule virale par cellule. Le p].asmide recombinant pGS20-ENV
est précipité en présence de phosphate de calcium sur les fibroblastes infectés. Après 43 lleures de culture, le virus est libéré des cellules par une alternance gel-dégel.
e) Sélection et purification d'un virus recombi.nant de la vaccine contenant le gène env.
Des cellules confluentes dépourvues de l'activité thy-midine kinase (TK-) sont infectées par le virus obtenu après transfection. Après 48 heures d'infectionr les cellules sont recouvertes de gélose contenant de la bromodésoxyuridine. Le phénotype TK+ est létal en présence de bromodésoxyuridine.
Seules des plal~es constituées par du virus TK (ayant inséré
un gène étanger lors de la recombinaison homologue à l'étape de transfection) se forment.
Après 2 ou 3 jours, les plages de ].ysc ;ont visualisées après coloration des cellules vi.vantes au rouge neutre. Le virus correspondant aux plages observées est prélevé, multi-plié ; l'ADN des clones isolés est extrait et hybridé à la sonde "ENV".
Seuls le ou les clones hybridant à la sonde "ENV" sont conservés pour les clonages ultérieurs et les tests d'expression de gp51 et de gp30.
Nous avons ainsi sélectionné le virus recombinant VV-ENV1 exprimant à la fois gp51 et gp30.
PREPARATION ET CARACTERISATION DES ANTICORPS MONO-13 2~ 7~
Immunisation des souris On a injecté à des souris Balb/c par voie sous-cutanée et intrapéritonéale 50 ~g de gp51 en présence d'adjuvant complet de Freund. Cette injection a été répétée 2 semaines après en présence d'adjuvant incomplet de Freund, puis 4 semaines après sans adjuvant, On a procédé, deux mois après, à une dernière injection par voie intrapéritonéale et par voie intraveineuse.
Fusion des cellules On a préparé les hybrides par fusion de cellules de myélome de souris avec les splénocytes des souris immunisées selon la technique décrite par HERZENBERG L.A. et al. dans ''~ Handbook of Experimental Immuno].ogy (D. WEIR, ed.) 25.1-25 (Blackwell, London).
Les hybrides obtenus ont été répartis en plaques de 96 puits et sélectionnés sur milieu HAT en présence de thymo-cytes et de macrophages de souris, Les hybrides producteurs d'anticorps anti-gp51 on,t été détectés à l'aide d'un radio-immuno-essai en phase liquide avec l'antigène gp51 marqué à
l'iode 125 ou à l'aide d'un radio-immuno-essai en phase solide avec du virus ~LV adsorbé dans les puits des micro-plaques. Dans ce dernier cas, les anticorps spécifiques adsorbés sur le virus ont été détectés avec une anti-immunoglobuline de souris marquée à l'iode 125. Après lavage, la radioactivité adsorbée sur les complexes -. spécifiques est révélée par autoradiograpllie.
Les clones producteurs sélectionnés ont été transférés sur des plaques de 24 puits et sous-clonés en milieu semi-solide d'agarose.
Les cellules hybrides obtenues ont été injectées dans la cavité intrapéritonéale de souris préalablement traitées au pristane. Après 10 à 15 jours, on a récolté les ascites qui contenaient des quantités importantes des anticorps monoclonaux recherchés.
Purification et caractérisation des anticorl~s mono-clonaux 14 2~33~1 On a purifié ces anticorps monoclonaux par cl1romatogra-phie d'échange d'ions sur DEAE Affigel Blue selon la méthode décrite par Bruck et al. dans J. Immunological Methods 53, 313-319 (1982).
Ces anticorps monoclonaux on~ été marqués par l'iode 125 par le procédé à la chloramine T décrit par GREENWOOD
F.C. et al. dans Biochemical Journal, 89, 114-123 (1963).
La spécificité des di~férents anti.corps monoclonaux obtenus pour des épitopes donnés a été déterminée par des essais de compétition entre 1es anticorps pour de l'antigène gp51 adsorbé dans les puits des plaques de microtitration.
A cet effet, un microgramme d'anticorps monoclonal purifié non marqué radioactivement est incubé, pendant une nuit à 4 C, dans un volume de 50 ~l dans les puits d'une plaque de microtitration en matière plastique contenant la gp51 adsorbée (50 ng).
De l'anticorps marqué radioactivement à l'iode 125 (10 ng-100.000 cpm) est alors ajouté et l'incubation se poursuit 6 heures de plus à 4 C.
Les microplaques sont alors lavées intensivement et la radioactivité accrochee à la matière plastique de chaque puits est mesurée dans un compteur de type ~.
On interprète les résultats en sachant que, si deux i sites antigéniques sont très proches ou identiques, la liaison de l'un des anticorps (non marqué) à sorl épitope, va gêner ou empêcher la liaison du second anticorps (marqué) à
son épitope.
Les essais de compétition entre les anticorps mono-clonaux puri~i.es permettent de définir sur la molécule de gp51 huit sites antigeniques indépendants désignés par les lettres A, B, C, D, E, F, G, H.
CARACTERISATION DES RECOMBINANTS A L'AIDE DES ANTICORPS
MONO~LONAUX
La mise en évidence des épitopes F, G, H à la surface des cellules infectées par les recombinants est effectuée par l'une ou l'autre des deux méthodes suivantes :
2~3~7~
1. IMMUNOFLUORESCENCE
Des cellules sensibles (cellules VERO) sont ensemencées dans des tubes de Leighton. Après croissance, elles sont infectées dans un ordre de mul.tiplicité de 5 à l'aide des différents recombinants VP391, VP392, VV-ENV1 et de VTK79 (vaccine sauvage). Après 20 heures d'infection, les lames sont récupérées et incubées avec cl1acun des anticorps mono-clonaux anti-gp51, dirigés respectivement contre les sites définis A, B, ~', C, D, D', E, F, G et H.
Après 1 heure d'incubation, les lames sont lavées plusieurs fois avec du tampon isotonique PBS, puis incubées avec le conjugué anticorps anti-immunoglobulines murines -. marquées à la fluorescéine.
Après 1 heure d'incubation, les cellules sont lavées, :15 puis les lames sont montées pour être examinées avec un microscope avec lampe U.V., à l'aide de l'objectif à immer-sion.
Les résultats sont interprétés comme négatifs (-) si aucune fluorescence n'est observée. Une fluorescence est signalée par +l- (lorsque le cas est douteux) ou par + ou +++ (lorsqu'ils sont positifs) selon l'intensité observée.
Les résultats obtenus ont été rassemblés dans le Tableau I.
; On note une très bonne immunofluorescence sur les sites F, G, H sur le recombinant VV-ENV1.
On note que l'on obtient une très bonne immunofluores-cence pour les sites F et H sur le recombinant VP392 alors que le recombinant VP391 présente une immunofluorescence très faible pour ces mêmes épitopes. L'immunofluorescence sur VP391 et VP392 est d'intensité égale pour tous les sites A, ~, ~', D, D', E.
On observe l'absence du site G sur les recombinants VP391 et VP392. L'absence de cet épitope s'explique par le fait que le clone T 15-2 à partir duquel le gène codant pour la gP51 a été introduit dans le virus est un variant G-, non reconnu par l'anticorps monoclonal MONO G.
. . .
16 2~33~
Ces résultats montrent donc que, pour présenter au système immunitaire des an.imaux un anti~ène gp51 à l'aide d'un virus recombinant, il importe que ]a gp30 soit associée à la gp51, de façon à avoir un antigène gp51 possédant la configuration native observée sur une particule virale BLV, où les sites F, G, H sont les mieux exposés.
Le test permet de mettre en évidence la présence des sites A, B, B', C, D, D', E, F, G et H définis par les anticorps monoclonaux sur la gp51.
Un extrait cellulaire ou de surnageants de culture de cellules infectées par un virus recombinant ou bien par le virus BLV est pris en sandwicl1 entre l'anticorps monoclonal capteur anti E et un anticorps monoclonal de révélation con-jugué à la peroxydase. La présence Ei.nale d'une coloration : est le signe de la présence du site anti~énique reconnu par l'anticorps monoclonal de révélation.
Cette technique montre bien, par exemple, que le site G
est absent sur les préparations VP391 et VP392 obtenues avec le variant provirus BLV T15-2 ; mais qu'il est, par contre, présent lorsque le recombinant est obtenu en insérant l'information codant pour la gp51 et la gp30 à partir de l'ADNc copié sur l'ARN vi.ral du virus 8LV produit par les cellules de chauve-souris BL.
ADAPTATION DES RECOMBINANTS VACCINE SUR CELLULES OVINES
On a mené une expérience d'adaptation du recombinant VP392 (gp51 + gp30), par passages répétés sur une lignée cellulaire d'origine OVK (ovine kidney cells).
L'expérience a été conduite du 17 avril 19~7 au 21 juin 1987 en subcultivant deux fois par semaine les cellules OVK
et les cellules VERO (utilisées comme contrôle), en boîtes de Roux 25 cm2. Arrivées a conEluence, les cellules étaient lavées et infectées avec VP392 provenant de l'infection du passa~e antérieur (55 ~l prélevées du ml de suspension virale provenant de la boîte de Roux 25 cm2). Par boîte de Roux 25 cm2, on dénombre à confluence 3 x 106 cellules OVK
17 2 0 3 3 ~ 7 1 ontre 9 x 10 cellules VERO.
~es différentes suspensions viral.es ont été conservées à -20 C. On a déterminé leur titre en virus par titration en boîtes de 24 puits, selon la méthodc des dilutions limites 4 2 ~ 3 ~
(1986) (abridged) and in Virology 1 ~ 9, 27-33 (19 ~ 9) estimate that the three epitopes FG, H can play an important role both in the design of an anti-LV subunit vaccine.
These three epitopes are sensitive to the presence of an agent reduction sotlt located on a weakly fragment glycosylated on the NH2 terminal part of the glycoprotein and are the only epitopes recognized on the non-degraded virion.
It was described in the hrevet application FR-A-87-03881 filed by the applicant on March 20, 19 ~ 7 of the fractions pep-drugs inducing the formation of protective antibodies against be the bovine leukemia virus (BLV) which are characterized by the fact that they comprise a sequence peptide ~ producing all or part of the sequence of fragment of the gp51 glycoprotein envelope of the bovine leukemia carrying at least one of the epitopes F, G, H
responsible for the biological activity of the virus.
Finally, K. OHISHI and ~ l. in Vaccine (19 ~), 7, 42a-432, tried to express gp51 by the entire env gene.
If it is therefore known that, under certain conditions, the gp51 glycoprotein can induce antibody formation neutralizers, and if we were able to identify and locate on this glycoprotein the epitopes responsible for the activity biological evidence of the virus, however, it has so far not been likely to develop a vaccine that can confer good protection against bovine leukemia over a long period.
Difficulties encountered in developing a vac-cin, reside in the insufficient immunogenicity of the glycoprotein or its fragment which carries the F epitopes, G, H responsible for the activity of the virus, due to the confi-fragile spatial guration of these epitopes.
The present invention aims to provide a vaccine in which the gp51 is found in its configuration native where the epitopes F, G, H are present and well exposed, as on the surface of a viral particle, allows both to the immunogenic properties of these full-epitopes manifest themselves.
...
20330 ~ 1 The vaccine according to the invention comprises a ~ rac ~ .i.on peptide that includes the envelope glycoprotein gp51 of the BLV virus and which induces to a degree e] .evé the formation ant; neutralizing bodies, characterized in that the gp51 glycoprotein is associated with a glycoprotein transmembrane, so as to restore to the glycoprotein gp51 its native configuration where the epitopes are present F, G and H responsible for the biological activity of the virus BLV, in a pharmaceutical vehicle or excipient of the type of those used for the constitution of vcrccins.
These epitopes are then reconrllls by antibodies monoclonals directed against themselves on the particle viral.
The transmembrane glycoprotein associated with envelope glycoprotein gp51 is advantageously made up of the BLV virus glycoprotein gp30, which interacts with the gp51 glycoprotein to restore this its native configuration where the F, G, H epitopes are here. These epitopes rediscover the collfigllration native observed on the surface of the viral particle BLV and are therefore very reactive with monoclonal antibodies directed against them.
The transmembrane glycoprotein gp30 is a polypep-strongly glycosylated tide comprising 214 amino acids and which is, in part.i.culier, responsible for the good fixing of the envelope proteins in the cell membrane infected.
The two glycosylated proteins gp51 and gp30, of weight apparent molecular 51,000, respectively 30,000 daltons, are encoded by the env gene of the virus. The acid sequence amines of gp30 is typical of transmem-retrovirus branaria: two very hydrophobic regions including the one at the -COOH terminal is probably the one that crosses the viral membrane. See NR RICE and al., Virology (1984) 138, 82-93.
According to a preferred embodiment of the invention, 2 ~ 33 ~ 7 ~
synthesizes the gp51 and gp30 glycoproteins in a system of expression which together expresses, in a single molecule, gp51 and gp30 and which can be, for example, a virus recombinant or yeast.
The molecule comprising gp51 and gp30 thus expressed includes a natural cleavage site.
However, in a particular embodiment of the i.nvention, we can, according to any known method, indui.re a mutation in the gene coding for said molecule before its insertion into the plasmid, so that the molecule con-holding gp51 and gp30 is devoid of its cleavage site natural. In this embodiment: -jation, the glycoproteins gp51 and gp30 will therefore remain linked by covalent bond.
This can be done for example by inducing a 15 mutation of amino acid sequence 26a-269 so as to - ob ~ enir Gln-Thr instead of Arg-Ser, with the Eck- method stein, practiced with a commercial kers of the Amersllam "In type vitro Mutagenesis System ", code RPN 2322.
Thanks to the recombinant virus technique, many many foreign genes could be inserted and expressed.
The insertion of genes coding for gp51 and gp30, in the genome of the virus is done by techniques, main-holding well known, of (onstruction of recombinants and which ~ i include the following series of steps:
- insertion of the env gene (gene coding for gE ~ 51 and gp30) in a vector p] a: ~ suitable i.dique, - introduction of the recombinant plasmid into a cell prior ~: i.nfected by a strain of the virus, - the nucleotide sequences being identical, a in vitro recombination occurs between homolo-gues of the recombinant plasmid and DNA vi. r:; l 1; by this recombination, the env gene is integrated into the genome ; darl virus :; 1eqllel it is propagated and expressed.
The insertion of the gene coding for gp51, at the same time that of the gene coding for gp30, in the genome of the virus, can be, of course, still performed under ~ elms 2033 ~
very diverse:
- env gene from a BLV variant, for example] .e without one or two of the three sites F, G, H, - insertion of a single piece: Lement of the gene coding for S 1a ~ pS1, for example coming from a variant ~ LV, - insertion of a nucleotide sequence which can pro-come from a cloned LV ~ virus or a cDNA copy resulting from reverse transcription of vira RNA], - or a synthetic oligonucleotide coding for all or part of] a gp51.
Among the viruses which can be used, there may be mentioned in particular adenoviruses, herpesviruses, vaccinia virus, Fowlpox virus, Canarypox virus and baculoviruses. (For a Fowlpox vector, see for example J. Taylor and E.
Paoletti in Vaccine (1988), 6, p 466-467 and J. Taylor and al. in Vaccine (1988), 6, p 497-503).
Recombinant viruses can be used as is as vaccine agents against bovine leukemia or for can be used to infect a cell culture and produce in vitro the peptide fraction, which is recover and use as a vaccine agent.
Of course, in the case of vaccines comprising recombinant viruses, the recombinant virus can advantageously-ment express a single molecule, comprising gp51 and gp30, lacking 1 ~ 11 no cleavage site.
The vaccines thus prepared can be administered by various routes; in particular, we can proceed by intradermal, subcutaneous or intramuscular route. They can be administered ~ res with pharmaceutical carriers known and include, in addition: adjuvants.
For the preparation of vaccines, if the virucj recom-binants are a particularly convenient way to that be expressed: imaged together the gp51 and the gp30, of nom-breux other expression systems can also be used such as yeasts, especially yeast S. cerevisiae.
...,., ~, 2 ~ 3 ~ 7 ~
The present invention therefore also extends in a way general to any vaccine including an expression system qlJ i lets you express gp51 and gp30 together.
Vaccine preparations can also be obtained.
according to the invention based on lipo:; ollles in which the frac-gp51 and gp30 would be inserted in the lipi-diques.
The glycoproteins gp51 and gp30 can be egcl ~ ement inserted in ISCOM-type preparations ("Immunostimulat-ing comp] .ex ") such as those described by B.MOREIN et al. in Immunology Today Vol. 8 n-11, p. 333 to 338 (1987).
The gp51 and gp30 glycoproteins may still be - inserted in polyelectrolytes (acid copolymer acrylic and N-vinylpyrrolidone) used in particular from a (ljllv.lnt to gp51 and gp30 (see Petrov et al. Immmunology Letters (1986) 12 237-242).
The invention also relates to (.1 vacci.ns against bovine leukemia obtained from these ISCOM preparations - 20 or of these polyelectrolytes.
The inventors have found that it is also possible, in a cert; ~ ine able to give back to the gp51 its configura-native tion, by attaching an antibody to this glycoprotein monoclonal specific for one of the epitopes.
An alternative embodiment of the invention would consist therefore into a vaccine against the 1.a bovine leukemia virus (~ LV) comprising a peptide fraction comprising the envelope glycoprotein. BLV virus gp51 and inducing a high degree, the formation of neutralizing antibodies, characterized in that the gp51 glycoprotein is associated with a monoclonal antibody specific for one of the epitopes of gp51, so as to restore to the glycoprotein gp51 sa native configuration where the F, G and H epitopes are present responsible for the biological activity of the BLV virus, in a pharmaceutical vehicle or excipient of the type of those used for the constitution of vaccines.
9 2Q330 ~
The monoclonal antibody which is ~ fixed at 1.a gl ~ 51 is advantageously constituted by the directed monoclonal antibody against site E or against site A.
An alternative embodiment of the invention consist.ercli.t.
therefore to be fixed; ll r the glycoprotein gpS 1 a mono- antibody clonal directed against site E or against site A.
The monoclonal antibody directed against site E or (on-tre site A interacts with lcl gp51, in the way of gp30, restoring to gp51 its native configuration.
The gp51 on which we fixed an ant.i ~ t) monoclonal rps directed against E oll A epitopes, is recognized by monoclonal anticorys directed against the epitopes F, G, El.
Gp51 and the monoclollal antibody directed against the site E or A can be expressed in an expression system.
Such an expression can be constituted by a recombinant virus in which the coding gene has been inserted for gp51 and codan genes ~ for the monoclonal antibody directed against site E- or site A.
We can also consider inserting into preparations "ISCOM" type monoclonal antibody directed against site E
or site A and which then captures the gp51 ~ sa antigen area.
The invention extends ~ it., Also, to the vaccines obtained from, or containing a recombinant virus (? ~ priming 2S gp51 linked to its monoclonal antibody E or A, or made from type I preparations!. ~) M d; ~ ns which is inserted the monoclonal antibody which will capture, in ~ sui.te, the gp51.
Other characteristics and advantages of the invention will appear on reading the example of implementation of the i.nvention given below, without limitation.
In the attached figures:
- Figure 1 shows the c () ~ lrbe of titration of gp51 antibodies in rabbits which have received recombinant viruses which express on the one hand the gp51 alone, and on the other hand the gp51 and gp30 together;
2 ~ 33 ~ 7 ~
- Figures 2 3 and 4 show the curves of competition of anti-gp51 antibodies from rabbits who received recombinant viruses which express on the one hand gp51 and on the other hand the gp51 and the gp30 together with respective-the monoclonal antibodies directed against the epitopes F, G and H linked to the peroxidase enzyme.
EXAMPLE
We have in particular:
- a vaccinia recombinant expressing gp51 alone: VP391;
- vaccinia recombinants expressing gp51 and gp30 VP392 and VP459;
- a vaccinia recombinant expressing gp51 and gp30 in the absence of the natural cleavage site between these two glycoproteins: VP482; and 15- of a recombinant vbtenu from the plasmid pGS20 and expressing gp51 and gp30: VV-ENV1 (see construction below).
CONSTRUCTION OF THE ECOMBINANT OBTAINED FROM THE PLASMID
pGS20 (gp51 + gp30) 20a) Obtaining a cDNA bank in ~ gt10 Total RNAs were extracted from lung cells of bat chronically producing DLV virus.
Poly A + RNAs were selected on a column of oligo-dT-cellulose in order to be copied into double-stranded cDNAs and linked to the EcoRI site of the phage A gt10 DNA.
b) Search for cDNA corresponding to the messenger RNA of the envelope C600 HFL bacteria are infected with bacteriophages from the cDNA library and spread on dishes Petri. Each recombinant phage produces a lysis range.
An imprint of the Petri dish is made on a wire-be nitrocellulose. After denaturation and neutralization the DNA attached to the filter is hybridized with a probe "~ LV
proviral "marked at 3 ~ P by the technique of" displacements of cuts "(Nick-translation). The filter is then autoradiographed.
11 2 ~ 33a7: ~
The "BLV proviral" probe allows to identify clones containing ~ LV cDNA. I. Phes containing information proviral mation are then purified, digested by the enzyme EcoRI restriction; ] .the fragments are separated by electrophoresis transferred to nitrocel filter] .ulose according to the "Southern" method.
Molecular hybridization performed with a probe specific to the env region of the BI.V virus and analysis by restri.ction enzymes help identify and purify recombinant phages carrying].
the env gene.
c) Cloning into the plasmid pGS20 The plasmid pGS20 has been described in Mackett et al. J.
of Virology (1984) 49, 857-863. It is made up of a tie of the plasmid p ~ R323 and of the thymidine kinase gene of the vaccinia virus (TK gene). The 7.5 K promoter of this Pox-virus followed by two cloning sites is inserted into the TK gene.
To obtain the 2 3 kb insert containing the phase of reading of the 2 glycoproteins the DNA of a recombinant phage interesting is digested by the restriction endonuclease Xho I. The products of digestion are separated by agarose gel electrophoresis. The 2 3 kb fragment is recovered by electrophoresis and its 5 'projecting ends are made blunt by treatment with the fragment of Klenow of DNA polymerase I.
The vector pGS20 is linearized by the endonuclease of Sma I restriction and treated with alkaline phosphatase.
The 2.3 kb "ENV" insert is linked to the Sma I site of the plasmid pGS20. E. coli bacteria (strain MM294) returned competent are transformed. Selection of bacteria transformed is performed on ampicillin.
A clone enclosing the insert in the 5'-3 'direction behind promoter P7.5K, is chosen. The meaning of the insert is verified by Eco RI-Pvu II double digestion.
The plasmid pGS20-ENV is obtained. The continuation of t ~ 3n7l operations is advantageously summarized in; diagram I above attached.
d) Infection of CV1 cells with vaccinia virus sauvat3e and transfection with the recombinant plasmid pGS20 ENV.
CV1 (fil) l-oblast monkey cells) are cultured in a single-cell layer. On the other hand, particles of wild vaccinia viruses are produced:
fluent.
The fibroblasts are infected, due to a part-viral cule per cell. The pGS20-ENV recombinant plasmid.
is precipitated in the presence of calcium phosphate on the infected fibroblasts. After 43 cultures, the virus is released from cells by a freeze-thaw cycle.
e) Selection and purification of a recombinant virus of vaccinia containing the env gene.
Confluent cells lacking thy-midine kinase (TK-) are infected with the virus obtained after transfection. After 48 hours of infection the cells are covered with agar containing bromodeoxyuridine. The TK + phenotype is lethal in the presence of bromodeoxyuridine.
Only plal ~ es constituted by TK virus (having inserted a foreign gene during homologous recombination in step transfection) are formed.
After 2 or 3 days, the ranges of] .ysc; have visualized after coloring the living cells with neutral red. The virus corresponding to the ranges observed is sampled, multi-folded; the DNA of the isolated clones is extracted and hybridized to the "ENV" probe.
Only the clone (s) hybridizing to the "ENV" probe are kept for later cloning and testing expression of gp51 and gp30.
We have thus selected the recombinant virus VV-ENV1 expressing both gp51 and gp30.
PREPARATION AND CHARACTERIZATION OF MONO- ANTIBODIES
13 2 ~ 7 ~
Mouse immunization Balb / c mice were injected subcutaneously and intraperitoneal 50 ~ g of gp51 in the presence of adjuvant complete by Freund. This injection was repeated 2 weeks after in the presence of incomplete Freund's adjuvant, then 4 weeks later without adjuvant, We proceeded, two months later, to a last injection intraperitoneally and by intravenously.
Cell fusion The hybrids were prepared by fusion of mouse myeloma with splenocytes from immunized mice according to the technique described by HERZENBERG LA et al. in ~ 'Handbook of Experimental Immuno] .ogy (D. WEIR, ed.) 25.1-25 (Blackwell, London).
The hybrids obtained were distributed in plates of 96 wells and selected on HAT medium in the presence of thymo-mouse cytes and macrophages, Producing hybrids anti-gp51 on antibodies, t were detected using radio liquid phase immunoassay with gp51 antigen labeled iodine 125 or using a phase radioimmunoassay solid with ~ LV virus adsorbed in micro wells plates. In the latter case, the specific antibodies adsorbed on the virus were detected with an anti mouse iodine-125 immunoglobulin. After washing, radioactivity adsorbed on complexes -. specific is revealed by autoradiograpllie.
Selected producer clones have been transferred on 24-well plates and subcloned in semi-medium solid agarose.
The hybrid cells obtained were injected into the intraperitoneal cavity of previously treated mice with pristane. After 10 to 15 days, we collected the ascites which contained significant amounts of antibodies monoclonals sought.
Purification and characterization of anti-corl ~ s mono-clonal 14 2 ~ 33 ~ 1 These monoclonal antibodies were purified by clrromatogra-ion exchange copy on DEAE Affigel Blue according to the method described by Bruck et al. in J. Immunological Methods 53, 313-319 (1982).
These monoclonal antibodies have been labeled with iodine 125 by the chloramine T process described by GREENWOOD
FC et al. in Biochemical Journal, 89, 114-123 (1963).
The specificity of the different monoclonal anti-bodies obtained for given epitopes was determined by competition tests between antibodies for antigen gp51 adsorbed in the wells of the microtitration plates.
For this purpose, a microgram of monoclonal antibody purified radioactive label is incubated for one overnight at 4 C, in a volume of 50 ~ l in the wells of a plastic microtiter plate containing the gp51 adsorbed (50 ng).
Antibody radioactively labeled with iodine 125 (10 ng-100,000 cpm) is then added and the incubation continues 6 more hours at 4 C.
The microplates are then washed intensively and the radioactivity clings to the plastic of each well is measured in a type ~ counter.
We interpret the results knowing that, if two i antigenic sites are very close or identical, the binding of one of the antibodies (unlabelled) to the epitope, goes interfere with or prevent the binding of the second (labeled) antibody to its epitope.
Competition tests between mono- antibodies clones puri ~ i.es allow to define on the molecule of gp51 eight independent antigen sites designated by letters A, B, C, D, E, F, G, H.
CHARACTERIZATION OF RECOMBINANTS USING ANTIBODIES
MONO ~ LONAUX
The detection of F, G, H epitopes at the surface cells infected with the recombinants is performed by either of the following two methods:
2 ~ 3 ~ 7 ~
1. IMMUNOFLUORESCENCE
Sensitive cells (VERO cells) are seeded in Leighton tubes. After growth, they are infected in an order of multiplicity of 5 using the different recombinants VP391, VP392, VV-ENV1 and VTK79 (wild vaccine). After 20 hours of infection, the slides are recovered and incubated with none of the mono- antibodies anti-gp51 clones, directed respectively against the sites defined A, B, ~ ', C, D, D', E, F, G and H.
After 1 hour of incubation, the slides are washed several times with PBS isotonic buffer, then incubated with murine anti-immunoglobulin antibody conjugate -. fluorescein labeled.
After 1 hour of incubation, the cells are washed, : 15 then the slides are mounted to be examined with a microscope with UV lamp, using the immersion objective if we.
The results are interpreted as negative (-) if no fluorescence is observed. Fluorescence is indicated by + l- (when the case is doubtful) or by + or +++ (when positive) depending on the intensity observed.
The results obtained were collated in the Table I.
; There is very good immunofluorescence on the sites F, G, H on the recombinant VV-ENV1.
We note that we obtain a very good immunofluorescent-cence for the F and H sites on the recombinant VP392 then that the recombinant VP391 exhibits immunofluorescence very weak for these same epitopes. Immunofluorescence on VP391 and VP392 is of equal intensity for all sites A, ~, ~ ', D, D', E.
The absence of the G site is observed on the recombinants VP391 and VP392. The absence of this epitope is explained by the makes the T 15-2 clone from which the gene encoding gP51 was introduced into the virus is a G- variant, not recognized by the MONO G monoclonal antibody.
. . .
16 2 ~ 33 ~
These results therefore show that, to present to the immune system of animals an anti ~ ene gp51 using of a recombinant virus, it is important that] a gp30 be associated to gp51, so as to have a gp51 antigen having the native configuration observed on a BLV viral particle, where sites F, G, H are the best exposed.
The test highlights the presence of sites A, B, B ', C, D, D', E, F, G and H defined by the monoclonal antibodies on gp51.
A cell extract or culture supernatants from cells infected with a recombinant virus or BLV virus caught in sandwicl1 between monoclonal antibody anti E sensor and a revelation monoclonal antibody judged by peroxidase. The Ei.nale presence of a coloration : is the sign of the presence of the anti ~ enic site recognized by the revelation monoclonal antibody.
This technique shows, for example, that the G site is absent on preparations VP391 and VP392 obtained with the BLV T15-2 provirus variant; but that it is, by cons, present when the recombinant is obtained by inserting the information coding for gp51 and gp30 from the cDNA copied to the vi.ral RNA of the 8LV virus produced by the BL bat cells.
ADAPTATION OF VACCINE RECOMBINANTS ON SHEEP CELLS
We carried out a recombinant adaptation experiment VP392 (gp51 + gp30), by repeated passages on a line cell of OVK origin (ovine kidney cells).
The experiment was conducted from April 17, 19 ~ June 7 to 21 1987 by subculturing twice a week the OVK cells and VERO cells (used as control), in boxes of Roux 25 cm2. When they arrived, the cells were washed and infected with VP392 from infection of ~ anterior pass (55 ~ l taken from ml of suspension from the Roux box 25 cm2). Per box of Red 25 cm2, there are 3 x 106 OVK cells at confluence 17 2 0 3 3 ~ 7 1 have 9 x 10 VERO cells.
~ The different viral suspensions have been kept at -20 C. Their virus titer was determined by titration in 24-well dishes, according to the limit dilution method
5 (quatre répétitions par dilution, table de calcul de OL 50 scelon Read-Muench). Lors des titrations, le recomb.inant a été, à chaque fois, testé sur cellules VERO et sur cellules OVK.
Les résultats obtenus sont rassemblés dans le Tab]eau 10 II. Les titres en virus (DL50) rapportés ont été obtenus après respectivement 30 jours (16/5), 35 jours (21/5), 45 ; jours (1/6) et 60 jours (15/6) d'adaptation sur cellules OVK.
Ces résult~lts montrent que les titres observés sur OVK
: 15 sont plus E.~ibles que ceux obtenus sur VERO. Cette J différence s'explique par le fait que la quantité de cel-lules OVK mise en oeuvre est trois fois moindre par boîte de Roux 25cm2.
On note que, si le virus recombinant VP392 se réplique 20 un peu moins bien sur cellules OVK que sur cellules VE~O, sa réplication sur cellules OVK reste, néanmoins, bonne.
IMMUNISATION l)E LAPINS A L'AIDE DE RECOMBINANTS VACCINE
Plusieurs lapins ont été imml~nises à l'aide de suspen-sions de recombinants vaccine, soit ua.r voie intradermique . 25 (ID) seule, soit par voie intraveineuse (IV) (50 ~O de la dose) et par voie intradermique (50 ~0 de la dose). Les doses de virus infectieux par immunisation étaient de l'ordre de 107 pfu/ml. Un rappel a été effectué dans les mêmes condi-ti.or~s six semaines après le premier traitement.
Des prélèvements de sérum silncJuin ont été effectués à
plusieurs moments. Plusieurs tests ont él:é efEectués sur ces sérums.
;. 1. TEST ELISA
~ . .
Ce test, utilisé pour la détection des anticorps dans le sérum sanguin, a été réalisé dans les conditions suivantes:
.
:
1~ 2~3~71 - fixation de 100 ng d'anticorps monoclonal MONO E
purifié sur les parois des puits d'une plaque de microtitra-tion ; incubation pendant 16 heures à 4 C;
- après lavage et saturation avec une protéine inerte, la sérumalbumine bovine, introduction (en présence de la protéine inerte) d'une préparatiorl de protéines virales traitée au détergent Tween 80 2 ~0 (la preparation et ].e sur-nageant de culture des cellules FLK productrices de façon chronique du virus BLV);
- après incubation de 4~ hellres minimum à 4C et lavages, introduction dans les puits de 200 ~l des dilutions progressives d'antisérum à tester (8 dilutions de 3 en 3 à
partir de ].a dilution 20) ; incubation pendant 16 heures à
4 C;
- après lavage, addition de 100 ~ par puits de tampon contenant 200 ng de fragment Fab d'immunoglobulines de chèvre purifiés par cl1romatographie d'affinité, dirigés spécifiquement contre les i.mmunoglobulines de lapin et couplés à l'enzyme peroxydase ; incubation pendant 1 heure à
4 C;
- après lavage, révélation de l'activit.é enzymatique associée aux parois, à l'aide de substrat H~ 0~ +
tétraméthylbenzidine;
- après 20 mn, arrêt de la réaction avec Hz S04 2 N et lecture des densités optiques D.O. à l'aide d'un spectrophotomètre pour microplaques de titration.
2. TEST ELISA DE COMPETITION
Le test permet de déterminer la présence d'anticorps de lapins entrant en compétition avec ].es anticorps monoclonau~
conjugués à la peroxydase.
Le test a été réalisé dans les mêmes conditions que celles précédemment décrites à propos du test ELISA, avec cette différence que l'enzyme peroxydase est couplée avec des anticorps monoclonaux spécifiquement dirigés contre les épitopes A à H de la gp51.
A cette fin, on additionne, par puits, 100 ~l de tampon ,9 2~3~71 contenant 200 ng d'anticorL)s pllrifiés par chromatograpl1ie d'affinité el: dirigés spécifiquement contre les sites antigéniques A, B, B'...... F, G, H.
3. TEST D'INHIBITION DFS E~SEUDOTYPES VSV/BLV
Ce test, décrit par ZAVADA J. et al. dan:; .J. Natl.
Cancer Inst., p. 95 à 101 (1979), a été utilisé afin de déterminer la capacité qu'ont les ser~ :; de lapins auxquels ont été injectés des recombinants, de neutraliser l'acti.vité
biologique du virus BLV.
Le test d'inhibition de pseudotypes est basé sur des observations de J. ZAVADA et al. montrant que l'infection par le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) de cellules chroniquement infectées par le virus BLV fournit des parti-cules virales dont le génome est constitué de celui du virus VSV et dont l'enveloppe est celle du virus BLV (pseudotype).
Ces pseudotypes VSV/BLV possèdent les propriétés spécifiques liées à la g1ycoprotéine d'enveloppe gp51 du virus BLV comme 1a neutralisation et la spécificité d'hl3te.
Le génome VSV inclus dans ces pseudotypes rend les parti-cules capables de former rapidement (24-36 heures) des plages de lyse sur 1.es cellules de singe qu'on a infectées par ces pseudotypes.
Hrièvement, pour la ne~lt.ralisation des pseudotypes avec les sérums à tester, on mélange 1 ml d'une preL~aration de pseudotypes pouvant former 200 plages de ~yse sur les cel-- lules à tester t10~ , 10 ~, 103, 104 et d'autres dilutions intermédiaires). Ces sérums ont été préalablement inactivés à la chaleur (56'C) pendant 30 minutes.
Après une heu.re d'incubation à 20 C, on inocule 0,5 ml de chaqlle mélan~e sur un tapis de cellules de singe :,e trouvant dans une boîte de Petri. Après 90 mn d'incubation, l'inoculum est enlevé par lavage avec du tampon isotonique stérile et les cellules sont recouvertes d'une couche d'agar.
Après 24-36 heures d'incubation à 37 C, les cellules sont colorées au rouge neutre et les plages de lyse ~Q33~7~
r:r~si.duelles sont comptées.
Le titre en anticorps neutralisants contre l.e virus BLV
est obtenu en déterminant la di1s.li:ion de sérum avec laquelle on n'obtient seulement que 50 ~O des plages de lyse obtenues en l'absence de sérum à tester.
4. TEST D'INHIBITION DE SYNCYTIA
Ce test repose sur la constatation ~aite que des anticorps neutralisants peuvent empêcher la fusion des mem-branes cellulaires, mais non des membranes nucléaires, enl:re cellules ayant re,cu BLV E)ar injection et cellules indica-I:rices de chat CC81 (le test a été utilisé pol~r aractériser ].es anticorps monoclonaux par ~RUCK et al. dans Virology (1982) 122 p. 353-362). Les résll].~ats représentent la dilu-tion maximale de sérum pour laquelle on observe une diminu-tion de 50 ~O du nombre de syncytia.
~ rièvement, pour obtenir l'inhibition des syncytia avecles sérums à tester, on incube dans les puits d'une plaque de microtitration les dilutions de sérum (2, 4, 8, 16 ...) avec les cellules FLK productrices de virus BLV. Ces sérums ont été préalablement inactivés à la chaleur (56 C) pendant 30 minutes.
Après trois heures d'incubation à 37 C, le milieu de culture est enlevé et les noyaux de cellules adhérentes sont colorés à l'aide du réactif de Giemsa.
Les cellules contenant plus de 5 noyaux :;ont considérées comme syncytia. Les dilutions de sérum neu-tralisant au moins à 50 ~0 la formation de syncytia sont considérées comme positives.
; 5. ~ESULTATS
' 30 nans le Tableau III, on a rassemblé les résultats, de ces 4 tests, obtenus a~ec VP391, VP392, VV-ENV1, VP459 (gp51 + gp30) et VP482.
On a représenté sur la figure 1 des courbes de titra-tion des anticorps anti-gp51, obterules par la méthode ELISA
précédemment décrite. On a porté en abscisses les dilutions du sérum et en ordonnées la densité optique D.O. mesurée à
~1 2~33~71 460 nm.
Les courbes référencées 4-4 et 5-5 sont les courbes obtenues avec les lapins qui orlt reçu le virus recombinant VP391 (~p51 seule) - lapins n 4 et 5.
5Les courbes référellcées 7-7, 8-3 et 10-10 sont les courbes obtenues avec les lapins qui ont reçu le virus recombinant VP392 tgp51 et ~p30)-lapins n- 7, a et 10.
La courbe référencée 11-11 est la courbe obtenue avec un lapin qui a reçu la gp51 uurifiée dans l'adjuvant complet de Freund (ACF) - lapin n 2670.
La courbe référencée 12-12 est la courbe obtenue avec un lapin normal.
Sur les figures 2, 3 et 4, on a représenté les courbes de compétition des anticorps anti-gpS1 de lapin respective-ment avec les anticorps monoclonaux F, G et H couplés à laperoxydase.
L'ensemble des résultats obtenus montre donc que, lorsque l'on administre à un lapin le virus recombinant qui exprime la gp51 et la gp30 (VP392, VP459, VP482, VV-ENV1), les anticorps formés - présentent une activité neutralisante ; les anticorps du lapin n- 10 ont même un pouvoir neutralisant supérieur à
celui des anticorps de lapin n- 2670 ayant reçu la gp51 purifiée ;
25- entrent très bien en compétition avec les anticorps monoclonaux dirigés contre les sites biolo~iques F, G, H.
On constate, par contre, qu'aucune compétition avec les anticorps monoclonaux diri.gés contre les épitopes F, G, H
n'est apparente avec les anticorps des lapins 4 et 5 qui ont 30reçu le recombinant qui exprime la gp51 seule (VP391).
De plus, aucune activité neutralisante et protectrice des anticorps de ces lapins n'a pu être mise en évidence.
Il apparaît dans le tableau III que seules les associa-tions gp51 et gp30 sont capables d'induire les hauts taux d'anticorps neutralisants dans les deux tests pratiqués. Les tests de compétition ELISA montrent que ces associations ont ... . .
22 20~3~71 conservé les si~es biologiques F, G, H décrits précédemment et impliqués dans la neutralisation du ~LV.
IMMUNISATION DE ~OUTONS A L'AIDE DE RECOMBINANTS
Un lot de moutons a été vacciné à l'aide des virus recombinal1ts VP459, VP4~2 ainsi que la vaccine sauvage VP452. Ces moutons ont reçu dellx fois par injection des recombinants avant d'être surinfectés par BLV à l'aide des cellules sanguines infectées provenallt d'un animal leucémique.
Les moutons sont des moutons d'un an maximum dont le statut sérologique a été vérifi.é négatif pour le BLV. Les moutons 44 et 99 servent ici de contrôle à l'expérience de surinfection BLV.
Les recombinants de la vaccine ont été inoculés lors de la premi.ère injection par voie intradermique (ID) et par voie sous-cutanée ~SC) lors de la deuxième injection. Chaque mouton a reçu à cl1aque fois 2 doses de 108 recombinant:s vac-cine le long de la colonne vertébrale.
L'intervalle de temps entre les injections de recom-binants et la surinfection par BLV est chaque fois de 6semaines.
On a réalisé la surinfection à l'aide de sang entier d'un animal bovin (31700 globu].es blancs par mm dont 36 ~0 de lymphocytes). Le sang, d'abord recueil.li sur EDTA, a été
dilué 10 fois en citrate ; 0,5 ml de cette solution, .soit l'équivalent de 50 ~l de sang entier, a été injecté en 4 points intradermiques. Le virus BLV produit à partir des cellules sanguines mises en cultu.re "short-term" s'est avéré
être un variant G , tous les autres sites étant conservés.
On a effectué des prises de sang toutes les semaines, ~'parfois même à une fréquence plus grande, par exemple dans les jours suivant une inoclllation du virus recombinant. On a réalisé des comptages de globules blancs et des formules sanguines. On a recueilli à chaque fois du sérum qui a été
conservé à -20 C.
La recherche des anticorps anti-gp51 a été effectuée 23 2~33071 par des tests ELISA. Ces tests ont été réalisés dans ].es mêmes conditions que celles précédemment décrites ~outefois dans la rechert-l1e des anticorps les anti-immunoglobulines bovines ou ovines ont été coup].ées à
l enzyme ~-galactosidase. Dans le test ELISA de compétition utilisé également pour la recherche des anticorps la compétition a lieu avec l anticorps monoclonal contre l épitope G, couplé à l enzyme peroxydase.
Du sang a été prélevé sur EDTA deux à trois mois après la surinfection par les cellules infectées par le virus ~LV.
Les lymphocytes ont été recueillis par lyse différentielle et placés en culture in vitro pour une période de 96 heures.
Le surnageant de culture a éte dès lors recueilli et la présence des protéines virales gp51 et p24 a été recherchée par test ELISA.
Les moutons ont été suivis après la surinfection par BLV pendant une période de 6 mois après celle-ci pour la détection d anticorps antip24 signe de l infection par le virus BLV les animaux n ayant vu avant la surinfection que les protéines gp51 et gp30.
Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau IV.
; Ces résultats montrent :
- que des anticorps antigp51 ont été détectés à haut ; 25 titre chez les moutons ayant reçu les recombinants VP459 et VP482.
Ces anticorps ont été détectés dans un test de compétition avec l anticorps monoclonal G couplé à la peroxydase. Ces résultats sont en accord avec ceux observés dans l article de Portetelle, D. et al. dans J. Virol.
Methods, 23, 211-222 (1989) où la compétition existe avec l anticorps monoclonal contre G même si l animal testé a été infecté par un variant ~LV G .
nans des èxpériences préliminaires chez les moutons avec le recombinant VP391 (gp51 seule) aucune compétition n avait pu être montrée avec l anticorps monoclonal contre G .-2033~71 2~
(ou F ou H), comme cela est d'ailleurs décrit pour les lapins dans le tableau III ;
- que le virus BLV est détectable uniquement à partir des lymphocytes de moutons contrôles ou ayant reçu la vac-cine sauvage VP452 ;
- q~ie les recombinants exprimant gp51 et gp30 ~VP459 et VP4~2) diminuent fortement le nombre de cellules infectées ou empêchent l'infection lors d'une surinfection par HLV
la méthode utilisée (culture in vitro des lymphocytes) ne permet pas d'identifier le virus BLV dans ces cas ;
- que des anticorps antip24, signe d'infection par BLV, sont observés chez tous les contrôles et tous ceux ayant reçu VP452 ;
- qu'un seul mouton, ayant reçu VP459, présente un taux élevé persistant en anticorps antip24 et semble donc infecté;
- qu'un pouvoir neutralisant est observé chez les mou-tons ayant recu VP459 ou VP4~2 ;
- qu'après surinfection, un pouvoir neutralisant élevé
et ne décroissant pas est signe de l'infection par BLV ; un pouvoir neutralisant faible ou qui décroît dans le temps est signe d'une protection.
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traitement par le fragment Klenow de la DNA poly~érase I
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a~plificaeion et purification sur gradiene CsCl ' I ' digestions des endonucléases de restriction ' électrophorèse en gel d'agarose . .
transfert selon "Southern"
I
hybridation à la sonde "ENV"
I
autor~diocraohie 5 (four repetitions per dilution, OL 50 calculation table according to Read-Muench). During titrations, the recomb.inant has each time, tested on VERO cells and on cells OVK.
The results obtained are collected in the Water tab]
10 II. Virus titers (LD50) reported were obtained after 30 days (16/5), 35 days (21/5), 45 respectively ; days (1/6) and 60 days (15/6) of adaptation on cells OVK.
These results show that the titles observed on OVK
: 15 are more E. ~ ibles than those obtained on VERO. This J difference is explained by the fact that the quantity of the OVK processing is three times less per box Red 25cm2.
Note that, if the recombinant virus VP392 replicates 20 slightly worse on OVK cells than on VE ~ O cells, its OVK cell replication remains, however, good.
IMMUNIZATION l) E RABBITS USING RECOMBINANT VACCINES
Several rabbits were immobilized using hangers sions of vaccinia recombinants, i.e. ua.r intradermally . 25 (ID) alone, either intravenously (IV) (50 ~ O of dose) and intradermally (50 ~ 0 of the dose). The doses of infectious viruses by immunization were in the range of 107 pfu / ml. A recall was carried out under the same conditions.
ti.or ~ s six weeks after the first treatment.
SilncJuin serum samples were taken at several times. Several tests have been carried out on these sera.
;. 1. ELISA TEST
~. .
This test, used for the detection of antibodies in blood serum, was produced under the conditions following:
.
:
1 ~ 2 ~ 3 ~ 71 - fixation of 100 ng of MONO E monoclonal antibody purified on the walls of the wells of a microtitra plate tion; incubation for 16 hours at 4 C;
- after washing and saturation with an inert protein, bovine serum albumin, introduction (in the presence of inert protein) from a preparation of viral proteins treated with Tween 80 detergent 2 ~ 0 (preparation and] .e sur-swimming from culturing FLK-producing cells so BLV virus);
- after incubation of 4 ~ hellres minimum at 4C and washes, introduction into the wells of 200 ~ l of dilutions of antiserum to be tested (8 dilutions of 3 in 3 to from] .a dilution 20); incubation for 16 hours at 4 C;
- after washing, addition of 100 ~ per well of buffer containing 200 ng of Fab fragment of immunoglobulins goats purified by affinity chromatography, directed specifically against rabbit i.mmunoglobulins and coupled to the peroxidase enzyme; incubation for 1 hour at 4 C;
- after washing, revelation of the enzymatic activity associated with the walls, using substrate H ~ 0 ~ +
tetramethylbenzidine;
- after 20 min, stopping the reaction with Hz S04 2 N and reading of DO optical densities using a spectrophotometer for titration microplates.
2. ELISA COMPETITION TEST
The test makes it possible to determine the presence of antibodies to rabbits competing with] .es monoclonal antibody ~
conjugated to peroxidase.
The test was carried out under the same conditions as those previously described about the ELISA test, with this difference that the peroxidase enzyme is coupled with monoclonal antibodies specifically directed against epitopes A to H of gp51.
To this end, 100 ~ l of buffer are added per well.
, 9 2 ~ 3 ~ 71 containing 200 ng of anticorl) s pllrified by chromatography affinity el: directed specifically against sites antigenic A, B, B '...... F, G, H.
3. DFS E ~ SEUDOTYPES VSV / BLV INHIBITION TEST
This test, described by ZAVADA J. et al. dan :; .J. Natl.
Cancer Inst., P. 95-101 (1979), was used to determine the capacity of the services:; of rabbits to which have been injected with recombinants, to neutralize the activity BLV virus.
The pseudotype inhibition test is based on observations of J. ZAVADA et al. showing that the infection by cell vesicular stomatitis virus (VSV) chronically infected with the BLV virus provides parti-viral cells whose genome is made up of that of the virus VSV and whose envelope is that of the BLV virus (pseudotype).
These VSV / BLV pseudotypes have the properties specific to the gp51 envelope g1ycoprotein BLV virus as neutralization and specificity of host.
The VSV genome included in these pseudotypes makes the cules capable of rapidly forming (24-36 hours) lysis ranges on 1. monkey cells that have been infected by these pseudotypes.
Briefly, for the ne ~ lt.ralisation of pseudotypes with the sera to be tested, 1 ml of a preL ~ aration of pseudotypes that can form 200 ranges of ~ yse on cells - lules to be tested t10 ~, 10 ~, 103, 104 and other dilutions intermediaries). These sera have been previously inactivated in the heat (56'C) for 30 minutes.
After an hour of incubation at 20 ° C., 0.5 ml is inoculated of each melan ~ e on a carpet of monkey cells:, e found in a petri dish. After 90 minutes of incubation, the inoculum is removed by washing with isotonic buffer sterile and the cells are covered with a layer agar.
After 24-36 hours of incubation at 37 C, the cells are colored neutral red and the lysis ranges ~ Q33 ~ 7 ~
r: r ~ si.duelles are counted.
The BLV virus neutralizing antibody titer is obtained by determining the di1s.li:ion of serum with which only 50 ~ O of the lysis ranges obtained are obtained.
in the absence of serum to be tested.
4. SYNCYTIA INHIBITION TEST
This test is based on the observation ~ aite that neutralizing antibodies can prevent the fusion of mem-cell branes, but not nuclear membranes, ent: re cells having re, cu BLV E) ar injection and cells indicated I: CC81 cat rices (the test was used pol ~ r characterize ] .es monoclonal antibodies by ~ RUCK et al. in Virology (1982) 122 p. 353-362). The resll]. ~ Ats represent the dilu-maximum serum for which there is a decrease tion of 50 ~ O of the number of syncytia.
~ laughing, to obtain inhibition of syncytia with the sera to be tested, incubate in the wells of a plate microtitration dilutions of serum (2, 4, 8, 16 ...) with BLK virus-producing FLK cells. These sera have been previously inactivated with heat (56 C) for 30 minutes.
After three hours of incubation at 37 ° C., the medium of culture is removed and the adherent cell nuclei are stained with Giemsa reagent.
Cells containing more than 5 nuclei:; have considered syncytia. Dilutions of new serum tralising at least 50 ~ 0 the formation of syncytia are considered positive.
; 5. ~ RESULTS
'30 in Table III, the results are collated, these 4 tests, obtained with ~ ec VP391, VP392, VV-ENV1, VP459 (gp51 + gp30) and VP482.
Figure 1 shows the titration curves.
tion of anti-gp51 antibodies obterulated by the ELISA method previously described. We diluted the dilutions of serum and on the ordinate the optical density DO measured at ~ 1 2 ~ 33 ~ 71 460 nm.
The curves referenced 4-4 and 5-5 are the curves obtained from rabbits which have received the recombinant virus VP391 (~ p51 only) - rabbits 4 and 5.
5The curves referenced 7-7, 8-3 and 10-10 are the curves obtained with rabbits which received the virus recombinant VP392 tgp51 and ~ p30) -lapins n- 7, a and 10.
The curve referenced 11-11 is the curve obtained with a rabbit that received ugified gp51 in the complete adjuvant de Freund (ACF) - rabbit n 2670.
The curve referenced 12-12 is the curve obtained with a normal rabbit.
Figures 2, 3 and 4 show the curves of competition of the respective rabbit anti-gpS1 antibodies-ment with the monoclonal antibodies F, G and H coupled to laperoxidase.
All the results obtained therefore show that, when administering to a rabbit the recombinant virus which expresses gp51 and gp30 (VP392, VP459, VP482, VV-ENV1), the antibodies formed - have a neutralizing activity; antibodies of rabbit n- 10 even have a neutralizing power greater than that of rabbit antibodies n-2670 having received gp51 purified;
25- compete very well with antibodies monoclonals directed against biological sites F, G, H.
We note, on the other hand, that no competition with direct monoclonal antibodies against epitopes F, G, H
is not apparent with antibodies from rabbits 4 and 5 which have 30 received the recombinant which expresses gp51 alone (VP391).
In addition, no neutralizing and protective activity antibodies from these rabbits could not be demonstrated.
It appears in Table III that only the associates gp51 and gp30 are capable of inducing high rates neutralizing antibodies in the two tests performed. The ELISA competition tests show that these associations have ... .
22 20 ~ 3 ~ 71 preserved the biological si ~ es F, G, H described above and involved in the neutralization of ~ LV.
IMMUNIZATION OF ~ OUTONS USING RECOMBINANTS
A batch of sheep has been vaccinated using viruses recombinal1ts VP459, VP4 ~ 2 as well as wild vaccinia VP452. These sheep received dellx injection times recombinants before being infected with BLV using infected blood cells from an animal leukemic.
Sheep are sheep up to one year old whose serological status has been verified negative for BLV. The sheep 44 and 99 serve here as controls to the experiment of BLV infection.
The vaccinia recombinants were inoculated during the first injection intradermally (ID) and by subcutaneous route ~ SC) during the second injection. Each sheep received 2 doses of 108 recombinant each time: s vac-cine along the spine.
The time interval between recommended injections and the secondary infection with BLV is each 6 weeks.
Superinfection was carried out using whole blood of a bovine animal (31,700 globu] .es white per mm including 36 ~ 0 lymphocytes). The blood, first collected.li on EDTA, was diluted 10 times in citrate; 0.5 ml of this solution, or the equivalent of 50 ~ l of whole blood, was injected in 4 intradermal points. The BLV virus produced from "short-term" cultured blood cells have been shown to be a variant G, all the other sites being preserved.
We took blood samples every week, ~ 'sometimes even at a higher frequency, for example in on the days following inoclllation of the recombinant virus. We have performed white blood cell counts and formulas blood. Each time, serum was collected which was stored at -20 C.
The search for anti-gp51 antibodies has been carried out 23 2 ~ 33071 by ELISA tests. These tests were carried out in] .es same conditions as those previously described ~ however in the search for antibodies to bovine or ovine immunoglobulins have been cut to the enzyme ~ -galactosidase. In the ELISA test of competition also used for research of antibody competition takes place with monoclonal antibody against the G epitope, coupled with the peroxidase enzyme.
Blood was drawn from EDTA two to three months after superinfection by cells infected with the ~ LV virus.
Lymphocytes were collected by differential lysis and placed in in vitro culture for a period of 96 hours.
The culture supernatant was therefore collected and the presence of viral proteins gp51 and p24 was sought by ELISA test.
Sheep were followed up after superinfection with BLV for a period of 6 months after this for the detection of antip24 antibodies sign of infection with BLV virus animals having only seen before secondary infection proteins gp51 and gp30.
The results obtained are collated in the table IV.
; These results show:
- that antigp51 antibodies have been detected at high ; 25 titer in sheep having received the VP459 recombinants and VP482.
These antibodies were detected in a competition with monoclonal antibody G coupled to peroxidase. These results are in agreement with those observed in the article by Portetelle, D. et al. in J. Virol.
Methods, 23, 211-222 (1989) where competition exists with the monoclonal antibody against G even if the animal tested has been infected with a variant ~ LV G.
nans of preliminary experiments in sheep with the recombinant VP391 (gp51 alone) no competition could not be shown with the monoclonal antibody against G .-2033 ~ 71 2 ~
(or F or H), as is moreover described for rabbits in Table III;
- that the BLV virus is detectable only from sheep or control lymphocytes wild cine VP452;
- q ~ ie the recombinants expressing gp51 and gp30 ~ VP459 and VP4 ~ 2) greatly decrease the number of infected cells or prevent infection during HLV secondary infection the method used (in vitro culture of lymphocytes) does not does not identify the BLV virus in these cases;
- only antip24 antibodies, a sign of BLV infection, are observed in all controls and all those with received VP452;
- only one sheep, having received VP459, has a rate persistent high in antip24 antibody and therefore appears infected;
- that a neutralizing power is observed in the mo-tones having received VP459 or VP4 ~ 2;
- only after secondary infection, a high neutralizing power and not decreasing is a sign of BLV infection; a weak or decreasing neutralizing power over time is sign of protection.
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a ~ plificaeion and purification on gradiene CsCl 'I' restriction endonuclease digestions '' agarose gel electrophoresis . .
transfer according to "Southern"
I
"ENV" probe hybridization I
autor ~ diocraohie
Claims (23)
un degré élevé la formation d'anticorps neutralisants, caractérisé en ce que la glycoprotéine gp51 est associée à
une glycoprotéine transmembranaire, de manière à restituer à
la glycoprotéine gp51 sa configuration native où sont présents les épitopes F, G et H responsables de l'activité
biologique du virus BLV, dans un véhicule ou excipient phar-maceutique du type de ceux utilisés pour la constitution de vaccins. 1. Bovine leukemia virus (BLV) vaccine, comprising a peptide moiety which includes the gp51 envelope glycoprotein of the BLV virus and which induces a high degree the formation of neutralizing antibodies, characterized in that the glycoprotein gp51 is associated with a transmembrane glycoprotein, so as to restore to glycoprotein gp51 its native configuration where are present the F, G and H epitopes responsible for the activity of the BLV virus, in a pharmaceutical vehicle or excipient maceutical of the type used for the constitution of vaccines.
l'aide d'un virus recombinant. 5. Vaccine according to claim 3 or 4, characterized in that the glycoproteins gp51 and gp30 are expressed at using a recombinant virus.
8, caractérisé en ce que les glycoprotéines gp51 et gp30 sont insérées dans des liposomes. 9. Vaccine according to any one of claims 2 to 8, characterized in that the glycoproteins gp51 and gp30 are inserted into liposomes.
un degré élevé la formation d'anticorps neutralisants caractérisé en ce que la glycoprotéine gp51 est associée à
un anticorps monoclonal spécifique de l'un des épitopes de la gp51 de manière à restituer à la glycoprotéine gp51 sa configuration native où sont présents les épitopes F, G et H
responsables de l'activité biologique du virus BLV, dans un véhicule ou excipient pharmaceutique du type de ceux utilisés pour la constitution de vaccins. 17. Bovine Leukemia Virus (BLV) Vaccine comprising a peptide fraction comprising the gp51 envelope glycoprotein of the BLV virus and inducing a high degree the formation of neutralizing antibodies characterized in that the glycoprotein gp51 is associated with a monoclonal antibody specific for one of the epitopes of gp51 so as to restore to the glycoprotein gp51 its native configuration where the F, G and H epitopes are present responsible for the biological activity of the BLV virus, in a pharmaceutical vehicle or excipient of the type of those used for making vaccines.
sont exprimés à l'aide d'un virus recombinant, dans lequel sont insérés le gène codant pour la gp51 et des gènes codant pour l'anticorps monoclonal contre l'épitope E ou A. 21. Vaccine according to claim 20 characterized in that as glycoprotein gp51 and monoclonal antibody E or A
are expressed using a recombinant virus, in which are inserted the gene encoding gp51 and genes encoding for the monoclonal antibody against the E or A epitope.
l'anticorps monoclonal E ou A, ledit anticorps captant ensuite la glycoprotéine gp51. 22. Vaccine according to claim 20 characterized in that which is inserted into an ISCOM-type preparation monoclonal antibody E or A, said antibody capturing then the glycoprotein gp51.
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